CN109821013B - 抗对虾白斑病疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗对虾白斑病疫苗，其活性成分为如SEQ ID NO.1所示的蛋白，具体的，可以为含有能够表达SEQ ID NO.1所示的蛋白的重组工程菌的培养物，其制备方法为：(1)将如SEQ ID NO.2所示的合成基因Y1798G与空白载体连接获得重组载体；(2)将上述重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，扩大培养，所得培养物经过一定方法处理即为抗对虾白斑病疫苗。本发明的抗对虾白斑病疫苗，通过饲喂对虾即可达到预防对虾白斑病的目的，具有免疫活性高、效率高、实用价值高等优点。此种方法研制的口服疫苗不仅能针对对虾等水产生物，对于其它动物的口服疫苗的研制同样是一种有效的策略。

Description

抗对虾白斑病疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗对虾白斑病疫苗，及其制备方法，属于免疫技术领域。

背景技术

虾白斑综合症病毒(wssv)是对全球养殖对虾危害最大的病毒，毒力极强，感染宿主后致死率高达90～100％。对虾一般感染后48小时出现白斑，4天内死亡率达100％。这严重影响了对虾的产量以及对虾养殖用户的热情。WSSV除能感染大多数虾品种外，还能感染非对虾种类，如端足类、介形类、蟹类、龙虾类、桡足类、水蝇类等甲壳纲动物，这些动物中多数感染WSSV而不出现特殊病理症状，可在海洋生态系统充当WSSV传播的中间宿主，给对虾养殖和野生甲壳纲动物资源构成严重威胁，其疫情至今尚未得到有效控制。

现有技术中防治对虾白班症病毒通常采用治疗性疫苗，包括灭活疫苗和减毒疫苗，但都存在不少缺陷。相比之下，利用基因工程技术生产对虾白斑综合征病毒新疫苗是今后的研究的方向。利用基因工程技术所生产的疫苗包括亚单位疫苗、肽疫苗、DNA疫苗、活体重组疫苗等。

目前关于对虾白斑病症病毒的亚单位疫苗的研究主要集中在wssv的囊膜蛋白VP28，VP19和被膜蛋白VP26组成的单价抗原亚单位疫苗或双价抗原亚单位疫苗，而相关报道证明双价或多价抗原亚单位疫苗比单价抗原亚单位疫苗对白斑综合症病毒有更好的预防作用。

表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，它是利用基因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，将其作为一种疫苗使用，属于亚单位疫苗的范畴。抗原表位又称为抗原决定簇(AD)，抗原分子中抗原特异性的化学基团，它能够与T细胞抗原受体TCR或B细胞抗原受体BCR特异性结合，最终刺激机体的免疫反应。

发明内容

针对上述现有技术，鉴于目前国内外对WSSV疫苗的研究近况，融合申请人的研究，本发明提出了创新性的抗对虾白斑症病毒疫苗研发思路，即利用目前有研究证实与WSSV感染与致病力有关的重要决定因子囊膜蛋白VP28、VP19和被膜蛋白VP26，从这三种蛋白基因中筛选表位基因，利用基因工程手段，组成串联的表位基因，利用基因载体生产抗原表位蛋白，最终通过合适的渠道生产具有预防和治疗效应的疫苗。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种抗对虾白斑病疫苗，其活性成分为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白：

MGPKKDSDSDTDKDTDDDDDTANDNDDEDKYKNRTSYPKRRQTKTIETHTDNIETIRNGKSDAQMKEENTSRKINITGMQMVPKINPSKAFVGSSNTSSYSGTETERGERSYNTPGLSDKDMKTAPRTDPAGTGAENSIKGNTMSSKDIKSSSSEDGAAFDEIKKK；如SEQ ID NO.1所示。

一种抗对虾白斑病疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将合成基因Y1798G(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)与空白载体PET-32a连接获得重组载体；

(2)将上述重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，筛选出高表达菌株，扩大培养，所得培养物即作为抗对虾白斑病疫苗(培养物中含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白)；进一步地，对培养物进行提取纯化得到目的蛋白或热灭活处理；具体应用时，将培养物或目的蛋白通过低温喷涂技术的处理，按照一定的配比添加到虾饲料中即可。

进一步地，所述步骤(1)中，获得重组载体的具体方法为：利用限制性内切酶NcoI、BamHI分别对合成基因Y1798G、空白载体PET-32a进行双酶切，然后连接，得到重组载体。

所述双酶切体系如下：

合成基因Y1798G的双酶切体系(25ul体系)：10×NEB buffer3.1，2ul；Y1798Gplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH₂O，7ul；37℃，温育2h；

