CN102653723A - 对虾白斑综合征病毒vp28酵母表面展示与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白VP28的重组酵母菌的制备方法，是利用酵母表面展示载体pYD1，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌EBY100，得到表面展示VP28的重组酵母菌。其特征在于含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP28。本发明的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母活疫苗在甲壳类动物养殖中的应用。所制备的重组酵母菌可以作为口服疫苗免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征病毒的侵染。本发明的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易行，便于大规模生产。相对于其它疫苗，展示的VP28蛋白易被免疫系统识别，展示的VP28蛋白稳定性好。

Description

对虾白斑综合征病毒VP28酵母表面展示与应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术，具体地说，本发明涉及对虾白斑综合征病毒结构蛋白VP28酵母表面展示方法，本发明还涉及展示的对虾白斑综合征病毒VP28的生产方法与应用。 

背景技术

对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖业造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合征病毒的药物开发受到广泛关注。 

对虾为无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，但近年的研究表明，对虾存在类免疫(quasi-immune)应答机制，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。目前有关对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。已报道的蛋白类和核酸类WSSV疫苗制剂主要以注射方式为主，难以适应对虾大规模养殖。近年来活疫苗(live vaccine)引起了人们的广泛兴趣，特别是口服活疫苗。现在活的口服疫苗是利用病原菌致病基因、病毒外壳蛋白基因和抗体基因在病毒、细菌和酵母菌细胞中表达，然后被分泌到宿主外表面，并固定在宿主外表面上，利用这种表面展示的活宿主免疫养殖动物，达到防治病害。在这些宿主中，酒精酵母菌是最佳的微生物，以酒精酵母表面展示技术为基础制备的基因工程疫苗在小鼠和人体中已有成功的报道，但在对虾类疫苗的研究中至今还未见报道。 

已知VP28是由病毒基因组自身编码的结构蛋白，为WSSV的主要囊膜蛋白，VP28与对虾白斑综合征的系统感染有关。通过表面展示技术将对虾白斑综合征病毒VP28蛋白展示在酵母细胞表面，使多肽抗原更容易被免疫系统识别，同时酵母细胞表面成分可以起到免疫佐剂的作用。而且酒精酵母菌为食品级微生物，具备安全、容易培养的优点，可以很容易地过渡到廉价的口服疫苗，通过简单而又安全的方式接种。基于酵母细胞表面展示技术的VP28基因工程活载体疫苗，在对虾类疫苗的研究中至今未见报道。 

本发明的目的在于将VP28蛋白展示于酵母细胞表面，构建表面展示对虾白斑综合征病毒VP28蛋白的重组酵母EBY100，并将其用免疫对虾，保护对虾抗对虾白斑综合征病毒的侵染。 

发明内容

本发明的目的是提供一种以酿酒酵母为载体的对虾白斑综合征病毒VP28的展示方法，展示的对虾白斑综合征病毒VP28的重组酵母菌的生产方法，所制备的重组酵母菌作为活疫苗有WSSV感染抑制作用，可以免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征病毒的侵染。 

本发明的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易行，经济价廉，便于大规模生产，可用于对虾白斑综合征病毒口服疫苗。相对于其它疫苗，展示的VP28蛋白易被免疫系统识别，展示的VP28蛋白稳定性好。 

本发明的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母活疫苗在甲壳类养殖中的应用。 

本发明涉及编码VP28序列片段扩增的引物序列： 

28-s  GGCGGAATTCATGGATCTTTCTTTCACT 

28-a  TTCCTCGAGCTCGGTCTCAGTGCC 

本发明所采用的技术方案是： 

一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白VP28的重组酵母菌的制备方法，是利用酵母表面展示载体pYD1，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌EBY100，得到表面展示VP28的重组酵母菌。其特征在于含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP28。 

1.WSSV-VP28基因的制备： 

(1)WSSV病毒基因组的制备：将提纯的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和1％月桂酰肌氨酸钠中，在65℃中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50μl TE。-20℃保存，作为PCR扩增模板。 

(2)PCR扩增VP28基因：以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP28，凝胶电泳检测扩增PCR 产物大小，回收PCR产物。PCR反应条件：94℃变性5min，94℃40s，56℃40s，72℃40s，35个循环，72℃延伸5min。取2μlPCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳。 

2.重组体的构建： 

(1)表达载体的构建：用EcoRI和XhoI对VP28基因片段和质粒pYD1进行双酶切，酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组载体质粒，进行双酶切并对该重组载体质粒进行测序鉴定，重组体命名为pYD1-VP28。 

