KR20040104936A - 사스 바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중증 급성호흡기 증후군(SARS, 사스) 유발 코로나바이러스의 항원을 미생물 표면에 발현시키는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물 또는 그 추출 정제물을 함유하는 사스 예방용 백신에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사스 유발 코로나바이러스의 항원 단백질을 암호화하는 유전자와 미생물 표면 발현 모체인 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 또는 둘 이상을 함유하는 표면 발현벡터와, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 유효성분으로 포함하는 사스 백신에 관한 것이다.
본 발명에 따른 사스 유발 코로나바이러스의 항원단백질을 표면 발현하는 형질전환 미생물 및 상기 미생물로부터 추출·정제된 항원단백질은 사스의 치료용 또는 예방용 백신으로 활용할 수 있다. 특히, 본 발명의 사스 코로나바이러스 항원을 발현하는 재조합 균주는 경구 백신을 경제적으로 생산할 수 있는 장점을 가진다.
Description
본 발명은 중증 급성호흡기 증후군(SARS, 사스) 유발 코로나바이러스의 항원을 미생물 표면에 발현시키는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 상기형질전환된 미생물 또는 그 추출 정제물을 함유하는 사스 예방용 백신에 관한 것이다.
중증 급성호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS, 사스)은 2002년 11월부터 중국 광동지역을 중심으로 처음 발생하여 홍콩, 싱가포르, 캐나다 토론토 등 전 세계로 확산된 신종 전염병이다. 38℃ 이상의 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등의 호흡기 증상을 보이는 사스의 원인체는 변종 코로나바이러스가 병원체로 알려져 있다.
일반적으로 코로나바이러스는 매우 큰 RNA 바이러스로서 (+)RNA를 가진다. 게놈은 일반적으로 2만 9천에서 3만 1천개 정도의 염기로 구성이 되고, 현미경으로 관찰할때 왕관 모양으로 관찰되며 사람의 상부호흡기 질환, 동물의 호흡기, 간, 신경, 장 관련 질환의 원인이 되며, 자연계에는 세 그룹의 코로나바이러스가 존재하는데 이중 그룹 I과 그룹 Ⅱ는 포유류에, 그룹 Ⅲ은 조류에 감염한다.
자연계의 밝혀진 코로나바이러스는 때때로 면역계가 약화된 사람들에게 폐와 관련된 질병을 유발하고 개, 고양이, 돼지, 쥐, 새 등의 동물에서는 심각한 질병의 원인이 되기도 한다. 매우 높은 돌연변이율을 보이고 또한 재조합율 (recombination rate) 역시 25% 정도로 매우 높은 편이다. 아마도 이러한 특성이 기존 코로나바이러스의 변이를 일으켜 변종 코로나바이러스(사스 코로나바이러스)가 되어 동물로부터 인간에게로 전파가 되어 감염되었을 것으로 추측하고 있다.
세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 의하면 2002년 11월부터 31개국에서 7,447명의 사스 추정환자가 발생하여 그 중 551명이 사망하였다. 2003년의 사스 감염위험지역은 중국 북경, 광동, 홍콩, 내몽고, 산서, 천진, 싱가포르, 캐나다 토론토, 대만, 몽골 울란바토르, 그리고 필리핀 등이 대상이 되어 있으나 전세계적으로 확산될 위험성을 내재하고 있다.
사스 코로나바이러스는 2002년 발병 이후 독일 열대의학연구소가 처음으로 사스 바이러스의 염기서열 해독을 실시했다. 연구팀은 중합효소연쇄반응(PCR)으로 유전자 증폭이 가능한 특정 유전자 부위에 대한 염기서열 해독을 실시했다. 해독 결과는 독일 생명공학기업인 아르투스사에 제공돼 사스 감염키트를 개발하는데 활용됐고, 이 키트는 사스 의심환자에서 검출한 바이러스 유전자를 증폭시켜 사스바이러스 감염 여부를 알아낼 수 있다.
이후 사스바이러스의 전체 게놈 해독작업도 이뤄졌고, 현재까지 12개 이상의 분리주에 대한 염기서열이 완전히 분석되어 알려져 있다. 이중 가장 먼저 분리된 어바니(Urbani)주[사스에 의해 감염되어 사망한 WHO 파견 의사의 이름을 땀, SARS-Cov주(Rota,PA., Science 108:5952, 2003; Genebank Accession AY278741)의 전체 염기서열이 미 CDC 연구팀에 의해 해독되었고, 캐나다 브리티시 컬럼비아 암 연구팀은 4월 12일 캐나다 토론토의 환자에서 분리한 사스 Tor2 바이러스주(Marra, M.A., Science 108:5953, 2003; GenBank Accession 274119)의 전체 염기서열을 분석하였다.
두 연구팀은 각각 서로 다른 곳에서 사스에 감염된 환자로부터 분리한 코로나바이러스를 분석했지만 두 바이러스의 염기 차이는 15개에 불과했다. 이는 사스가 동일한 바이러스에 의해 유발됐음을 보여주는 것이다. 또한, 사스 코로나바이러스의 게놈 분석결과 기존에 알려져 있는 코로나바이러스와의 단백질을 구성하는 요소는 동일하나 게놈 및 게놈에 의한 아미노산의 상동성은 거의 없는 것으로 알려져 있고, 그 중에서 그나마 쥐의 간염바이러스와 칠면조의 기관지염 바이러스에 가까운 것으로 나타났다. 그러나 사스 코로나바이러스와 다른 코로나바이러스와 연관성은 분자계통 분류학적 분석에 의해 제시되었는데, 기존의 그룹과는 다른 것으로 나타났다.
현재 사스 코로나바이러스의 검출은 PCR로 처음 시작을 하고, 항체검사 양성은 ELISA나 IFA로 판정을 하며 바이러스 분리는 PCR에 의해 확진된 검체에 대해 세포배양 검사에서 바이러스를 분리하여 사스 코로나바이러스의 감염을 확정한다.