空白载体PET-32a的双酶切体系(25ul体系)：10×NEB buffer3.1，2ul；PET-32aplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH₂O，7ul；37℃，温育2h。

所述连接体系(20ul体系)如下：10×T4DNA连接反应缓冲液，2ul；T4DNA连接酶，1ul；带切口的载体PET-32a，4ul；目的DNA片段Y1798G，6ul；灭菌水，7ul；连接反应混合液于16℃，反应30～50分钟，后置4℃备用。

优选的，所述步骤(2)中，宿主为大肠杆菌。

进一步地，所述步骤(2)中，将重组载体导入宿主的具体方法为：取重组载体，加入到BL21(DE3)感受态中，轻弹混匀，冰上放置30分钟，置42℃水浴中热激90s,迅速转移至冰上放置3分钟，加入890ul新鲜的soc培养基，摇床培养1h，37℃；取50ul涂布于含有终浓度为100ug/ml氨苄的平板上，倒置过夜(10～14h)培养；可在含有氨苄的平板上生长的单菌落即为转化成功的转化子。

进一步地，所述步骤(2)中，扩大培养的具体方法为：

①挑取在含有氨苄的平板上生长的单菌落，于新鲜的含有氨苄(100μg/ml)的LB培养基上划线活化，37℃过夜(10～14h)培养，获得单克隆；

②挑取上述单克隆，接种于新鲜的含有终浓度100μg/ml的氨苄青霉素的LB中，37℃，220rpm培养5～6小时，使菌达到对数期生长期；

③取上述培养到对数期的菌液，按照1％(体积比)的接种量转接于新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素、1％(质量百分数)葡萄糖的LB培养基中，37℃，220rpm培养2～3h，待菌液OD₆₀₀达到0.6～1.0时，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，20～40℃诱导培养3～30h。

优选的，所述步骤(2)中，对培养物进行处理的具体处理方法为：于4℃～8℃,3000～5000rpm离心10～20min，收集菌体，加入原体积或1.5～2倍原体积的PBS缓冲液洗涤菌体，4～8℃，3000～5000rpm离心10～20min，离心后重新收集菌体，加入原体积约1/4～1/3体积的PBS重悬菌体，加入终浓度为1mM的PMSF，0.5mM的溶菌酶，2ul的DNaseI,冰浴中放置1～2h左右。置冰浴中，超声破碎20～40min，直至90％以上的菌体破碎。破碎的菌液，于4℃～8℃，经6000～8500rpm离心10～30min,收集上清，利用Ni Sepharose吸附柱及脱盐等操作纯化回收上清中的目的蛋白；或：于4℃～8℃,离心，收集菌体，加入原体积或1.5～2倍原体积的PBS缓冲液洗涤菌体，4℃，离心后重新收集菌体，加入原体积约1/3～1/4体积的PBS重悬菌体，于65～80℃热灭活10～20min。

进一步地，为验证培养物中是否含有目的蛋白，以及研究其性能，对培养物中的目的蛋白进行提取纯化，提取纯化的具体方法为：

(a)提取：

①上述扩大培养得到的菌液，于4℃～8℃，3000～5000rpm离心10～30min，收集沉淀，去上清；

②向上述得到的沉淀中加入菌液原体积(即步骤①中离心处理前的菌液的体积)1.5～2倍的PBS缓冲液以洗涤菌体，4℃～8℃，3000～5000rpm离心10～20min，弃上清，收集菌体；

③向上述得到的菌体中加入菌液原体积1/4～1/3的PBS缓冲液重悬菌体，再加入终浓度为1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，0.5mM的溶菌酶和2ul的DNaseI，冰浴中放置1～2h，得处理后菌液；

④将上述得到的处理后菌液倒入干净的三角瓶中，置冰浴中，超声破碎20～40min，超3～10秒停3～10秒，150～300w，振幅为65％～85％，得破碎的菌液；

⑤上述得到的破碎的菌液，装入离心管中，4℃～8℃,6000～8500rpm离心10～30min，收集上清液；

(b)纯化：

①向PD-10柱内填充材料；剪开PD-10柱的下部出水口，把事先经酒精和蒸馏水漂洗的滤膜(先用体积浓度为20％的酒精洗滤膜，再用蒸馏水漂洗滤膜)放入PD-10柱底部；

