CN103319590A - 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用 - Google Patents

栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103319590A
CN103319590A CN2013101926972A CN201310192697A CN103319590A CN 103319590 A CN103319590 A CN 103319590A CN 2013101926972 A CN2013101926972 A CN 2013101926972A CN 201310192697 A CN201310192697 A CN 201310192697A CN 103319590 A CN103319590 A CN 103319590A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cfpgrp
chlamys farreri
peptidoglycan recognition
recognition protein
wssv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013101926972A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103319590B (zh
Inventor
宋林生
刘瑞
邱丽梅
衣启麟
张峘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Oceanology of CAS
Original Assignee
Institute of Oceanology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Oceanology of CAS filed Critical Institute of Oceanology of CAS
Priority to CN201310192697.2A priority Critical patent/CN103319590B/zh
Publication of CN103319590A publication Critical patent/CN103319590A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103319590B publication Critical patent/CN103319590B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用。序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的重组酵母可作为抗对虾白斑症病毒（WSSV）的免疫增强剂。即该蛋白经表面展示技术表达于解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）的细胞表面，改造后的酵母可直接应用于水产养殖，具有增强养殖动物抗WSSV感染的作用。

Description

栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白(CfPGRP-S1)的应用
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用。
背景技术
免疫增强剂是指能够促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物质。因其具有安全、广谱、高效、无毒、无污染、低成本等诸多优点，目前已在畜牧养殖中作为饲料添加剂广泛应用。但快速发展的水产养殖业所需的免疫增强剂的开发和应用仍处于起步阶段，其中较为关键的就是解决活性物质的导入技术和应用方法的难题。
表面展示（Surface display）技术是一种较新的基因工程技术，它使表达的外源肽或蛋白质以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞的表面，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性，借以研究多肽（蛋白质）的性质、相互识别和作用等。目前利用酵母菌进行表面展示的技术已发展相对成熟，其中利用酒精酵母表面展示的系统已经完全商品化。
肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein，PGRP）是固有免疫模式识别受体的一种，在免疫应答过程中起重要作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用，
序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1表面展示酵母可作为抗WSSV病毒的免疫增强剂。
进一步的说，所述栉孔扇贝肽聚糖识别重组蛋白CfPGRP-S1可作为抑制WSSV病毒复制和提高凡纳滨对虾抗WSSV能力的免疫增强剂。
进一步的说，所述栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1经表面展示表达于解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）的细胞表面，得到的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1酵母菌可直接作为抗WSSV病毒的免疫增强剂。
所述序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1表面展示的过程为：
1）以栉孔扇贝CfPGRP-S1编码区为模板，采用P1和P2为引物进行PCR扩增，待用；
2）PCR扩增产物与pMD18-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与表面展示载体经HindIII，BamHI双酶切后连接；
3）将上述构建载体转入解脂耶罗维亚菌株中进行诱导培养，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白CfPGRP-S1菌株，该菌株经免疫荧光检测证明CfPGRP-S1可被正确表达；
所述因为P1和P2分别为P1：5’-CGCAAGCTTATTACAGCTGATTACCTGATAACAG-3’；P2：5’-CGCGGATCCATGATGATGATGATGATGAGGGCATCCCGGACCAT-3’。
本发明所具有的优点：
本发明将栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1），表面展示于被认为安全的微生物解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）上。
