KR100782332B1 - 새우 흰 반점 바이러스 항원의 표면 발현벡터 및 이에 의해형질전환된 미생물 - Google Patents

새우 흰 반점 바이러스 항원의 표면 발현벡터 및 이에 의해형질전환된 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새우 흰 반점 바이러스 항원의 표면 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 상기 새우 흰 반점 바이러스 항원이 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 항원을 유효성분으로 함유하는 새우 흰 반점 바이러스성 질병 치료 또는 예방용 백신 및 사료 첨가제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 새우 흰 반점 바이러스 항원이 표면발현된 박테리아 및 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원은 백신, 사료 첨가제 등으로 사용되어, 새우 흰 반점 바이러스로 인해 유발된 질병을 치료 및 예방할 수 있으므로, 상기 바이러스로 인한 갑각류의 집단폐사를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 양식업 및 어업의 이익 증대에 기여할 수 있다.
흰 반점 바이러스, 항원, 표면발현, 백신, 사료 첨가제

Description

새우 흰 반점 바이러스 항원의 표면 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물{Cell Surface Expression Vector for WSSV Antigen and Microorganism Transformed by the Same}
도 1은 새우 흰 반점 바이러스의 항원인 VP26 및 VP28의 표면 발현벡터 pBT:pgsA-VP26 (A) 및 pBT:pgsA-VP28 (B)의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 pBT:pgsA-VP26 및 pBT:pgsA-VP28 형질전환체에서 VP26 (A) 및 VP28 (B)의 발현을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다 (lane 1: 형질전환되지 않은 락토바실러스 카세이; lane 2: pBT:pgsA-VP26/락토바실러스 카세이; lane 3: pBT:pgsA-VP28/락토바실러스 카세이).
도 3은 새우 흰 반점 바이러스로 근육감염 (A) 및 침지감염 (B) 시킨 실험군 및 대조군 새우의 치사율을 시일에 따라 관찰한 것이다.
도 4는 침지감염 후 치사된 새우로 PCR을 수행하여 바이러스의 감염 여부를 관찰한 것이다 ([1]~[6]은 치사된 새우의 번호; lane 1: VP26; lane 2: VP28).
발명의 분야
본 발명은 새우 흰 반점 바이러스 항원의 표면 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 상기 새우 흰 반점 바이러스 항원이 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 항원을 유효성분으로 함유하는 새우 흰 반점 바이러스성 질병 치료 또는 예방용 백신 및 사료 첨가제에 관한 것이다.
발명의 배경
새우 흰 반점 바이러스 (WSSV, White Spot Syndrome Virus)는 전 세계적으로 새우 양식에 심각한 폐사를 일으키는 질병의 원인균으로서 현재까지 알려진 새우의 질병 중 가장 치명적인 것으로 알려져 왔다. 새우 흰 반점 바이러스는 림프기관, 조혈기 조직, 아가미, 장, 위, 중앙신경조직, 피하조직 및 촉각선을 포함하는 중배엽 및 외배엽의 다양한 조직으로 감염되어, 각 감염조직에 심각한 피해를 주어 대량폐사를 유발한다. 새우 흰 반점 바이러스는 수직감염 (모체로부터 자손에게 직접 이행되는 감염)되며, 감염된 개체군이나 양식장 주변의 게나 속 등의 갑각류에게 수평감염 (불특정 다수의 개체에게 전파되는 일반적인 감염)되는 것으로 알려져 있다.
1992년 8월 중국의 푸안 지방의 보리새우 양식장에서 최초로 보고된 이래 1993년 일본, 대만, 중국 등지에서 다발적으로 발견되었다. 현재는 일본, 중국을 비롯하여 필리핀, 태국, 인도네시아 및 인도에 이르기까지 동남아시아 거의 전역에 확산되고 있다. 한국에서는 1993년 충남과 전북의 새우 양식장에서 처음 발견된 이후 피해지역이 확산되었고, 1996년에는 폐사율이 75%에 이를 정도로 피해가 급증하였다. 동아시아에서 처음으로 발견된 이래 동남아시아, 미국 및 중남미의 새우 양식장으로 빠르게 확산되는 것으로 보고되었다.