所述填充材料是通过以下方法制备得到的：轻轻晃动盛Ni Sepharose 6FastFlow基质的瓶子，使基质混匀；吸取3～5mL到15mL离心管中，以500～600×g离心5～10min，弃上清，用10～15mL去离子水重悬基质，轻晃3～5min，500～1000×g离心5～10min，弃上清；加入10～15mL Bingding buffer，轻晃3～5min，500～1000×g离心5～10min，弃上清；加入Bingding buffer，配成基质浓度为40％～60％(体积百分数)的填充材料；

所述Bingding buffer的组分组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，40mM咪唑，余量为水；

所述Elution buffer的组分组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，余量为水；

②将上清液加入到填充材料中(每1mL填充材料加入3～5ml上清液)，在室温下、摇床上以最低转速轻摇1～2h，得混合液；

③用盖子堵住PD-10柱下端出口，将混合液加入PD-10柱中，打开下端出口，靠重力让液体流出，流出部分为不带有His标签的蛋白，带有His标签的重组蛋白结合到填料上；

④用4～6倍柱体积的Binding buffer淋洗以洗去杂蛋白；

⑤上述淋洗后，用4～6倍柱体积的Elution buffer淋洗以洗脱带有His标签的重组蛋白；用10～12倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子；

⑥收集上述洗脱液，装入透析袋中(每个透析袋装液不超过体积的2/3)，置于浓度为0.01M的PBS缓冲液(pH 8.0)中透析，每6～8小时更换一次PBS缓冲液，更换2～3次后，透析结束，透析袋中即为目的蛋白。

本发明的抗对虾白斑病疫苗，使用方式为：将抗对虾白斑病疫苗与虾养殖饲料混合，饲喂对虾。经过纯化的抗对虾白斑病疫苗按照1600～3200倍的稀释比例同基础饲料拌料。或：带有菌体保护的抗对虾白斑病疫苗，疫苗量终浓度按照1×10⁶～1×10⁸cfu/g同基础饲料拌料。按照虾总体重的0.8％～1.2％量投喂，每天3～5次。

本发明的抗对虾白斑病疫苗，由于抗原表位的特异性的识别功能，它理论上能明显提高疫苗的免疫强度；在结构上它是一个多表位抗原蛋白，特异性更高；在免疫方式上，将经过纯化或者低温热灭活的菌体，通过低温喷涂直接掺入到饲料中，不仅节约了成本，而且维持了疫苗的稳定性，使得此种免疫方式，可行性更强，更科学合理。

附图说明

图1：构建重组质粒前的表位基因和经双酶切切后的空白表达载体电泳图。

图2：重组菌诱导条件的探索，其中，Lane1：对照0.1mM IPTG室温诱导3h；Lane2：重组菌0.1mM IPTG 37℃诱导3h；Lane3：重组菌0.1mM IPTG 37℃诱20h；Lane4：重组菌0.1mMIPTG室温诱导3h；Lane5：重组菌0.1mM IPTG室温诱导20h；Lane6：重组菌0.5mMIPTG 37℃诱导3h；Lane7：重组菌0.5mM IPTG室温诱导3h；Lane8：重组菌1mM IPTG 37℃诱导3h；Lane9：重组菌1mM IPTG室温诱导3h；Lane10：低分子蛋白marker。

图3：重组表达菌超声破碎后的沉淀和上清sds-page电泳图。

图4：纯化后的目的蛋白sds-page胶展示，其中，(1)为纯化后含有trx的目的蛋白；(2)为经牛肠激酶切去trx融合蛋白的目的蛋白及wssv病毒的电泳图。

图5：对虾白斑病毒Western blot结果图，其中，(1)为转膜图片，(2)为化学发光图，(3)为考马斯亮蓝染胶。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实验一研制对虾白斑病抗体疫苗

一、抗原表位的筛选

表位抗原(Epitope)，一般是由6～12个氨基酸或碳水基团组成，它是由连续或不连续的蛋白三维结构组成，它具有亲水性、弹性、可触性等特点。

申请人利用Lasergene软件包中的protean软件预测以及所掌握的经验，经过筛选后，最终确定的抗原表位的氨基酸序列为：

MGPKKDSDSDTDKDTDDDDDTANDNDDEDKYKNRTSYPKRRQTKTIETHTDNIETIRNGKSDAQMKEENTSRKINITGMQMVPKINPSKAFVGSSNTSSYSGTETERGERSYNTPGLSDKDMKTAPRTDPAGTGAENSIKGNTMSSKDIKSSSSEDGAAFDEIKKK；如SEQ ID NO.1所示。

