CN101732715A - LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用。本发明发现LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白可应用于制备抑制癌细胞向肝转移的药物。本发明还提供了一种抑制结肠癌肝转移的药物，其活性成分为LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。LSECtin蛋白及其融合蛋白能粘附结肠癌细胞、抑制结肠癌细胞往肝脏的归巢性迁移，因此，很可能成为抗粘附治疗肿瘤肝转移的一个新靶标。本发明具有巨大的社会意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用。
背景技术
90％以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。侵袭性生长和转移潜能是恶性肿瘤的顽固性和难治性的根本原因。目前人类对肿瘤的认识水平和常规治疗手段尚无法从根本上清除恶性肿瘤，因此，挖掘抑制肿瘤转移的药物仍是当今急需解决的问题。
肿瘤转移指恶性肿瘤细胞脱离其原发部位，通过各种渠道转运到不连续的靶组织，继续增殖生长成同样性质肿瘤的过程。据统计，60％以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。恶性肿瘤的转移途径主要有血道转移和淋巴道转移：①血道转移：癌细胞若进入血管，部分死亡，部分仍然存活，活的癌细胞可随血液流到身体任何一处停留并生长，发生血行转移。②淋巴道转移：癌细胞很容易侵入淋巴管，被淋巴液带到淋巴结而生成转移瘤；癌细胞在淋巴结缘窦时，淋巴结不肿大，肉眼所见大致正常；癌细胞逐渐在淋巴结内生长造成淋巴结的肿大而坚硬；局部淋巴结转移后，癌细胞又可沿其侧枝逐步扩散，转移至远隔部位之淋巴结。肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，其中肿瘤细胞的粘附性在肿瘤侵袭和转移中起着极为重要的作用，因此抗粘附治疗在抗肿瘤侵袭转移方面必将有着十分广阔的应用前景。美国FDA批准的临床I期新抗体CNTO95(αV整合素的人源性单抗)，在体外实验中可阻断人黑色素瘤细胞的粘附、移动和侵袭。在黑色素瘤异种移植的裸鼠体内，CNTO95不但可抑制肿瘤血管生成，并且可以有效抑制肿瘤的生长。
LSECtin(Liver and lymph node Sinusoidal Endothelial Cells lectin)为贺福初等在国际上率先克隆并研究的一种新的C-型凝集素，在肝脏和淋巴结中特异表达，其基因与已知的C-型凝集素DC-SIGN、DC-SIGNR和CD23基因紧密成簇排列于染色体19p13.3区域，同属于II型C-型凝集素家族(Liu，W.et al.Characterization of a novel C-type lectin-like gene，LSECtin：demonstrationof carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells ofliver and lymph node.J Biol.Chem.279，18748-18758，2004)。
发明内容
本发明的目的是提供一种LSECtin及其融合蛋白的新用途。
本发明提供的新用途是LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移的药物中的应用。
所述含有LSECtin的融合蛋白为LSECtin与人IgG的融合蛋白。
所述LSECtin具体为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白具体为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述癌细胞具体可为结肠癌细胞。
本发明还提供了一种抑制结肠癌肝转移的药物，其活性成分为LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。
所述含有LSECtin的融合蛋白为LSECtin与人IgG的融合蛋白。
所述LSECtin具体为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白具体为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述癌细胞具体可为结肠癌细胞。
实验证明：LSECtin蛋白及其融合蛋白与结肠癌细胞LS174T、LoVo、SW480结合，而且识别其表面的特异糖链；结肠癌细胞株LS174T在体外与肝窦内皮细胞上的粘附可被LSECtin蛋白及其融合蛋白阻断；结肠癌细胞株LS174T在体内与肝脏的粘附可被LSECtin蛋白及其融合蛋白阻断；整体实验进一步证明LSECtin蛋白及其融合蛋白能阻断LS174T往肝脏的转移。LSECtin蛋白及其融合蛋白能粘附结肠癌细胞、抑制结肠癌细胞往肝脏的归巢性迁移，可能用作制备预防和/或治疗结肠癌肝转移的药物。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为实施例1的HE染色标记检测结果。
图2为实施例1的癌胚抗原标记检测结果。
图3为注射LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白后结肠癌肝转移小鼠的存活率；(a)为LSECtin蛋白，(b)为可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
图4为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体外粘附的影响。
图5为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体内的粘附的影响。
图6为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与结肠癌细胞的粘附。
图7为不同浓度的LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞的粘附；(a)为LSECtin蛋白，(b)为可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
图8为LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞粘附的抑制剂；(a)为LSECtin蛋白，(b)为可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用到的实验材料如下：
CHO，中国仓鼠卵巢癌细胞(中国医学科学院基础医学细胞中心)；Fc-FITC抗体(Sigma，HP-6017)；LipofectamineTM 2000Reagent(Invitrogen)；ImmunoPureImmobilized Protein A/G(Pierce)；LS174T、LoVo、DLD-1、SW480结肠癌细胞株(中科院上海细胞库)；CFSE(Sigma)；LSECtin蛋白(购自于R&D公司)。
BalB/c雌鼠：体重20±2克，6-8周，购自维通利华动物中心；
BalB/c SPF级裸鼠：体重20±2克，6-8周，购自维通利华动物中心。