3.重组酵母菌的构建与诱导表达 

提取重组质粒pYD1-VP28与EBY100感受态细胞混合，加入醋酸锂转化溶液，振荡，然后30℃水浴30分钟；再加入二甲基亚砜，42℃水浴7分钟后，离心，TE重悬细胞。取100μl细胞悬液涂布于缺乏色氨酸的YNB(含Leu)营养缺陷型选择平板上，25～35℃培养24～48h，获得转化成功的酵母菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆。同法，用空载体pYD1转化感受态细胞作为不表达目的基因产物的阴性对照。于上述营养缺陷型平板上挑取阳性单个酵母菌落，接种于含有1～2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中，30℃、250r/min振荡培养过夜；当菌液OD₆₀₀值在2.0～5.0时，3000～5000r/min离心5～10分钟，弃上清，再用含有1.0～2.0％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬细胞(使其OD₆₀₀值为0.5～1.0)，20℃振荡培养诱导目的蛋白表达；在诱导表达的第0、12、24、42h分别取出1ml细胞培养物作为待鉴定的细胞样品，4℃保存备用。 

4.展示VP28蛋白的酵母细胞的鉴定 

分别在诱导表达后0h、12h、24h、和42h测OD₆₀₀的值，以EBY100为阴性对照，以EBY100/pYD1-VP28菌株为阳性对照做免疫荧光检测，一抗为anti-VP28抗体，二抗为FITC标记的羊抗鼠抗体，各样品用PBS于4℃离心洗涤后，加入一抗，冰上放置30min，PBS洗涤后，加入二抗，避光冰上放置30min，PBS离心洗涤后加入PBS 40μL，取少量在荧光显微镜下检测并拍照。 

5.展示的VP28的重组酵母菌生产方法 

将活化的VP28重组酵母菌菌种接种于YNB-CAA(含1.0-2.0％葡萄糖)培养基中，20～30℃下振荡培养过夜，至OD₆₀₀值在2～5，离心菌体，用PBS洗去多余的培养基，用生理盐水悬浮菌体并接入YNB-CAA(含1.0～2.0％D-半乳糖)液体培养基中，起始OD₆₀₀控制在0.6～1.0，在20～30℃下 诱导培养36～60h，将所得的培养物离心并用PBS洗涤，获得重组酵母菌活疫苗。 

在本发明中，术语“编码vp28序列”是指编码具有WSSV蛋白活性的多肽的核苷酸序列。 

该术语还包括能编码具有与vp28相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些形式包括：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5‘和/或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳的5个以内)核苷酸。 

在本发明中，术语“VP28”指具有基因调控活性的SEQ ID NO.2的多肽。该术语还包括具有基因调控功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1～50个，较佳的1～30个，更佳的1～20个，最佳的1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为30个以内，较佳的为10个以内，更佳的5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括VP28多肽的活性片段和活性衍生物。 

在本发明中，术语“WSSV感染抑制”是指在易感WSSV的动物中，WSSV感染的发生率和严重程度的降低，如降低动物死亡数量。如果相对于对照群体，VP28降低感染性至少20％，较好至少50％或更高时即达到WSSV感染抑制。 

在本发明中，术语“甲壳动物”，通常指“虾”，“螃蟹”和“龙虾”甲壳动物。

在本申请的说明书和附图中，用于表示碱基(核苷酸)，氨基酸等的缩写是由生化命名IUPAC-IUB委员会推荐的那些和本领域常用的那些，说明如下： 

DNA：脱氧核糖核酸；A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶；G：鸟嘌呤；C：胞嘧啶； 

G，Gly：苷氨酸；A，Ala：丙氨酸；V，Val：缬氨酸；L，Leu：亮氨酸；I，Ile：异亮氨酸；S，Ser：丝氨酸；T，Thr：苏氨酸；C，Cys：半胱氨酸；M，Met：甲硫氨酸；E，Glu：谷氨酸；D，Asp：天门冬氨酸；K，Lys：赖氨酸；R，A：g：精氨酸；H，His：组氨酸；F，Phe：苯丙氨酸；Y，Tyr：酩氨酸；W，Trp：色氨酸；P，Pro：脯氨酸；N，Asn：天冬酰胺；Q，Gin：谷酰胺。 

附图说明：

图1：PCR扩增VP28.泳道1和2：扩增的VP28.泳道M：DNAMarker(DL2000) 