上述序列经过密码子的优化，最终送华大基因公司进行基因序列的合成工作。所合成的完整基因序列为：

ccATGGGTCCGAAGAAAGACTCTGACAGCGATACCGACAAGGACACCGACGACGATGACGACACTGCGAACGACAACGATGATGAGGACAAATACAAAAACCGTACCTCTTATCCGAAACGTCGCCAGACCAAGACCATCGAGACCCACACTGATAACATCGAAACCATCCGTAACGGCAAGTCCGACGCGCAGATGAAAGAAGAAAACACTTCTCGTAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTTCCGAAAATCAACCCGTCTAAAGCGTTCGTTGGTTCCTCTAACACCTCTTCTTACTCTGGTACCGAAACCGAACGTGGTGAACGCTCTTACAACACCCCGGGTCTGTCTGATAAGGATATGAAAACCGCTCCGCGTACCGACCCGGCTGGTACTGGTGCGGAAAACTCTATCAAAGGTAACACCATGTCTTCTAAAGACATCAAATCTTCTAGCTCTGAAGACGGTGCTGCGTTCGACGAAATCAAAAAGAAGTAAggatcc；如SEQ ID NO.2所示。

此合成基因的名为Y1798G，长度为509bp，克隆所用载体为PGH(EcoRV)，具有氨苄的抗性。

二、表达载体的构建

利用碱裂解法分别提取克隆载体质粒和表达载体质粒，由于所合成的基因上携带有限制性内切酶位点NcoI/BamHI，利用这两个限制性内切酶分别对克隆载体和表达载体进行双酶切，目的条带分别进行切胶回收，电泳检测(如图1所示)。双酶切体系如下：

合成基因Y1798G的体系(25ul体系)：10×NEB buffer3.1，2ul；Y1798G plasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH₂O，7ul；37℃，温育2h；

空白载体PET-32a的体系(25ul体系)：10×NEB buffer3.1，2ul；PET-32aplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH₂O，7ul；37℃，温育2h。

将目的条带与带切口的空白表达载体进行连接，构建重组表达载体，连接体系(20ul体系)为：10×T4DNA连接反应缓冲液，2ul；T4DNA连接酶，1ul；带切口的载体PET-32a，4ul；目的DNA片段Y1789G，6ul；灭菌水，7ul；连接反应混合液于16℃，反应30～50分钟，后置4℃备用。

重组表达质粒的转化：连接液5～10ul,加入到BL21(DE3)感受态中，轻弹混匀，冰上放置30～50分钟，置42℃水浴中热激90s，迅速转移至冰上放置3分钟，加入890ul新鲜的soc培养基，摇床培养1h，37℃；取50ul～100ul涂布于含有相应氨苄及氯霉素的平板上，倒置过夜培养。

三、目的基因的表达

根据软件预测的目的蛋白大约的分子量为：Theoretical pI/Mw:5.27/35404.97。

挑选转化成功的转化子，小量诱导培养，以确定是否有目的蛋白的表达：

(1)挑取有转化质粒的单菌落。接种于3～5ml选择性LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振荡培养过夜。

(2)次日将过夜的菌液取0.5～1ml转接于10～20ml选择性液体LB培养基中，37℃,200～250rpm振荡培养至OD₆₀₀达0.6～1时，取1ml样本作为诱导前标本，10000rpm离心1分钟收集菌体沉淀，-20℃冻存备用。

(3)剩余菌液加入母液浓度为1mol/L的IPTG，使IPTG终浓度为0.2mM，37℃，200～250rpm振荡培养4～5小时，取1ml样本作为诱导后标本，10000rpm离心1分钟收集菌体沉淀，-20℃冻存备用。

(4)将诱导前后菌体沉淀用20～40ul PBS(pH＝8.0)重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5min，SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色1～3小时后，脱色观察结果。

结果显示良好，与阴性对照相比目的条带表达很明显。进一步设置不同的诱导时间和诱导物浓浓度及培养时间来确定其最优表达条件(见图2)。经过探索发现转BL21(DE3)转化菌在37℃，0.1mM IPTG诱导浓度下诱导目的蛋白最多，而且随着培养室时间的增加，产量也在继续增加。

四、表达重组菌的扩大培养

步骤如下：

(1)挑取步骤二中在含有氨苄的平板上生长的单菌落，于新鲜的含有氨苄(100μg/ml)的LB培养基上划线活化，37℃过夜(10～4h)培养，获得单克隆；

(2)挑取上述单克隆，接种于新鲜的含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB中，37℃，200～250rpm培养5～6小时，使菌达到对数期；

