KR102154172B1 - 흰반점증후군바이러스 및 비브리오 세균의 갑각류 감염을 억제하는 생균제 및 그의 용도 - Google Patents

흰반점증후군바이러스 및 비브리오 세균의 갑각류 감염을 억제하는 생균제 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해수, 새우 내장, 오징어 내장, 된장 등으로부터 분리하고 선발된, 새우 등 갑각류에 감염하는 흰반점증후군바이러스 및 비브리오 균에 대해 우수한 감염억제 활성을 갖는 신규한 바실러스 균주 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

흰반점증후군바이러스 및 비브리오 세균의 갑각류 감염을 억제하는 생균제 및 그의 용도{Probiotics for inhibiting white spot syndrome virus and Vibrio bacterium infecting crustacean and use thereof}
본 발명은 해수, 새우 내장, 오징어 내장, 된장 등으로부터 분리하고 선발된, 새우 등 갑각류에 감염하는 흰반점증후군바이러스 및 비브리오 균에 대해 우수한 억제 활성을 갖는 신규한 바실러스 균주 및 그의 용도에 관한 것이다.
새우는 종교, 인종, 국가에 관계없이 전 세계인들이 좋아하는 식품대상 종으로서 톤당 10,000~15,000불($)에 이르는 세계적으로 높은 고부가 수산물중의 하나이다. 전 세계 새우 생산량은 지난 2012년 768만 톤이었고, 이 가운데 절반 이상인 432만톤이 양식을 통해 생산됐다.
이러한 양식산 새우의 생산량은 2012년까지 증가세를 보였으나 2013년에는 주요 생산국에서 대량 폐사가 발생함에 따라 큰 폭으로 감소했다. 특히 양식 산 중 가장 많은 비중을 차지하는 흰다리새우의 폐사 피해가 컸다.
양식새우는 배합사료로만 투여하면서 4월부터 10월까지 약 6개월간 출하가 가능하여 큰 질병 없이 사육한다면 어떠한 양식 어종보다도 부가가치가 큰 수산자원 중의 하나이다. 국내 양식장은 강화도를 시작으로 영종도, 조암, 태안, 남해안까지 해안의 간석지에 3,000평에서 1만여평의 호지를 만들어 사육하고 있다. 밀집 새우 양식은 고도의 생산성을 기대할 수 있지만 필연적으로 질병의 발생과 전파를 초래한다. 이러한 질병들의 가장 중요한 병원체는 높은 이환율과 치사율을 가지는 바이러스이고, 그 다음은 비브리오 세균이다. Baculovirus의 일종인 흰반점 증후군바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)가 일으키는 흰반점증후군 (white spot syndrome disease, WSSD) 질병은 1992년 8월 중국의 푸지안 지방의 보리새우 양식장에서 최초로 보고된 이래 현재는 일본, 중국을 비롯하여 필리핀, 태국, 인도네시아 및 인도에 이르기까지 동남아시아 거의 전역에 확산 되었는데, 감염률이 높은 데다 아직 예방법이 개발되지 않아 피해가 커지고 있다. 흰반점증후군바이러스는 주로 새우, 가재, 게 등의 갑각류에 감염되는데, 특히, 이 바이러스에 감염될 경우 흰반점증증후군이 발현되어, 갑각류의 갑피(carapace), 외지 (appendage) 및 큐티클에 흰반점이 나타나고, 간 췌장(hepatopancreas)이 붉은색을 띠게 된다. 흰반점증후군바이러스에 감염된 새우류는 그 감염 강도에 따라 3~10일 내에 90~100%가 폐사되며, 20일 이내에 전량 폐사되는 새우류의 치명적인 질병으로 최근 새우양식에 가장 큰 걸림돌이 되고 있고, 우리나라는 93년 이후 해마다 새우양식장의 절반이 대량 폐사되는 피해를 가져오고 있다.
신종 새우 질병인 '조기치사증후군 (early mortality syndrome, 이하 EMS)' 또는 급성간췌장궤사증후군(acute hepatopancreatic necrosis syndrome)이라 명명된 이 질병에 감염되면 입식 후 20~30일 내에 대량 폐사하는데 때로는 100% 폐사한다. 최근 발표된 EMS 원인체로 비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)로 논의되고 있다.
