CN103272228A - 鲫鱼出血病生物防治方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：给养殖鲫鱼免疫接种多价载体疫苗；所述多价载体疫苗是利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该重组菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌HT5304（BacillussubtilisHT5304），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2013029。本发明还提供了枯草芽孢杆菌HT5304（BacillussubtilisHT5304）在鲫鱼养殖病害防治中的应用。本发明的生物防治方法是通过给养殖鲫鱼免疫接种多价载体疫苗，实现对鲫鱼病毒性病原和细菌性病原出血病的多效价免疫防治。

Description

鲫鱼出血病生物防治方法及应用

技术领域

本发明涉及一种用于鲫鱼出血病免疫防治的鲫鱼出血病生物防治方法及应用，属于微生物学、免疫学和水产动物病害防治领域。 

背景技术

鲫鱼，属于鲤科，是我国主要养殖的大宗淡水鱼之一。然而在鲫鱼养殖过程中，不仅受到病毒的侵染威胁同时也面临环境中细菌性感染的潜在风险。目前在我国鲫鱼养殖过程的重大疫病风险主要来自于由鲤疱疹病毒II（CyHV-2）和气单胞菌（主要为嗜水气单胞菌）引发的鲫鱼出血病，这些病害给鲫鱼养殖业的健康发展带来了破坏性影响和严重经济损失。 

疱疹病毒性造血器官坏死病（herpesviral haematopoietic necrosis，HVHN）是鲫鱼的一种高致病性病毒病，最初对该病的病原定义为金鱼造血器官坏死病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV），也有称作疱疹病毒性造血器官坏死病病毒（herpesviral haematopoietic necrosis virus，HVHNV）。该病原是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，按照国际病毒系统分类委员会的系统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）。它与另外两个感染鲤科的病毒鲤疱疹病毒I型（CyHV-1）和鲤疱疹病毒III型（CyHV-3）在进化上有着较近的亲缘关系（Waltzek TB, et al. 2005. J Gen Virol 86:1659-1667）。目前对此三种病毒已建立起快速、准确的分子生物学诊断检测方法（Goodwin A.E.,et al.2006 Diseases of Aquatic Organisms 69, 137-143）。 

鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）是直径为175~200 nm的二十面体，有囊膜包裹（Groff J M，et al.1998，J Vet Diagn Invest，1（04）：375-378）, 该病毒主要在水温18℃-25℃条件下致使鱼发病，发病鲫鱼具体症状表现为体表出血，尤其是鳃盖与腹部前部出血严重。由幼鱼到成鱼均有发生，是一种高传染性和死亡率较高的重大疫病。CyHV-2于1992年最先在日本被发现，之后在澳大利亚、美国和我国台湾地区相继有报道，由CyHV-2引发的死亡率可高达100%（Jung SJ et al.1995. J Fish Dis 18:211-220; Stephens FJ, et al.2004 Aust Vet J82:167-169；Waltzek T B et al. 2007. J Aquat Anim Health 21:60-67; Andor D et al. 2011. Magyar Allatorvosok Lapja 13:174-181）。2011在靠近捷克共和国易北河附近的湖泊中发现大量异育银鲫因感染CyHV-2而产生大面积的死亡（Daněk T, et al., 2012 Dis Aquat Organ 102(2):87-95）。2009年以来，该病毒在我国许多省市鲫鱼养殖地区相继引发大面积病害，给鲫鱼养殖业带来巨大冲击。 

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于弧菌科、气单胞菌属，是一种常见的病原菌，属于革兰氏阴性菌，使两栖类、鱼类、爬行类及人类等多种动物受到感染，是一种人-兽-鱼共患病病原菌。嗜水气单胞菌可产生许多毒性很强的外毒素，一般水产动物感染嗜水气单胞菌之后常引发肝肾脏异变，症状为全身出血，该菌也是鱼类细菌性出血病的主要病原菌。此外在发病鲫鱼中也已分离纯化到嗜水气单胞菌，经回染实验证明鲫鱼出现出血症状（刘亚楠等，2012，水生态学杂志05期；陆文浩等，2009，广东海洋大学学报，第01期），在鲫鱼养殖过程中该病原常伴随病毒性病害同时发生，已开发的单效价疫苗往往难以奏效，给防治带来困难。 