(3)取上述培养到对数期的菌液，按照1～2％(体积比)的接种量转接于新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素、1％(质量百分数)葡萄糖的LB培养基中，37℃，200～250rpm培养2～3h，待菌液OD₆₀₀达到0.6～1.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导培养10～30h。

五、目的蛋白的收获

步骤如下：

(1)上述扩大培养得到的菌液，于4～8℃，3000～5000rpm离心10～20min，收集沉淀，去上清；

(2)向上述得到的沉淀中加入菌液原体积(即步骤①中离心处理前的菌液的体积)1.5～2倍的PBS缓冲液以洗涤菌体，4～8℃，3000～5000rpm离心10～20min，弃上清，收集菌体；

(3)向上述得到的菌体中加入菌液原体积1/4～1/3的PBS缓冲液重悬菌体，再加入终浓度为1mM的PMSF，0.5mM的溶菌酶和2ul的DNaseI，冰浴中放置1～2h，得处理后菌液；

(4)将上述得到的处理后菌液倒入干净的三角瓶中，置冰浴中，超声破碎20～40min，超3～10秒停3～10秒，150～300w，振幅为65％～85％，得破碎的菌液；

(5)上述得到的破碎的菌液，装入离心管中，4～8℃,6000～8500rpm离心10～20min，分别收集上清液和沉淀；

(6)将沉淀用Tris-EDTA(50mM tris，10Mm EDTA)缓冲液重悬，加入终浓度为1％的tritonX-100和终浓度为1mM的PMSF，冰浴中充分溶解；

(7)分别取上清液和上述重悬后的沉淀液各30ul，加入5×蛋白上样loadingbuffer，混匀后于沸水浴中煮5min,后于SDS-PAGE胶上电泳检测目的蛋白存在哪个组分中；

(8)经电泳发现(如图3所示)，目的蛋白基本上多分布在上清液中，沉淀中很少，考虑到沉淀中的目的蛋白多以包涵体存在，且纯化较为繁杂，故决定只对上清中的目的蛋白进行纯化。

六、目的蛋白的纯化

步骤如下：

(1)向PD-10柱内填充材料；剪开PD-10柱的下部出水口，把事先经酒精和蒸馏水漂洗的滤膜(先用体积浓度为20％的酒精洗滤膜，再用蒸馏水漂洗滤膜)放入PD-10柱底部；

所述填充材料是通过以下方法制备得到的：轻轻晃动盛Ni Sepharose 6FastFlow基质的瓶子，使基质混匀；取3～5mL到15mL离心管中，以500～600×g离心5～10min，弃上清，用10～15mL去离子水重悬基质，轻晃3～5min，500～1000×g离心5～10min，弃上清；加入10～15mL Bingding buffer，轻晃3～5min，500～1000×g离心5～10min，弃上清；加入Bingding buffer，配成基质浓度为40％～60％(体积百分数)的填充材料；

所述Bingding buffer的组分组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，40mM咪唑，余量为水；

所述Elution buffer的组分组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，余量为水；

(2)将上清液加入到填充材料中(每1mL填充材料加入4ml上清液)，在室温下、摇床上以最低转速轻摇1～2h，得混合液；

(3)用盖子堵住PD-10柱下端出口，将混合液加入PD-10柱中，打开下端出口，靠重力让液体流出，流出部分为不带有His标签的蛋白，带有His标签的重组蛋白结合到填料上；

(4)用4～6倍柱体积的Binding buffer淋洗以洗去杂蛋白，收集流出成分，用紫外分光光度计检测流出成分的蛋白变化，直至基本无蛋白流出；

(5)上述淋洗后，用4～6倍柱体积的Elution buffer淋洗以洗脱带有His标签的表位蛋白，用紫外分光光度计检测蛋白流出情况，以Elution buffer为空白对照，直至无蛋白洗出；利用微量蛋白核酸浓度测定仪测定每个收集管中蛋白的浓度，丢弃不含目的蛋白的收集管；用10～12倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子；

(6)收集上述含有目的蛋白的洗脱液，装入透析袋中(每个透析袋装液不超过体积的2/3)，置于浓度为0.01M的PBS缓冲液(pH 8.0)中透析，每6～8小时更换一次PBS缓冲液，更换2～3次后，透析结束，透析袋中即为目的蛋白；

(7)取上述纯化后的目的蛋白适量，加入5×蛋白上样loading buffer，混匀后于沸水浴中煮5min，后于SDS-PAGE胶上电泳，检测纯化效果，如图4所示，由图4可知，通过marker中每条带的蛋白含量，大体可确定含有trx融合蛋白标签的重组蛋白的浓度约为400ug/ml，切去trx融合蛋白标签的重组蛋白浓度为200ug/ml。

