CN104623631A - 一种c型凝集素的应用 - Google Patents

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周泽军
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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类C型凝集素的应用。C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。本发明重组C型凝集素用于制备鱼类预防细菌或病毒感染的制剂，即能显著增强鱼类的抗细菌和抗病毒能力。

Description

一种C型凝集素的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类C型凝集素的应用。
背景技术
凝集素(lectin)是一类糖结合蛋白，广泛存在于动物和植物中。动物凝集素分为几种不同亚类，其中一种为C型凝集素(C-type lectin)。所有C型凝集素都具有一个保守的糖识别域(carbohydrate-recognition domain)，参与底物结合。大部分C型凝集素对底物的识别依赖于钙离子。C型凝集素在多种生物过程中发挥作用，包括细胞间相互作用和细胞信号传导等。许多C型凝集素能与病原表面的糖结合，造成病原凝集，从而诱发一系列免疫反应，促进病原的清除。因此C型凝集素是一种重要的天然免疫防御因子。目前已知的脊椎动物C型凝集素主要是作用于细菌和酵母，抗病毒C型凝集素尚无报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种鱼类(半滑舌鳎)C型凝集素的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种C型凝集素的应用，C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。
所述C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的药物。
所述C型凝集素用于制备鱼类抗病毒和抗细菌的药物或抑制剂，其中鱼类为半滑舌鳎。
所述C型凝集素为C型凝集素重组蛋白。
所述C型凝集素在大肠杆菌中表达即得到重组蛋白。
本发明具有如下优点：本发明的C型凝集素能够明显提高鱼类抗病毒和抗细菌感染能力。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化的C型凝集素重组蛋白。其中，泳道1，分子量标准；泳道2,C型凝集素。
图2为本发明实施例提供的凝集素增强鱼类抵抗细菌和病毒侵染。其中，A为抗细菌侵染；B为抗病毒侵染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
C型凝集素重组蛋白的制备
1)表达C型凝集素重组蛋白的质粒pCTL1的构建：
本发明中的C型凝集素基因序列已报道(GenBank accession number XP_008329461.1)。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,63℃ 60s,65℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(pET259构建过程参见Hu YH,Zheng WW,Sun L.Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum (Sciaenops ocellatus).Fish Shellfish Immunol 2010；28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pCTLl。DNA测序表明pCTLl含有编码C型凝集素序列的基因。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGTTATCTTTAAGCGAACCTGAGCC-3’；R1为5’-GATATCAAGACAGCTCGAGGGACGGGTTGCAC-3’。
2)重组C型凝集素蛋白的诱导表达和纯化
将上述的质粒pCTL1用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pCTL1。
将BL21/pCTL1于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续以转速160rpm摇动培养4-5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，将纯化的蛋白悬浮于PBS缓冲液。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)，质谱分析证实纯化的蛋白具有C型凝集素蛋白的序列和保守的糖识别域。
所述裂解液为终浓度的10mM NaH2PO4、10mM Tris和8M尿素,pH8.0。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
实施例2
重组C型凝集素的免疫应用
步骤1)凝集素的注射
将上述实施例1获得的C型凝集素在PBS中稀释至20ug/ml，即为凝集素稀释液。将20条半滑舌鳎(重约10.1g)随机分为4组，每组5条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别注射50ul凝集素稀释液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别注射50ul PBS。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
步骤2)细菌和病毒悬液制备
在LB培养基中培养鳗弧菌C312至OD600为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为106cfu/ml，即为鳗弧菌悬液。将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见Zhang M,Xiao Z,Hu Y,Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),in China.Aquac Res.2012；43:556–64)于PBS中稀释至105copies/ml，即为病毒悬液。
所所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.6250，保藏日期2012.6.21，分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
步骤3)攻毒感染
在上述步骤2)注射后1h，将A和B组的每条鱼注射100ul上述步骤2)的鳗弧菌悬液，将C和D组的每条鱼注射100ul上述步骤2)的病毒悬液。在细菌感染后第2天，取A和B组鱼肾脏和脾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30℃培养48h，计算出现的菌落数。在病毒感染后第7天，利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从C和D组鱼肾脏和脾脏组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明A组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为323和327)显著(P<0.01)低于B组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为460和495)；C组鱼肾脏和脾脏的病毒数(分别为6.8×103和10.8×105)显著(P<0.05)低于D组鱼肾脏和脾脏的病毒数(分别为9.3×105和13.8×105)。(参见图2)。
这些结果表明，本发明的C型凝集素能够显著增强鱼类抵抗细菌和病毒的侵染。

Claims (4)

1.一种C型凝集素的应用，其特征在于：C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。
2.按权利要求1所述的C型凝集素的应用，其特征在于：C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的药物。
3.按权利要求1或2所述的C型凝集素的应用，其特征在于：所述C型凝集素为C型凝集素重组蛋白。
4.按权利要求3所述的C型凝集素的应用，其特征在于：所述C型凝集素在大肠杆菌中表达即得到重组蛋白。
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