CN101152558A - LSECtin的一种新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了LSECtin的一种新用途。该新用途是LSECtin在作为抗丙型肝炎病毒感染药物作用靶点中的应用。如LSECtin在筛选抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及LSECtin的一种新用途。
背景技术
丙型肝炎病毒属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，是非甲、非乙型肝炎的主要致病因素。全世界大约有1.7亿人感染HCV。在HCV感染者中，大约有55-85％的急性感染转变成慢性感染，其中一些有症状的慢性感染能够发展成肝硬化和肝细胞性肝癌。由于缺少动物模型和有效的HCV体外细胞培养系统，因此关于HCV病毒感染机制还不清楚。研究者推测HCV的高发病率是由于病毒启动了免疫逃逸机制，机体不能对HCV病毒蛋白产生有效免疫反应造成[3]。目前还没有有效的疫苗可以用于HCV感染的预防，而临床较多应用IFN-α和病毒唑联合治疗，由于受到剂量、治疗时间和病毒基因型影响，疗效个体差异较大，而且有较大的副作用，因此仍然需要开发疫苗和新的治疗药物。
HCV基因组编码一个长的肽链，这个肽链被病毒的细胞蛋白酶切割为多个成熟病毒蛋白。这些蛋白分为结构蛋白(core、E1、E2和可能存在的p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NSSA和NS5B)。E1和E2是高度糖基化蛋白，它们形成异源二聚体并且被N连接的糖原进行广泛的转录后修饰。在感染过程中，HCV病毒颗粒首先与细胞表面特异性受体相互作用，引起HCV E1和E2的构象变化，导致病毒和细胞的膜融合，从而进入细胞。有证据表明E2糖蛋白参与受体的识别，E1介导膜融合。
在HCV的感染过程中有众多的粘附因子和受体同时或相继参与。由于缺少有效的HCV体外细胞培养系统，人们利用表达在昆虫细胞系统的病毒样颗粒、假病毒颗粒和可溶性E2蛋白作为替代物鉴定了一些潜在的HCV受体，包括CD81、SR-BI等，最近的研究证实CD81是HCV入胞所必需的共受体。由于HCV是嗜肝性病毒，而CD81、SR-B1是广泛表达的膜蛋白，因此不能通过它们解释HCV感染的组织特异性，从而提示必然存在肝脏特异表达的结合HCV的分子。最近的研究指出细胞表面的一些分子虽然不是感染所必需的，但是能够有效的提高病毒感染效率如C型凝集素家族成员中的DC-SIGN(DC-specific ICAM-3grabblng nonintegrin，DC-SIGN)和DC-SIGNR(DC-SIGN-related protein，DC-SIGNR)。DC-SIGN和DC-SIGNR作为俘获受体参与多种病毒的反式感染，包括HIV、埃博拉病毒、SARS冠状病毒和HCV。
DC-SIGN、DC-SIGNR属于II型C型凝集素，即Ca2+依赖型凝集素。它们属II型穿膜蛋白，N端位于细胞内部，C端位于细胞外，胞外部分含有一个糖识别结构域(CRD)。Ca2+是CRD结构整合和保证凝集素活性所必需的，直接参与配体结合。CRD结构域的典型特征是含有2个反向平行的β折叠和2个α螺旋，形成一个结合Ca2+的口袋，可以识别糖配体。有些在序列上同源的结构域却不识别糖配体，而是识别多肽或者脂类，它们与配体的结合可以不依赖Ca2+，这些结构被称为C型凝集素样的结构域(C-type lectin-like domains，CTLD)。
II型C型凝集素具有细胞粘附和识别病原体双重功能，其中识别病原体受多个水平的调节，主要包括以下几个方面：一、微生物表面和病原体相关分子的所有组成成分。大多数C型凝集素通过CRD/CTLD识别甘露糖、半乳糖，从而与糖蛋白上的糖基相互作用，发挥细胞粘附和捕捉抗原的功能，而糖基结合的特异性决定了选择性识别病原微生物；二、不同免疫细胞存在不同病原体识别受体；三、凝集素在细胞表面的分布影响糖结合能力；四、受体之间的CROSS-TALK形成多分子复合网络。由于C型凝集素识别病原体受到多个水平的调节，因此就有众多因素影响C型凝集素识别病原体。首先微生物表面的病原体相关分子模式(Pathogen-AssociatedMolecular Patterns，PAMPs)，包括LPS、肽聚糖、真菌细胞壁多糖的密度以及配体糖基排列、分枝的微小差异直接影响与C型凝集素的特异性结合。例如DC-SIGN能结合特殊排列的较复杂的甘露糖、非唾液酸化的Lewis-X/A、硫酸化的Lewis-A，而不与硫酸化的Lewis-X结合。其次凝集素在细胞表面的分布、多聚化的程度以及与细胞的脂筏(Lipid rafts)共定位也影响病原体识别。凝集素在细胞表面成簇分布有利于病毒的结合。DC-SIGN在树突状细胞(dendritis cells，DCs)上成簇分布，并且定位在某一微区域，为病毒入侵宿主细胞提供停靠“码头”。细胞的脂筏胆固醇和鞘糖脂含量高，脂筏与C型凝集素共定位也为病毒进入宿主提供一个停靠“码头”。最后，C型凝集素与Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)之间的cross-talk可以通过控制免疫激活和免疫耐受之间的平衡影响对病原体的识别。结核杆菌衍生的甘露糖化的脂阿拉伯甘露糖与DCs上的DC-SIGN结合，能抑制TLR介导的IL-12的产生，使免疫系统从保护性的Th1转变到Th2，有利于结核杆菌的免疫逃逸。