实验二抗对虾白斑病疫苗的小白鼠免疫试验

(一)免疫小白鼠，步骤如下：

(1)购买实验用小白鼠，每只体重25g，随机分成三组，对照组4只，切去trxA融合蛋白组8只，含有trxA融合蛋白组8只。

(2)抗原：所纯化得到的含有trxA融合蛋白标签的重组蛋白和切去trxA融合蛋白标签的重组蛋白。

(3)免疫方式：采用皮下注射的方式。

(4)抗原用量：抗原蛋白分子量大于18kDa,对于小白鼠来说，合适的抗原量为2～40μg,最佳抗原量15μg,抗原分子量小于18kDa，对于小鼠来说，合适的抗原量为4～60μg，最佳抗原量为40μg。本实验中，空白对照组未作免疫，含有trx融合蛋白标签的重组蛋白的分子量大于18kD,故其抗原用量为15ug/只，切除trx融合蛋白标签重组蛋白的分子量小于18KD，故其用量为40ug/只。

(5)免疫方案：共免疫4次，第一次免疫采用完全弗氏佐剂与纯化的表位蛋白混合，利用2个注射器和1个中间接头，反复推拉乳化完全弗氏佐剂与表位抗原蛋白的混合物(最开始先把水向油的注射器推)，直至乳化到油水不分层，且滴到冷水中1分钟内不扩散开，即为乳化成功的标志。中间间隔2周，进行第二次免疫，这次免疫采用不完全弗氏佐剂和表位抗原蛋白混合，乳化方法同前面。间隔两周后进行第三次免疫，本次免疫采用的仍是不完全弗氏佐剂和抗原的混合，乳化方法同前面。在处死免疫动物的前10～12天，对小鼠加强一次免疫，本次免疫采用抗原加生理盐水的混合。

(二)盐析法粗提血清抗体：

实验组小白鼠经最后一次加强免疫2周后，摘除眼球取血，分别用1.5的EP管收集血液，静置室温放置2h，4℃，4000rpm，离心7min，收集血清，将同一组的血清合并。共三个组，分别为对照组，含trxA融合蛋白的抗原组，去trxA融合蛋白的抗原组。为了防止血清中的其他蛋白对免疫蛋白作用的影响，需要通过盐析粗提的方法去除血清中的一些其他蛋白，降低干扰。

首先需要配置饱和硫酸铵：取100ml双蒸水加热至75℃，将80g硫酸铵溶于其中，搅拌20min，冷却，待硫酸铵结晶沉于瓶底，其上清即为饱和硫酸铵，在使用前用28％的氨水调节pH至7.3。

具体步骤如下：

(1)血清1份加1份生理盐水混匀，然后逐滴加入饱和硫酸铵2份，边加边搅拌，防止形成团状块，降低沉淀物生物的特异性，混匀后沉淀静置30～45min。

(2)4℃，10000～12000rpm离心5～10min，将上清弃去(含白蛋白)，取沉淀物(含球蛋白)，溶于少量生理盐水。

(3)用33％饱和的硫酸铵提取γ球蛋白：将上述提取物加生理盐水2份，加1份饱和硫酸铵，边加边搅拌，混匀静置30～45min,然后低温10000～12000rpm离心5～10min,弃上清，沉淀物用少量生理盐水溶解。

(4)按照同样方法用33％饱和硫酸铵再提取1次。

(5)将提取物装入透析袋中，在无菌生理盐水中透析，以除去所含的硫酸铵，加入终浓度0.025％的叠氮钠，分装保存，一部分存放4℃，一部分存放-20℃中。

(6)透析后取少量进行了sds-page电泳，大体上了解提取效果及蛋白浓度。

(三)Western blot：

(1)试剂的准备：需要配制的部分溶液如下：

①SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 3g,glycine14.4g,SDS 1g,加水定容至1L。

②转膜缓冲液：Tris 3g,glycine14.4g,甲醇200ml，定容至1L。

③TBST buffer(杂交膜清洗液)：NaCl 8g，1M Tris-HCl(pH8.0)20ml，溶液定容前加0.5mlTween 20定容至1L。

④封闭缓冲液：5％(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer，4℃保存待用(本封闭液应现配先用)。