새우에 감염하는 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 가지는 약제 개발은 아직 없는 실정이고, 특히 식품으로 사용되는 새우에 사용하여도 독성 등 부작용이 없으며 가격이 저렴한 천연물 약제의 개발이 요구된다. 항생제와 합성약품이 다른 바이러스병에 일부 효과를 보이고 있으나 잔여활성, 내성균주 출현, 환경위험 때문에 흰반점증후군병에는 사용되지 않고 있다
일부 식물추출물이 흰반점증후군바이러스 억제에 효과가 있다는 특허문헌(한국특허등록 제10-0824106, 한국특허출원 제10-2017-0022579)가 있으나, 이들 추출물을 사용하여 새우양식에 적용하였을 때 흰반점증후군바이러스에 의한 대량폐사를 줄였다는 보고는 아직 없다. 또한, 미생물제재를 갑각류 양식장에 투여하여 유익한 미생물들의 우점화를 통한 갑각류의 일반적인 면역력을 증가시켜보자는 특허(한국특허등록 제10-1738591)가 있으나 흰반점증후군바이러스에 특이하게 억제효과가 있다는 보고 역시 없다. 더구나 흰반점증후군바이러스 뿐 아니라 새우 양식에 역시 큰 피해를 주는 비브리오균을 동시에 억제하는 보고도 아직 없다. 따라서 새우 및 갑각류에 가장 치명적인 흰반점증후군바이러스 및 비브리오균의 두 가지 병원균에 대하여 동시에 효과적인 억제제의 필요성이 꾸준히 제기되고 있다.
이상에서 나타난 배경으로 미루어 새우 흰반점증후군바이러스 및 비브리오균 의 감염 억제효과를 낼 수 있는 유용 미생물을 탐색하여 생균제로써 국내ㆍ외 새우를 비롯한 갑각류 양식 산업에 적용한다면 경제적인 이익뿐 아니라 항생제 없는 안전한 먹거리 창출에도 이바지 할 수 있다.
생균제(probiotics)는 "적당량을 섭취하였을 때 숙주동물에게 건강상 이익을 주는 살아있는 미생물“로 정의되고 있는데, 유익한 미생물의 성장을 촉진하는 한편 병원성 미생물을 억제하는 것으로 알려져 국내외적으로 널리 사용되고 있다. 생균제는 동물이 섭취하였을 때 성장촉진과 사료효율의 향상, 장내 미생물의 경합에 의한 어린 동물들의 장 질환 방지 및 병원성 미생물 감소, 면역기능 향상 등 다양한 면에서 유익한 영향을 미친다.
한국특허등록 제10-0824106호(2008.04.21.공고). "흰반점바이러스를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법" 한국특허출원 제10-2017-0022579호(2019.01.21.공고). "흰반점 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 조성물" 한국특허등록 제10-1738591호(2017.05.24.공고). "갑각류 양식용 미생물 제제 및 이를 이용한 갑각류의 생산성 증진방법"
본 발명자들은 새우를 비롯한 갑각류 양식분야에서 높은 폐사율로 경제적으로 큰 손실을 유발하는 주요한 병원체인 흰반점증후군바이러스와 비브리오세균에 대해 효과적인 감염억제작용을 가져서 항생제대체제로 유용하게 이용될 수 있는 균주의 개발에 대한 연구를 수행하고 우수한 항바이러스 및 항세균 활성을 갖는 바실러스 균주를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 새우를 비롯한 갑각류의 흰반점증후군바이러스와 비브리오세균 감염 억제 활성이 우수한, 신규한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 흰반점증후군바이러스와 비브리오세균 감염 억제 우수 균주, 또는 그의 배양액을 포함하는 새우를 비롯한 갑각류의 생균제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 흰반점증후군바이러스와 비브리오 세균 감염 억제 우수 활성을 갖는 균주, 또는 그의 배양액을 포함하는 새우를 비롯한 갑각류 양식 사료 첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 바닷물, 바다 퇴적물, 새우와 오징어 등 어류의 내장,그리고 된장으로부터 분리하였으며, 흰반점증후군바이러스와 비브리오세균 감염 억제활성이 우수하여 선발된 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis) KS1 (KACC92239P)를 제공한다.