DC-SIGN主要高表达于外周组织中不成熟DC以及淋巴组织中成熟DC的表面。DC-SIGN既是一种粘附分子，又是多种病原微生物的受体。目前已经发现DC-SIGN可以结合HIV、SIV、埃博拉病毒、巨细胞病毒、HCV和登革热病毒等，而且还可以和多种病原菌、酵母和寄生虫相互作用。DC-SIGNR特异性地表达在肝和淋巴结窦内皮细胞上，也可以结合多种病原体，包括HIV、HCV、辛德毕斯病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒，还有一些病原菌。最近，研究人员发现DC-SIGNR可以结合SARS相关的冠状病毒上的大S糖蛋白，中国仓鼠卵巢细胞转染DC-SIGNR后会对SARS相关的冠状病毒易感。以前只发现DC-SIGNR在肝窦内皮细胞和淋巴结中表达，而近期通过免疫组化发现DC-SIGNR还可以在II型肺泡细胞和肺内皮细胞中表达，为DC-SIGNR作为SARS相关的冠状病毒受体在肺部感染中发挥作用提供了组织表达谱上的特异性。DC-SIGN、DC-SIGNR不仅能够增强HIV对CD4+T细胞的反式感染，也能够通过CRD识别HCV膜糖蛋白E2的甘露聚糖，结合HCV，然后通过内化过程送入溶酶体，进行处理并提呈给邻近的肝实质细胞，引起肝实质细胞反式感染HCV。这个过程能使病毒长时间滞留在机体内而导致慢性感染，因而DC-SIGN、DC-SIGNR可能在病原微生物的慢性感染和免疫逃避中发挥着重要作用。DC-SIGN、DC-SIGNR属于II型C型凝集素家族，这一家族都含有典型的糖基识别结构域，那么家族中的其它成员是否也参与一种或多种病原微生物的感染？
LSECtin(liver sinusoidal endothelial cells C-type lectin，LSECtin)是一个新的II型C型凝集素家族成员，与DC-SIGN和DC-SIGNR结构相似，其N端含有一个较短的胞内结构域、一个穿膜部分和胞外部分、胞外由一个含coiled-coil结构域的颈部和一个C末端CTLD结构域组成。人源LSECtin基因定位于19p13.3，与CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR基因共同位于一个大约105kb大小的染色体区域。这一个染色体区域从中心粒起，依次为CD23、LSECtin、DC-SIGN和DC-SINGR。四个基因紧密成簇排列，它们的基因结构比较相似，说明它们是由同一个祖先基因经过平行复制而来，进化树分析已经证实这一结论。LSECtin与DC-SIGNR、DC-SIGN、CD23的氨基酸同源性分别为32％、31％和31％。
发明内容
本发明的目的是提供LSECtin的一种新用途。
本发明所提供的LSECtin的新用途是LSECtin在作为抗丙型肝炎病毒感染药物作用靶点中的应用。如LSECtin在筛选抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。
本发明通过HCV感染患者血清中的病毒颗粒、分泌型表达的HCV糖蛋白E2截短形式和HCV假病毒颗粒结合实验证实C型凝集素LSECtin是一个新的HCV的结合受体，LSECtin与HCV的黏附是通过LSECtin的CRD结构域和HCV的囊膜上E2糖蛋白之间的相互作用介导的。
附图说明
图1为LSECtin和DC-SIGNR稳定和瞬时细胞膜表面表达水平
A LSECtin和DC-SIGNR稳定表达的细胞膜表达水平
B LSECtin瞬时梯度表达的细胞膜表达水平
图2为LSECtin与HCV E2蛋白的特异性结合
A稳定表达LSECtin的细胞结合HCV E2蛋白
B瞬时表达LSECtin的细胞结合HCV E2蛋白的能力随着LSECtin的表达水平的提高而增加
C分泌型表达的LSECtin抑制LSECtin与HCV E2蛋白的结合
D EGTA抑制LSECtin与HCV E2蛋白的结合，Mannan部分降低LSECtin与HCV E2蛋白的结合
图3为LSECtin与HCV假病毒颗粒的结合以及EGTA抑制LSECtin与HCV假病毒颗粒的结合，Mannan部分降低LSECtin与HCV假病毒颗粒的结合
图4为LSECtin与HCV患者血清结合
图5为LSECtin与CD81、DC-SIGNR的相互作用
A免疫共沉淀实验证明LSECtin与DC-SIGNR的相互作用
B交互免疫共沉淀实验证明LSECtin与DC-SIGNR的相互作用
C免疫共沉淀实验证明LSECtin与CD81的相互作用
D分泌型LSECtin与DC-SIGNR的细胞粘附实验
E分泌型LSECtin与CD81的细胞粘附实验
具体实施方式
下述实验证实表达LSECtin的细胞能够以钙离子依赖的方式通过C末端的CTLD功能域结合HCV E2蛋白，钙离子螯合剂EGTA可以有效地封闭E2与LSECtin之间的相互作用，而这正是CTLD结构域的典型特征。HCV E2蛋白是高度甘露糖糖基化的蛋白，DC-SIGN、DC-SIGNR通过识别甘露糖识别E2蛋白，甘露聚糖能够抑制两者与HCV的结合。但是实验表明甘露聚糖不能抑制LSECtin结合E2糖蛋白和HCV假病毒颗粒，这提示LSECtin不是通过识别E2蛋白上的甘露糖结合HCV，具有与DC-SIGN、DC-SIGNR不同的特异性糖基识别谱。免疫共沉淀实验和细胞粘附实验证实了LSECtin和DC-SIGNR、CD81存在相互作用，这说明HCV的三个受体有可能在肝窦内皮细胞表面形成微区域，从而更有效地增强受体对HCV的亲和性。
实施例1、LSECtin与HCV E2蛋白的特异性结合
1材料
质粒pIRES(真核表达载体将2个基因分别克隆到2个多克隆位点并且高表达，能够在同一条mRNA上翻译2条连续的开放阅读框架)购自BD bioscience clontech，pSECtag2(分泌型真核表达载体)购自Invitrogen公司。
相关试剂Fc抗体购自Sigma公司。
2方法
一、LSECtin和DC-SIGNR稳定和瞬时细胞膜表面表达水平
1)pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin真核表达载体的构建
A、以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用引物pAL1(5′-TCGCTAGCATGGACACCACCAGGTCAGC-p3′)和pAL2(5′-CGGAATTCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-p3′)PCR扩增全长LSECtin基因，分别用EcoRI和NheI酶切全长LSECtin基因PCR扩增产物和pIRES，将全长LSECtin基因插入pIRES的EcoRI和NheI位点，得到重组载体pIRES-LSECtin。