PBS溶液：135mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8mM K2HPO4；pH7.2。
实施例2至实施例8中所用的LSECtin蛋白溶液均是用PBS溶液稀释LSECtin蛋白得到的，所用的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白溶液，均是用PBS溶液稀释实施例1得到的纯化后的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白得到的。
实施例1、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白的获得
1、可溶性LSECt in-Fc融合蛋白表达载体(pIG-sLSECt in)的构建
pIG-sLSECtin含有可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(氨基酸序列见序列表的序列2)的编码序列(见序列表的序列3)。pIG-sLSECt in的构建方法如下：
(1)pET-28-sLSECt in表达载体的构建
设计LSECtin膜外部分的特异性引物：F1：5′-CGG GGATCCAAGGCCTCCACGGAGCGC-3′，(画线部分为BamHI酶切位点)和R1：5′-ACGCGTCGACTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTC-3′(画线部分为SalI酶切位点)，以流产的人胎肝cDNA为模板，PCR扩增LSECtin的膜外部分。PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃45s，58℃1min，72℃1min，30个循环；再72℃10min。PCR产物用BamH I和Sal I37℃双酶切过夜。同时，质粒pET-28a(invitrogen公司)也用BamH I和Sal I双酶切。酶切产物纯化、连接，转染JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定重组子并测序验证，将得到的重组表达载体命名为pET-28-sLSECtin。
(2)pIG-sLSECtin表达载体的构建
以F2：5′-CGGAAGCTTAAGGCCTCCACGGAGCGC-3′(画线部分为Hind III酶切位点)和R2：5′-ACGCTCTAGATCAGCAGTTGTGCCTTTTCTC-3′(画线部分为Xba I酶切位点)为引物，以上述步骤(1)构建的重组表达载体pET-28-sLSECtin为模板，PCR扩增LSECtin的膜外部分可溶性LSECtin(其氨基酸序列是GenBank AccessionNumber AAR84185的自氨基末端第55至293位氨基酸)。
PCR反应条件为：先94℃5min变性；再94℃45s，58℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃，10min。PCR产物用Hind III和Xba I 37℃双酶切过夜。同时，Signal pIGplus质粒(invitrogen公司)也用Hind III和XbaI双酶切。酶切产物纯化、连接，转染JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，HindIII和XbaI双酶切鉴定重组子并测序验证，将得到的重组表达载体命名为pIG-sLSECtin。
将该质粒进行测序，结果表明，pIG-sLSECtin含有序列3所示的核苷酸序列，该核苷酸序列编码序列2所示的氨基酸序列。
2、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白的表达与纯化
将pIG-sLSECtin质粒用LipofectamineTM 2000Reagent转染到CHO中国仓鼠卵巢癌细胞，转染后48小时，用含G418的DMEM完全培养基(1mg/ml)培养，两周后，挑选单细胞克隆转入24孔板培养，一周后扩大培养。从每一株单克隆细胞中分别取少许细胞在24孔板中培养，24小时后换为无血清培养基(将DMEM完全培养基中的血清去除得到的培养基)继续培养72小时，收上清，以LSECtin抗体(购自R&D公司)为一抗进行Western Blot检测。将强阳性的细胞株继续扩大培养，无血清培养基培养三天后，收集上清，用ImmunoPure Immobilized Protein A/G进行纯化，纯化后进行Western Blot鉴定，鉴定结果表明得到了纯化的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
实施例2、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞株在肝脏形成转移灶的影响
取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半。随机分为3组，每组10只。
取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。第一组裸鼠体内注射0.1ml LSECtin蛋白(5μg/ml)；第二组裸鼠体内注射0.1ml可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(5μg/ml)；第三组裸鼠体内注射0.1ml PBS。12小时后将结肠癌细胞(1×107/只)经尾静脉注入裸鼠体内。分别于试验后第7天、第14天、第21天每组各杀死3只老鼠，取其肝脏固定、石蜡包埋，分别采用H&E染色和癌胚抗原免疫组化染色，观察LS174T的肝转移情况、分析肿瘤转移率。
H&E染色标记检测结果见图1。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能明显减少肝脏内肿瘤转移灶的形成。癌胚抗原标记检测结果见图2。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能明显减少肝脏内肿瘤转移灶的形成。
实施例3、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对结肠癌肝转移小鼠存活的影响
取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。第一组裸鼠体内注射0.1ml LSECtin蛋白(5μg/ml)；第二组裸鼠体内注射0.1ml可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(5μg/ml)；第三组裸鼠体内注射0.1ml PBS。12小时后将结肠癌细胞(1×107/只)经尾静脉注入裸鼠体内。连续观测小鼠的存活率。
结果见图3。结果表明，在相同天数的条件下，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白能明显提高小鼠存活率。
实施例4、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体外粘附的影响
取BalB/c雌鼠30只，分别制备肝组织冰冻切片，将30张冰冻切片分为3组，每组10张。分别检测LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体外粘附的影响，具体操作如下：