(2)配制胶：根据抗原分子量的大小，选择合适的胶浓度，共制备了2块胶，分离胶的浓度分别为12％和15％，浓缩胶都为5％。

(3)上样：将含有trxA融合蛋白标签的重组蛋白和WSSV病毒分别与6×loadingbuffer混匀，煮沸5min,上样于12％浓度分离胶的胶上，将去除trxA融合蛋白标签的重组蛋白上样于15％浓度分离胶的胶上。具体的上样量适当把握，一般在30～100ug蛋白。

(4)电泳：80v，40min,130v,约150min,至预染marker全部分离，染料跑到胶的最低部边缘即可停止。

(5)转膜：严格比对预染marker的位置，寻找目的条带所在的位置，利用尺板切出需要位置的胶，放入盛水的盘子暂待。准备转膜用的夹子，严格按照三明治的顺序放置各物，负极→黑板→海绵→厚滤纸→切下来的胶→PVDF膜→滤纸→海绵→白板→正极。转膜条件为140mA，2小时足够。

(6)封闭：转膜结束后，将膜置于TBST中清洗1～2min，洗两次，洗去转膜液，然后置于含有5％的脱脂奶粉的TBST中封闭，注意保湿，置4℃中过夜。

(7)一抗孵化：根据膜和盛放一抗容器的大小，利用一抗稀释液配置适量的一抗，本次置于封口袋中孵育，故配制了30ml一抗液，抗体血清按照1:2000的比例稀释，所用抗体稀释液同封闭液。室温，摇床孵化2h。

(8)洗膜：将一抗液收集起来，将膜用TBST清洗,每次洗膜10min,3～5次。

(9)二抗孵化：二抗孵化时，所用的盛放容器仍是一样大小的封口袋，二抗液体积为30ml,二抗的稀释比例为1:6000,所用稀释液为购买的westernblot抗体稀释液。加入二抗后，室温孵育1.5h,摇床转速为75～80转/min。

(10)洗膜：用TBST洗膜4～5次，每次6～8nin。

(11)化学发光：将洗好的膜置于干净的保鲜膜上，吸干净多余的液体，从膜边缘用吸水纸吸干，在膜上均匀的加入预先按1:1的比例混好的ECL发光试剂，使发光试剂沾满整个PVDF膜，在20min内利用凝胶成型系统的冷CDD镜头，曝光拍照，曝光总时间为600s，频率为10s一张。

(12)结果：对虾白斑病毒及重组蛋白同血清抗体蛋白进行WB实验，实验结果良好，能清楚的演示病毒蛋白同抗体结合，如图5所示(稍微不尽人意的地方是背景稍微高一点，但不影响实验结果的查看)，说明所制备的的重组蛋白对小鼠进行免疫后，所提取的抗体能够特异性的识别对虾白斑病毒，进一步的从实验上初步证实我们所发明的的制备抗对虾白斑病疫苗的方法是有效的、可行的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 潍坊麦吉迪生物科技有限公司

<120> 抗对虾白斑病疫苗及其制备方法

<140> 2018115453002

<141> 2018-12-17

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp Thr Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Thr Ala Asn Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Lys

20 25 30

Asn Arg Thr Ser Tyr Pro Lys Arg Arg Gln Thr Lys Thr Ile Glu Thr

35 40 45

His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln

50 55 60

Met Lys Glu Glu Asn Thr Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln

65 70 75 80

Met Val Pro Lys Ile Asn Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ser Ser Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu Arg Gly Glu Arg Ser Tyr

100 105 110

Asn Thr Pro Gly Leu Ser Asp Lys Asp Met Lys Thr Ala Pro Arg Thr

115 120 125

Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala Glu Asn Ser Ile Lys Gly Asn Thr Met

130 135 140

Ser Ser Lys Asp Ile Lys Ser Ser Ser Ser Glu Asp Gly Ala Ala Phe

145 150 155 160

Asp Glu Ile Lys Lys Lys

165

<210> 2

<211> 509

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccatgggtcc gaagaaagac tctgacagcg ataccgacaa ggacaccgac gacgatgacg 60

acactgcgaa cgacaacgat gatgaggaca aatacaaaaa ccgtacctct tatccgaaac 120

gtcgccagac caagaccatc gagacccaca ctgataacat cgaaaccatc cgtaacggca 180

agtccgacgc gcagatgaaa gaagaaaaca cttctcgtaa gatcaacatc actggtatgc 240

agatggttcc gaaaatcaac ccgtctaaag cgttcgttgg ttcctctaac acctcttctt 300

actctggtac cgaaaccgaa cgtggtgaac gctcttacaa caccccgggt ctgtctgata 360

aggatatgaa aaccgctccg cgtaccgacc cggctggtac tggtgcggaa aactctatca 420

aaggtaacac catgtcttct aaagacatca aatcttctag ctctgaagac ggtgctgcgt 480

tcgacgaaat caaaaagaag taaggatcc 509

Claims (10)