B、以pcDNA3-DC-SIGNR(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用引物pAD1(5′-GCGCTAGCGAAAACATGAGTGAC-p3′)和pAD2(5′-CGGAATTCTCATTCGTCTCTGAAGCA-p3′)PCR扩增全长DC-SIGNR基因，分别用EcoRI和NheI酶切全长DC-SIGNR基因PCR扩增产物和pIRES，将全长DC-SIGNR基因插入pIRES的EcoRI和NheI位点，得到重组载体pIRES-DC-SIGNR。
C、以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用引物pAL11(5′-CGTCTAGAATGGACACCACCAGGTACAGC-p3)和pAL21(5′-TAGCGGCCGCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-p3′)PCR扩增全长LSECtin基因，分别用XbaI和NotI酶切全长LSECtin基因PCR扩增产物和pIRES-DC-SIGNR，将全长LSECtin基因插入pIRES-DC-SIGNR的XbaI和NotI位点，得到重组载体pIRES-DC-SIGNR-LSECtin。
2)稳定表达pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin的NIH-3T3细胞的筛选
NIH-3T3细胞铺六孔板，24小时后，用脂质体Lipofectamine2000和pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin质粒分别转染NIH-3T3细胞，转染后48小时，换含G418(800μg/ml)的DMEM，10％FBS的培养基，两周后，挑选单细胞克隆转入24孔板培养，一周后，扩大培养，并用LSECtin单抗(北京蛋白质组研究中心)和DC-SIGNR多抗(Santa Cruz Biotechnology公司)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP和兔抗羊IgG-HRP(中山公司)为二抗，Western Blot检测LSECtin和DC-SIGNR的表达，表达最高的细胞株扩大培养，液氮保存。
3)稳定表达的流式分析
表达pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin的NIH-3T3细胞稳定株用EDTA消化，PBS洗涤三次，细胞用4％的多聚甲醛固定，流式缓冲液(PBS，pH7.4，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤三次，分别加1∶50稀释的LSECtin单抗室温30min，流式缓冲液洗涤三次，分别加FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶50)，室温30min，流式缓冲液洗涤4次，流式细胞仪分析；或者用标记FITC的DC-SIGNR抗体室温30min，流式缓冲液洗涤4次，流式细胞仪分析。
以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用引物p1(5′-GCGAATTCAATGGACACCAGGTACAG-3′)和p2(5′-CGGGATCCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-3′)PCR扩增全长LSECtin基因，分别用EcoRI和BamHI酶切全长LSECtin基因PCR扩增产物和pFLAG-CMV2(Sigma)，将全长LSECtin基因插入pFLAG-CMV2(Sigma)的EcoRI和BamHI位点，得到重组载体pFLAG-CMV2-LSECtin。
用Effectene(Qiagen)分别转染0.1、0.2、0.4μg pFLAG-CMV2-LSECtin至HEK293T细胞，30小时后收获细胞。EDTA消化，PBS洗涤三次，细胞用4％的多聚甲醛固定，流式缓冲液(PBS，pH7.4，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤三次，分别加1∶50稀释的LSECtin单抗室温30min，流式缓冲液洗涤三次，分别加FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶50)，室温30min，流式缓冲液洗涤4次，流式细胞仪分析。
结果如图1所示，流式细胞检测稳定表达LSECtin、DC-SIGNR的细胞株的表达水平分别为59.37％、56.23％。图1中A左侧两张图片以DC-SIGNR多抗为一抗的检测结果，图1中A右侧两张图片和B图以LSECtin单抗为一抗的检测结果，其中图1A中从左数1、3分别为左数2、4的阴性对照(NIH-3T3细胞)。NIH-3T3-DC-SIGNR表示稳定表达pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3细胞，NIH-3T3-LSECtin表示稳定表达pIRES-LSECtin的NIH-3T3细胞。图1中A，M1表示与蛋白黏附的细胞；图1中B的0、0.1、0.2、0.4μg分别表示转染pFLAG-CMV2-LSECtin质粒的量，0.83％、15.91％、25.56％和35.64％分别表示HEK293T细胞相应表达LSECtin的流式水平，R2表示与蛋白黏附的细胞。
二、LSECtin与HCV E2蛋白的特异性结合
1、可溶性E2-myc融合蛋白表达载体构建
pBRTM-HCV1-3011(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，扩增HCV E2 364-661aa区域，F1：5′-CGCGGATCCTG GTGGGGAACTGGGCG-3′(划线部分为BamHI位点)，R1：5′-CCGCTCGAGA CTCGGACCTGTCCCTGTC-3’(划线部分为XhoI位点)，用LA Taq酶(TaKaRa)PCR扩增，循环条件为先94℃5min；然后94℃45s，58℃1min，72℃1min，20次循环；最后72℃，10min。产物用PCR纯化试剂盒纯化，BamHI和XhoI双酶切，产物回收后，与同样处理的C端带Myc-His标签的pSecTag2/Hygro(Invitrogen)连接转化JM109感受态细胞，挑选菌落，摇菌，提取质粒，XhoI和BamHI双酶切鉴定重组子和测序。测序正确的重组子大量提取质粒，并定量。将该正确的重组质粒命名为pSec-E2-myc。