综上所述，针对鲫鱼出血病这一重大疫病，构建一种高效、经济和应用便利并可同时抵御病毒和细菌性病原侵染的多效价生物防御体系是鲫鱼养殖业健康可持续发展的迫切生产需求。 

在水产养殖病害防治中，使用疫苗是一种较理想的预防方法，接种疫苗已经成为世界范围内水产养殖业发达国家和地区的生产养殖规范。而口服剂型疫苗因其相对注射接种和浸泡接种疫苗在水产养殖生产中更为便利和经济，不会给鱼类造成不必要的应激反应，是水产疫苗最为理想的疫苗产品形式。 

表面展示技术是利用分子生物学方法将小肽或蛋白质固定在噬菌体、细胞或芽孢的表面（Kim, et al. 2009，Cell Mol Life Sci 66: 3127-3136.），该技术在疫苗研发领域具有重要的应用（Lee, J.S. ,et al. 2000. Nature Biotechnol 18: 645-648.），其中芽孢表面展示技术已被证明是一种高效的抗原传递方式，通过口服或粘膜形式免疫给药均可激发机体免疫反应，达到有效的疾病预防效果（Flick-Smith HC ,et al. 2002 Infect Immun 70:2022-2028；Duc IH ,et al. 2007，Vaccine 25:346-355）。目前，在水产疫苗研发领域，D.Ning等证明利用枯草芽孢杆菌表面展示技术制备的口服疫苗可有效用于对虾白斑综合症病的预防（D.ning et al.，2011，J Appl Microbiol，111（6）:1327-1336）。这些研究说明基于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术，可为水产口服疫苗的开发提供一种潜在的应用技术平台。 

穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）是具有细胞膜穿透能力的一段碱性氨基酸多肽，在蛋白质中部序列具有富含阳离子区域，可直接携带其它DNA、多肽及蛋白质等大分子穿越脂质双分子层完成跨膜转运，将外源物质运送到动物细胞内（Lindgren M et al.，2000. Trends Pharmacol Sci，21(3):99-103）。穿膜肽由于其显著的细胞膜穿透能力，可携带抗原分子进入生物体并定位于组织细胞且有效激发机体免疫反应，在国际上已被广泛应用于疫苗的开发, 并被证明是一种新型有效的抗原蛋白递送载体分子（Sakuma S, et al., 2012. Mol Pharm 9(10):2933-41）。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有病害防治技术中在鲫鱼出血病防治上存在的不足之处，提供一种鲫鱼出血病生物防治方法及应用，所述生物防治方法是通过给养殖鲫鱼免疫接种多价载体疫苗，实现对鲫鱼病毒性病原和细菌性病原出血病的多效价免疫防治。 

按照本发明提供的技术方案：鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：给养殖鲫鱼免疫接种多价载体疫苗；所述多价载体疫苗是利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该重组菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌 HT5304（Bacillus subtilis HT5304），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2013029。 

作为本发明的进一步改进，所述鲫鱼出血病是指由鲫鱼疱疹病毒（CyHV-2）和/或嗜水气单胞菌导致的鲫鱼出血病。 

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成芽孢后能够在芽孢表面展示嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗原蛋白。 

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上重组整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因相融合所获得的cotB-gapdh融合基因片段（SEQ ID NO: 1），所述融合基因片段重组整合在枯草芽孢杆菌重组菌株染色体上的amyE基因位点，通过诱导该枯草芽孢杆菌重组菌株可产生能够表面展示嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗原蛋白的芽孢。 

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够分泌穿膜肽与鲤疱疹病毒II（CyHV-2）囊膜蛋白ORF81形成的融合蛋白。 

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组整合有由枯草芽孢杆菌p43启动子、分泌信号肽sacB基因、穿膜肽tat基因和鲤疱疹病毒II（CyHV-2）囊膜蛋白orf81基因相融合所获得的p43-sacB-tat-orf81融合基因片段（SEQ ID NO: 2），该p43-sacB-tat-orf81融合基因片段利用同源交换整合至枯草芽孢杆菌染色体的lacA基因位点，该枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够胞外分泌表达穿膜肽与鲤疱疹病毒II（CyHV-2）囊膜蛋白ORF81的融合蛋白。 