사스에 대한 근본적인 치료방법은 없으며, 보존적인 지지요법만이 있다. 새로운 전염병인 사스의 원인체인 사스 코로나바이러스에 대한 연구가 현재 시작 단계이기 때문에 예방을 위한 백신은 개발되어 있지 않고, 세계적으로 예방 백신을 개발하기 위해 다각적인 연구가 진행되고 있다.
미생물의 세포표면에 원하는 단백질을 부착하여 발현시키는 기술을 세포표면발현(cell surface display)기술이라 한다. 이 세포표면 발현기술은 박테리아나 효모 등 미생물의 표면 단백질을 표면발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 표면에 발현시키는 기술로서 재조합 생백신의 생산, 펩타이드/항체 라이브러리(library) 제작 및 스크리닝(screening), 전세포 흡착제(whole cell absorbent), 전세포 생물전환 촉매 등 다양한 응용범위를 가지고 있는 기술이다. 이 기술은 어떤 단백질을 세포 표면에 발현시키는가에 따라 그 응용범위가 결정되어지며, 따라서 세포표면 발현기술을 이용한 산업적 응용 잠재력은 상당하다고 할 수 있다.
성공적인 세포표면 발현기술을 위해서는 표면발현모체가 가장 중요하다. 얼마나 효과적으로 외래단백질을 세포표면에 발현시킬 수 있는 모체를 선정하고 개발하느냐가 이 기술의 핵심이 된다. 따라서 다음의 성질을 가진 표면발현모체를 선정해야 한다. 먼저 외래단백질을 세포표면까지 보내기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 분비신호가 있을 것, 둘째 세포외막 표면에 안정되게 외래단백질이 부착될 수 있도록 도와주는 표적신호가 있을 것, 셋째 세포 표면에 다량으로 발현되나 세포의 성장에 거의 영향을 미치지 않을 것, 넷째 단백질의 크기에 관계없고 외래단백질의 3차원 구조에 변화가 없이 안정적으로 발현될 것 등이다. 하지만 위의 조건을 모두 만족시키는 표면발현 모체는 아직까지 개발되지 않은 상태이다.
지금까지 알려져 사용된 표면발현모체로는 세포 외막 단백질, 지질 단백질(lipoprotein), 분비 단백질(secretory protein), 편모 단백질과 같은 표면기관 단백질 등 크게 4가지이다. 그람음성균(Gram negative bacteria)의 경우 LamB, PhoE(Charbitet al., J. Immunol., 139:1658, 1987; Agterberget al., Vaccine, 8:85, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용하였고, 지질단백질인 TraT(Feliciet al., J. Mol. Biol., 222:301, 1991), PAL(peptidoglycan associated lipoprotein)(Fuchset al., Bio/Technology, 9:1369, 1991) 그리고 Lpp(Franciscoet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489:2713, 1992) 등 역시 이용되었으며, FimA나 1 형(type 1) 핌브리아(fimbriae)의 FimH 어드헤신(adhesin)과 같은 핌브리아 단백질(Hedegaardet al., Gene, 85:115, 1989), PapA 필루(pilu) 서브유닛과 같은 필리(pili) 단백질 등을 세포 표면발현 모체로 이용하여 외래 단백질의 발현을 시도하기도 하였다. 이 외에도 빙핵활성 단백질(ice nucleation protein)(Junget al., Nat. Biotechnol., 16:576, 1998; Junget al., Enzyme Microb. Technol., 22:348, 1998; Leeet al., Nat. Biotechnol., 18:645, 2000), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiela oxytoca)의 풀루라나제(pullulanase) (Kornackeret al., Mol. Microl., 4:1101, 1990), 니세리아(Neiseria)의 IgA 프로테아제(Klauseret al., EMBO J., 9:1991, 1990), 대장균의 adhesin인 AIDA-1, shigella의 VirG 단백질, Lpp와 OmpA의 fusion 단백질 등이 표면발현 모체로 사용할 수 있다는 보고가 있다. 그람양성균(Gram positive bacteria)을 이용하는 경우에는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)유래의 protein A 및 FnBPB 단백질을 표면발현 모체로 사용하여 말라리아 항원을 효과적으로 발현시킨 보고가 있으며, 젖산 박테리아의 표면 코트(coat) 단백질을 이용하여 표면 발현에 이용했다는 보고와Streptococcus pyogenes유래의 M6 단백질 (Medaglini, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92:6868, 1995),Bacillus anthracis의 S-layer protein EA1,Bacillus subtilisCotB 등 그람양성 박테리아의 표면 단백질을 모체로 이용했다는 보고가 있다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리 감마 글루탐산의 합성 복합체 유전자(pgsBCA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하여, 외래단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터와 상기 벡터로 형질전환된 미생물의 표면에외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발한 바 있다(출원번호 10-2001-48373). 상기에서 소개된 표면발현 모체들을 이용하여 병원체의 항원 또는 항원 결정기를 유전공학적 방법을 이용하여 대량 생산이 가능한 세균에서 안정하게 발현시키고자 하는 연구가 많이 시도되었다. 특히 비병원성의 세균 표면에 외래 면역원을 발현시켜 살아있는 상태로 경구투여를 할 경우 종래의 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 백신들 보다 더 지속적이고 강한 면역반응을 유도할 수 있다고 보고되었다. 이러한 면역반응 유도는 세균의 표면 구조물들이 표면 발현된 외래단백질의 항원성(antigenicity)을 증가시키는 보조제(adjuvant) 작용을 하기 때문이며 살아있는 상태의 균에 대한 체내의 면역 반응에 의한 것으로 알려져 있다. 이러한 표면발현 시스템을 이용한 비병원성 세균의 재조합 생백신의 개발은 주목할 만하다.
이에, 본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리 감마 글루탐산의 합성 복합체 유전자(pgsBCA)를 표면발현 모체로 활용하여 유전자 및 단백질 분석에 의해 선정한 사스 코로나바이러스의 항원을 유산균과 같은 비병원성 식품 안전성이 보장된 미생물의 표면에 다량 발현하여 확인하고, 이 미생물을 경구 복용하여 사스 코로나바이러스에 대한 체내 혈중 항체 생성능 및 점막 면역을 유도시키는 보다 경제적이고 안정적인 예방 백신을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 미생물의 표면발현 시스템을 활용하여 사스 코로나바이러스 항원을 발현할 수 있는 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 사스 코로나바이러스의 항원이 표면에 발현된 형질전환된 미생물, 상기 미생물로부터 추출된 사스 코로나바이러스 항원 또는 상기 미생물로부터 정제된사스 코로나바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 사스 예방용 백신을 제공하는데 있다.