2、可溶性Fc-sE2融合蛋白表达载体构建
pBRTM-HCV1-3011(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，扩增HCV E2 364-661aa区域，F1：5′-CGCTCTAGAAACCCACGTCACCGG-3′(划线部分为XbaI位点)，R1：5′-CCGGGGCCCTCACTCGGACCTGTCCCTGTC-3′(划线部分为ApaI位点)，用LA Taq酶(TaKaRa)PCR扩增。PCR产物用XbaI和ApaI双酶切，产物回收后，与同样处理的C端带Fc标签的Signal plus/G418(北京正旦国际科技有限责任公司)连接转化JM109感受态细胞，挑选菌落，摇菌，提取质粒，XbaI和ApaI双酶切鉴定重组子和测序。测序正确的重组子大量提取质粒，并定量。将该正确的重组质粒命名为pS-Fc-sE2。
3、可溶性sE2-myc和Fc-sE2融合蛋白表达
CHO细胞铺六孔板，24小时后用脂质体Lipofectamine2000和pSec-E2-myc或pS-Fc-sE2质粒转染CHO细胞，转染后48小时，换Hygromycin(200μg/ml)或G418(800μg/ml)的DMEM，10％FBS的培养基，两周后，挑选单细胞克隆转入24孔板培养，一周后，扩大培养，并用Myc或Fc单抗(invitrogen)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(中山公司)为二抗，Western Blot检测E2的表达，表达最高的细胞株扩大培养，液氮保存。收集细胞上清液，12000g，4℃，30分钟，弃沉淀，上清-70℃保存。制备大量融合蛋白时，用无血清的CHO培养基Hygromycin(200μg/ml)或G418(800μg/ml)替代含血清的DMEM培养基，培养4天，收集上清，离心去沉淀，30kDa超滤浓缩、定量，得到sE2-myc(可溶性的myc标签的E2蛋白)和Fc-sE2(Fc标签的可溶性E2蛋白)。其中，Hygromycin(200μg/ml)用于筛选转染pSec-E2-myc的细胞，G418(800μg/ml)用于筛选转染pS-Fc-sE2的细胞。
4、真核表达E2-myc和Fc-sE2融合蛋白与细胞粘附实验
步骤一中的单独表达LSECtin的稳定株、单独表达DC-SIGNR的稳定株、和共表达LSECtin和DC-SIGNR的稳定株各2×105个细胞，样品用结合缓冲液洗涤一次，离心去上清，加入200μl的sE2-myc(5μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；加入50μl的Myc单抗(20μg/ml)冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；再加50μl的FITC标记的羊抗鼠IgG(10μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次，重悬于500μl的含4％多聚甲醛的PBS中，流式检测。或者加入Fc-sE2蛋白200μl(5μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；加入FITC标记的Fc单抗(10μg/ml)，冰上30分钟，结合缓冲液洗涤离心三次，重悬于500μl的含4％多聚甲醛的PBS中。进行流式分析。其中，结合缓冲液为20mM Tris-HCl，pH8.0，15mM CaCl2，1Mm MgCl2，0.5％Triton X-100，150Mm NaCl。
结果如图2中A所示，以NIH-3T3细胞作阴性对照，检测Fc-sE2蛋白与LSECtin、DC-SIGNR分别稳定表达的细胞结合。流式结果显示粘附率分别为28.37、25.39％、(阴性对照NIH-3T3细胞为1.91％)，说明与DC-SIGNR相同，LSECtin能够结合E2糖蛋白；而且与DC-SIGNR结合比较，两者的结合能力没有差别。NIH-3T3-DC-SIGNR表示转pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3细胞，NIH-3T3-LSECtin表示转pIRES-LSECtin的NIH-3T3细胞。
用Effectene(Qiagen)分别转染0.1、0.2、0.4μg pFLAG-CMV2-LSECtin至HEK293T细胞，30小时后收获细胞，分为两份样品。一份样品EDTA消化，PBS洗涤三次，细胞用4％的多聚甲醛固定，流式缓冲液(PBS，pH7.4，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤三次，分别加1∶50稀释的LSECtin单抗室温30min，流式缓冲液洗涤三次，分别加FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶50)，室温30min，流式缓冲液洗涤4次，流式细胞仪分析。结果如图2中B左图所示，表明随着LSECtin质粒转染量的增加，膜表面表达LSECtin的细胞数也相应增加。横坐标表示是转染pFLAG-CMV2-LSECtin的量。另一份样品用结合缓冲液洗涤一次，离心去上清，加入200μl的sE2-myc(5μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；加入50μl的Myc单抗(20μg/ml)冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；再加50μl的FITC标记的羊抗鼠IgG(10μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次，重悬于500μl的含4％多聚甲醛的PBS中，流式检测。结果如图2中B右图所示，说明随着膜表面表达LSECtin的细胞数增加，能够结合E2蛋白的细胞也相应增多，从而说明E2蛋白的结合是依赖于细胞膜表面表达的LSECtin。图2中B的数值为3次重复实验的平均值±标准差。图2中B表达水平为流式细胞术测定的数据，表示表达LSECtin的细胞数占总细胞数的比例；HCV E2结合率指表达LSECtin的细胞中能够结合HCV E2的细胞所占的比例。