바실러스 서브티리스 KS1은 새우를 비롯한 갑각류에 감염을 유발하며, 특히, 양식 새우에 질병을 유발하여 100%의 폐사율을 일으키는 주요한 병원체로 알려진, 새우 흰반점증후군바이러스와 비브리오세균의 감염을 동시에 억제하는 항바이러스 및 항세균 활성을 갖는다.
바실러스 서브티리스 KS1은 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다.
본 발명에서 분리된 균주, 바실러스 서브티리스 KS1은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 바실러스 속 미생물의 배양 방법에 의해 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 균주 KS1은 탄소원, 질소원, 비타민, 및 미네랄을 포함하는 배지, 예를 들면, 3% NaCl을 포함한 Tryptic Soy broth 배지에서 pH 5 내지 8, 바람직하게는 pH 7.3, 및 18℃내지 40℃, 바람직하게는 35 내지 37℃에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 본 발명의 균주는 L당 casein peptone (판크레아?J) 17 g, 인산일수소칼륨 2.5 g, 포도당 2.5 g, 염화나트륨 30 g, soya peptone (파파인 digest) 을 포함하는 배지에서 16시간 내지 48시간, 바람직하게는 24시간 배양함으로써 대량생산될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 바실러스 서브티리스 KS1 균주 또는 그의 배양물을 유효성분으로 포함하는 생균제를 제공한다.
상기 균주는 생균제에 균주 자체로 포함되거나, 또는 그의 배양물로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 바실러스 서브티리스 KS1 균주 또는 그의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 균주는 사료 첨가제에 균주 자체로 포함되거나, 또는 그의 배양물로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 사료 첨가제는 항생제 대체제로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정적으로 유지하여 갑각류의 건강상태를 양호하게 하고, 그에 의해 갑각류의 증체량과 육질을 개선시키고 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 발효사료, 배합사료, 펠렛 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 바실러스균과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 바실러스균을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생균제"는 살아 있는 균 즉, 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 체내에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하고, 항미생물제를 생성하여 유해 미생물의 증식을 억제한다. 또한, 투여된 생균제는 사료의 고분자 형태의 영양소를 분해하는 소화효소를 분비하여 영양분의 흡수를 도와주어 양식 갑각류의 체중 증가 뿐 아니라 양호한 건강 상태로 면역력을 높여주는 역할을 수행한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "사료 첨가제"는 기본 사료에 기능을 부여하거나, 보충하기 위해 첨가되는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배양물"은 본 발명에 따른 바실러스균을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심 분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 균주의 배양에 의해 수득된 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 생균제는 양식 사육수에 투여 또는 사료에 혼합하여 경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
생균제의 투여 용량은 생균 수가 1x105 내지 1x1011 세포/g 이도록 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해, 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 양태에 따른 바실러스 서브티리스 KS1 균주, 또는 그의 배양물, 그로 제조한 생균제, 사료첨가제, 및 발효제품은 새우 등의 갑각류에 매우 심각한 병을 일으키어 전량 폐사에 이르게 하는 흰반점증후군바이러스와 비브리오균에 대해 우수한 감염 억제 활성을 가지고 있고 사료의 소화흡수력을 도와주는 단백질분해효소 및 지질분해효소 활성을 보여, 양식장의 물 또는 사료에 투여함으로써 항생제 대체 효과와 함께 새우 전량 폐사의 획기적 감소와 생산성 증가를 꾀할 수 있으며 항생제 잔류의 위험이 없어 안전한 친환경적 새우 등 갑각류 식품을 제공하고, 폐사악취감소, 폐수누출감소, 환경개선에 의한 양식 갑각류 생산성 제고에 의한 경제적 이익을 창출할 수 있다.
도 1은 분리 균이 단백질 분해효소 및 지질 분해효소 분비능이 있음을 보여준다.
도 2의 윗 사진은 새우가 흰반점증후군바이러스에 감염되어 흰반점이 많이 형성된 것을 보여준다. 도 2의 아래 사진은 흰반점이 훨씬 적게 형성된 것을 보여준다.
도 3은 흰반점이 없는 새우이다.