도 1은 돼지 전염성 위장염 바이러스의 항원성 네 부위(A, B, C, D)와 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질과의 관계를 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 방법인 친수성 플롯(hydrophilicity plot), 제임슨-울프(Jameson-wolf) 방법인 항원 인덱스(Antigenic index) 그리고 에미니(Emini) 방법인 표면 확률 플롯(surface probability plot)을 통해 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 돼지 전염성 위장염 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과의 관계를 카이트-둘리틀 방법인 친수성 플롯, 제임슨-울프 방법인 항원 인덱스 그리고 에미니 방법인 표면 확률 플롯을 통해 분석한 것을 나타낸 결과이다.
도 3A는 본 발명에 따른 그람음성 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면발현용 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA의 유전자 지도이고, 도 3B는 본 발명에 따른 pHCE2LB:pgsA-SARS SC의 유전자 지도이며, 도 3C는 본 발명에 따른 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC의 유전자 지도이다.
도 4A는 본 발명에 따른 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS NB를 나타내는 유전자 지도이고, 도 4B는 본 발명에 따른 pHCE2LB:pgsA-SARS N의 유전자 지도이다.
도 5A, 5B 및 5C는 락토바실러스에서 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 SARS SA, SARS SC, SARS SBC 항원의 발현을 pgsA에 대한 특이 항체와 상기 융합 단백질간의 특이적인 결합을 면역블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 확인한 것이다.
도 6A 및 6B는 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 SARS SA와 SARS SBC 항원의 락토바실러스 표면발현을 유산균 세포를 분획한 단백질들을 pgsA에 대한 특이 항체로 면역블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 확인한 것이고, 도 6C는 SARS SBC 항원의 락토바실러스 표면발현을 형광-활성 세포선별 측정법 (FACScan assay)으로 확인한 것이다.
도 7A 및 7B는 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 SARS NB와 SARS N 항원의 락토바실러스 표면발현을 유산균 세포를 분획한 단백질들을 pgsA에 대한 특이 항체로 면역블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 확인한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC 및 pHCE1LB:pgsA-SARS NB로 각각 형질전환되고, 항원기의 표면발현이 확인된 락토바실러스 카제이 균주를 경구와 비강으로 각각 투여한 마우스의 혈청내 SARS SA 및 SARS SC 항원에 대한 IgG 항체가를 엘리자 방법(ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent assay)으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA,pHCE2LB:pgsA-SARS SC및 pHCE1LB:pgsA-SARS NB로 각각 형질전환되고, 항원기의 표면발현이 확인된 락토바실러스 카제이 균주를 경구와 비강으로 각각 투여한 마우스의 장 및 기관지, 폐포 세척액 내 SARS SA 및 SARS SC 항원에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC및 pHCE1LB:pgsA-SARS NB로 각각 형질전환되고, 항원기의 표면발현이 확인된 락토바실러스 카제이 균주를 경구와 비강으로 각각 투여한 마우스의 혈청내 SARS NB 항원기에 대한 IgG 항체가를 엘리자 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC및 pHCE1LB:pgsA-SARS NB로 각각 형질전환되고, 항원기의 표면발현이 확인된 락토바실러스 카제이 균주를 경구와 비강으로 각각 투여한 마우스의 장 및 기관지, 폐포 세척액 내 SARS NB항원기에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 또는 둘 이상과, 사스 코로나바이러스의 스파이크(spike) 항원단백질 또는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 항원단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서, 상기 표면 항원단백질 유전자로는 사스 코로나바이러스의 스파이크 항원단백질을 암호화하는 유전자라면 모두 사용될 수 있으며, 사스 코로나바이러스의 스파이크 항원단백질 유전자를 단독으로 이용할 수도 있고, 둘 이상을 복합적으로 이용할 수도 있다. 또한, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자에는 pgsA가 포함되는 것이 바람직하다. 상기 스파이크 항원단백질은 SARS SA, SARS SB, SARS SC, SARS SD 또는 SARS SBC일 수 있고, 뉴클레오캡시드 항원단백질은 SARS NA, SARS NB 또는 SARS N일수 있다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스의 스파이크 항원단백질 또는 뉴클레오캡시드 항원단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 적용될 수 있는 미생물은, 생체 적용시 독성이 없거나, 약독화된(attenuated) 미생물이라면 어느 것이라도 가능하다. 바람직하게는, 그람음성균으로 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라 등을, 그람양성균으로 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스 등을 적절히 선택할 수 있다. 유산균과 같이 식용이 가능한 미생물을 선택하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 항원단백질이 표면에 발현된 미생물 자체를 이용하거나, 상기 미생물을 파괴하고 세포막 성분을 조추출한 물질을 이용하거나, 상기 미생물로부터 정제한 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 SARS 예방용 백신을 제공한다.
본 발명에 의한 백신은 사스 코로나바이러스에 의해 유발되는 중증 급성호흡기 증후군의 예방용 의약품으로 이용될 수 있다.
본 발명에 의한 백신은, 경구용 또는 식용으로 섭취할 수도 있고, 피하 또는 복강에 주사할 수도 있고, 비강 투여를 할 수 있다.