作为本发明的进一步改进，所述多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢形式添加到饲料中，以口服方式接种免疫。 

本发明的枯草芽孢杆菌重组菌株构建方法为： 

采用枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术，利用枯草芽孢杆菌孢衣蛋白CotB为分子载体，与嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）融合，利用同源交换原理整合至枯草芽孢杆菌染色体amyE基因位点；然后以该枯草芽孢杆菌为出发载体菌株，进一步从鲤疱疹病毒II（CyHV-2）中克隆囊膜蛋白基因orf81并与枯草芽孢杆菌分泌信号肽sacB基因和穿膜肽基因tat融合，获得sacB-tat-orf81融合基因，将融合基因克隆至枯草芽孢杆菌p43启动子下游并利用同源交换整合至上述枯草芽孢杆菌染色体lacA基因位点。通过上述方法获得的枯草芽孢杆菌重组菌株即为鲫鱼出血病多价载体疫苗。

本发明还提供了保藏号为CCTCCNo：M2013029的枯草芽孢杆菌 HT5304（Bacillus subtilis HT5304）在鲫鱼养殖病害防治中的应用。 

生物材料样品保藏：分类命名是枯草芽孢杆菌 HT5304（Bacillus subtilis HT5304），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2013029，保藏日期为2013年1月20日，保藏地址中国武汉 武汉大学。

本发明与现有技术相比，优点在于：本发明通过给养殖鲫鱼免疫接种多价载体疫苗，实现对鲫鱼病毒性病原和细菌性病原出血病的多效价免疫防治。所述多价载体疫苗是利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成芽孢后能够在芽孢表面展示嗜水气单胞菌GAPDH抗原蛋白，在形成营养细胞时能够分泌穿膜肽与CyHV-2囊膜蛋白ORF81构成的融合蛋白。本发明利用芽孢所具有的独特抗逆性，将枯草芽孢杆菌重组菌株以芽孢形式添加到鲫鱼饲料中口服免疫，芽孢能携带嗜水气单胞菌GAPDH抗原蛋白顺利通过鱼的消化道屏障，激发鱼的体液免疫反应，同时芽孢在鱼肠道定植萌发形成营养细胞，营养细胞能够大量分泌穿膜肽与CyHV-2囊膜蛋白ORF81构成的融合蛋白，穿膜肽携带囊膜蛋白ORF81透过胃肠道细胞的磷脂双分子层进入宿主细胞，激活鱼的细胞免疫反应。本发明构建的基于多价载体疫苗免疫接种的鲫鱼出血病生物防治方法不仅可用于养殖鲫鱼出血病的多效价免疫防治，同时可以应对病毒病和细菌病的多重侵害。并且该方法可通过添加到饲料中以口服方式实现高效免疫接种，具有广阔的商业开发前景。 

附图说明

图1为口服免疫接种多价载体疫苗的鲫鱼对鲤疱疹病毒II（CyHV-2）的免疫效果评价实验统计结果图。 

图2为口服免疫接种多价载体疫苗的鲫鱼对嗜水气单胞菌的免疫效果评价实验统计结果图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。 

实施例1：鲫鱼出血病多价载体疫苗的制备

1、培养基配制

（1）DSM液体培养基：细菌营养肉汤（Difco）8g，10%（w/v）KCl 10ml，1.2%（w/v） MgSO₄·7H₂O 10ml，1M NaOH 1.5ml，调pH至7.6，ddH₂O定容至1000ml。高压灭菌后，冷却至50℃，在使用前分别加入已灭菌的1M Ca（NO₃）₂、0.01MMnCl₂、1mMFeSO₄各1ml。

（2）PBS缓冲液：Na₂HPO₄·2H₂O 2.74g/L，NaH₂PO₄·H₂O 0.63g/L， 将所述成份溶解于1000ml 蒸馏水，于121℃灭菌20分钟。 