도 4는 두 생균제 후보균의 흰다리새우에 대한 흰반점바이러스(WSSV) 감염 억제 효과를 보여준다.
이하, 본 발명을 구체적인 실험예 및 실시예에 기초하여 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.
[ 실험예 1] 균주 수집 및 분리
본 연구실에서 소장하고 있는 유산균과 고초균 등 유익 미생물들을 실험에 사용하였다. 또한, 자연에서 균주를 분리하기 위해, 바닷물과 바다 퇴적물, 발효식품 등의 시료를 생리식염수로 적당배수로 희석하였고, 새우와 오징어 내장은 적출하여 균질기로 분쇄 후 생리식염수로 적당배수로 희석하였다. 이 희석물 0.1 ml를 3% NaCl 함유 TSA 또는 MRS agar에 도말하여 25℃에서 2일 동안 배양하여 형성된 콜로니들 중 색깔과 형태가 다른 콜로니들을 분별하여 분리 보관하였다.
[ 실험예 2] 소화효소 생산능
새우사료에는 단백질 50 - 60%, 10 % 지질이 포함되어 있는데, 이들을 분해하는 각각 효소인 단백질분해효소와 지질분해효소의 활성이 분리균에서 높으면 이들이 잘 소화 분해되어 새우 성장율에 직접적으로 영향을 주고, 간접적으로 사료섭취량을 감소시켜주고 사료전환율은 증가한다. 특히 흰반점증후군바이러스에 감염된 새우들은 사료섭취가 감소하는데, 분리균의 소화효소에 의해 사료 소화가 잘되므로 영양상태가 좋아 생존율을 높여서 새우 사멸율을 감소시켜주는 효과가 있고, 감염되지 않은 새우들은 감염 기회가 줄어들게 된다.
단백질분해효소 생산능을 측정하기 위해 수집 및 분리된 균주 각각의 균체를 PBGS agar (펩톤 5, 비프추출물 3, 젤라틴 4, 염화나트륨 30, agar 20 g/l, pH 7.2)에 루프로 접종하고 이들을 25, 35, 그리고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 염화수은 15 g, 염산 20 ml를 넣고 최종 100 ml로 부피를 만든 수용액으로 염색하였다. 단백질 분해 활성은 콜로니 주변에 생긴 투명환의 크기로 비교하였다(도 1).
지질분해효소 생산활성 측정을 위해서는, 균을 로다민 비 (Rhodamine B) agar배지에 루프로 접종하고 25, 35, 37℃에서 48시간 배양한 후 자외선 하에서 콜로니 주변에 로다민 비가 발산하는 오렌지 색의 형광의 가수분해된 환을 관찰하였다 (도 1).
[ 실험예 3] 새우사육
새우는 국내산 민물 줄새우(Palaemon paucidens)와 해수 흰다리새우(Litopenaeus vannamei)를 구입하여 실험에 사용하였다. 사육수는 2일 동안 공기주입을 한 다음, 여기에 새로 구입한 새우를 넣고 2~3일 적응시켰다. 줄새우 경우, 사육수 11리터를 포함하는 16.7리터 크기 (30.0× 21.0× 26.5 cm)의 물탱크에 알맞은 공기주입을 하면서, 구입한 새우의 저장 배양은 18℃에서, 흰반점증후군바이러스 감염 실험과 생균제 스크리닝 실험은 24±1.0℃에서 각각 수행하였다. 흰다리새우는 100리터 해수를 담은 탱크에 배양하였다. 사료량은 새우체중의 7.5%를 초기에 그 다음에는 소비하지 않은 사료양에 따라서 일일당 체중의 3.5~5.0%로 조정하였다. 사료투여는 오전 6시에 60%, 오후 6시에 40%를 공급하였고, 소비하지 않은 사료와 새우 변 등 분비물을 함유한 탱크 바닥 물은 새우의 생존을 위해 2 cm 지름의 플라스틱 호스를 사용하여 싸이폰 방식으로 매일 제거하였다.