새우 흰 반점 바이러스의 게놈은 약 292,697bp의 길이를 가진 환형의 이중 나선 DNA (double-strand DNA)로 이루어져 있으며, 길이는 약 275nm, 폭은 120nm 이다. 비리온 (Virion)은 rod형으로 3겹의 외피 (envolop)에 단단히 둘러쌓여 있고, 말단에는 꼬리와 같은 부착물을 가지고 있다. 새우 흰 반점 바이러스는 15~28kDa의 크기를 가지는 5개의 주요한 단백질을 가지고 있는데, 외피 (envelop)에는 VP28 및 VP19가 존재하고, 비리온 (virion)에는 VP26, VP24, VP15 세 개의 주요한 단백질이 존재하며, 이것은 바이러스 입자 표면에 위치하여, 새우 흰 반점 바이러스 (WSSV)의 감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다.
바이러스 감염의 진단에는 조직 병리학적 검사, 전자 현미경, 면역반응법, 형광항체법 (FAT), ELISA법, 유전자 탐침법 (gene probe), 유전자 증폭법 (polymerase chain reaction: PCR) 등이 사용되는데, 새우 흰 반점 바이러스 (WSSV)는 전체 게놈이 모두 해독되어 있어 (van Hulten MC. et al., Virol .,2001) PCR에 의해 쉽고 빠르게 감염 여부를 확인할 수 있다.
새우 흰 반점 증후군의 발병은 주로 수온이 20℃이상에서 발생하며, 치하기에서 성하기까지 연중 발생한다. WSSV를 보균하고 있는 모하로부터 수직 감염되며, 또한 감염된 개체군이나 양식장 주변의 게나 속 등 갑각류에서 수평 감염되는 것으로 알려져 있다. 새우에 감염되면, 흰색의 반점들이 갑각의 내면을 따라 몸 전체로 확산되며, 갑각과 근육의 결합이 느슨해져 쉽게 분리된다. 발병이 진행되면, 육안으로도 흰 반점의 확인이 가능하며, 혈림프는 불투명하고, 발병 중기의 간췌장은 괴사상태를 보인다. 또한 세포 핵 및 림프기관은 정상보다 특히 비대하게 변하는 증상을 보이고, 감염 후 3일 내지 10일이 경과하면 거의 100%가 폐사하게 된다. 그러므로 새우 흰 반점 바이러스의 급증은 새우 양식업에 막대한 손해를 일으키고 있는 실정이며, 새우 흰 반점 바이러스의 감염의 예방 및 치료할 수 있는 백신 등에 대한 필요성이 점점 증대되고 있지만 뚜렷한 대책이 없는 실정이다. 국내에서도 베타 글루칸 제제를 사료에 첨가하여 면역능력을 향상시키는 방법, 염소소독제로 새우의 입식전에 호지를 소독하여 바이러스를 소멸시키는 방법, 어류 및 대하의 복합 양식 등이 이용되었지만 뚜렷한 효과를 보지 못하고 있다.
새우 흰 반점 바이러스 (WSSV)의 경우에는 아직 숙주 세포가 정확히 밝혀지지 않았고, 계대 배양이 어려워 생균이나 약독화 혹은 불활성화된 바이러스를 항원으로 이용한다는 것이 현실적으로 불가능한 상황이다. 새우의 면역체계는 척추동물과는 틀려서 백신의 개발에 어려움이 있다. 새우의 면역체계에 관한 문헌이나 정보를 입수하는 것도 어려움중의 하나이다. 새우류 등의 무척추 동물은 항체를 이용한 특이적 면역 기능이 존재하지 않는 것으로 알려져 있으나, 비브리오 페네우스의 불 활성화 균체를 이용한 새우 혈구 세포의 번식 활성 촉진 작용에 의한 감염 방제 효과가 보고 되어있다 (일본 특개평 3-204820). 또한 WSSV의 외피 (envolope) 단백질인 VP28의 면역성 실험 (challenge test) 결과 새우의 생존률이 증가함이 보고되었고, 이것은 특정한 면역 반응이 새우에서 유도될 수 있는 가능성을 제시한 결과이다 (Jeroen Witteveldt et al ., J. Vriol., 2004). 그러나 아직 이러한 바이러스 감염증에 대해 유효한 약제가 개발되고 있지 않아 효과적인 방제 대책이 없는 상태이다.
미생물의 세포표면에 원하는 단백질을 부착하여 발현시키는 기술을 세포표면발현 (cell surface display)기술이라 한다. 이 세포표면 발현기술은 박테리아나 효모 등 미생물의 표면 단백질을 표면발현 모체 (surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 표면에 발현시키는 기술로서 어떤 단백질을 세포 표면에 발현시키는가에 따라 그 응용범위가 결정되어지며, 따라서 세포표면 발현기술을 이용한 산업적 응용 잠재력은 상당하다고 할 수 있다.