사스 코로나바이러스의 감염은 현재까지 감염성 비말에 의한 호흡기 감염을 통해 이루어지는 것으로 알려져 있어 호흡기 점막 조직 표면(mucosal surface)에서 일어나는 것으로 추정되므로 점막면역에 의한 감염의 방어는 매우 중요하다. 사스코로나바이러스의 항원을 표면에 발현하는 미생물은 점막에서의 항체형성(mucosal response)을 더 효과적으로 유도할 수 있는 장점을 가지고 있어, 상기의 형질전환된 미생물 자체를 이용한 경구용 백신 혹은 비강 투여 백신이 비경구용 (parenteral) 백신 보다 사스 코로나바이러스의 방어에 더 효과적일 것으로 기대된다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질내 항원성 부위 유전자 및 뉴클레오캡시드 단백질내 항원성 부위의 유전자를 적용하였으나, 어떠한 항원단백질 유전자를, 단독으로 또는 둘 이상을 복합적으로 이용할 수도 있을 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar. chungkookjang, KCTC 0697BP)으로부터 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsBCA를 획득하여 이용하였으나, 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 모든 바실러스 속 균주로부터 pgsBCA를 획득하여 제조된 벡터 또는 이 벡터를 이용한 형질전환된 미생물 등도 본 발명의 범위에 포함된다 하겠다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스 청국장에 존재하는 pgsBCA 유전자의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 타균주 유래의 pgsBCA 유전자를 사용하여 백신용 벡터를 제조하거나, 이를 이용하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 유전자 pgsBCA 중에서 pgsA만을 활용하여 표면 발현용 벡터를 제작하였으나, 간접실시예로부터 유추해 볼 수 있듯이, 유전자 pgsBCA의 전부 또는 일부만을 사용하여 백신용 벡터를 제작하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
또한, 하기 실시예에서는, 상기 벡터에 대한 숙주로서, 그람음성 세균인 살모넬라 타이피와 그람양성세균인 락토바실러스만을 사용하였으나, 이 세균 이외에 여하한 그람음성균 또는 그람양성균도 본 발명에 의한 방법으로 형질전환시키면 동일한 결과를 얻을 수 있다는 사실도 당업자에게는 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는, 백신용 벡터로 형질전환된 미생물 자체를 생백신으로 생체에 적용한 예만이 제시되어 있다. 그러나, 백신관련 기술분야의 지식으로 보아, 상기 미생물로부터 조추출된 발현단백질(사스 코로나바이러스의 항원단백질) 또는 정제된 발현단백질을 생체에 적용하더라도 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음은 당연할 것이다.
실시예 1: 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질내 항원성 부위 유전자 합성
사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 1256 아미노산으로 구성된 당단백질이다. 많은 연구가 이루어져 있는 다른 코로나바이러스의 경우 스파이크 단백질 대부분이 바이러스 입자 표면을 싸고 있는 외피(envelope) 단백질에 삽입되어 외부에 노출된 구조를 이루고 있고 이러한 노출 부위 및 항원성 부위가 바이러스 감염을 유도하고, 감염을 막기 위한 백신의 목적 항원으로 그 연구가 많이 이루어져 있다.
따라서, 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질 1256 아미노산중 항원성을 나타낼 수 있는 부위를 선정하기 위하여 항원성에 대한 많은 연구가 이루어진 다른 돼지 전염성 위장염 코로나바이러스(Transmissible Gastroenteritis, TGE Coronavirus)의 스파이크 단백질과의 단백질 비교 분석 및 구조적 비교 분석을 통하여 항원성 부위를 선정하고, 이를 합성하였다. 구체적으로 돼지 전염성 위장염 바이러스의 스파이크 단백질의 항원성 부위는 네 부위(A, B, C, D)로 잘 알려져 있다 (Enjuanes, L., Virology, 183:225, 1991). 이들 부위와 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질과의 관계를 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 방법인 친수성 플롯(hydrophilicity plot), 제임슨-울프(Jameson-wolf) 방법인 항원 인덱스 (Antigenic index) 그리고 에미니(Emini) 방법인 표면 확률 플롯(surface probability plot)을 통해 분석한 후, 사스 코로나바이러스 Tor2 분리물(isolate)의 스파이크 단백질 염기서열 중 SARS SA, SARS SB, SARS SC 및 SARS SD를 선정하였다(도 1).
우선 전체 염기서열이 분석된 사스 코로나바이러스 Tor2 분리물의 스파이크 단백질의 염기서열(21492 - 25259 염기, 1255 아미노산)을 기초로 하여 항원성 부위라 예상되는 2~114의 아미노산 부위를 선택하여 SARS SA라 명명하였고, 375~470의 아미노산 부위를 선택하여 SARS SB라 명명하였고, 510~596의 아미노산 부위를선택하여 SARS SC라 명명하였으며, 1117~1197의 아미노산 부위를 선택하여 SARS SD라 명명하였다. 이들 항원성 부위들 중 SARS SA와 SARS SC 부위의 유전자를 합성하였다.
먼저 SARS SA라 명명한 113길이의 아미노산에 해당되는 유전자를 합성하기 위하여, 서열 1 내지 8의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, 증폭된 339bp의 SARS SA 유전자를 수득하였다.
서열 1: 5'-ggatcctttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccg-3'
서열 2: 5'-tgagtgtaattaggagcttgaacatcatcaaaagtggtacaacggtcaaggtc- 3'
서열 3: 5'-aattacactcaacatacttcatctatgcgtggggtttactatcctgatgaaatttttc- 3'
서열 4: 5' - aaaatggaagaaataaatcctgagttaaataaagagtgtctgaacgaaaaattt-3'
서열 5: 5'-cttccattttattctaatgttactgggtttcatactattaatcatacgtttggcaac-3'
서열 6: 5'-ggcagcaaaataaataccatccttaaaaggaatgacagggttgccaaacgtatg-5'
서열 7: 5'-atttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttgg-3'
서열 8: 5'-ggtaccaagcttattacacagactgtgacttgttgttcatggtagaaccaaaaaccc-3'
SARS SC라 명명한 87 길이의 아미노산에 해당되는 유전자를 합성하기 위하여, 서열 9 내지 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, 증폭된 261bp의 SARS SC 유전자를 수득하였다.