CfPGRP-S1不仅可以结合多种病原相关分子模式、直接杀灭各种外源微生物，还可以抑制病毒复制、增强机体免疫，是一种重要的具有巨大潜在应用价值的免疫分子，而且经表面展示的CfPGRP-S1酵母菌可直接应用，不需要经过提纯。因而实施本发明具有生产成本、应用简便，效果多重等特点，预期将在水产养殖领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）酵母菌株可提高凡纳滨对虾WSSV感染后的存活率的效果图。
图2为本发明实施例提供的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）酵母菌株可较低对虾体内WSSV病毒的拷贝数的效果图。
具体实施方式
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。实验例1
栉孔扇贝CfPGRP-S1酵母表面展示氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1中所示。
SEQ ID NO.1
MEKSLWTSCLVVLLLSPTCLSITADYLITGPRDDKCAALGGICQNDNQYCTGSYFSNKCAGPVTTRCCTKNITIRDTKECKNVMIISRDSWGARRPVKVLPLKTPVGDFFLHHTDTKNCTTAKNCISIVKSIQQYHMNDKNWWDIAYSFLVGEDGHVYEGRGWKTVGSHTRGCNDKSLAASMIGNFNDVLPNAAALSSVKRLISCGVEIGRLSPNYSLFGHRDVRDTDCPGNALYKNMSSWTHFHIHGPGCP
序列特征：
◆长度：252个氨基酸
◆类型：蛋白
◆链型：单链
◆拓扑结构：线形
◆特性：分子量为27.87kDa，等电点为8.318，其中编码序列的1-21位为信号肽序列，成熟肽分子量为25.60kDa，等电点为8.408，具有一个保守的PGRP结构域和位于羧基末端的三个锌离子结合位点。
◆来源：栉孔扇贝（Chlamys farreri）
栉孔扇贝CfPGRP-S1酵母表面展示的载体构建：
1.重组载体的构建：本发明中采用酵母菌表面展示的表达载体。（表面展示载体的具体信息参见文献Yue L,Chi Z,Wang L,Liu J,Madzak C,Li J,Wang X:Construction of a new plasmid for surface display on cells of Yarrowia lipolytica.J Microbiol Methods2008,72:116-123）。通过PCR技术，使用5’末端分别添加了HindIII，BamHI特定酶切位点的基因特异性引物P1(5’-CGCAAGCTTATTACAGCTGATTACCTGATAACAG-3’)和P2（5’-CGCGGATCCATGATGATGATGATGATGAGGGCATCCCGGACCAT-3’）扩增栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1基因含PGRP结构域的编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后，挑取单克隆利用上述载体引物进行菌落PCR筛选并测序，验证测序正确后用质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒（大连宝生物工程有限公司），待用；使用HindIII，BamHI双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产物纯化回收；纯化片段与经HindIII，BamHI双酶切的酵母表面展示载体连接，完成载体的构建。
2.目的蛋白的表面展示：将上述构建的重组载体和不含插入片段的空载体分别转化到解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica），挑取单克隆，经测序验证读码框正确，如序列表SEQ ID NO.1中氨基酸所示的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1。将单克隆接种于200mL PBB液体培养基中，28℃震荡摇床中培养3-5天，然后取50μL涂片于多聚赖氨酸包被的载玻片上，通过免疫荧光的方法检测CfPGRP-S1在酵母菌的表达情况。载玻片上的酵母菌依次通过5%脱脂奶粉37℃封闭1小时，自制的CfPGRP-S1多克隆抗体在37℃孵育30分钟，Invitrogen Axla488标记的荧光抗体在37℃孵育30分钟后，利用荧光显微镜在488nm的激发波长下观察CfPGRP-S1在酵母菌表面的表达情况，得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸所示的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1的菌株，该检测方法证实CfPGRP-S1已被正确表达，并成功展示于细胞表面。
实施例2
表面展示CfPGRP-S1重组酵母提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力分别将上述重组得到表面展示CfPGRP-S1和对照基因（LvLectin1）的酵母重组子，以及不含有外源基因的酵母菌于28℃震荡培养后，按终浓度为107CFU/ml分别对三组凡纳滨对虾进行浸泡，每组15尾。浸泡三天后，将三组的凡纳滨对虾移至干净海水中养殖一天。此后，用终浓度为106copies/ml的WSSV对凡纳滨对虾进行注射攻毒。攻毒后一周内记录各组凡纳滨对虾的死亡情况，每天各组对虾的累积死亡率如下图1所示：攻毒一周后，阴性对照组对虾的死亡率为100%，CfPGRP-S1和LvLectin1浸泡组对虾的死亡率分别为66.7%和80%。由此可见，表面展示CfPGRP-S1和LvLectin1基因的重组酵母菌均能显著降低凡纳滨对虾感染WSSV的死亡率，并且CfPGRP-S1重组酵母的保护效果要好于LvLectin1重组酵母。可见上述表面展示后的发酵产物表面展示CfPGRP-S1可直接应用，不需要经过提纯。
实例3
表面展示CfPGRP-S1重组酵母可降低对虾血细胞内WSSV拷贝数
抽取凡纳滨对虾新鲜血细胞，于细胞培养板中培养。同时，将浓度为105copies/ml的WSSV分别与无外源基因的酵母菌、含CfPGRP-S1以及LvLectin1基因的重组酵母菌在18℃下进行孵育，酵母菌的终浓度均为107CFU/ml。孵育1h后，分别对培养的对虾原代血细胞进行攻毒，并于6h、12h和24h时收集血细胞。
将不同时间点收集的血细胞进行裂解并用病毒基因组试剂盒提取病毒DNA，以提取的DNA为模板进行绝对定量real-time PCR，根据WSSV拷贝数的标准曲线分析用不同酵母孵育后WSSV在血细胞中拷贝数的变化。结果如图2所示，WSSV与CfPGRP-S1孵育后，在对虾血细胞中的拷贝数显著降低，并且在24h内能持续降低WSSV的拷贝数。而LvLectin1组仅在6h时显著降低了WSSV的拷贝数，但在12h和24h时与对照组没有区别。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA00003229785400021

Claims (4)