성공적인 세포표면 발현기술을 위해서는 표면발현 모체가 가장 중요하다. 얼마나 효과적으로 외래단백질을 세포표면에 발현시킬 수 있는 모체를 선정하고 개발하느냐가 이 기술의 핵심이 된다.
지금까지 알려져 사용된 표면발현 모체로는 세포 외막 단백질, 지질 단백질 (lipoprotein), 분비 단백질 (secretory protein), 편모 단백질과 같은 표면기관 단백질 등 크게 4가지이다.
그람음성균 (Gram negative bacteria)의 경우 LamB, PhoE (Charbit et al ., J. Immunol., 139:1658, 1987; Agterberg et al ., Vaccine, 8:85, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질이 주로 이용되었고, 지질단백질인 TraT (Felici et al ., J. Mol . Biol., 222:301, 1991), PAL (peptidoglycan associated lipoprotein) (Fuchs et al ., Bio / Technology, 9:1369, 1991) 및 Lpp (Francisco et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 489:2713, 1992) 등이 이용되었으며, FimA나 1 형 (type 1) 핌브리아 (fimbriae)의 FimH 어드헤신 (adhesin)과 같은 핌브리아 단백질 (Hedegaard et al ., Gene, 85:115, 1989), PapA 필루 (pilu) 서브유닛과 같은 필리 (pili) 단백질 등을 세포 표면발현 모체로 이용하여 외래 단백질의 발현을 시도하기도 하였다. 이 외에도 빙핵활성 단백질 (ice nucleation protein) (Jung et al ., Nat . Biotechnol., 16:576, 1998; Jung et al ., Enzyme Microb . Technol., 22:348, 1998; Lee et al ., Nat . Biotechnol., 18:645, 2000), 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiela oxytoca)의 풀루라나제 (pullulanase) (Kornacker et al ., Mol . Microl., 4:1101, 1990), 니세리아 (Neiseria)의 IgA 프로테아제 (Klauser et al ., EMBO J., 9:1991, 1990), 대장균의 adhesin인 AIDA-1, shigella의 VirG 단백질, Lpp와 OmpA의 fusion 단백질 등이 표면발현 모체로 사용할 수 있다는 보고가 있다.
그람양성균 (Gram positive bacteria)을 이용하는 경우에는 스타필로코쿠스 오레우스 (Staphylococcus aureus)유래의 protein A 및 FnBPB 단백질을 표면발현 모체로 사용하여 말라리아 항원을 효과적으로 발현시킨 보고가 있으며, 젖산 박테리아의 표면 코트 (coat) 단백질을 이용하여 표면 발현에 이용했다는 보고와 Streptococcus pyogenes 유래의 M6 단백질 (Medaglini, D et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . USA ., 92:6868, 1995), Bacillus anthracis의 S-layer protein EA1, Bacillus subtilis CotB 등 그람양성 박테리아의 표면 단백질을 모체로 이용했다는 보고가 있다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리 감마 글루탐산의 합성 복합체 유전자 (pgsBCA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하여, 외래단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터와 상기 벡터로 형질전환된 미생물의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발한 바 있다 (등록번호 10-0469800). 상기에서 소개된 표면발현 모체들을 이용하여 병원체의 항원 또는 항원 결정기를 유전공학적 방법을 통해 대량 생산이 가능한 세균에서 안정하게 발현시키고자 하는 연구가 많이 시도되었다.
특히, 비병원성의 세균 표면에 외래 면역원을 발현시켜 살아있는 상태로 경구투여를 할 경우 종래의 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 백신들보다 더 지속적이고 강한 면역반응을 유도할 수 있다고 보고된 바 있다. 이러한 면역반응 유도는 세균의 표면 구조물들이 표면 발현된 외래단백질의 항원성 (antigenicity)을 증가시키는 보조제 (adjuvant) 역할을 하기 때문이며, 살아있는 상태의 균에 대한 체내의 면역 반응에 의한 것으로 알려져 있다. 이러한 표면발현 시스템을 이용한 비병원성 세균의 재조합 생백신의 개발은 주목할 만하다.