서열 9: 5'-ggatccgtttgtggtccaaaattatctactgaccttattaagaaccagtgtgtcaat-3'
서열 10: 5'-gaagaaggagttaacacaccagtaccagtgagaccattaaaattaaaattgacacact-3'
서열 11: 5'-aactccttcttcaaagcgttttcaaccatttcaacaatttggccgtgatgtttctga-3'
서열 12: 5'-ctaaaatttcagatgttttaggatcacgaacagaatcagtgaaatcagaaacat-3'
서열 13: 5'-ctgaaattttagacatttcaccttgtgcttttgggggtgtaagtgtaattaca-3'
서열 14: 5'-ggtaccaagcttattaaacagcaacttcagatgaagcatttgtaccaggtgtaattac-3'
합성에 의한 항원부위 유전자의 확보 이외에 Canada's Michael Smith Genome Science Center로부터 구입한 SARS spike cDNA clone (SARS coronavirus TOR2)을 template로 하여 264~596의 아미노산 부위를 coding하는 유전자를 서열 15 및 16의 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭시켜 996bp 크기의 유전자를 확보하고, 이를 SARS SBC으로 명명을 하였다[이는 중화항체를 생성할 수 있는 주요 부위를 함유하고 있다 (PNAS, 101:2536, 2004)].
서열 15(SBC sense): 5'-cgcggatccctcaagtatgatgaaaat-3'
서열 16(SBC anti-sense): 5'-cggggtaccttaaacagcaacttcaga-3'
실시예 2: 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질내 항원성 부위 유전자 합성
사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질은 422 아미노산으로 구성된 단백질이다. 많은 연구가 이루어져 있는 다른 코로나바이러스의 경우 뉴클레오캡시드 단백질 대부분이 항원으로 작용된다는 보고가 있고, 이 부위를 코로나바이러스의 감염을 막기 위한 백신의 목적 항원으로 이용하려는 연구가 많이 이루어져 있다.
사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 아미노산 중 항원성을 나타낼 수 있는 부위를 돼지 전염성 위장염 코로나바이러스(Transmissible Gastroenteritis, TGE Coronavirus)의 뉴클레오캡시드 단백질과의 비교분석을 통해 항원성 부위를 선정하여 합성하였다.
구체적으로, 돼지 전염성 위장염 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과의 관계를 카이트-둘리틀 방법인 친수성 플롯, 제임슨-울프 방법인 항원 인덱스 그리고 에미니 방법인 표면 확률 플롯을 통해 분석한 후, 사스 코로나바이러스 Tor2 분리물의 뉴클레오캡시드 단백질 염기서열 중 SARS NA 및 SARS NB를 선정하였다(도 2).
우선 전체 염기서열이 분석된 사스 코로나바이러스 Tor2 분리물의 뉴클레오캡시드 단백질의 염기서열(28120 - 29388 염기, 422 아미노산)을 기초로 하여 항원성 부위라 예상되는 2~157의 아미노산 부위를 선택하여 SARS NA라 명명하였고, 163~305의 아미노산 부위를 선택하여SARS NB라 명명하였으며, 본 발명에서는 SARS NB 부위의 유전자를 합성하였다.
SARS NB라 명명한 143 길이의 아미노산에 해당되는 유전자를 합성하기 위하여, 서열 17 내지 26의 염기서열을 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, 증폭된 429bp의 SARS NB 유전자를 수득하였다.
서열 17: 5'-ggatcccctcaaggtacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggtagccgtgg-3'
서열 18: 5'-accacgactacgtgatgaagaacgagaagaggcttgactgccgccacggctacc-3'
서열 19: 5'-cacgtagtcgtggtaattcacgtaattcaactcctggcagcagtcgtggtaat-3'
서열 20: 5'-gcgagggcagtttcaccaccaccgctagccatacgagcaggagaattaccacga-3'
서열 21: 5'-gaaactgccctcgcacttttgctgcttgaccgtttgaaccagcttgagagcaa-3'
서열 22: 5'-tagtgacagtttgaccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaa-3'
서열 23: 5'-caaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgtcaaaaacgt-3'
서열 24: 5'-ggaccacgacgcccaaatgcttgagtgacgttgtactgttttgtggcagtacgtttttg-3'
서열 25: 5'-gggcgtcgtggtccagaacaaacccaaggtaatttcggggaccaagaccttatccgt-3'
서열 26: 5'-ggtaccaagcttattaaatttgcggccaatgtttgtaatcagtaccttgacggataagg-3'
또한, 합성에 의한 항원부위 유전자의 확보이외에 Canada's Michael Smith Genome Science Center로부터 구입한 SARS nucleocapsid cDNA clone (SARS coronavirus TOR2)을 template로 하여 nucleocapsid의 2~305의 아미노산 부위를 coding하는 유전자를 서열 27 및 28의 primer를 이용하여 PCR로 증폭시켜 912bp 크기의 유전자를 확보하고, 이를 SARS N으로 명명을 하였다.
서열 27(N sense): 5'-cgcggatcctctgataatggtccgcaa-3'
서열 28(N anti-sense): 5'-cggggtaccttaaatttgcggccaatgttt-3'
실시예 3: 표면발현용 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA 및 pHCE2LB:pgsA-SARS SC의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질내 항원성 부위 SARS SA 및 SC를 표면발현할 수 있는 표면발현벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA와 pHCE2LB:pgsA-SARS SC를 제작하였다.
우선, 인간 파필로마바이러스의 L1 항원을 그람음성 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면발현용 벡터(그람음성 및 그람양성 범용 벡터인 pAT에 항시적 고발현 프로모터인 HCE 프로모터, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA 그리고 HPV L1을 포함하는 전환벡터)에 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질내 항원성 부위 SARS SA 및 SARS SC를 도입하기 위하여 pHCE2LB:pgsA-HPVL1(KCTC 10349BP)을BamHI과KpnI으로 절단하여 HPVL1 유전자를 제거하여 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA를 준비하였다.
상기 실시예 1에서 합성된 SARS SA 및 SARS SC 항원 유전자를 제한효소BamHI과KpnI으로 각각 절단하여 미리 준비된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 각각 연결하여 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA와 pHCE2LB:pgsA-SARS SC를 각각 제작하였다(도 3A 및 3B). 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA와 pHCE2LB:pgsA-SARS SC를 이용하여 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의 pHCE2LB:pgsA-SARS SA와 pHCE2LB:pgsA-SARS SC 플라스미드의 존재를 각각 확인하였다.