图2：pYD1-VP28重组质粒转化酵母菌落PCR鉴定M：DNAMarker(DL2000)；1：阴性对照；2，3，4，5：重组质粒转化酵母菌EBY100； 

图3：pYD1-VP28诱导表达的细胞免疫荧光检测.A：pYD1空载体转化组；B：pYD1-VP28重组质粒诱导表达42h；C：pYD1-VP28重组质粒诱导表达24h； 

具体实施方式：

在本发明所用的术语，除特指外，一般为本领域普通技术人员通常理解的含义。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1：VP28基因扩增 

PCR引物由上海生物工程有限公司合成，PCR管中，建立如下反应体系： 

10×Buffer 2.5μl；dNTP 2.0μl；WSSVDNA模板1.0μl；28-a(10pmol/μl) 1.0μl；28-s(10pmol/μl) 1.0μl；rTaq酶(5U/μl)0.5μl；ddH₂O 17μl。 

PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s 35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，取PCR反应产物5μL加入1μL上样缓冲液(loading buffer)和Gene finder的混合液(1∶9)在含有Genefinder的1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测。PCR产物大小为631bp，结果鉴定见本发明附图说明及附图1。扩增片段由大连宝生物公司测序，VP28基因序列为SEQ ID No.1所示。 

实施例2：重组载体的构建 

将PCR产物用EcoR I和Xho I进行双酶切，同时载体pYD1也用EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切的结果电泳鉴定后，采用宝生物工程有限公司的胶回收试剂盒回收纯化质粒pYD1和VP28基因片断，将回收的双酶切纯化后的产物(VP28和pYD1)用T₄DNA Ligase连接，载体与目的片断的物质的量比 为1∶8～1∶10。将上述连接产物25μl加入Top10感受态细胞中，42℃水浴热激45s，然后迅速置于冰上放置1分钟，加入一定量的LB培养基(无Amp)至1000μl，于37℃摇床上培养1小时，以恢复抗性；将转化菌液200μl涂到含Amp(50μg/ml)固体LB培养基上，用灭菌的玻璃珠使菌液均匀分布在培养基的表面；37℃培养12～16h。随机挑取12个单克隆分别为1～12号进行扩大培养，并以菌液为模板，以VP28的反应条件进行PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。对扩大培养的单克隆阳性菌提取质粒并进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测VP28基因片段，重组质粒命名为VP28-pYD1。 

实施例3：VP28-pYD1对酵母感受态细胞的转化 

取100μl EBY100感受态细胞(1×10⁸细胞/ml)与5μl pYD1-VP28重组质粒(0.1μg/μl)在EP管中混匀后，加入醋酸锂转化溶液(1mmol/L liAc，40％PEG3350，1×TE)，振荡10秒，30℃水浴30分钟；再加入二甲基亚砜，42℃水浴7min后，14000r/min离心5秒，弃上清，用0.5ml TE缓冲液重悬细胞。取100μl细胞悬液涂布于缺乏色氨酸的YNB(Leu)营养缺陷型选择平板上(0.5～0.7％YNB，1.0～2.0％葡萄糖，0.005～0.01％亮氨酸，1.5～2.0％琼脂)，25～30℃培养24～48h，获得转化成功的酵母菌落。同法，用空载体pYD1转化感受态细胞作为不表达目的基因产物的阴性对照。 

实施例4：VP28-pYD1蛋白的诱导表达 

于上述营养缺陷型平板上挑取阳性单个酵母菌落，接种于5ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中(含0.5％～0.7％YNB，0.2～0.5％水解酪蛋白氨基酸)，30℃、250r/min振荡培养过夜；当菌液OD₆₀₀值在2.0～5.0时，3000～5000r/min离心5～10min，弃上清，再用含有1.0～2.0％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬细胞(使其OD₆₀₀值为0.5～1.0)，20℃振荡培养诱导目的蛋白表达；在诱导表达的第0、12、24、42小时分别取出1ml细胞培养物作为待鉴定的细胞样品，4℃保存备用。 

实施例5：展示VP28蛋白的酵母细胞的鉴定 

分别在诱导表达后0h、12h、24h、和42h测OD₆₀₀值，冰箱4℃存放，以EBY100为阴性对照，以EBY100/PYD1-VP28菌株为阳性对照做免疫荧光检测，一抗为anti-VP28，二抗为羊抗鼠-FITC，分别按照要求的稀释倍数用含1.0％BSA的PBS稀释后置冰上待用，各样品用PBS于4℃4000g离心洗涤后，加入一抗Anti-VP28，冰上放置30min，PBS洗涤后，加入二抗，避光冰上放置30min，PBS离心洗涤后加入PBS 40μL，取少量在荧光显微镜下检测并拍照。结果鉴定见本发明附图说明及附图3。 

