CN103848912B - 海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用。肽聚糖识别蛋白（AiPGRP）基因的重组蛋白为序列表SEQ？ID？NO.1中氨基酸序列所示。具体是利用体外重组表达技术获得了海湾扇贝AiPGRP重组蛋白，公开了所述海湾扇贝AiPGRP基因重组蛋白的凝菌和抗菌活性。利用本发明获得的重组蛋白可用于抗菌的饲料添加剂和新型免疫增强剂的开发。

Description

海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用。
背景技术
伴随长期的进化过程，在病原生物的压力下，动物界产生了两套免疫系统，即获得性免疫和固有免疫，目前普遍认为无脊椎动物只拥有固有免疫系统。固有免疫应答包括免疫识别、免疫信号的调整与放大、免疫信号传导并转录激活产生效应分子等几个基本的过程。其中，对“自己”与“非己”的识别过程，是诱导免疫应答反应的起始阶段，是动物体对病原微生物实现有效防御的基础。1997年，模式识别受体和模式识别理论的提出，揭示了免疫识别作用的本质。目前，无脊椎动物中已发现了10余类模式识别受体，如肽聚糖识别蛋白（PGRP）和Toll样受体等，它们通过结合不同的病原相关分子模式完成对各种病原微生物的识别，在诱导细胞因子和炎症的产生、抗菌肽的表达、激活酚氧化酶级联反应、吞噬等一系列固有免疫应答中发挥重要作用。
肽聚糖识别蛋白是一类能特异性识别肽聚糖及含肽聚糖的细菌，在固有免疫应答中发挥重要作用的模式识别受体蛋白。1996年，肽聚糖识别蛋白首次于家蚕的血淋巴中发现。对昆虫及哺乳动物等模式动物PGRPs的研究发现，PGRPs在固有免疫应答中起着模式识别、信号调控和效应分子的三重作用。在海洋无脊椎动物中，虽然PGRPs的研究也取得了一定的进展，但研究的广泛性和深入性不足，至今仍有许多问题没有解决。
海洋无脊椎动物具有进化地位原始、基因结构和功能多样化等优点，研究海洋无脊椎动物基因组及功能基因,能深层次地探究海洋生命的奥秘;发掘海洋无脊椎动物基因,有利于保护海洋生物资源;从海洋无脊椎动物的功能基因入手,有助于培育出优质、高产、抗逆的养殖新品种,从根本上解决海水养殖无脊椎动物的质量和病害问题,同时还有助于开发具有我国自主知识产权的海洋基因工程新药,部分解决海洋药源问题。因此阐明海洋无脊椎动物PGRPs的结构和功能具有十分重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白，肽聚糖识别蛋白（AiPGRP）基因的重组蛋白为序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列所示。
海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的制备方法：
（1）以海湾扇贝AiPGRP编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用；
（2）PCR扩增产物与将pEASY-E1载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
（3）将上述构建载体转入Trans1-T1表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白AiPGRP；
所述引物P1和P2分别为P1：5’-GATCGAATCTGCGACAACATACATG-3’；P2：5’-AATCATCGCGGCACATTGCTGTC-3’。
海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的应用，所述序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白AiPGRP用于制备广谱抗菌类制剂。
所述序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白AiPGRP用于制备免疫增强剂或饲料添加剂。
本发明所具有的优点：涉及海湾扇贝肽聚糖识别蛋白（AiPGRP）基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了海湾扇贝肽聚糖识别蛋白AiPGRP，该重组蛋白对鳗弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母具有凝集作用，并能抑制鳗弧菌和藤黄微球菌的生长，在开发广谱抗菌类药物和新型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
本发明中的海湾扇贝AiPGRP为短型肽聚糖识别蛋白，进而利用体外重组表达技术获得了海湾扇贝肽聚糖识别蛋白AiPGRP，该重组蛋白对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌具有凝集作用，同时能够杀灭革兰氏阴性菌，并抑制革兰氏阳性菌的生长，在开发广谱抗菌类药物和新型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的海湾扇贝AiPGRP基因重组蛋白对鳗弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母的凝集作用图。
图2为本发明实施例提供的海湾扇贝AiPGRP基因重组蛋白对鳗弧菌和藤黄微球菌生长的抑制作用图。
具体实施方式
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1海湾扇贝AiPGRP基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：
1、重组载体的构建
本发明中采用的重组载体为北京全式金公司的pEASY-E1原核表达载体。通过PCR技术，使用基因特异性引物P1和P2扩增海湾扇贝AiPGRP基因除去信号肽的编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物纯化回收，与pEASY-E1载体连接。转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成载体的构建。
所述引物P1为5’-GATCGAATCTGCGACAACATACATG-3’；
引物P2为5’-AATCATCGCGGCACATTGCTGTC-3’。
2、重组蛋白的表达
以北京全式金公司的Trans1-T1为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表达宿主菌中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于50mLLB液体培养基中，37℃震荡摇床中培养12-16小时，然后将此培养液以体积比1：100的比例接种200mL新的LB液体培养基中，37℃培养至OD600=0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mMmL-1，继续培养4h。4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL5X蛋白上样缓冲液，100℃沸水煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。