실시예 4: 표면발현용 전환 벡터 pHCE2LB:pgsA:SARS SBC의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 사스 코로나바이러스의 스파이크 단백질내 항원성 부위SARS SBC를 표면발현할 수 있는 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC를 제작하였다.
우선, 상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 pHCE2LB:pgsA 표면발현용 벡터를 준비한 후, 상기 실시예 1에서 언급한 사스 코로나바이러스의 SARS spike cDNA clone을 template로 하여 264~596의 아미노산 부위를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭시킨 996bp 크기의 SARS SBC 유전자를 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA에 삽입하여, pHCE2LB:pgsA-SARS SBC를 제작하였다(도 3C). 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC를 이용하여 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC 플라스미드의 존재를 확인하였다.
실시예 5: 표면발현용 전환 벡터 pHCE2LB:pgsA:SARS NB의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질내 항원성 부위 SARS NB를 표면발현할 수 있는 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS NB를 제작하였다.
우선, 상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 pHCE2LB:pgsA 표면발현용 벡터를 준비한 후, 상기 실시예 2에서 합성된 SARS NB 항원 유전자를 제한효소BamHI과KpnI으로 절단하여 준비된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하여 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS NB를 제작하였다(도 4A). 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS NB를 이용하여 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의pHCE2LB:pgsA-SARS NB 플라스미드의 존재를 확인하였다.
실시예 6: 표면발현용 전환 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS N의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질내 항원성 부위 SARS N을 표면발현할 수 있는 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS N을 제작하였다.
우선, 상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 pHCE2LB:pgsA 표면발현용 벡터를 준비한 후, 상기 실시예 2에서 언급한 사스 코로나바이러스의 SARS nucleocapsid cDNA clone을 template로 하여 2~305의 아미노산 부위를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭시킨 912bp 크기의 유전자 SARS N을 표면발현 벡터 pHCE2LB:pgsA에 삽입하여 pHCE2LB:pgsA-SARS N을 제작하였다(도 4B). 제작된 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS N을 이용하여 그람양성 세균인 락토바실러스에 형질전환시킨 후, 락토바실러스내의 pHCE2LB:pgsA-SARS N 플라스미드의 존재를 확인하였다.
실시예 7: 사스바이러스 spike 항원단백질의 유산균 표면발현 확인
상기 표면 발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC 및 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC로 각각 락토바실러스를 형질전환 시킨 후, 각각의 항원단백질 발현을 조사하였다.
폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 pgsA의 C-말단과 각각 융합된 사스바이러스의 스파이크 항원내 항원성 부위의 발현은 pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC 및 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC로 각각 형질전환된 락토바실러스 카제이를 MRS배지(Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 37℃에서 정체 배양, 증식시킴으로 표면발현을 유도하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA에 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴 면역블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 상기 각각의 스파이크 항원 발현을 확인하였다. 구체적으로 발현이 유도된 락토바실러스 카제이 전세포를 동일한 세포농도에서 얻은 단백질로 디네이쳐(denature)시켜 시료를 준비하고, 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을PVDF (polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad) 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액(50 mM 트리스 염산, 5 % 스킴 밀크(skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음, pgsA에 대한 토끼 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에1000배 희석하여 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 바이오틴이 접합된 토끼에 대한 2차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 아비딘-바이오틴(avidin-biotin)시약을 1시간 동안 반응시켜 다시 세척하였다. 세척된 멤브레인에 기질과 발색시약으로 H202와 DAB 용액을 첨가하여 발색시키고 pgsA에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다(도 5). 도 5A에서, 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이이고, 레인 2, 3 및 4는 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS SA/락토바실러스 카제이이다. 도 5B에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이이고, 레인 2, 3, 4, 5 및 6은 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS SC/락토바실러스 카제이이다. 도 5C에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이이고 , 레인 2는 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC/락토바실러스 카제이이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 각각의 유산균 whole cell에서 특이 융합 단백질[약 54kDa의 pgsA-SARS SA (도 5A), 약 51kDa의 pgsA-SARS SC (도 5B) 및 약 78kDa의 pgsA-SARS SBC (도 5C)]을 확인할 수 있었다.
또한, pHCE2LB:pgsA-SARS SA와 pHCE2LB:pgsA-SARS:SBC 표면발현벡터로 형질전환된 유산균에서 pgsA에 의해 각각의 항원 단백질이 유산균의 표면에 발현되었는지를 확인하기 위하여, 각각의 벡터로 형질전환된 유산균을 ultracentrifuge을 이용한 cell fractionation 방법으로 cell wall과 cytoplasm으로 분획한 후, 각각의 융합단백질의 위치를 pgsA에 대한 specific 항체를 이용한 웨스턴 블랏(westernblot)을 통하여 확인하였다.
구체적으로 상기의 방법으로 융합단백질의 표면발현이 유도된 락토바실러스를 형질전환되지 않은 락토바실러스와 동일한 세포농도가 되도록 수확하고, 세포를 TES 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 25% sucrose)으로 여러 번 세척한 다음, 5 ㎎/㎖ lysozyme, 1 mM PMSF 그리고 1 mM EDTA가 포함이 된 증류수로 부유시키고, -60℃와 상온을 여러 번 이동하여 얼림과 녹임을 수회 반복한 후, DNase (0.5 mg/㎖)와 RNase (0.5 mg/㎖)를 첨가하고 sonication하여 세포를 파괴하였다. 이어서 파쇄액을 4℃, 20분 동안의 10,000 X g 원심분리하여 파괴되지 않은 whole 락토바실러스(pellet; whole cell 분획)와 cellular debris(상등액)를 분리하고, 분리된 cellular debris를 4℃, 1시간 동안의21,000 X g 원심분리하여 락토바실러스의 cytoplasm 단백질을 포함하는 상등액(soluble 분획)과 pellet을 얻었다. 상기 수득된 펠렛(pellet)을 1% SDS를 포함하는 TE용액(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, pH 7.4)에 부유시켜락토바실러스의 cell wall 단백질(cell wall 분획)을 얻었다.