实施例6：展示VP28蛋白的重组酵母在养殖对虾免疫中的应用 

取健康的南美白对虾180尾，对虾平均体重5～6g，每组30尾，每组设平行组，实验水温18～26℃，取本发明制备的展示VP28蛋白的酵母菌(6×10¹⁰cells/ml)包被对虾饲料(10⁷cells-10⁸cells/g饲料)，同样方法制备空载体pYD1菌作为对照包被对虾饲料(10⁷cells/g饲料)，同时设投喂未包被的对虾饲料为正常对照组，各组饲喂20天后，展示VP28蛋白的酵母菌组和空载体pYD1菌组投喂WSSV感染的螯虾，记录各组对虾的存活率，养殖结果表明，投喂展示VP28蛋白的酵母菌组的对虾10d后累积死亡率为52％，阳性对照组(空载体pYD1菌)对虾的死亡率10d后达到100％，正常对照组对虾无死亡现象，表明展示VP28蛋白的重组酵母可提高对虾抗WSSV感染力。 

序列表 

1.SEQIDNo.1的信息 

(1)序列特征： 

长度：612bp 

类型：核酸 

链性：双链 

拓扑结构：线性 

(2)分子类型：DNA 

(3)序列描述：SEQ ID No.1 

1      atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt 

61     gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac 

121    acaggcaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt 

181    ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc 

241    aagatccgca atggaaagtc tgatgcacaa atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc 

301    actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga 

361    acattcaaga tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg 

421    ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc 

481    gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca 

541    attgcagcta ccgccggtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc 

601    actgagaccg ag     

2.SEQIDNo.2的信息 

(1)序列特征： 

长度：204个氨基酸 

类型：氨基酸 

拓扑结构：线性 

(2)分子类型：蛋白质 

(3)序列描述：SEQ ID No.2 

1      MDLSFTLSVV SAILAITAVI AVFIVIFRYH NTVTKTIETH 

41     TDNIETNMDE NLRIPVTAEV GSGYFKMTDU SFDSDTLGKI 

81     KIRNGKSDAG MKEEDADLVI TPVEGRALEV TVGGNLTFEG 

121    TFKVWNNTSR KINITGMQMV PKINPSKAFV GSSNTSSFTP 

161    VSIDEDEVGT FVCGTTFGAP IAATAGGNLF DMYVHVTYSG 

201    TETE 

Claims (8)

1.一种表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母及其制备方法，是利用酵母表面展示载体，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌得到表面展示VP28的重组酵母菌。

2.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母及其制备方法，其特征在于，所述的重组酵母为含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP28。

3.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母菌活疫苗在养殖甲壳动物免疫中的应用。

4.如权利要求2所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组体的制备方法，其特征在于，构建所述的对虾白斑综合征病毒VP28表达载体时，先用EcoRI和XhoI两种限制性内切酶将PCR扩增的VP28产物与pYD1空载体分别双酶切，然后将双酶切的产物连接并转化入感受态大肠杆菌TOP10，PCR筛选插入VP28基因的阳性克隆，测序验证正确的阳性克隆即为重组表达体(pYD1-VP28)。

5.如权利要求4所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组体，其特征在于，它包括：编码VP28的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ IDNO.1中1-612位的核苷酸杂交。

6.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母的制备方法，其特征在于，将所述的重组表达体转化入酵母菌EBY100感受态细胞，再将转化产物涂布在YNB选择培养基上于25-30℃下培养24-48h，挑取长出的单菌落，用菌落PCR的方法筛选阳性转化子，阳性转化子即为表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母。

7.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母，其特征在于，它包括，具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列，或其活性片段，或其活性衍生物。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵生产所述的展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母菌活疫苗时，是将所述的重组酵母菌接种于含1.0-2.5％葡萄糖的YNB-CAA的培养基中，在25-30℃下振荡培养过夜，至OD600值在2-5，离心菌体，用生理盐水悬浮菌体并接入YNB-CAA(含D-半乳糖)液体培养基中，在20-30℃下诱导培养36-60h，将所得的培养物离心并用PBS洗涤，获得重组酵母菌活疫苗。

Images