3、重组蛋白的纯化与复性
将上述所得蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF纯化获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。
具体操作步骤如下：
镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带His标签的重组蛋白
（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10mL；
（2）用缓冲液1（1.14gL-1NaH2PO4，14.5gL-1Na2HPO4，29.3gL-1NaCL，480gL-1尿素平衡2-5个床体积，流速为2mLmin-1；
（3）将20ml细胞破碎液（50mMPBS，pH7.4，0.5MNaCl）0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mLmin-1；
（4）用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为mLmin-1；
（5）用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2mLmin-1，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；
（6）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mLmin-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在适当的复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mMEDTA、50mMTris-HCl、100mMNaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。每次在4℃透析12h，即得到SEQIDNO.1氨基酸所示的海湾扇贝AiPGRP基因重组蛋白。
SEQIDNO.1
MRGSHHHHHHGMASELALDRICDNIHVISRDDWGARSPTTRSGLSDPVNMFLVHHTATDTCDDVSSCSSILRGIQNYHINNKEWSDIGYSFLIGGDGQVYEGRGWGVVGAHTYNYNRRGYAVSFIGNFETTLPSTRARNAARALIQCGVDKGHINEDYTLHGHRDADRRVHPTVCPGQRLYDEISTWPHFDSNVPR
序列特征：
长度：196个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线型
特性：分子量为22.03kDa，等电点为6.58，其中编码序列的1-18位为信号肽序列，成熟肽分子量为20.01kDa，等电点为6.36，具有一个保守的PGRP结构域。
来源：海湾扇贝
实施例2：海湾扇贝AiPGRP原核重组蛋白的凝菌活性分析
对鳗弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母的凝集实验：
将过夜培养的鳗弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母离心，收集离心管底的菌体沉淀，收集的沉淀分别用TBS（50mML-1Tris-HCl，50mML-1NaCl）洗涤三次后分别重悬于含有FITC（终浓度0.1mgmL-1）的0.01MNaHCO3溶液中，而后在分别于暗处标记30min。标记后的微生物分别于TBS中洗涤三次，然后再分别重悬于含有10mMZnCl2的TBS缓冲液中，使其浓度达到2.5×109cellmL-1。再分别取10μL的上述微生物悬液分别与25μL上述实施例获得的重组蛋白溶液（重组蛋白浓度根据具体情况调整）混匀，室温下孵育1h后，取10μl涂于载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。设rTrx（pET-32a空载体表达蛋白）蛋白对照组和TBS空白对照组（参见图1）。
实验结果表明，重组AiPGRP蛋白能够有效凝集鳗弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母。
实施例3：海湾扇贝AiPGRP原核重组蛋白的抑菌活性分析
对鳗弧菌和藤黄微球菌的生长抑制实验：
在平底96孔板（Costar，Fisher）中每孔加入200μLLB液体培养基和10μL对数生长期的鳗弧菌或藤黄微球菌菌液，再加入终浓度为100μgmL-1的重组蛋白rAiPGRP，另设rTrx蛋白对照组和TBS空白对照组，所有孔中均含有10mMZnCl2。220rpm，37℃振荡培养，每隔1h用酶标仪分别检测记录各孔OD600值。每个样品设四个重复，根据4次测定结果取平均值作图（参见图2）。
实验表明重组AiPGRP蛋白能够杀灭革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌的繁殖存在抑制作用。

Claims (3)

1.一种海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白，其特征在于：肽聚糖识别蛋白(AiPGRP)基因的重组蛋白为序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列所示。
2.一种权利要求1所述的海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的制备方法，其特征在于：
(1)以海湾扇贝AiPGRP编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用；
(2)PCR扩增产物与将pEASY-E1载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
(3)将上述构建载体转入Trans1-T1表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白AiPGRP；
所述引物P1和P2分别为P1：5’-GATCGAATCTGCGACAACATACATG-3’；P2：5’-AATCATCGCGGCACATTGCTGTC-3’。
3.一种权利要求1所述的海湾扇贝肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的应用，其特征在于：所述序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白AiPGRP用于制备抗鳗弧菌和藤黄微球菌制剂。
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