[ 실험예 4] 흰반점증후군바이러스 준비
물은 2일 동안 공기주입을 한 다음, 여기 에 새로 구입한 새우를 넣고 2~3일 적응시킨 다음 흰반점증후군바이러스 함유 조직 추출액 10 μl (2 g의 줄새우 경우) 또는 20 μl (5~6 g의 흰다리새우 경우)를 건강한 새우의 4번째와 5번째 마디 등 사이에 주사바늘로 근육 주사하여 주입하였다. 새우들은 2 또는 3일 후부터 폐사하기 시작하여 7일부터 10일 내에 모두 폐사하였다. 죽은 새우를 취하여 체표면을 징크(zinc)와 과산화염소수(sodium hypochloride) 용액으로 소독하였다. 이 후 곤충세포배양액(Graces’ insect medium)으로 흔들면서 세척하여 독성을 제거하였다. TNE buffer (Tris 50 mM, NaCl 100 mM and EDTA 1 mM, pH 7.4)와 함께 넣고 균질기에서 분쇄한 후 2,000 ⅹg, 10 분간 원심한 다음, 상층 부유액을 멸균된 0.2 μm 크기의 여과막으로 여과하여 세균 등을 포함한 미생물을 제거하였다. 여과액을 취하여 2 ml 용량의 냉동용 작은 병에 0.5 ml씩을 분주하여 실험에 사용 시까지 -70°C 냉장고에 보관하였다.
[ 실험예 5] 새우생체를 이용한 흰반점증후군바이러스 감염억제 우수균주 선별 방법 확립
새우양식탱크의 사육수에 생균제 후보균을 넣은 후 2일 후 흰반점증후군바이러스 함유 조직 추출액을 첨가한 후 새우의 형성된 흰반점을 관찰하였다. 생균제 후보균에 따라서 새우에 흰반점이 가장 많이 형성된 경우(도 2), 적은 량의 흰반점 형성 경우(도 2), 흰반점이 형성 안된 경우(도 3)가 육안으로 구별할 수 있을 만큼 뚜렷이 나타났다. 따라서 인위적으로 흰반점새우추출액의 공격감염(challenge infection)에 의한 감염과 흰반점형성이 육안으로 확인되었으므로 이 방법을 사용하여 흰반점증후군바이러스 감염과 흰반점 형성을 억제할 수 있는 생균제 균주를 탐색할 수 있게 되었다. 이와 더불어 새우의 건강상태, 활발한 움직임 정도, 새우 껍질의 단단한 강도도 흰반점형성 정도와 더불어 우수균주 선별 기준이 된다.
[ 실험예 6] 줄새우를 이용한 흰반점증후군바이러스 감염을 억제하는 우수 프로바이오틱스 후보균 탐색
수집한 분리세균과 보유세균들로부터 우수 프로바이오틱스 후보균주를 선별하기 위하여 줄새우에 흰반점증후군바이러스를 직접 인위적으로 감염시키는 공격실험(challenge test)을 통해 감염을 감소시키는 효과가 큰 생균제들을 탐색하였다. 생균제 후보 균주들은 3% NaCl를 함유한 TSB (Tryptic Soy Broth)에서 37℃, 200 rpm에서 24 시간 동안 배양하였다.
생균제 후보균의 배양액 (OD 600=1) 2 ml를 사육탱크에 넣어주고 2일 후 흰반점증후군바이러스 조직추출액 0.5 ml를 30마리의 줄새우가 들어 있는 새우양식 탱크(30× 21.0× 26.5 cm)의 11 리터 사육수에 직접 투여하였다. 투여 후 3일 간격으로 물을 갈아주었으며 새우의 행동을 매일 관찰하였다. 줄새우 배양 중 새우 사멸율을 측정하여, 상대적으로 새우 사멸율이 적고, 흰반점형성정도가 낮으며, 새우의 건강성과 움직임의 활발성, 새우껍질의 단단한 강도 등을 종합하여 생균제 후보 균을 선별하였다. 총 59 균주를 시험하여 우수한 3균주를 선정하였고 이들의 감염억제효과를 재확인 실험을 수행하였고 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
담수 줄새우에서 흰반점증후군바이러스(WSSV)에 대한 선별균의 감염 억제효과
균주 No 새우 생존율 ( % ) 새우 상태
3일 6 9 12 15 흰반점 건강상태 외피
단단함
대조구 무첨가 100 86.7 66.7 60.0 60.0 - ± ++
WSSV
첨가
100 73.3 53.3 20.0 0.0 ++ ± ±
후보균
+ WSSV
#1 100 86.7 66.7 56.7 46.7 ± ++ ++
#2 100 76.7 60.7 45.0 26.7 + + ++
#5 100 83.3 53.3 36.7 30.0 ± ++ +
흰반점 정도; ++ 많음, + 중간, ± 적음, - 없음. 건강상태: ++ 건강하고 매우 활발하게 운동, + 건강하고 활발함, ± 감소된 건강과 감소된 운동성.