（3）LB培养基：胰蛋白胨（Tryptone） 10g/L，酵母提取物（Yeast extract） 5g/L，氯化钠（NaCl） 10g/L，调pH至7.0。 

2、平板培养基复苏：取-80℃保存的保藏号为 CCTCCNo：M2013029 的枯草芽孢杆菌重组菌株种子划线接种于LB固体平板上，在37℃培养过夜，使枯草芽孢杆菌重组菌株复壮，形成单菌落。 

3、种子的制备：挑取单菌落接种于100ml DSM液体培养基中，37℃培养18h，OD₆₀₀至2.0，作为种子液。 

4、发酵液的制备：制备的种子液按照1%的接种量接种到5L生物反应器中，采用DSM液体培养基，培养温度37℃，通气量2L/分钟，pH7.5，培养25-30h，至芽孢形成率90%以上，终止发酵，得发酵液。 

5、枯草芽孢杆菌芽孢菌粉的制备：将上述发酵液于室温以5000g离心10分钟，收集菌泥，向菌泥中加入15%重量百分比的淀粉，喷雾干燥，得到水分重量百分含量<5%的枯草芽孢杆菌芽孢菌粉，该枯草芽孢杆菌芽孢菌粉即为所述的用于防治鲫鱼出血病的多价载体疫苗。 

6、疫苗饲料的制备：将上述的枯草芽孢杆菌芽孢菌粉与鱼饲料原料混合制粒，按大约1×10¹⁰个芽孢/g饲料进行包被，饲料经微粉碎后过40目筛，混合均匀后用小型颗粒饲料机加工成直径1.5mm的颗粒饲料备用，饲料加工过程中温度65-70℃持续时间约10min。 

  

实施例2：口服免疫接种多价载体疫苗的鲫鱼对鲤疱疹病毒II（CyHV-2）的免疫效果评价。

实验用鱼的饲养：从江苏购置的试验用鱼（鲫鱼）经无CyHV-2携带检测后暂养于2000L水族箱，配以流动循环淡水处理和净化系统，养殖水温维持20±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。选择体重为350±50g的健康鲫鱼随机分组至200L试验水族箱，每个水族箱30条，实验水族箱每天换水两次，换水量为1/3，维持水温20±2℃，继续暂养2周。 

CyHV-2病毒悬浮液制备：解剖病鱼，选取鳃、肾和脾，剪碎后在液氮下研磨，按1/10（w/V）的比例，加入TN缓冲液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH 7.6，0.4 mol/ L NaCl），用玻璃匀浆器在冰浴下匀浆，匀浆液经4℃，7000 g离心20 min，弃沉淀；上清经0.45μm微孔滤膜过滤后，4℃，20000 g离心50 min，沉淀用TN缓冲液悬浮至终浓度为1×10⁶IU/ml，实验室保存备用。 

免疫效力评价：上述已分组水族箱分别设置空白对照组、口服对照组、免疫对照组和免疫组。其中空白对照组和口服对照组饲喂正常基础饲料，免疫对照组饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组饲喂用实施例1制备的疫苗饲料，每组设置3个平行。 

将上述各组鲫鱼连续饲喂免疫3天，每条鱼每天免疫3g饲料，免疫一周后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，停止免疫28天后，对除空白对照组外的各组鲫鱼分别攻毒，攻毒的方式为每条鱼腹腔注射实验室储存的CyHV-2病毒悬液100μl。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况，14天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组鱼的累计死亡率，统计结果如图1所示。 

利用下列公式计算相对免疫保护率： 

相对免疫保护率（RPS）%＝（口服对照组的累计死亡率-免疫组的累计死亡率）/口服对照组的累计死亡率×100%。

经计算，实施例1制备的多价载体疫苗对鲤疱疹病毒II的免疫保护率达到70%，由此可见，该疫苗对鲤疱疹病毒II的感染具有很好的防治效果，能有效地保护鲫鱼受到鲤疱疹病毒II的侵染，具有很好的应用价值。 

  

实施例3：口服免疫接种多价载体疫苗的鲫鱼对嗜水气单胞菌的免疫效果评价。

实验用鱼的饲养：从江苏购置的试验用鱼（鲫鱼）经无CyHV-2携带检测后暂养于2000L水族箱，配以流动循环淡水处理和净化系统，养殖水温维持20±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。选择体重为350±50g的健康鲫鱼随机分组至200L试验水族箱，每个水族箱30条，实验水族箱每天换水两次，换水量为1/3，维持水温20±2℃，继续暂养2周。 