用Effectene(Qiagen)分别转染0.1、0.2、0.4μg pFLAG-CMV2-LSECtin至HEK293T细胞，30小时后收获细胞分为两份。一份样品用结合缓冲液洗涤一次，离心去上清，加入200μl的sE2-myc(5μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；加入50μl的Myc单抗(20μg/ml)冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；再加50μl的FITC标记的羊抗鼠IgG(10μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次，重悬于500μl的含4％多聚甲醛的PBS中，流式检测。另一组200μl的sE2-myc(5μg/ml)与分泌性的LSECtin蛋白孵育30分钟后再与细胞进行结合实验，实验步骤同上。结果如图2中C所示，表明分泌性的LSECtin蛋白能够特异性的抑制E2蛋白与表达LSECtin的细胞结合，说明LSECtin与E2蛋白结合的特异性。横坐标标题中的control表示转染pFLAG-CMV2的HEK293T细胞，LSECtin表示转染pFLAG-CMV2-LSECtin的HEK293T细胞与E2蛋白结合、LSECtin+sLSECtin表示E2蛋白与分泌型的LSECtin蛋白孵育后，与转染pFLAG-CMV2-LSECtin的HEK293T细胞结合。
图2中C的数值为3次重复实验的平均值±标准差；HCV E2结合率指表达LSECtin的细胞中能够结合HCV E2的细胞所占的比例。
5、EGTA和甘露聚糖的抑制实验
步骤一中的单独表达LSECtin的稳定株、单独表达DC-SIGNR的稳定株、和共表达LSECtin和DC-SIGNR的稳定株各2×105个细胞，用结合缓冲液洗涤一次，离心去上清，加入200μl的sE2-myc(5μg/ml)，再加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)或甘露聚糖，使EGTA的终浓度为15mM，甘露聚糖的终浓度为20μg/ml。同时设不加EGTA或甘露聚糖的对照。冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；加入50μl的Myc单抗(20μg/ml)冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次；再加50μl的FITC标记的羊抗鼠IgG(10μg/ml)，冰上60分钟，结合缓冲液洗涤离心三次，重悬于500μl的含4％多聚甲醛的PBS中。进行流式分析。其中，结合缓冲液为结合缓冲液为20mM Tris-HCl，pH8.0，15mM CaCl2，1Mm MgCl2，0.5％Triton X-100，150MmNaCl。
结果如图2中D所示，表明流式检测LSECtin组、DC-SIGNR组和NIH-3T3组粘附率分别为48.45、47.19、3.7％；加入甘露聚糖后各组结合E2蛋白的粘附率分别是29.11、18.63、8.21％；加入EGTA后其粘附率为14.13、18.17、4.02％。结果说明和DC-SIGNR相同，LSECtin与HCV E2的结合可以被EGTA抑制。与DC-SIGNR不同的是，在甘露聚糖的存在下DC-SIGNR的粘附率由47.19％降低到18.63％，而LSECtin的粘附率由48.45％降到29.11％，提示甘露聚糖不能完全抑制LSECtin与E2蛋白的结合。图2中D，medium表示对照，mannan表示加入甘露糖的处理，EGTA表示加入EGTA的处理；NIH-3T3-DC-SIGNR表示转pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3细胞，NIH-3T3-LSECtin表示转pIRES-LSECtin的NIH-3T3细胞。图2中D的数值为3次重复实验的平均值±标准差；HCV E2结合率指表达LSECtin的细胞中能够结合HCVE2的细胞所占的比例。本实验用的LSECtin-NIH3T3、DC-SIGNR-NIH3T3都是稳定表达细胞株(图2B则是瞬时表达)，因此LSECtin、DC-SIGNR表达水平几乎是每个细胞都有，所以粘附HCV E2的值也比较高。
实施例2、LSECtin与HCV假病毒颗粒的结合以及抑制实验
1、HCV E1E2真核表达载体的构建
以pBRTM-HCV1-3011(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用如下引物扩增HCV E1E2 364-1096aa区域，双酶切克隆到pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司)载体的HindIII和EcoRI位点，得到重组载体pcDNA-HCV E1E2。
5′-GCT AAG CTT GGA TGG CCG ACC TCA TGG GGT AC-3′
5′-CGA GAA TTC CGC CTC CGC TTG GGA TAT-3′
2、产生HCV假病毒
用293T细胞8×105/孔铺六孔板，24h后用脂质体2000共转染pNL4-3.Luc.R-E-(荧光素酶基因取代N端nef基因而且env阅读框架被破坏的HIV前病毒DNA载体，北京正旦国际科技有限责任公司)和pcDNA-HCV E1E2，48-72小时后收集上清，通过p24抗原ELISA检测试剂盒(购自bioMerieu bv，Boxtel，NL公司)进行p24抗原ELISA定量，浓度为67μg/μl，假病毒-80℃冻存。
3、HCV假病毒与结合实验：
