CN101732715B - LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用。本发明发现LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白可应用于制备抑制癌细胞向肝转移的药物。本发明还提供了一种抑制结肠癌肝转移的药物，其活性成分为LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。LSECtin蛋白及其融合蛋白能粘附结肠癌细胞、抑制结肠癌细胞往肝脏的归巢性迁移，因此，很可能成为抗粘附治疗肿瘤肝转移的一个新靶标。本发明具有巨大的社会意义和经济价值。

Description

LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用

技术领域

本发明涉及LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用。

背景技术

90％以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。侵袭性生长和转移潜能是恶性肿瘤的顽固性和难治性的根本原因。目前人类对肿瘤的认识水平和常规治疗手段尚无法从根本上清除恶性肿瘤，因此，挖掘抑制肿瘤转移的药物仍是当今急需解决的问题。

肿瘤转移指恶性肿瘤细胞脱离其原发部位，通过各种渠道转运到不连续的靶组织，继续增殖生长成同样性质肿瘤的过程。据统计，60％以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。恶性肿瘤的转移途径主要有血道转移和淋巴道转移：①血道转移：癌细胞若进入血管，部分死亡，部分仍然存活，活的癌细胞可随血液流到身体任何一处停留并生长，发生血行转移。②淋巴道转移：癌细胞很容易侵入淋巴管，被淋巴液带到淋巴结而生成转移瘤；癌细胞在淋巴结缘窦时，淋巴结不肿大，肉眼所见大致正常；癌细胞逐渐在淋巴结内生长造成淋巴结的肿大而坚硬；局部淋巴结转移后，癌细胞又可沿其侧枝逐步扩散，转移至远隔部位之淋巴结。肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，其中肿瘤细胞的粘附性在肿瘤侵袭和转移中起着极为重要的作用，因此抗粘附治疗在抗肿瘤侵袭转移方面必将有着十分广阔的应用前景。美国FDA批准的临床I期新抗体CNTO95(αV整合素的人源性单抗)，在体外实验中可阻断人黑色素瘤细胞的粘附、移动和侵袭。在黑色素瘤异种移植的裸鼠体内，CNTO95不但可抑制肿瘤血管生成，并且可以有效抑制肿瘤的生长。

LSECtin(Liver and lymph node Sinusoidal Endothelial Cells lectin)为贺福初等在国际上率先克隆并研究的一种新的C-型凝集素，在肝脏和淋巴结中特异表达，其基因与已知的C-型凝集素DC-SIGN、DC-SIGNR和CD23基因紧密成簇排列于染色体19p13.3区域，同属于II型C-型凝集素家族(Liu，W.et al.Characterization of a novel C-type lectin-like gene，LSECtin：demonstrationof carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells ofliver and lymph node.J Biol.Chem.279，18748-18758，2004)。

发明内容

本发明的目的是提供一种LSECtin及其融合蛋白的新用途。

本发明提供的新用途是LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移的药物中的应用。

所述含有LSECtin的融合蛋白为LSECtin与人IgG的融合蛋白。

所述LSECtin具体为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白具体为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述癌细胞具体可为结肠癌细胞。

本发明还提供了一种抑制结肠癌肝转移的药物，其活性成分为LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。

所述含有LSECtin的融合蛋白为LSECtin与人IgG的融合蛋白。

所述LSECtin具体为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白具体为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述癌细胞具体可为结肠癌细胞。

实验证明：LSECtin蛋白及其融合蛋白与结肠癌细胞LS174T、LoVo、SW480结合，而且识别其表面的特异糖链；结肠癌细胞株LS174T在体外与肝窦内皮细胞上的粘附可被LSECtin蛋白及其融合蛋白阻断；结肠癌细胞株LS174T在体内与肝脏的粘附可被LSECtin蛋白及其融合蛋白阻断；整体实验进一步证明LSECtin蛋白及其融合蛋白能阻断LS174T往肝脏的转移。LSECtin蛋白及其融合蛋白能粘附结肠癌细胞、抑制结肠癌细胞往肝脏的归巢性迁移，可能用作制备预防和/或治疗结肠癌肝转移的药物。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为实施例1的HE染色标记检测结果。

图2为实施例1的癌胚抗原标记检测结果。

图3为注射LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白后结肠癌肝转移小鼠的存活率；(a)为LSECtin蛋白，(b)为可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。

图4为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体外粘附的影响。

图5为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体内的粘附的影响。

图6为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与结肠癌细胞的粘附。

图7为不同浓度的LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞的粘附；(a)为LSECtin蛋白，(b)为可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。

图8为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞粘附的抑制剂；(a)为LSECtin蛋白，(b)为可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用到的实验材料如下：