외피의 단단함; ++ 단단함, + 중간, ± 연약함.
위 표 1에 나타난 바와 같이 15일째에 WSSV감염된 그룹은 모두 폐사하였으나, 이들 3균주들을 사용한 새우그룹들은 26%이상의 생존율을 보였고, no.1 균주가 가장 높은 생존율을 보였다. 새우의 상태에서는 이들 3 균주들은 모두 흰반점증후군바이러스 감염 대조구 그룹(WSSV 첨가)보다 흰반점 수가 뚜렷이 적었고, 건강상태, 새우껍질의 강도(단단한 정도)도 더 우수하였다.
흰반점증후군바이러스와 생균제 후보균을 첨가하지 않은 대조그룹에 비해서도 이들 3균주 모두 새우의 건강상태가 더 양호하였다. 전반적으로 보면 이들 3균주 중에서 no. 1, no. 5가 우수하였고, 특히 no. 1 균주가 가장 높은 새우 생존율, 가장 적은 흰반점 수와 양호한 새우건강상태, 단단한 껍질의 강도 등 여러 면에서 가장 우수한 흰반점증후군바이러스 감염억제효과를 나타내었다.
[ 실험예 7] 100 리터 해수에서의 흰다리새우 배양 및 감염억제 성능 시험
민물 줄새우로부터 선정한 후보균 no. 1과 no. 5 균주를 다시 확대하여 해수 흰다리새우로 시험하였다. 100 리터 해수를 담은 탱크에 공기펌프를 사용하여 2일 동안 공기를 불어 넣은 후 25마리 흰다리 새우 (각 약 6 g)를 넣고 2-3일 동안 적응 후 0.1% 생균제 배양균(OD 600 = 1.0, 3% NaCl를 함유한 TSB에서 37℃, 200 rpm에서 24 시간 배양)을 각 탱크에 접종 후 2일 후에 0.01% 흰반점증후군바이러스를 배양탱크에 직접 첨가하였다. 탱크1과 탱크2는 대조구(control)로서 탱크 1은 후보균과 흰반점증후군바이러스를 넣지 않았고, 탱크 2는 생균제 후보균은 넣지 않고 흰반점증후군바이러스만 넣었고, 탱크 3와 탱크 4는 흰반점증후군바이러스와 각각 생균제 후보균 no. 1 과 no. 5를 넣었다. 탱크 내 해수 온도는 24℃를 유지하였다.
실험 결과 표 2와 도 4에 나타낸 바와 같이 흰반점증후군바이러스에 감염된 그룹은 20일 후에 모두 사망하였으나, no. 1 경우 생존율 84%, 그리고 no. 5 경우 생존율 60%이었고, no. 1 경우는 26일째에도 계속 생존율 84%를 유지하였다. 새우의 건강상태에서는 no. 1 경우 흰반점 수가 가장 적었고, 건강상태는 가장 좋았고 새우가 활발히 운동하였으며, 새우 껍질의 강도도 단단하였다. 따라서 100리터 해수에서도 선정된 두 균주 no. 1과 no. 5는 모두 흰반점증후군바이러스 감염 억제 효과가 있었으며 특히 no. 1의 흰반점증후군바이러스 감염 억제 효과 및 건강 효과가 가장 뚜렷이 우수하였다.