实施例1步骤一中的单独表达LSECtin的稳定株、单独表达DC-SIGNR的稳定株、和共表达LSECtin和DC-SIGNR的稳定株各2×105个细胞，用粘附缓冲液洗涤三次，离心去上清，加入HCV假病毒lng，37℃作用60分钟，粘附缓冲液洗涤离心三次，裂解细胞，通过p24抗原ELISA检测试剂盒(购自bioMerieu bv，Boxtel，NL公司)进行p24抗原ELISA定量。其中，p24抗原的浓度为67μg/μl。粘附缓冲液为20mM Tris-HCl，pH8.0，15mM CaCl2，1Mm MgCl2，150Mm NaCl。
4、EGTA和甘露聚糖的抑制实验：用HCV假病毒与稳定株细胞的结合实验按步骤3操作，但在加入假病毒的同时，再加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)或甘露聚糖，使EGTA的终浓度为15mM，甘露聚糖的终浓度为20μg/ml。其他同步骤3。ELISA检测结合在细胞上的HCV假病毒中p24抗原含量，并计算与加入的p24抗原量之比，高出阴性对照2倍的认为是阳性。结果如图3所示，阴性对照、LSECtin、DC-SIGNR阳性对照细胞的p24抗原回收率分别为2.17、11.57、26.23％。结果显示LSECtin结合HCV假病毒，但其结合能力要弱于DC-SIGNR。EGTA、甘露聚糖抑制后，粘附率分别为4.58、9.56、5.47、2.74、1.06、5.79％。与DC-SIGNR相同，LSECtin与HCV假病毒颗粒的结合可被钙离子拮抗剂EGTA抑制；不同的是DC-SIGNR结合能被甘露聚糖抑制，而LSECtin不能。图3中，medium表示步骤3中的结果，mannan表示加入甘露糖的处理，EGTA表示加入EGTA的处理；NIH-3T3-DC-SIGNR表示转pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3细胞，NIH-3T3-LSECtin表示转pIRES-LSECtin的NIH-3T3细胞。图3中，p24Antigen Recovered(％)表示p24抗原回收率，图3中的数值为3次重复实验的平均值±标准差。
实施例3、LSECtin与HCV患者血清结合
1材料
HCV患者血清和无HCV感染血清均来自解放军301医院生化科。HCV阳性血清诊断均在RT-PCR检测大于104个拷贝/ml。质粒pcDNA3.1-DC-SIGNR(北京正旦国际科技有限责任公司)。
2、病毒的结合实验
实施例1步骤一中的NIH-3T3细胞、表达LSECtin的NIH-3T3稳定株各2×105个细胞，用粘附缓冲液洗涤三次，加入HCV患者血清(含HCV病毒)或无HCV感染血清37℃60分钟，粘附缓冲液洗涤离心三次；用HCV荧光实时定量PCR试剂盒(购自深圳匹基生物技术有限公司)进行检测结合在细胞表面的丙肝病毒的RNA。粘附缓冲液配方为20mM Tris-HCl，pH8.0，15mM CaCl2，1Mm MgCl2，150Mm NaCl。
3、病毒结合的抑制实验
抑制试验中HCV患者血清(含HCV病毒)或无HCV感染血清和分泌型表达的LSECtin蛋白4℃孵育30分钟后，与细胞进行结合(步骤同2)。
4、EGTA和甘露聚糖的抑制实验：用血清与稳定株细胞的结合实验按步骤2操作，但在加入血清的同时，再加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)或甘露聚糖，使EGTA的终浓度为15mM，甘露聚糖的终浓度为20μg/ml。其他同步骤2。
结果如图4和表1所示，以HCV阴性血清结合NIH-3T3细胞、稳定表达LSECtin细胞为阴性对照，检测的拷贝数均小于500。在与三份HCV阳性患者的血清(＞105)结合中，NIH-3T3细胞结合拷贝数分别为500、500和4300；而稳定表达LSECtin的细胞结合拷贝数分别为6.237×103、1.375×104、1.044×104。说明LSECtin能够结合HCV病毒颗粒。抑制试验显示钙离子螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、分泌型LSECtin蛋白(sLSECtin)能够抑制LSECtin与HCV患者血清中HCV病毒的结合；而甘露聚糖(mannan)不能够抑制两者的结合，说明LSECtin能够特异性的与HCV结合，但不是与HCV病毒的甘露糖结合。这些结果与LSECtin和HCV的E2蛋白、HCV的假病毒颗粒的实验结果相同。表1中，血清滴度列的数值是用于实验的血清样品HCV的RNA拷贝数，而NIH-3T3列、NIH-3T3-LSECtin列的HCV的RNA拷贝数则是与细胞结合的HCV RNA拷贝数；HCV-是指无HCV感染血清，#1、#2和#3表示HCV患者血清；ND表示没有测定。图4中，NIH-3T3列的数值是HCV阴、阳性血清结合到NIH-3T3细胞拷贝数与HCV阴性血清结合NIH-3T3细胞拷贝数的比值；NIH-3T3-LSECtin列的数值是HCV阴、阳性血清结合到稳定表达LSECtin的NIH-3T3细胞株的拷贝数与HCV阴性血清结合NIH-3T3细胞拷贝数的比值；HCV-、HCV+分别表示HCV阴、阳性血清。图4中的数值为3次实验、4个个体样品的平均值。
表1
| 血清滴度 | NIH-3T3 | NIH-3T3-LSECtin | |
| HCV- | ND | ＜500 | ＜500 |
| #1 | 1,900,000 | 500 | 6.237×103 |
| #2 | 1,734,000 | 500 | 1.375×104 |
| #3 | 3,200,00 | 4300 | 1.044×104 |
实施例4、LSECtin与CD81、DC-SIGNR的相互作用
材料
质粒真核表达载体pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司)。相关试剂anti-Myc单克隆抗体购自Clontech公司，anti-DC-SIGNR多克隆抗体购自Santa CruzBiotechnology公司，protein A/G-Agarose购自Santa Cruz Biotechnology公司，CHO无血清培养基、G418购自Gibco公司，谷胺酰胺购自Hyclone公司，FITC-anti-Fc(ab)′抗体购自Sigma公司，超滤管(30kDa)购自Millipore。