각각의 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 각각의 락토바실러스 분획 중 pgsA와 융합된 사스바이러스의 스파이크 항원이 cell wall에 위치함을 확인하였다(도 6). 도 6A에서 레인 1은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이이고, 레인 2는 형질전환된pHCE2LB:pgsA-SARS SA/락토바실러스 카제이의 whole cell이며, 레인 3 및 4은 각각 pHCE2LB:pgsA-SARS SA로 형질전환된 균주의 soluble 분획 및 cell wall 분획이다. 도 6B에서 레인 1은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이이고, 레인 2는 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC/락토바실러스 카제이의 whole cell이며, 레인 3 및 4은 각각 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC로 형질전환된 균주의 soluble 분획 및 cell wall 분획이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 유산균 whole cell과 cell wall 분획에서 약 54 Kda의 pgsA와 융합된 SARS SA 단백질, 약 78 Kda의 pgsA와 융합된 SARS SBC 단백질을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터, pgsA와 융합된 각각의 사스 항원단백질들이 발현되어 pgsA에 의해 유산균의 표면으로 이동하여 위치한다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 사스바이러스의 스파이크 항원의 항원기의 발현이 폴리감마글루탐산 합성 단백질 pgsA의 C-말단과의 융합에 의해 락토바실러스의 표면에 발현됨을 형광-활성 세포선별 측정방법(Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)으로 확인하였다.
면역형광(immunofluorescence) 염색을 위하여 발현을 유도시킨 락토바실러스을 동일한 세포농도가 되도록 수확하고 세포를 완충용액(PBS buffer, pH 7.4)으로 여러 번 세척한 다음, 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 완충용액 1 ㎖에 부유시키고 사스바이러스의 스파이크 항원에 대한 마우스 유래의 폴리클론 1차 항체를 1000배 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포들은 완충용액으로 여러 번 세척하고, 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 완충용액 1 ㎖ 에 부유시킨 다음, 바이오틴이 결합되어 있는 2차 항체를 1000배 희석하여 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 다시 반응이 끝난 세포는 완충용액으로 여러 번 세척하고, 1 % 소혈청 알부민이 들어있는 완충용액 0.1 ㎖ 에 부유시킨 다음, 바이오틴에 특이적인 스트렙토아비딘-R-피코에리트린(streptavidin-R-phycoerythrin) 염색시약을 1000배 희석하여 결합시켰다.
반응이 끝난 락토바실러스을 여러 번 세척하고, 형광-활성 세포선별 측정방법으로 측정한 결과, 형질전환되지 않은 락토바실러스와 비교되는 사스바이러스의 SBC 스파이크 항원 단백질이 락토바실러스의 표면에 발현된 것을 확인하였다(도 6C). 도 6C에서 회색은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이에서 유래된 것이고, 흰색은 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS SBC/락토바실러스 카제이의에서 유래된 것이다. 도 6C에 나타난 바와 같이, 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이의에서는 형광발현이 검출되지 않았으나, pHCE2LB:pgsA-SARS SBC 벡터에 의해 형질전환이 된 유산균에서는 SBC 스파이크 항원 단백질이 표면발현된 것을 명확히 확인할 수 있었다.
실시예 8: 사스바이러스 nucleocapsid 항원단백질의 유산균 표면발현 확인
상기 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS NB과 pHCE2LB:pgsA-SARS N으로 각각 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 각각의 항원단백질 발현을 조사하였다.
폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 pgsA의 C-말단과 각각 융합된 사스바이러스의 뉴클레오캡시드 항원의 발현은 pHCE2LB:pgsA-SARS NB 및 pHCE2LB:pgsA-SARS N으로 각각 형질전환된 락토바실러스 카제이를 MRS배지, 37℃에서 정체 배양,증식시킴으로 표면발현을 유도하였다.
pHCE2LB:pgsA-SARS NB와 pHCE2LB:pgsA-SARS N 표면발현 벡터로 형질전환된 유산균에서 pgsA에 의해 각각의 항원 단백질이 유산균의 표면에 발현되었는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 7에서와 동일한 방법인 각각의 벡터로 형질전환된 유산균을 ultracentrifuge을 이용한 cell fractionation 방법으로 cell wall과 cytoplasm으로 분획한 후, 각각의 융합단백질의 위치를 pgsA에 대한 specific 항체를 가지고 western blot을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 각각의 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 각각의 락토바실러스 분획 중 pgsA와 융합된 사스바이러스의 뉴클레오 항원이 cell wall에 위치한다는 것을 확인하였다(도 7). 도 7A에서 레인 1은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이이고, 레인 2는 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS NB/락토바실러스 카제이의 whole cell이며, 레인 3 및 4은 각각 pHCE2LB:pgsA-SARS NB로 형질전환된 균주의 soluble 분획 및 cell wall 분획이다. 도 7B에서 레인 1은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이이고, 레인 2는 형질전환된 pHCE2LB:pgsA-SARS N/락토바실러스 카제이의 whole cell이며, 레인 3 및 4은 각각 pHCE2LB:pgsA-SARS N으로 형질전환된 균주의 soluble 분획 및 cell wall 분획이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 유산균 whole cell과 cell wall 분획에서 약 57kDa의 pgsA와 융합된 SARS NB 단백질 및 약 75kDa의 pgsA와 융합된 SARS N 단백질을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터, pgsA와 융합된 각각의 사스 항원단백질들이 발현되어 pgsA에 의해 유산균의 표면으로 이동하여 위치한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 사스 바이러스의 spike 항원단백질 및 nucleocapsid 항원단백질이 표면발현된 유산균의 백신효과 분석
상기의 실시예에서 제작된 표면발현용 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA , pHCE2LB:pgsA-SARS SC 및 pHCE2LB:pgsA-SARS NB로 그람양성균인 락토바실러스 카제이를 형질전환시키고 실시예7에서와 같은 방법으로 상기 항원을 락토바실러스 카제이에서 표면발현을 유도한 후, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 사스바이러스의 spike 항원단백질 및 nucleocapsid 항원단백질의 항원성을 마우스 모델을 이용하여 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 표면발현 전환벡터 pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC 및pHCE2LB:pgsA-SARS NB을 락토바실러스 카제이에 형질전환시켜 각각의 동일한 세균농도가 되도록 수확한 세포를 완충용액(PBS buffer, pH7.4)으로 여러 번 세척을 하고, 항원이 표면발현된 락토바실러스 5 X 109균을 4-6주령의 BALB/c 마우스의 구강으로 1일 간격으로 세번 그리고 1주뒤 다시1일 간격으로 세번 그리고 2주 뒤에 역시 1일 간격으로 세번 투여한 후, 다시 4주 후에 1일 간격으로 세번 투여하였다. 또한 항원이 표면발현된 락토바실러스 1 X 109균을 마우스의 비강으로 1일 간격으로 세번 그리고 1주뒤 다시 1일 간격으로 세번 그리고 2주 뒤에는 2일 간격으로 두번 투여한 후, 다시 4주 뒤에 2일 간격으로 두번 투여하였다. 각각의 경구와 비강투여 후 2주 간격으로 각각의 ① 마우스군 혈청을 취하여 혈청내 spike 항원단백질 및 nucleocapsid 항원단백질에 대한 IgG 항체가 및 ② 마우스의 내장부위를 취하여 장의 내부를 씻은부유액내 및 기관지와 폐포의 내부를 씻은 부유액내에서의 spike 항원단백질 및 nucleocapsid 항원단백질에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 항원에 대한 항체가를 측정하였다.