새우 흰반점 바이러스의 감염을 예방 및 치료하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다. 항혈청이나 단일클론 항체를 이용한 항체 개발 방법 (한국등록특허 10-0489617: 흰 반점 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 항체단백질 및 이 를 포함한 알, 및 이들의 제조방법; 한국공개특허 2003-0069506: 새우 흰 반점 바이러스에 대한 난황항체) 등이 보고되었으나, 항체를 얻기 위한 소요경비 및 기술적 문제로 실용적이지 못한 문제점을 안고 있다. 또한, 바이러스 항체를 유도하기 위해 생균이나 약독화 (弱毒禍) 혹은 불활성화된 바이러스를 이용해야 하는데, 바이러스 자체를 항원으로 이용할 경우, 바이러스에는 여러 단백질이 존재하기 때문에 단일 항원을 이용할 경우보다 병원성 항원에 대한 항체 역가가 낮다는 문제점을 안고 있다.
이에 본 발명자들은 새우 흰 반점 바이러스성 질병을 치료 및 예방하기 위한 백신을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 미생물 표면발현용 재조합 벡터 (백신제조용 벡터)로 형질전환된 미생물을 제작하고, 상기 미생물을 이용하여 새우 흰 반점 바이러스성 질병을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 S-layer 단백질을 코딩하는 유전자(SlpA7)의 프로모터를 함유하는 새우 흰 반점 바이러스 항원의 세포 표면발현용 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터에 의해 형질전환된 박테리아를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 새우 흰 반점 바이러스 항원이 세포 표면에 발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 새우 흰 반점 바이러스성 질병 치료 또는 예방용 백신 및 사료 첨가제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자, 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 S-layer 단백질을 코딩하는 유전자(SlpA7)의 프로모터를 함유하는 새우 흰 반점 바이러스 항원의 세포 표면발현용 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항원은 새우 흰 반점 바이러스의 외피 항원인 VP19 또는 VP28인 것을 특징으로 할 수 있고, 새우 흰 반점 바이러스의 비리온 항원인 VP15, VP24 및 VP26으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 도 1A에 도시된 유전자 지도를 가지는 플라스미드 pBT:pgsA-VP26인 것을 특징으로 할 수 있고, 도 1B에 도시된 유전자 지도를 가지는 플라스미드 pBT:pgsA-VP28인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 구성된 군에 서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 유산균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 박테리아를 배양하여 새우 흰 반점 바이러스 항원을 상기 박테리아의 세포 표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 새우 흰 반점 바이러스 항원의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 박테리아 배양에 의해 수득된 새우 흰 반점 바이러스 항원이 세포 표면에 발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 새우 흰 반점 바이러스성 질병 치료 또는 예방용 백신을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 백신은 경구용 또는 식용으로 섭취하는 것을 특징으로 할 수 있고, 피하 또는 복강 주사용인 것을 특징으로 할 수 있고, 비강 투여용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 박테리아 배양에 의해 수득된 새우 흰 반점 바이러스 항원이 세포 표면에 발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 새우 흰 반점 바이러스의 항원을 미생물의 세포 표면에 발현시키기 위하여, pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 미생물 표면발현용 재조합 벡터를 제작하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 항원으로 새우 흰 반점 바이러스 비리온의 항원 단백질인 VP26 및 외피 (envelop)의 항원 단백질인 VP28을 세포 표면에 발현할 수 있는 벡터 pBT:pgsA-VP26 및 pBT:pgsA-VP28을 제작하였다. 상기 미생물 표면 발현벡터 pBT:pgsA-VP26 및 pBT:pgsA-VP28로 유산균인 락토바실러스 카세이를 형질전환시켜 상기 항원을 유산균의 표면에 발현시킨 다음, 상기 형질전환체를 새우의 사료에 섞어 공급하고, 새우 흰 반점 바이러스를 감염 (근육감염 및/또는 침지감염)시켜, 시일의 경과에 따른 새우의 치사율을 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비해 새우 흰 반점 바이러스의 항원이 발현된 미생물을 처리한 군에서 새우의 치사가 지연되거나 저하됨을 관찰할 수 있었다 (도 3). 이를 통하여, 본 발명에 따른 새우 흰 반점 바이러스의 항원이 발현된 미생물은 새우 흰 반점 바이러스의 감염에 대하여 치료 및 예방 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는, 새우 흰 반점 바이러스 항원으로 VP26 및 VP28을 사용하였으나 이에 국한되는 것은 아니며, 새우 흰 반점 바이러스 항원인 VP15, VP19, VP24, VP26 및 VP28 중 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한 하기 실시예에서는, 형질전환의 숙주세포로 사용되는 미생물은 생체 적용시 독성이 없거나 약독화된 (attenuated) 미생물이라면 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트램토코커스 중 어느 것이라도 사용 가능하며, 바람직하게는 식용이 가능한 미생물 (유산균)이다.