2.1Co-IP实验验证LSECtin与DC-SIGNR的相互作用
1)pcDNA3.1A-DC-SIGNR、pFLAG-CMV2-LSECtin真核表达载体的构建
A、以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用引物pl(5′-GCGAATTCAATGGACACCAGGTACAG-3′)和p2(5′-CGGGATCCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-3′)PCR扩增全长LSECtin基因，分别用EcoRI和BamHI酶切全长LSECtin基因PCR扩增产物和pFLAG-CMV2(Sigma)，将全长LSECtin基因插入pFLAG-CMV2(Sigma)的EcoRI和BamHI位点，得到重组载体pFLAG-CMV2-LSECtin。
B、以pcDNA3-DC-SIGNR(北京正旦国际科技有限责任公司)为模板，用引物pD1(5′-TCGGATCCGAAAACATGAGT-3′)和pD2(5′-CAGAATTCCAACTATTCGTCTCT-3′)PCR扩增全长DC-SIGNR基因，分别用EcoRI和KpnI酶切全长DC-SIGNR基因PCR扩增产物和pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，将全长DC-SIGNR基因插入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的EcoRI和KpnI位点，得到重组载体pcDNA3.1A-DC-SIGNR。
2)免疫共沉淀实验
pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2-LSECtin共转染HEK293T细胞，24小时后，收获、裂解细胞，提取细胞总蛋白。1mg细胞总蛋白，加入0.25μg对照IgG(兔IgG)，20μl protein-A/G agarose4℃摇30min，4℃离心5min(2,500r/min)，小心收取上清(沉淀的agarose待用，作为对照)，加入2μl flag抗体(Sigma)或者Myc抗体(Clonetech)，4℃摇4h，加入50μl protein-A/G agarose，4℃摇过夜，4℃离心5min，收取agarose沉淀(小心弃去上清)，加细胞裂解液，4℃摇30min，离心(2,500r/min)，洗3-4次，(与上面的待用沉淀的agarose同时做)，洗过的agarose沉淀重悬于40μl 1x上样缓冲液，100℃，5-10min；然后进行SDS-PAGE和Western blotting。其中，Western blotting中所用的一抗为flag抗体(Sigma)或者Myc抗体(Clonetech)。
2.2稳定株筛选
1)稳定表达DC-SIGNR的CHO细胞的筛选
CHO细胞铺六孔板，24小时后，用脂质体Lipofectamine2000和pcDNA3.1A-DC-SIGNR质粒共转染到CHO细胞，转染后48小时，换含G418(800μg/ml)的10％FBS DMEM培养基，两周后，挑选单细胞克隆转入24孔板培养，一周后，扩大培养，并用DC-SIGNR多抗为一抗，兔抗羊IgG-HRP为二抗，Western Blot检测DC-SIGNR的表达，表达最高的细胞株扩大培养，液氮保存。
2)稳定表达的流式分析
表达pcDNA3.1A-DC-SIGNR的CHO细胞稳定株用EDTA消化，PBS洗涤三次，细胞用4％的多聚甲醛固定，流式缓冲液(PBS，pH7.4，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤三次，用标记Fluorescein的DC-SIGNR抗体室温30min，流式缓冲液洗涤四次，流式细胞仪分析。
2.3细胞粘附实验
1)构建稳定表达LSECtin胞外区域的CHO细胞，获得Fc-sLSECtin融合蛋白
CHO细胞铺六孔板，pIG-sLSECtin(北京正旦国际科技有限责任公司)质粒用Lipofectamine2000，转染CHO细胞，转染后48小时，换含G418(800μg/ml)的DMEM，10％FBS的培养基，两周后，挑选单个细胞克隆转入24孔板培养，一周后，扩大培养，并用Fc单抗为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(中山公司)为二抗，Western Blot检测细胞培养上清液sLSECtin的表达，ELISA法测Fc含量，表达最高的细胞株，扩大培养，用含G418(400μg/ml)的DMEM培养稳定表达LSECtin胞外区域蛋白的细胞，扩大培养。细胞长至90％时，用更换CHO无血清培养基(含G418 400μg/ml)替代含血清的DMEM培养基，培养4天，收集上清并离心去沉淀。用截留分子量为30kDa超滤管浓缩100倍，得到Fc-sLSECtin融合蛋白，低温保存。
2)稳定表达DC-SIGNR的CHO细胞的黏附
培养稳定表达DC-SIGNR的CHO细胞2×105，收集细胞，用结合缓冲液(20mMTris-HCl2，pH8.0，15mM CaCl2，1Mm MgCl2，1％TritonX-100，150mM NaCl)洗涤一次，离心去上清，加入Fc-sLSECtin蛋白200μl(5μg/ml)，冰浴60分钟，结合缓冲液离心洗涤三次；加50μl FITC-anti-Fc(ab′)2抗体(5μg/ml)，冰浴30分钟，结合缓冲液离心洗涤三次；细胞重悬于500μl的结合缓冲液中，立即流式细胞仪分析。对照组Fc蛋白(将pIG(北京正旦国际科技有限责任公司)按照步骤1)的方法转入CHO细胞表达得到Fc蛋白)替代Fc-sLSECtin融合蛋白，其它步骤相同。
1、免疫共沉淀实验证明LSECtin与DC-SIGNR的相互作用