해수 흰다리 새우에서 흰반점증후군바이러스(WSSV)에 대한 선별균의 감염 억제효과
균주 No 새우 생존율 ( % ) 새우상태
6일 16 20 21 24 26 흰반점 건강상태 외피의 단단함
대조구 무첨가 96 8 8 8 8 - + ++
WSSV첨가 96 96 0 0 0 0 ++ ± ±
후보균
+ WSSV
#1 96 84 84 84 84 ± ++ ++
#5 84 60 44 28 28 + + +
흰반점 정도; ++ 많음, + 중간, ± 적음, - 없음. 건강상태: ++ 건강하고 매우 활발하게 운동, + 건강하고 활발함, ± 감소된 건강과 감소된 운동성.
외피의 단단함; ++ 단단함, + 중간, ± 연약함.
[ 실험예 8] 비브리오(Vibrio parahaemolyticus ) 균에 대해 저해 측정
비브리오균이 섞여 있는 top agar를 씌운 저해환 측정용 agar 배지 표면에 penicylinder (용량 300 ㎕, 외경 8 ㎜, 내경 6 ㎜, 높이 10 ㎜) 또는 paper disc를 올려놓고, 여과 멸균된 후보균 배양상등액 100 ㎕를 각각의 penicylinder 또는 paper disc에 넣고 30℃배양기로 옮긴 후 3일간 배양하여 비브리오균 성장 저해환의 유무와 크기를 측정하는 agar diffusion 방법을 사용하였다. 모든 생균제 후보 균주들은 3% NaCl를 함유한 TSB (cell density 2×108/ml)과 비브리오균은 3% NaCl을 함유한 Nutrient Broth (세포농도 2×107/ml)에서 37℃, 200 rpm에서 24시간 동안 배양하였다.
실험결과, no.1 균주의 비브리오균 저해환은 4 mm 이었고, no. 2와 no. 5 균주들은 둘 다 3 mm이었다.
[ 실험예 9] 선정균주들의 여러 온도에서의 성장성, 염내성, 단백질분해효소 및 지질분해효소 활성
선정균주들이 생균제로서의 좋은 특성을 가졌는지 조사하기 위하여 여러 온도에서의 성장성, 염내성, 단백질분해효소 및 지질분해효소 활성을 측정하였다(표 3). 균체를 백금니를 사용하여 TSA 또는 MRS agar 배지에 스트리킹하고 18, 21, 25, 37℃에 2일 동안 (18℃ 경우는 3일 동안) 배양한 후 성장 상태를 +++, ++, +, -로 나타내었다.
No. 1, no. 2, no. 5 균주 모두 18~37℃에서 성장을 보였고, 25℃와 30℃에서 3% NaCl에서 성장하여 염내성을 나타내었으며, 25℃와 30℃에서 단백질분해효소 및 지질분해효소 활성을 보여 갑각류 프로바이오틱으로서의 좋은 모두 특성을 갖추었다.
이들 균주 들 중에서 특히 no. 1 균주는 조사한 모든 특성이 가장 우수하고, 높은 흰반점증후군바이러스 감염 억제능을 가지고 있고, 새우의 양식 중 체중증가 효과가 뛰어나며 비브리오균 억제능도 갖추고 있어 본 연구에서 갑각류 생균제로서 최종 선정하였다.
선정 균주들의 여러 온도에서의 세포성장도, 3% NaCl에서의 세포성장도, 단백질분해효소와 지질분해효소 활성.
균주
No.
여러온도(℃)에서의 세포 성장도 3% NaCl에서의 세포 성장도 효소 활성으로서의 콜로니 주변의 투명 환 지름 (cm)
단백질분해효소 지질분해효소
18 21 25 37 25 30 25 37 25 37
1 + ++ ++ ++ ++ ++ 6 11 3 8
2 ± ++ ++ ++ ++ ++ 5 6 <1 7
5 ± ++ ++ ++ ++ ++ 4 5 <1 5
[ 실험예 10] 균주의 동정
(1) 유전학적 동정
최종 선발된 no. 1 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 수행하였다. 이 균주로부터 분리된 게놈 DNA를 27F 프라이머 및 1492R 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 분석한 결과 각 서열번호 1과 같은 결과를 얻었고, 이 서열들을 NCBI BLAST N 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast/)을 이용하여 진뱅크(Genebank)에 등록된 염기서열과 상동성을 비교하였는데, 그 결과 Bacillus subtilis와 100%의 상동성을 보였다.