실시예 1: 표면발현용 벡터 pBT : pgsA - VP26 및 pBT : pgsA - VP28 의 제작
바실러스 속 균주에서 유래한, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 (pgsA, pgsB 및 pgsC) 중에서 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 새우 흰 반점 바이러스 비리온의 항원 단백질인 VP26 및 외피 (envelop)의 항원 단백질인 VP28을 표면발현할 수 있는 벡터 pBT:pgsA-VP26 및 pBT:pgsA-VP28을 제작하였다.
본 발명의 수행에 앞서, 본 발명자들은 2004년 한국 고창에서 폐사한 새우에서 분리한 바이러스 (바이러스의 분리과정은 하기 실시예 3에 기재된 바와 동일함)를 주형으로 사용하고, 서열번호 2와 3 및 서열번호 4와 5의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행함으로써, 이로부터 각각 VP 26 및 VP 28 유전자 단편을 수득하였다. 수득된 VP 26 및 VP 28 유전자 단편은 pGEM T 벡터 (Promega)에 삽입하여 보관하였다.
1-1: pBT : pgsA - VP26 의 제작
그람음성 및 그람양성 범용 벡터인 pAT에 항시적 고발현 프로모터인 SlpA7 프로모터 (서열번호 1) 및 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 중 pgsA 유전자를 포함하는 표면 발현벡터 pBT:pgsA는, 벡터의 표면발현을 증가시키기 위해 pHCE2LB:pgsA-HPVL1 (KCTC 10349BP: pHCE2LB:pgsA-HPVL1로 형질전환된 대장균)의 HCE 프로모터 부분을 SlpA7 프로모터로 교체하고, 목적 유전자를 삽입하기 위해 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리하여 HPVL1 유전자를 제거함으로써 준비되었다.
SlpA7 프로모터는 HCE 프로모터 유래의 124 bp와 유산균에서 알려진 S-layer protein을 코딩하는 slpA 유전자의 프로모터들에서 나타나는 consensus sequence를 바탕으로 선택된 90 bp 부위가 연속적으로 연결된 총 214 bp의 염기서열(서열번호 1)을 가진다.
서열번호 1: 5'-tgatctctcc ttcacagatt cccaatctct tgttaaataa cgaaaaagca tcaatcaaaa cggcggcatg tctttctata ttccagcaat gttttatagg ggacatattg atgaagatgg gtattagtat ttttcggtca ttttaacttg ctattttttg aagaggtcag taaatatgaa tcgtggtaag tattttcaca cttctggaaa aagg-3'
본 발명에 있어서, pAT 벡터는 그람양성 미생물 범용 벡터로 널리 알려져 있으나 (Trieu-Cuot, et al ., Gene, 29:99, 1991; Zhou and Johnson, Biotech . Lett., 29:121, 1993), 본 발명이 해당하는 분야에서는 그람음성 미생물을 이용한 형질전환 미생물 제조시 형질전환 벡터를 제조하기 위한 back-bone 벡터로도 이용되고 있다 (US 2002/309560, US 2002/217613, US 2002/197153, Jung C.M., et al ., J. Bacteriology, 181:2816, 1999).
준비된 표면 발현벡터 pBT:pgsA에 새우 흰 반점 바이러스의 VP26 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위하여, 약 615bp의 VP26 유전자를 함유하는 pGEM T 벡터의 VP26 유전자를 주형으로 사용하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 상기 기재한 바와 같은 크기를 가지는 VP26 유전자를 수득하였다.
서열번호 2: 5'-cgc ggatcc gaa ttt ggt aac ctt aca-3'
서열번호 3: 5'-gga aagctt tta tta ctt ctt ctt gat tt-3'
(서열번호 2 및 3에서 밑줄 친 부분은 각각 BamHI 및 KpnI의 절단부위를 나타낸 것임)
PCR 산물인 VP26 유전자를 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리하고, 상기 실시예 1-1에서 제작된 표면 발현벡터 pBT:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C 말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결함으로써, 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 새우 흰 반점 바이러스의 항원인 VP26을 표면발현할 수 있는 벡터 pBT:pgsA-VP26을 제작하였다 (도 1A).