1.一种栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用，其特征在于：
序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1重组表达进而可作为WSSV病毒的免疫增强剂或添加剂。
2.按权利要求1所述的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用，其特征在于：
所述栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1可作为抑制WSSV病毒复制和提高凡纳滨对虾抗WSSV能力的免疫增强剂或饲料添加剂。
3.按权利要求1所述的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用，其特征在于：所述栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1经表面展示于解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）的细胞表面，进而可直接作为WSSV病毒的免疫增强剂。
4.按权利要求1、2或3所述的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用，其特征在于：
所述序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白CfPGRP-S1表面展示的过程为：
1）以栉孔扇贝CfPGRP-S1编码区为模板，采用P1和P2为引物进行PCR扩增，待用；
2）PCR扩增产物与pMD18-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与表面展示载体经HindIII，BamHI双酶切后连接；
3）将上述构建载体转入解脂耶罗维亚菌株中进行诱导培养，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的CfPGRP-S1菌株；
所述因为P1和P2分别为P1：5’-CGCAAGCTTATTACAGCTGATTACCTGATAACAG-3’；P2：5’-CGCGGATCCATGATGATGATGATGATGAGGGCATCCCGGACCAT-3’。
CN201310192697.2A 2013-05-22 2013-05-22 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用 Expired - Fee Related CN103319590B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310192697.2A CN103319590B (zh) 2013-05-22 2013-05-22 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310192697.2A CN103319590B (zh) 2013-05-22 2013-05-22 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103319590A true CN103319590A (zh) 2013-09-25
CN103319590B CN103319590B (zh) 2014-10-22

Family

ID=49188675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310192697.2A Expired - Fee Related CN103319590B (zh) 2013-05-22 2013-05-22 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103319590B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103848912A (zh) * 2014-03-27 2014-06-11 中国科学院海洋研究所 海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用
CN104356217A (zh) * 2014-11-06 2015-02-18 中国科学院海洋研究所 一种具菌结合活性的栉孔扇贝frep蛋白及其制备和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418310A (zh) * 2008-12-05 2009-04-29 江苏大学 表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法
CN101619102A (zh) * 2008-12-16 2010-01-06 中国科学院海洋研究所 一种具杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用
CN102021124A (zh) * 2009-12-28 2011-04-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 对虾白斑综合征病毒vp37酵母表面展示与应用
CN102653723A (zh) * 2009-12-28 2012-09-05 中国水产科学研究院黄海水产研究所 对虾白斑综合征病毒vp28酵母表面展示与应用
CN102895677A (zh) * 2012-10-30 2013-01-30 无锡海健生物科技有限公司 一种新型对虾多价载体疫苗及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418310A (zh) * 2008-12-05 2009-04-29 江苏大学 表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法
CN101619102A (zh) * 2008-12-16 2010-01-06 中国科学院海洋研究所 一种具杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用
CN102021124A (zh) * 2009-12-28 2011-04-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 对虾白斑综合征病毒vp37酵母表面展示与应用
CN102653723A (zh) * 2009-12-28 2012-09-05 中国水产科学研究院黄海水产研究所 对虾白斑综合征病毒vp28酵母表面展示与应用
CN102895677A (zh) * 2012-10-30 2013-01-30 无锡海健生物科技有限公司 一种新型对虾多价载体疫苗及其应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103848912A (zh) * 2014-03-27 2014-06-11 中国科学院海洋研究所 海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用
CN103848912B (zh) * 2014-03-27 2016-05-11 中国科学院海洋研究所 海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用
CN104356217A (zh) * 2014-11-06 2015-02-18 中国科学院海洋研究所 一种具菌结合活性的栉孔扇贝frep蛋白及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103319590B (zh) 2014-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105801707B (zh) 一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用
CN104593397A (zh) 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用
CN102617724B (zh) 一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN103103202A (zh) Harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用
CN102181469A (zh) 枯草芽孢杆菌表面展示人血清白蛋白重组芽孢及其制备方法
CN104560855B (zh) 缺失phoP的鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株及构建方法
CN104371025B (zh) 一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白及其应用
CN103319590B (zh) 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用
CN102796200B (zh) 一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用
CN103772507A (zh) 一种融合型抗菌肽及其制备方法和应用
CN103012578B (zh) 一种重组猪白细胞介素2及其编码基因和表达方法
CN110759983A (zh) 一种靶向沉默害虫模式识别蛋白gnbp3基因表达的重组真菌及在害虫防治中的应用
CN105567721A (zh) 一种穿梭质粒及其构建方法和应用
CN104402987A (zh) 一种长牡蛎白介素il17n重组蛋白及其制备和应用
CN103215274A (zh) 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用
CN101659958B (zh) 一种多效价活疫苗、其制备方法及应用
CN111019952B (zh) 一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用
CN102899331A (zh) 一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用
CN103045614B (zh) 突变噬菌体e基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用
CN103467589B (zh) 一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用
CN102229944B (zh) 一种重组猪α-干扰素的制备方法
CN106749609B (zh) 一种鸡alpha干扰素及其制备方法
CN109593766A (zh) 草鱼铁调素基因及其编码的重组蛋白和应用
CN104560854A (zh) 缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株及其构建方法和应用
CN107245105A (zh) HN‑VP233‑221aa融合蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141022

Termination date: 20210522