16S rRNA 염기서열에 근거하여, KS1 및 바실러스 서브틸리스로 동정하고 국립농업생명공학연구원 농업유전자원 센터에 2018년 10월 14일자로 KACC92239P로 기탁하였다.
(2) 생화학적 특성 분석
16S rRNA의 서열에 의해 바실러스 서브틸리스로 동정된 KS1 균주에 대해 API 50 CHL 키트(Bio Merioux)를 이용하여 당 이용 능을 분석하였고, 분석 결과를 표 4에 표시하였다. 이에 따르면, 최종 선발된 no. 1 은 생화학적 특성분석에서도 97.1% ID로 바실러스 서브틸리스로 동정되었다.
번호 기질 +/- 번호 기질 +/-
1 글리세롤( Glycerol ) + 26 살리신 ( Salicin ) +
2 에리트리톨 ( Erythritol ) - 27 셀로비오스 ( Cellobiose ) +
3 D- 아라비노스 (D- Arabinose ) - 28 말토스 ( Maltose ) +
4 L- 아라비노스 (L- Arabinose ) + 29 락토스 ( Lactose ) -
5 D- 리보스 (D- Ribose ) + 30 멜리비오스 ( Melibiose ) +
6 D- 자일로스 (D- Xylose ) + 31 수크로스 ( Sucrose ) +
7 L- 자일로스 (L- Xylose ) - 32 트레할로스 ( Trehalose ) +
8 D- 아도니톨 (D- Adonitol ) - 33 이눌린 ( Inulin ) +
9 메틸 -β-D- 자일로스 ( Methyl -β-D-Xylopyranoside) - 34 멜레지토스
( Melezitose )
-
10 갈락토스 ( Galactose ) - 35 라피노스 ( Raffinose ) +
11 글루코스 ( Glucose ) + 36 전분 ( Starch )) +
12 프락토스 ( Fructose ) + 37 글리코겐 ( Glycogen ) +
13 만노스 ( Mannose ) + 38 자일리톨 ( Xylitol ) -
14 소르보스 ( Sorbose ) - 39 젠티오비오스 ( Gentiobiose ) -
15 람노스 ( Rhamnose ) - 40 투라노스 (D- Turanose ) +-
16 둘시톨 ( Dulcitol ) - 41 릭소스 ( Lyxose ) -
17 이노시톨 ( Inositol ) + 42 타가토스 ( Tagatose ) -
18 만니톨 ( Mannitol ) + 43 D- 푸코스 (D- Fucose ) -
19 솔비톨 ( Sorbitol ) + 44 L- 푸코스 (L- Fucose ) -
20 메틸 -α-D- 만노피란시드
( Methyl -α- D- Mannopyranoside )
- 45 D- 아라비톨 (D- Arabitol ) -
21 메틸 - α-D-글루코시드
( Methyl -α-D- Glucoside )
+ 46 L- 아라비톨 (L- Arabitol ) -
22 N-아세틸-글루코사민
(N-Acetylglucosamine)
- 47 글루코네이트 ( Gluconate ) -
23 아미그달린 ( Amygdalin ) + 48 2- 케토 -글루코네이트(2-Ketogluconate) -
24 알부틴 ( Arbutin ) + 49 5- 케토 -글루코네이트(5-Ketogluconate) -
25 에스쿨린 ( Esculin ) -
농업생명공학연구원 KACC92239P 20181014
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Claims (3)

  1. 흰반점증후군바이러스 및 Vibrio parahaemolyticus균의 갑각류에 대한 감염력 억제 활성과, 단백질분해효소 및 지질분해효소 활성을 갖는, KACC92239P로 기탁된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) KS1.
  2. 청구항 1의 바실러스 서브틸리스 균주 또는 그의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 흰반점증후군바이러스 및 Vibrio parahaemolyticus균의 감염 억제 생균제.
  3. 청구항 1항의 바실러스 서브틸리스 균주 또는 그의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 흰반점증후군바이러스 및 Vibrio parahaemolyticus균의 감염 억제 갑각류 사료 첨가제.
KR1020190035679A 2019-03-28 2019-03-28 흰반점증후군바이러스 및 비브리오 세균의 갑각류 감염을 억제하는 생균제 및 그의 용도 KR102154172B1 (ko)

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