1-2: pBT : pgsA - VP28 의 제작
상기 실시예 1-1의 표면 발현벡터 pBT:pgsA에 새우 흰 반점 바이러스의 VP28 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위하여, 약 615bp의 VP28 유전자를 함유하는 pGEM T 벡터의 VP28 유전자를 주형으로 사용하고, 서열번호 4 및 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 상기 기재한 바와 같은 크기를 가지는 VP28 유전자를 수득하였다.
서열번호 4: 5'-cgc ggatcc gat ctt tct ttc act ctt-3'
서열번호 5: 5'-gga aagctt tta tta ctc ggt ctc agt gcc-3'
(서열번호 4 및 5에서 밑줄 친 부분은 각각 BamHI 및 KpnI의 절단부위를 나타낸 것임)
PCR 산물인 VP28 유전자를 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리하고, 상기 실시예 1-1에서 제작된 표면 발현벡터 pBT:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C 말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결함으로써, 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 새우 흰 반점 바이러스의 항원인 VP28을 표면발현할 수 있는 벡터 pBT:pgsA-VP28을 제작하였다 (도 1B).
실시예 2: 새우 흰 반점 바이러스의 항원 VP26 및 VP28 의 세포 표면발현
락토바실러스 카세이 균주를 실시예 1-1 및 1-2의 표면 발현벡터 pBT:pgsA-VP26 및 pBT:pgsA-VP28로 형질전환시킨 다음, 형질전환체를 MRS배지 (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA)를 이용하여 37℃에서 정치배양하여 표면발현을 유도하였다.
본 발명에 있어서, 형질전환의 숙주세포는 택일적으로, 그람음성균인 대장 균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라 등을 사용할 수 있으며, 그람양성균인 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스, 스트램토코커스 등을 사용할 수도 있다.
상기 배양된 형질전환체를 동일한 세포농도로 맞추고, 이 중 일정량을 추출하여 단백질을 변성 (denaturation)시켜 시료를 준비한 다음, 이를 SDS-PAGE로 분석하여 분획된 단백질을 PVDF 멤브레인 (polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad)으로 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액 (50mM Tris-HCl, 5% skim milk, pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹 시킨 다음, 블로킹 용액에 PgsA에 대한 토끼 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고, 아비딘-바이오틴 (avidin-biotin) 시약을 1시간 동안 반응시켜 다시 세척한 다음, 기질 (H2O2)과 발색시약 (DAB)을 첨가하여 발색반응을 유발함으로써, 형질전환체에서 융합단백질 (PgsA-VP26 및 PgsA-VP28)의 발현을 확인하였다 (도 2).
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 형질전환체에서 융합단백질 PgsA-VP26 (도 2A) 및 PgsA-VP28 (도 2B)의 발현을 확인할 수 있었다. 링커가 포함된 PgsA가 약 43.6kDa이고, VP26 및 VP28가 각각 약 22.2kDa 및 약 19kDa이므로, 형질전환체에서 발현된 융합단백질 PgsA-VP26 및 PgsA-VP28는 각각 약 65.8kDa 및 약 62.6kDa에 해당한다.
실시예 3: 새우 흰 반점 바이러스 항원으로 형질전환된 미생물의 바이러스 방어효과
실시예 2의 VP26 및 VP28 융합단백질이 표면발현된 형질전환체에서, 각 융합단백질에 대한 형질전환체의 면역반응 및 이에 의한 새우 흰 반점 바이러스 감염 억제효과를 조사하였다.
3-1: 새우 흰 반점 바이러스의 감염 농도 결정
새우 흰 반점 바이러스의 감염 억제효과를 조사하기 위하여, 먼저 새우 흰 반점 바이러스의 면역성 검사 (challenge test) 수행을 위한 바이러스의 투여 농도를 결정하였다.
면역성 검사에 사용한 새우는 penaeus chinensis이고, 새우 흰 반점 바이러스는 2004년 한국 고창에서 상기 바이러스로 인하여 폐사한 새우에서 분리한 것을 사용하였다.
고창의 폐사 새우를 균질화 (homogenization) 시켜 phosphate buffer (pH 7.4)에 희석시키고, 희석된 바이러스 함유 용액을 0.45μm 필터로 여과 (filtration)한 다음, 30%의 슈크로즈 (sucrose)를 이용한 기울기 원심분리 (gradient centrifugation)를 수행하여 바이러스 용액을 농축시켰다. 농축된 바이러스를 phosphate buffer (pH 7.4)에 재희석시켜 감염에 사용할 바이러스로 준비하였다. 준비된 바이러스는 새우 흰 반점 바이러스에 대한 특이적 프라이머 (서열번 호 2와 3 및 서열번호 4와 5)를 이용하여 PCR을 수행함으로써 재차 바이러스의 유무를 확인하였다.
