CN104474557B - 一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素‑2(CgCLec‑2)重组蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素‑2(CgCLec‑2)的应用。长牡蛎C型凝集素‑2(CgCLec‑2)基因用于制备抑菌剂或饲料添加剂。本发明中体外重组表达的长牡蛎凝集素‑2(CgCLec‑2)蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有抑制生长作用，作为一种有效的模式识别受体，在开发抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)的应用。
背景技术
长牡蛎是一种重要的海水养殖贝类，在中国沿海均有分布。牡蛎养殖业在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，并具有巨大的发展前景。由于各种微生物引起的多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。因此，对长牡蛎开展免疫防御机制研究将有助于人类对其病害进行有效防控和治疗。
长牡蛎作为软体动物的代表，以其特殊的进化地位，得到人们越来越多的关注。由于缺乏适应性免疫防御系统，长牡蛎主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物的侵染。海洋环境中存在着大量的微生物群，宿主识别有害非己成分的能力显得尤为重要。C型凝集素作为一类重要的模式识别受体，能够识别表达在微生物细胞表面的病原相关分子模式，在固有免疫应答中发挥不可或缺的作用。
C型凝集素是一类包含有糖类识别结构域(CRD)并且以钙离子依赖的形式识别并结合糖类的蛋白。1860年，研究人员报道了蛇毒凝集素的凝集活性。随着对C型凝集素的深入研究，越来越多的证据表明，C型凝集素不仅作为模式识别分子在固有免疫应答反应中起作用，同时也作为效应分子抵御病原微生物的入侵。它不仅可以识别并结合入侵病原，并且具有促吞噬，结节形成及激活补体等功能。C型凝集素的抑菌活性首先在小鼠中发现，随后文昌鱼中也有类似报道。
发明内容
本发明的在于提供一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)重组蛋白的应用。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)重组蛋白的应用，长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制备抑菌剂或饲料添加剂。
所述长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制备抑制抗金黄色葡萄球菌的抑菌剂。
所述长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。
制备方法：
(1)用特定引物P1和P2对长牡蛎C型凝集素CgCLec-2编码区片段进行扩增；
P1：5’-CGCGGATCCATGGATACAGAAGTGACCTCAT-3’
P2：5’-CCCAAGCTTCTATAAAGTTTGTTCACAGATG-3’
(2)采用BamH I和HindⅢ对上述的重组子及pET32a载体进行酶切,酶切片段通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
(3)将上述构建重组子转入Transetta DE3表达菌株中进行诱导培养，而后纯化，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白CgCLec-2。本发明所具有的优点：
本发明中体外重组表达的长牡蛎凝集素-2(CgCLec-2)蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有抑制生长作用，作为一种有效的模式识别受体，在开发抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明实时例提供的长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2以钙离子依赖的形式识别并结合PAMPs。
图2为本发明实施例提供的长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2对金黄色葡萄球菌生长的影响。
具体实施方式
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1
长牡蛎凝集素-2(CgCLec-2)基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：
1、重组载体的构建
本发明中采用的重组载体为pET-32a原核表达载体。
通过PCR技术，采用5’末端分别添加了Bam H I和Hind Ⅲ特定酶切位点的基因特异性引物，对长牡蛎C型凝集素CgCLec-2编码区片段进行扩增：
基因特异性引物为：
P1(5’-CGCGGATCCATGGATACAGAAGTGACCTCAT-3’)：
P2(5’-CCCAAGCTTCTATAAAGTTTGTTCACAGATG-3’)，
反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用BamH I和Hind Ⅲ两个酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经BamH I和Hind Ⅲ两个酶酶切的表达载体pET-32a连接，完成载体的构建。上述实验操作的具体方法请参照《分子克隆第三版》。
2、重组蛋白CgCLec-2的表达
将构建好的重组载体转化表达宿主菌Transetta(DE3)中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mL的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至OD600＝0.4-0.8。加入IPTG，使终浓度达到1mmol L-1，继续培养4小时。4℃，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL的5倍的蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。
3、重组蛋白CgCLec-2的纯化与复性
本发明中重组蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化。获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。
具体操作步骤如下：
镍琼脂糖凝胶柱纯化分离带His标签的重组蛋白变性状态下蛋白纯化步骤如下：