1.一种抗对虾白斑病疫苗，其特征在于：其活性成分为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；是通过以下方法制备得到的：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的合成基因与空白载体连接获得重组载体；

（2）将重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，扩大培养，所得培养物中含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白。

2.权利要求1所述的抗对虾白斑病疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的合成基因Y1798G与空白载体连接获得重组载体；

（2）将上述重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，筛选表达量高的菌株，扩大培养，所得培养物经常规方法处理即为抗对虾白斑病疫苗的有效成分。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述空白载体为载体PET-32a；获得重组载体的具体方法为：利用限制性内切酶NcoI、BamHI分别对合成基因Y1798G、空白载体PET-32a进行双酶切，然后连接，得到重组载体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述双酶切体系如下：

合成基因Y1798G的体系：10×NEB buffer3.1，2 μl；Y1798G plasmid，15 μl；NcoI，0.5μl；BamHI，0.5 μl；ddH₂O，7 μl；37℃，温育2 h；

空白载体PET-32a的体系：10×NEB buffer3.1，2 μl；PET-32a plasmid，15 μl；NcoI，0.5 μl；BamHI，0.5 μl；ddH₂O，7 μl；37℃，温育2 h；

所述连接体系如下：10×T4 DNA连接反应缓冲液，2 μl；T4 DNA 连接酶，1 μl；带切口的载体PET-32a，4 μl；目的片段DNA，6 μl；灭菌水，7 μl；连接反应混合液于16℃反应30～50分钟，后置4℃备用。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，宿主为大肠杆菌；

所述步骤（2）中，将重组载体导入宿主的具体方法为：取重组载体，加入到BL21（DE3）感受态中，轻弹混匀，冰上放置30分钟，置42℃水浴中热激90 s，迅速转移至冰上放置3分钟，加入890 μl新鲜的soc培养基，37℃摇床培养1 h；取50 μl涂布于含有氨苄的平板上，倒置过夜培养；在含有氨苄的平板上生长的单菌落即为转化成功的转化子。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，扩大培养的具体方法为：

①挑取在含有氨苄的平板上生长的单菌落，于新鲜的含有氨苄的LB培养基上划线活化，37℃过夜培养，获得单克隆；

②挑取上述单克隆，接种于新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，220rpm培养5～6小时，使菌达到对数期；

③取上述培养到对数期的菌液，按照1%的接种量转接于新鲜的含有终浓度100 μg/ml氨苄青霉素、1%葡萄糖的LB培养基中，37℃，220 rpm培养2～3 h，待菌液OD₆₀₀达到0.6～1.0时，加入终浓度为0.1～1 mM的IPTG，20～40℃诱导培养3～30 h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，对培养物进行处理的具体处理方法为：于4℃～8℃，3000～5000 rpm离心10～20 min，收集菌体，加入原体积或1.5～2倍原体积的PBS缓冲液洗涤菌体，4～8℃，3000～5000 rpm离心10～20min，离心后重新收集菌体，加入原体积1/4～1/3体积的PBS重悬菌体，加入终浓度为1 mM的PMSF，0.5 mM的溶菌酶和2 μl的DNaseI，冰浴中放置1～2 h；置冰浴中，超声破碎20～40 min，直至90%以上的菌体破碎；破碎的菌液于4℃～8℃，6000～8500 rpm离心10～30 min，收集上清，利用Ni Sepharose吸附柱及脱盐操作纯化回收上清中的目的蛋白；

或于4℃～8℃离心，收集菌体，加入原体积或1.5～2倍原体积的PBS缓冲液洗涤菌体，4℃离心后重新收集菌体，加入原体积1/3～1/4体积的PBS重悬菌体，于65～80℃热灭活10～20 min。

8.权利要求1所述的抗对虾白斑病疫苗在制备预防对虾白斑病感染的制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：具体应用时，将抗对虾白斑病疫苗与虾养殖饲料按照一定比例的配比混合，饲喂对虾。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：经过纯化的抗对虾白斑病疫苗按照1600～3200倍的稀释比例同基础饲料拌料；或带有菌体保护的抗对虾白斑病疫苗的疫苗量终浓度按照1×10⁶～1×10⁸cfu/g同基础饲料拌料；

按照虾总体重的0.8%～1.2%量投喂，每天3～5次。

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