病原菌悬浮液的制备：在LB液体培养基中培养嗜水气单胞菌至OD₆₀₀为0.6，然后于室温以5000rpm离心10分钟，收集沉淀菌体，用PBS缓冲液悬浮至终浓度为1×10⁹cfu/ml，实验室保存备用。 

免疫效力评价：上述已分组水族箱分别设置空白对照组、口服对照组、免疫对照组和免疫组。其中空白对照组和口服对照组饲喂正常基础饲料，免疫对照组饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组饲喂用实施例1制备的疫苗饲料，每组设置3个平行。 

将上述各组鲫鱼连续饲喂免疫3天，每条鱼每天免疫3g饲料，免疫一周后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，停止免疫28天后，对除空白对照组外的各组鲫鱼分别攻毒，攻毒的方式为每条鱼腹腔注射实验室储存的嗜水气单胞菌病原菌悬液0.1ml。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况，14天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组鱼的累计死亡率，统计结果如图2所示。 

利用下列公式计算相对免疫保护率： 

相对免疫保护率（RPS）%＝（口服对照组的累计死亡率-免疫组的累计死亡率）/口服对照组的累计死亡率×100%。

经计算，实施例1制备的多价载体疫苗对嗜水气单胞菌的免疫保护率达到83%，由此可见，该疫苗对嗜水气单胞菌的感染具有很好的防治效果，能有效地保护鲫鱼受到嗜水气单胞菌的侵染，具有很好的应用价值。 

序列表

<110>无锡海健生物科技有限公司

<120>鲫鱼出血病生物防治方法及应用

<160> 2

 

<210> 1

<211>2527

<212> DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

<400>1

acgattaggc cgtttgtcct catggacccg tataaaaaga atgatattga gcgttttgac     60

cgtgagccgg atgtgatctg cgagtatatt aaaaaccgtt cacaatacct caaagatcat    120

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ggcatag                                                   2527

 

<210> 2

<211>1285

<212> DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

<400>2

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Claims (8)

1. 鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：给养殖鲫鱼免疫接种多价载体疫苗；所述多价载体疫苗是利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该重组菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌 HT5304（Bacillus subtilis HT5304），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2013029。

2.如权利要求1所述的鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：所述鲫鱼出血病是指由鲫鱼疱疹病毒（CyHV-2）和/或嗜水气单胞菌导致的鲫鱼出血病。

3.如权利要求1所述的鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成芽孢后能够在芽孢表面展示嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗原蛋白。

4.如权利要求1所述的鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上重组整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因相融合所获得的cotB-gapdh融合基因片段（SEQ ID NO: 1），所述融合基因片段重组整合在枯草芽孢杆菌重组菌株染色体上的amyE基因位点，通过诱导该枯草芽孢杆菌重组菌株可产生能够表面展示嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗原蛋白的芽孢。

5.如权利要求1所述的鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够分泌穿膜肽与鲤疱疹病毒II（CyHV-2）囊膜蛋白ORF81形成的融合蛋白。

6.如权利要求1所述的鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组整合有由枯草芽孢杆菌p43启动子、分泌信号肽sacB基因、穿膜肽tat基因和鲤疱疹病毒II（CyHV-2）囊膜蛋白orf81基因相融合所获得的p43-sacB-tat-orf81融合基因片段（SEQ ID NO: 2），该p43-sacB-tat-orf81融合基因片段利用同源交换整合至枯草芽孢杆菌染色体的lacA基因位点，该枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够胞外分泌表达穿膜肽与鲤疱疹病毒II（CyHV-2）囊膜蛋白ORF81的融合蛋白。

7.如权利要求1所述的鲫鱼出血病生物防治方法，其特征在于：所述多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢形式添加到饲料中，以口服方式接种免疫。

8.保藏号为CCTCCNo：M2013029的枯草芽孢杆菌 HT5304（Bacillus subtilis HT5304）在鲫鱼养殖病害防治中的应用。

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