瞬时转染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2-LSECtin至293T细胞，30小时后裂解细胞，进行预免疫沉淀后，用anti-myc单抗免疫沉淀，anti-Flag单抗(invitrogen)和anti-myc单抗Western印记检测，结果如图5中A所示，单独转染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和共转染的细胞免疫沉淀产物中可以检测到DC-SIGNR，表明免疫沉淀正确。同时在共转染的细胞免疫沉淀产物中检测到LSECtin，表明LSECtin能够被DC-SIGNR免疫共沉淀。图5中A，1、2道转染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2，3、4道转染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2，5、6道转染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2-LSECtin，7、8道转染pcDNA3.1A-DC-SIGNR(pcDNA3.1A-DC-SIGNR表达的蛋白为Myc标签的DC-SIGNR，在图中表示为Myc-DC-SIGNR)和pFLAG-CMV2-LSECtin。Lysate代表细胞裂解物，IP代表免疫沉淀产物，IB代表immunoblotting，也称为Western blot；从左至右依次为泳道1、2、3、4、5、6、7、8。
2、交互免疫共沉淀实验证明LSECtin与DC-SIGNR的相互作用
为了进一步排除其它干扰因素，避免标签抗体导致的假阳性，又进行了交互免疫共沉淀，用anti-Flag单抗免疫沉淀，anti-myc单抗和anti-Flag单抗Westernblot检测，结果如图5中B，表明LSECtin能够免疫共沉淀DC-SIGNR，说明LSECtin和DC-SIGNR之间确实存在相互作用。图5中B，7、8道转染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2，5、6道转染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2，3、4道转染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2-LSECtin，1、2道转染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2-LSECtin。Lysate代表细胞裂解物，IP代表免疫沉淀产物，IB代表immunoblotting，也称为Western blot；从左至右依次为泳道1、2、3、4、5、6、7、8。
3、免疫共沉淀实验证明LSECtin与CD81的相互作用
瞬时转染pCMV-MYC-CD81(北京正旦国际科技有限责任公司)和pFLAG-CMV2-LSECtin至293T细胞，30小时后裂解细胞，进行预免疫沉淀后，用anti-flag单抗免疫沉淀，anti-flag单抗和anti-myc单抗Western印记检测，结果如图5中C所示，表明单独转染pFLAG-CMV2-LSECtin和共转染的细胞免疫沉淀产物中可以检测到LSECtin，表明免疫沉淀正确。同时在共转染的细胞免疫沉淀产物中检测到CD81，表明CD81能够被LSECtin免疫共沉淀。图5中C，1、2道转染pCMV-MYC(购自Clontech公司)和pFLAG-CMV2，3、4道转染pCMV-MYC-CD81和pFLAG-CMV2，5、6道转染pCMV-MYC和pFLAG-CMV2-LSECtin，7、8道转染pCMV-MYC-CD81和pFLAG-CMV2-LSECtin；Lysate代表细胞裂解物，IP代表免疫沉淀产物，IB代表immunoblotting，也称为Western blot；从左至右依次为泳道1、2、3、4、5、6、7、8。
4、分泌型LSECtin与DC-SIGNR的细胞粘附实验
用Fc-LSECtin蛋白与稳定表达DC-SIGNR的CHO细胞株进行细胞粘附实验，结果如图5中D所示，Fc-LSECtin和CHO细胞当作阴性对照，检测Fc-LSECtin结合DC-SIGNR稳定株实验组粘附率，分别为19.66％和80.16％。表明Fc-LSECtin蛋白能够粘附稳定表达pcDNA3.1A-DC-SIGNR的CHO细胞株，进一步证实两者存在相互作用。图5中D，control表示Fc-LSECtin与CHO细胞的黏附率，DC-SIGNR表示Fc-LSECtin结合稳定表达DC-SIGNR的CHO细胞株的黏附率。图5中D的数值为3次重复实验的平均值±标准差。
5、分泌型LSECtin与CD81的细胞粘附实验
用Effectene(Qiagen)转染试剂分别瞬时转染0.4μg pCMV-MYC、pCMV-MYC-CD81至HEK293T细胞，24小时后收集细胞，用结合缓冲液(20mMTris-HCl2，pH8.0，15mM CaCl2，1Mm MgCl2，1％TritonX-100，150mM NaCl)洗涤一次，离心去上清，加入Fc-sLSECtin蛋白200μl(5μg/ml)，冰浴60分钟，结合缓冲液离心洗涤三次；加50μl FITC-anti-Fc(ab′)2抗体(5μg/ml)，冰浴30分钟，结合缓冲液离心洗涤三次；细胞重悬于500μl的结合缓冲液中，立即流式细胞仪分析。结果如图5中E所示，Fc-LSECtin和转染pCMV-MYC的HEK293T细胞当作阴性对照，检测Fc-LSECtin结合转染pCMV-MYC-CD81的HEK293T细胞实验组粘附率，分别为8.89％和27.72％(如图5)。表明Fc-LSECtin蛋白能够粘附表达pCMV-MYC-CD81的HEK293T细胞，进一步证实两者存在相互作用。图5中E的数值为3次重复实验的平均值±标准差。
Claims (2)
1.LSECtin在作为抗丙型肝炎病毒感染药物作用靶点中的应用。
2.LSECtin在筛选抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。
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