(1)镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10mL；
(2)用缓冲液I(缓冲液I为50mmol L-1Tris-Hcl缓冲液,pH＝7.4,50m mol L-1NaCl,8mol L-1尿素)平衡2-5个床体积，流速为2mL min-1；
(3)经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000转，4℃离心30分钟，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mL min-1；
(4)用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2mL min-1；
(5)用含有50mmol L-1咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mL min-1；
(6)用含400mmol L-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集。
(7)用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；
(8)用纯水流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mL min-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在适当的复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mM EDTA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10％甘油、1％甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、1M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。每次在4℃透析12h，即得到SEQ ID NO.1所示的长牡蛎CgCLec-2基因重组蛋白。
SEQ ID NO.1
MDTEVTSLQDKYTDQKDNITDLGDTLKILLREQEWMVSNVSELHGKMQEMRDATLVIHQQVSEQLNHTEDSLRRFFVESFQNITNEYFENLQNISKQNVTSSLFEVVFKQANAAVALKEEIRKYALMMERLQFEISELKQNITLNKGTPSSPVTCPVGWSMFETSCYMAFNQQLSWNDASMKCLMSGSKLVEIETKAENDFLTTTLPNFKAGEAYWTGGKDDVTEGLWVWISSGATFGFLNWNQGEPNDAGGIEDCLQLYKRRGRKTYWNDNYCERSFNFICEQTL
◆ 长度：286个氨基酸
◆ 类型：氨基酸
◆ 链型：单链
◆ 特性：分子量为33kDa，等电点为4.75，具有一个保守的CRD结构域。
◆ 来源：长牡蛎
实施例2
长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2以钙离子依赖的形式识别并结合糖类
将20μg的LSP,PGN和MAN分别溶于50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中(pH 9.6)，每孔100μL包被酶标板，4℃过夜。为了避免非特异性结合加入200μL 3％BSA，37℃封闭1h。之后，每孔加入100μL 2倍梯度稀释的重组蛋白rCgCLec-2，在加入终浓度为10mM Ca2+或者不加入Ca2+的条件下18℃孵育3h。加入100μL用3％BSA稀释的大鼠抗rCgCLec-2的多克隆抗体(1:1000)，37℃孵育1h。加入100μL HRP标记的羊抗大鼠IgG(1:3000)，37℃孵育1h。每次孵育步骤之间用TBST洗3次，每次5min。二抗孵育并彻底清洗结束后，每孔加入100μL TMB，避光发色30min后，加入50μL 2M NaOH终止发色，酶标仪405nm处读取并记录数值。设rTrx蛋白阴性对照组和TBS空白对照组。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图(参见图1)。数据分析时，实验组(P)—空白对照(B)/阴性对照组(N)—空白对照(B)>2.1的孔视为阳性(参见图1)。实验表明重组蛋白CgCLec-2在没有钙离子的条件下，LPS,PGN和MAN的P/N都小于2.1，表明对该三类糖都没有结合能力(参见图1.A)；重组蛋白rCgCLec-2在10mM钙离子存在的条件下当蛋白浓度为17μg L-1时，LPS孔的P/N值为3.37，当蛋白浓度为2.12μg L-1时，PGN孔的P/N值为2.23，当蛋白浓度为68μg L-1时，MAN孔的P/N值为3.95。随着蛋白浓度的升高，各个PAMPs的P/N值逐渐变大，表明对糖的结合能力逐渐增强。该实验表明重组rCgCLec-2蛋白对糖类的识别和结合有钙离子依赖性。
实施例3
长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2的抑菌活性
1、微生物的培养及制备
金黄色葡萄球菌用LB培养基37℃，220rpm，培养到对数生长期时，用Tris-HCl(50mmol L-1,pH＝8.0)稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×103CFU。
2、重组蛋白CgCLec-2抑菌活性测定
对数生长期的金黄色葡萄球菌离心收集后用TBS(50mM Tris-Hcl,150mM NaCl)清洗重悬(104CFU)。50μL的长牡蛎重组蛋白CgCLec-2与等体积的金黄色葡萄球菌重悬液在CaCl2终浓度10mM的条件下室温孵育2h。取20μL上述混合物于平底96孔板(Costar，Fisher)中，每孔加入200μL LB液体培养基，于酶标仪中37℃振荡培养，每隔1h分别检测记录各孔OD600值。另设rTrx蛋白对照组和TBS空白对照组。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图(参见图2)。实验表明重组蛋白CgCLec-2在没有钙离子的条件下对LPS，PGN和MAN的P/N值<2.1,表明没有结合能力(参见图1.A)；重组蛋白CgCLec-2在10mM的钙离子存在的条件下随着。
Claims (1)
1.一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)重组蛋白的应用，其特征在于：SEQ ID NO.1所示长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因编码重组蛋白在用于制备抗金黄色葡萄球菌的抑菌剂的应用。
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