CHO，中国仓鼠卵巢癌细胞(中国医学科学院基础医学细胞中心)；Fc-FITC抗体(Sigma，HP-6017)；Lipofectamine^TM 2000 Reagent(Invitrogen)；ImmunoPureImmobilized Protein A/G(Pierce)；LS174T、LoVo、DLD-1、SW480结肠癌细胞株(中科院上海细胞库)；CFSE(Sigma)；LSECtin蛋白(购自于R&D公司)。

BalB/c雌鼠：体重20±2克，6-8周，购自维通利华动物中心；

BalB/c SPF级裸鼠：体重20±2克，6-8周，购自维通利华动物中心。

PBS溶液：135mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8mM K₂HPO₄；pH7.2。

实施例2至实施例8中所用的LSECtin蛋白溶液均是用PBS溶液稀释LSECtin蛋白得到的，所用的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白溶液，均是用PBS溶液稀释实施例1得到的纯化后的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白得到的。

实施例1、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白的获得

1、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白表达载体(pIG-sLSECtin)的构建

pIG-sLSECtin含有可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(氨基酸序列见序列表的序列2)的编码序列(见序列表的序列3)。pIG-sLSECtin的构建方法如下：

(1)pET-28-sLSECtin表达载体的构建

设计LSECtin膜外部分的特异性引物：F1：5′-CGG GGATCCAAGGCCTCCACGGAGCGC-3′，(画线部分为BamH I酶切位点)和R1：5′-ACGCGTCGACTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTC-3′(画线部分为Sal I酶切位点)，以流产的人胎肝cDNA为模板，PCR扩增LSECtin的膜外部分。PCR反应条件为：先94℃ 5min；然后94℃ 45s，58℃1min，72℃ 1min，30个循环；再72℃ 10min。PCR产物用BamH I和Sal I 37℃双酶切过夜。同时，质粒pET-28a(invitrogen公司)也用BamH I和Sal I双酶切。酶切产物纯化、连接，转染JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定重组子并测序验证，将得到的重组表达载体命名为pET-28-sLSECtin。

(2)pIG-sLSECtin表达载体的构建

以F2：5′-CGGAAGCTTAAGGCCTCCACGGAGCGC-3′(画线部分为Hind III酶切位点)和R2：5′-ACGCTCTAGATCAGCAGTTGTGCCTTTTCTC-3′(画线部分为Xba I酶切位点)为引物，以上述步骤(1)构建的重组表达载体pET-28-sLSECtin为模板，PCR扩增LSECtin的膜外部分可溶性LSECtin(其氨基酸序列是GenBank AccessionNumber AAR84185的自氨基末端第55至293位氨基酸)。

PCR反应条件为：先94℃ 5min变性；再94℃ 45s，58℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；最后72℃，10min。PCR产物用Hind III和Xba I 37℃双酶切过夜。同时，Signal pIGplus质粒(invitrogen公司)也用Hind III和Xba I双酶切。酶切产物纯化、连接，转染JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，HindIII和Xba I双酶切鉴定重组子并测序验证，将得到的重组表达载体命名为pIG-sLSECtin。

将该质粒进行测序，结果表明，pIG-sLSECtin含有序列3所示的核苷酸序列，该核苷酸序列编码序列2所示的氨基酸序列。

2、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白的表达与纯化

将pIG-sLSECtin质粒用Lipofectamine^TM2000 Reagent转染到CHO中国仓鼠卵巢癌细胞，转染后48小时，用含G418的DMEM完全培养基(1mg/ml)培养，两周后，挑选单细胞克隆转入24孔板培养，一周后扩大培养。从每一株单克隆细胞中分别取少许细胞在24孔板中培养，24小时后换为无血清培养基(将DMEM完全培养基中的血清去除得到的培养基)继续培养72小时，收上清，以LSECtin抗体(购自R&D公司)为一抗进行Western Blot检测。将强阳性的细胞株继续扩大培养，无血清培养基培养三天后，收集上清，用ImmunoPure Immobilized Protein A/G进行纯化，纯化后进行Western Blot鉴定，鉴定结果表明得到了纯化的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。

实施例2、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞株在肝脏形成转移灶的影响

取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半。随机分为3组，每组10只。

取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。第一组裸鼠体内注射0.1ml LSECtin蛋白(5μg/ml)；第二组裸鼠体内注射0.1ml可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(5μg/ml)；第三组裸鼠体内注射0.1ml PBS。12小时后将结肠癌细胞(1×10⁷/只)经尾静脉注入裸鼠体内。分别于试验后第7天、第14天、第21天每组各杀死3只老鼠，取其肝脏固定、石蜡包埋，分别采用H＆E染色和癌胚抗原免疫组化染色，观察LS174T的肝转移情况、分析肿瘤转移率。

H&E染色标记检测结果见图1。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能明显减少肝脏内肿瘤转移灶的形成。癌胚抗原标记检测结果见图2。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能明显减少肝脏内肿瘤转移灶的形成。