새우 흰 반점 바이러스의 근육감염 처리농도를 결정하기 위하여, 상기 바이러스 용액을 5 μl, 10 μl, 20 μl 및 30 μl씩 분주하고, 30 게이지 주사기를 이용하여 각각의 바이러스 분주액을 6~8g의 penaeus chinensis 새우의 제 3~4복절 사이에 주입하였다 (15마리/그룹). phosphate buffer를 주입한 것을 대조군으로 사용하였다. 주입 후 2주일 동안 새우의 폐사율을 조사하고, 주입 후 7일 동안의 누적 폐사율을 조사한 결과, 바이러스 분주액의 주입량이 20 μl인 경우 누적 폐사율이 50~70%인 것을 확인할 수 있었다. 20 μl의 바이러스 용액을 근육감염을 위한 처리농도로 결정하였다.
새우 흰 반점 바이러스의 침지감염 처리농도를 결정하기 위하여, 상기 재희석한 바이러스 용액을 1:100, 1:1000, 1:3000, 1:5000 및 1:10000으로 희석하여 준비하고, 각각의 바이러스 희석액으로 수조를 채운 다음, 6~8g의 penaeus chinensis 새우를 7시간 동안 수조에 침지시켰다 (15마리/그룹). 7시간의 침지 후, 수조의 물을 교환한 다음, 2주일 동안 새우의 폐사율을 조사하고 침지 후 14일 동안의 누적 폐사율을 조사한 결과, 희석비율이 1:1000인 바이러스 용액에서 누적 폐사율이 50~70%인 것을 확인할 수 있었다. 1:1000의 희석비율을 가진 바이러스 용액을 침지감염을 위한 처리농도로 결정하였다.
3-2: 항원이 표면발현된 미생물의 새우 흰 반점 바이러스 근육감염 방어효과
새우 흰 반점 바이러스 VP26 및 VP28 항원이 표면발현된 락토바실러스를 섭취시킨 새우를 이용하여 새우 흰 반점 바이러스의 근육감염 억제효과를 조사하였다.
실험군 및 대조군으로 각각 20마리의 새우로 구성된 두 그룹을 준비하였다. 준비된 실험군의 새우에게 약 10일 동안 VP26 및 VP28 항원이 표면발현된 락토바실러스를 0.5% 포함한 새우사료를 공급한 다음, 이후부터 상용화된 새우사료를 공급하였다. 20마리의 새우에게 상용화된 새우사료를 준 것을 대조군으로 사용하였다. 실험시작 10일 후, 실험군으로 설정된 각 그룹의 새우를 상기 실시예 3-1에서 결정된 농도의 새우 흰 반점 바이러스로 근육감염시킨 다음, 시일에 따른 새우의 치사율을 관찰하였다 (도 3A).
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 대조군의 새우는 감염 후 3~5일 사이에 모두 치사된 반면, 항원이 표면발현된 락토바실러스를 공급한 실험군의 새우는 감염 후 4~8일까지 생존함을 확인할 수 있었다. 이는 새우 흰 반점 바이러스의 항원을 발현하는 유산균에 의해 상기 바이러스의 감염이 방어되었음을 간접적으로 입증하는 결과이다.
3-3: 항원이 표면발현된 미생물의 새우 흰 반점 바이러스 침지감염 방어효과
새우 흰 반점 바이러스 VP26 및 VP28 항원이 표면발현된 락토바실러스를 섭취시킨 새우를 이용하여 새우 흰 반점 바이러스의 침지감염 억제효과를 조사하였다.
실험군 및 대조군으로 각각 20마리의 새우로 구성된 두 그룹을 준비하였다. 준비된 실험군의 새우에게 약 10일 동안 VP26 및 VP28 항원이 표면발현된 락토바실러스를 0.05~5%, 바람직하게는 0.1~1%, 보다 바람직하게는 0.5% 포함한 새우사료를 공급한 다음, 이후부터 상용화된 새우사료를 공급하였다. 20마리의 새우에게 상용화된 새우사료를 준 것을 대조군으로 사용하였다. 실험시작 10일 후, 실험군으로 설정된 각 그룹의 새우를 상기 실시예 3-1에서 결정된 희석비율을 가진 새우 흰 반점 바이러스 용액이 담긴 수조에서 7시간 동안 침지감염시키고 물을 갈아준 다음, 시일에 따른 새우의 치사율을 관찰하였다 (도 3B).