4-6 주령의 BALB/c 마우스 10마리를 하나의 군으로 정하였고, SARS SA 및 SARS SC를 각각 발현하는 유산균을 혼합하여 한 군으로 하고, SARS NB를 발현하는 유산균을 한 군으로 하였으며, SARS SA, SARS SC 그리고 SARS NB를 각각 발현하는 유산균을 혼합하여 한 군으로 하였다. 이러한 세군을 다시 경구투여군과 비강투여군으로 분리하여 대조군을 포함하여 총 8군으로 실험을 수행하였다.
도 8은 마우스 혈청내 사스바이러스의 Spike 항원단백질인 SA 및 SC 항원에 대한 IgG 항체가를 나타낸 것이다. 도 9는 장의 내부를 씻은 부유액 및 기관지와 폐포의 내부를 씻은 부유액내에서의 spike 항원단백질인 SA 및 SC 항원에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 나타낸 것으로, A는 경구투여군에서의 IgA 항체가를 나타내고, B는 비강투여군에서의 IgA 항체가를 나타낸다.
또한, 도 10은 마우스 혈청내 사스바이러스의 nucleocapsid 항원단백질인 NB항원에 대한 IgG 항체가를 나타탠 것이다. 도 11은 장의 내부를 씻은 부유액 및 기관지와 폐포의 내부를 씻은 부유액내에서의 nucleocapsid 항원단백질인 NB 항원에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 나타낸 것으로, A는 경구투여군에서의 IgA 항체가를 나타내고, B는 비강투여군에서의 IgA 항체가를 나타낸다.
도 8 내지 11에 나타난 바와 같이, pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC 및 pHCE2LB:pgsA-SARS NB로 형질전환시킨 락토바실러스를 각각 혹은 혼합하여 투여한 BALB/c 마우스군의 혈청, 내장세척액 및 기관지 폐 세척액에서 사스바이러스의 spike 및 nucleocapsid 항원단백질의 항원기에 대한 IgG 항체가 및 IgA 항체가가 대조군에 비해 상당히 높게 나타난다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 의한 사스바이러스의 spike 및 nucleocapsid 항원단백질의 항원기가 표면발현된 미생물은 생백신으로서 효과적으로 작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에 따른 사스 유발 코로나바이러스의 항원단백질을표면 발현하는 형질전환 미생물 및 상기 미생물로부터 추출정제된 항원단백질은 사스의 치료용 또는 예방용 백신으로 활용할 수 있다. 특히, 본 발명의 사스 코로나바이러스 항원을 발현하는 재조합 균주는 경구 백신을 경제적으로 생산할 수 있는 장점을 가진다.
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<223> PCR primer(N anti-sense)
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Claims (19)
- 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 또는 둘 이상과, 사스 코로나바이러스의 스파이크(spike) 항원단백질 또는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 항원단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터.
- 제1항에 있어서, 스파이크 항원단백질은 SARS SA, SARS SB, SARS SC, SARS SD 또는 SARS SBC인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제1항에 있어서, 뉴클레오캡시드 항원단백질은 SARS NA, SARS NB 또는 SARS N인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제2항에 있어서, pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC 또는pHCE2LB:pgsA-SARS SBC인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제3항에 있어서, pHCE2LB:pgsA-SARS NB 또는 pHCE2LB:pgsA-SARS N인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제6항의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 사스 코로나바이러스의 스파이크 항원단백질 또는 뉴클레오캡시드 항원단백질의 제조방법.
- 제8항의 방법에 의해 수득된 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 SARS 바이러스 예방용 백신.
- 제9항에 있어서, 상기 항원단백질은 미생물표면에 발현된 형태이거나, 조추출된 형태 또는 정제된 형태인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제9항에 있어서, 경구용 투여 또는 식용 섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 백신.
- 제9항에 있어서, 피하 또는 복강 주사용인 것을 특징으로 백신.
- 제9항에 있어서, 비강 투여용인 것을 특징으로 백신.
- 제8항에 있어서, 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항의 방법에 의해 제조되고, 사스 코로나바이러스의 스파이크 항원단백질 또는 뉴클레오캡시드 항원단백질이 표면에 발현된 유산균.
- 제15항의 유산균, 상기 유산균으로부터 추출된 항원단백질 또는 상기 유산균으로부터 정제된 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 사스 예방용 백신.
- 제16항에 있어서, 경구용 투여 또는 식용 섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 백신.
- 제16항에 있어서, 피하 또는 복강 주사용인 것을 특징으로 백신.
- 제16항에 있어서, 비강 투여용인 것을 특징으로 백신.
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