实施例3、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对结肠癌肝转移小鼠存活的影响

取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。第一组裸鼠体内注射0.1ml LSECtin蛋白(5μg/ml)；第二组裸鼠体内注射0.1ml可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(5μg/ml)；第三组裸鼠体内注射0.1ml PBS。12小时后将结肠癌细胞(1×10⁷/只)经尾静脉注入裸鼠体内。连续观测小鼠的存活率。

结果见图3。结果表明，在相同天数的条件下，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白能明显提高小鼠存活率。

实施例4、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体外粘附的影响

取BalB/c雌鼠30只，分别制备肝组织冰冻切片，将30张冰冻切片分为3组，每组10张。分别检测LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体外粘附的影响，具体操作如下：

取正常小鼠肝组织冰冻切片，第一组切片用LSECtin蛋白和LS174T结肠癌细胞孵育，第二组切片用可溶性LSECtin-Fc融合蛋白和LS174T结肠癌细胞孵育，第三组切片用PBS和LS174T结肠癌细胞孵育，作为对照。1小时后，检测结肠癌细胞是否黏附到小鼠肝组织冰冻切片上及黏附部位。结合结肠癌细胞后的冰冻切片用戊二醛固定，H＆E染色。显微镜下照相保存，并分析细胞黏附结果。

结果见图4。LS174T细胞能够容易地黏附到肝脏上，其黏附位置为肝窦内皮细胞。LS174T细胞与肝窦内皮细胞的黏附能被LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白阻断。

实施例5、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体内的粘附的影响

一、LS174T结肠癌细胞荧光标记

用活体染料CFSE(Sigma)标记LS174T结肠癌细胞。具体操作为：将1×10⁶LS174T结肠癌细胞在1ml PBS和5uM CFSE中37℃孵育10min，然后加入1ml冷却的PBS停止反应，被标记的细胞立即清洗并计数。

二、体内粘附实验

取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。第一组裸鼠体内注射0.1ml LSECtin蛋白(5μg/ml)；第二组裸鼠体内注射0.1ml可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(5μg/ml)；第三组裸鼠体内注射0.1ml PBS。12小时后注射荧光标记的结肠癌细胞(1×10⁷/只)，12小时后处死小鼠，制备肝细胞悬液，用流式细胞技术检测肝内转移的肿瘤细胞数。

结果见图5。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白能明显减少肿瘤细胞往肝脏的转移。

实施例6、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与各种结肠癌细胞的粘附

分别检测LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与4种结肠癌细胞(LS174T、LoVo、DLD-1、SW480)的粘附性；PBS溶液作为对照；具体方法如下：

(1)PBS洗涤癌细胞，4500rpm，3min，弃上清；

(2)癌细胞与LSECtin蛋白(或可溶性LSECtin-Fc融合蛋白共孵育)，孵育体系中，癌细胞的浓度为5×10⁵/ml、蛋白的浓度为10μg/ml，室温放置1h；

(3)PBS洗涤，4500rpm，3min，弃上清；

(4)加LSECtin抗体，冰上放置1h；

(5)PBS洗涤，4500rpm，3min，弃上清；

(6)加FITC标记二抗(购自Santa Cruz)，暗处冰上放置1h；

(7)PBS洗涤，4500rpm，3min，弃上清；

(8)加100μlPBS、400μl4％多聚甲醛固定，流式细胞仪分析。

结果见图6。结果表明，LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能结合结肠癌细胞SW480、LoVo和LS174T。

实施例7、不同浓度的LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞的粘附

分别检测不同浓度的LSECtin蛋白(0、1、2、5、10μg/ml)、不同浓度的实施例1制备的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(0、1、2、5、10μg/ml)与LS174T结肠癌细胞的粘附性；PBS溶液作为对照；具体方法同实施例6。

结果见图7。结果表明，结果表明，LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与结肠癌细胞LS174T的结合均随着蛋白浓度的增加而升高。

实施例8、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞粘附的抑制剂

将10μg/ml的LSECtin蛋白(或10μg/ml的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白)分别与EDTA(10mM)、甘露醇糖(Mannan)(10mM)、岩藻糖(Fucose)(10mM)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)(10mM)或PBS(对照)等体积混合，孵育30分钟。然后检测LSECtin蛋白(或可溶性LSECtin-Fc融合蛋白)与LS174T结肠癌细胞的粘附性，具体方法同实施例6。

结果见图8。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与结肠癌细胞LS174T的结合能不同程度的被EDTA、甘露醇糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖所抑制。

                        序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用

<130>CGGNARY81876

<160>3

<210>1

<211>293

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>482

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

<210>3

<211>1449

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Claims (4)

1.LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移的药物中的应用；所述LSECtin为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述癌细胞为结肠癌细胞。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为序列表中序列3所示的DNA分子。

3.一种抑制结肠癌肝转移的药物，其活性成分为LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白；所述LSECtin为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

4.如权利要求3所述的药物，其特征在于：所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为序列表中序列3所示的DNA分子。

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