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 대조군의 새우는 감염 후 13일이 되는 시점에서 약 70%의 치사율을 나타낸 반면, 실험군의 새우는 감염 후 19일이 되는 시점에서 약 25%의 치사율을 나타내었다. 이는 새우 흰 반점 바이러스의 항원을 발현하는 유산균에 의해 상기 바이러스의 감염 (자연감염과 유사한 조건하에서의 감염)이 방어되었음을 간접적으로 입증하는 결과이다.
상기 실시예 3-2 및 3-3의 결과를 토대로, 본 발명의 항원이 표면발현된 미생물은 새우 흰 반점 바이러스의 감염으로 인한 새우의 폐사를 치료 및 예방하는 효과를 가지므로, 상기 바이러스성 질환에 대한 백신, 사료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
3-4: PCR 에 의한 침지감염 확인
상기 실시예 3-3의 침지감염 실험에 있어서, 대조군 및 실험군 새우의 치사 현상이 침지감염 이외의 요인이 아닌 새우 흰 반점 바이러스의 감염에 의한 것임을 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다.
먼저, 실시예 3-3의 치사된 새우를 균질화 (homogenization) 시켜 phosphate buffer (pH 7.4)에 희석시키고, 희석된 바이러스 함유 용액을 0.45μm 필터로 여과 (filtration)한 다음, 30%의 sucrose gradient centrifugation으로 농축시켰다. 농축된 바이러스를 phosphate buffer (pH 7.4)에 재희석시켜 주형으로 사용하고, 상기 서열번호 2와 3 및 서열번호 4와 5의 프라이머를 사용하여 각각 PCR을 수행함으로써, 치사된 새우에서 VP26 및 VP28 유전자의 존재를 확인하였다 (도 4).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 치사된 새우에서 약 615bp인 VP26 및 VP28 유전자가 검출됨을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 3-3의 새우 치사는 다른 환경적 용인이 아닌 새우 흰 반점 바이러스의 침지감염에 의한 것임을 입증하는 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 표면 발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 상기 새우 흰 반점 바이러스 항원이 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 새우 흰 반점 바이러스성 질병 치료 또는 예방용 백신 및 사료 첨가제를 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 새우 흰 반점 바이러스 항원이 표면발현된 박테리아 및 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원은 백신, 사료 첨가제 등으로 사용되어, 새우 흰 반점 바이러스로 인해 유발된 질병을 치료 및 예방할 수 있으므로, 상기 바이러스로 인한 갑각류의 집단폐사를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 양식업 및 어업의 이익 증대에 기여할 수 있다.
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Claims (15)

  1. pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자, 새우 흰 반점 바이러스 항원을 암호화하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 S-layer 단백질을 코딩하는 유전자(SlpA7)의 프로모터를 함유하는 새우 흰 반점 바이러스 항원의 세포 표면발현용 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원은 새우 흰 반점 바이러스의 외피 항원인 VP19 또는 VP28인 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원은 새우 흰 반점 바이러스의 비리온 항원인 VP15, VP24 및 VP26으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 도 1A에 도시된 유전자 지도를 가지는 플라스미드 pBT:pgsA-VP26인 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 도 1B에 도시된 유전자 지도를 가지는 플라스미드 pBT:pgsA-VP28인 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 박테리아.
  8. 제7항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  9. 제8항에 있어서, 상기 박테리아는 유산균인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  10. 제7항의 형질전환된 박테리아를 배양하여 새우 흰 반점 바이러스 항원을 상기 박테리아의 세포 표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 새우 흰 반점 바이러스 항원의 제조방법.
  11. 제7항의 형질전환된 박테리아 배양에 의해 수득된 새우 흰 반점 바이러스 항원이 세포 표면에 발현된 형질전환된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 새우 흰 반점 바이러스성 질병 치료 또는 예방용 백신.
  12. 제11항에 있어서, 경구용 또는 식용으로 섭취하는 것을 특징으로 하는 백신.
  13. 제11항에 있어서, 피하 또는 복강 주사용인 것을 특징으로 하는 백신.
  14. 제11항에 있어서, 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 백신.
  15. 제7항의 형질전환된 박테리아 배양에 의해 수득된 새우 흰 반점 바이러스 항원이 세포 표면에 발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 새우 흰 반점 바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.
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