取正常小鼠肝组织冰冻切片，第一组切片用LSECtin蛋白和LS174T结肠癌细胞孵育，第二组切片用可溶性LSECtin-Fc融合蛋白和LS174T结肠癌细胞孵育，第三组切片用PBS和LS174T结肠癌细胞孵育，作为对照。1小时后，检测结肠癌细胞是否黏附到小鼠肝组织冰冻切片上及黏附部位。结合结肠癌细胞后的冰冻切片用戊二醛固定，H&E染色。显微镜下照相保存，并分析细胞黏附结果。
结果见图4。LS174T细胞能够容易地黏附到肝脏上，其黏附位置为肝窦内皮细胞。LS174T细胞与肝窦内皮细胞的黏附能被LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白阻断。
实施例5、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白对LS174T结肠癌细胞与肝窦内皮细胞体内的粘附的影响
一、LS174T结肠癌细胞荧光标记
用活体染料CFSE(Sigma)标记LS174T结肠癌细胞。具体操作为：将1×106LS174T结肠癌细胞在1ml PBS和5uM CFSE中37℃孵育10min，然后加入1ml冷却的PBS停止反应，被标记的细胞立即清洗并计数。
二、体内粘附实验
取纯系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。第一组裸鼠体内注射0.1ml LSECtin蛋白(5μg/ml)；第二组裸鼠体内注射0.1ml可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(5μg/ml)；第三组裸鼠体内注射0.1ml PBS。12小时后注射荧光标记的结肠癌细胞(1×107/只)，12小时后处死小鼠，制备肝细胞悬液，用流式细胞技术检测肝内转移的肿瘤细胞数。
结果见图5。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白能明显减少肿瘤细胞往肝脏的转移。
实施例6、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与各种结肠癌细胞的粘附
分别检测LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与4种结肠癌细胞(LS174T、LoVo、DLD-1、SW480)的粘附性；PBS溶液作为对照；具体方法如下：
(1)PBS洗涤癌细胞，4500rpm，3min，弃上清；
(2)癌细胞与LSECtin蛋白(或可溶性LSECtin-Fc融合蛋白共孵育)，孵育体系中，癌细胞的浓度为5×105/ml、蛋白的浓度为10μg/ml，室温放置1h；
(3)PBS洗涤，4500rpm，3min，弃上清；
(4)加LSECtin抗体，冰上放置1h；
(5)PBS洗涤，4500rpm，3min，弃上清；
(6)加FITC标记二抗(购自Santa Cruz)，暗处冰上放置1h；
(7)PBS洗涤，4500rpm，3min，弃上清；
(8)加100μlPBS、400μl4％多聚甲醛固定，流式细胞仪分析。
结果见图6。结果表明，LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能结合结肠癌细胞SW480、LoVo和LS174T。
实施例7、不同浓度的LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞的粘附
分别检测不同浓度的LSECtin蛋白(0、1、2、5、10μg/ml)、不同浓度的实施例1制备的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(0、1、2、5、10μg/ml)与LS174T结肠癌细胞的粘附性；PBS溶液作为对照；具体方法同实施例6。
结果见图7。结果表明，结果表明，LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与结肠癌细胞LS174T的结合均随着蛋白浓度的增加而升高。
实施例8、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与LS174T结肠癌细胞粘附的抑制剂
将10μg/ml的LSECtin蛋白(或10μg/ml的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白)分别与EDTA(10mM)、甘露醇糖(Mannan)(10mM)、岩藻糖(Fucose)(10mM)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)(10mM)或PBS(对照)等体积混合，孵育30分钟。然后检测LSECtin蛋白(或可溶性LSECtin-Fc融合蛋白)与LS174T结肠癌细胞的粘附性，具体方法同实施例6。
结果见图8。结果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白与结肠癌细胞LS174T的结合能不同程度的被EDTA、甘露醇糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖所抑制。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
<120>LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用
<130>CGGNARY81876
<160>3
<210>1
<211>293
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
Met Asp Thr Thr Arg Tyr Ser Lys Trp Gly Gly Ser Ser Glu Glu Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Pro Trp Gly Arg Trp Val His Trp Ser Arg Arg Pro Leu
20 25 30
Phe Leu Ala Leu Ala Val Leu Val Thr Thr Val Leu Trp Ala Val Ile
35 40 45
Leu Ser Ile Leu Leu Ser Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ala Ala Leu Leu
50 55 60
Asp Gly His Asp Leu Leu Arg Thr Asn Ala Ser Lys Gln Thr Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gly Ala Leu Lys Glu Glu Val Gly Asp Cys His Ser Cys Cys Ser
85 90 95
Gly Thr Gln Ala Gln Leu Gln Thr Thr Arg Ala Glu Leu Gly Glu Ala
100 105 110
Gln Ala Lys Leu Met Glu Gln Glu Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg Glu
115 120 125
Arg Val Thr Gln Gly Leu Ala Glu Ala Gly Arg Gly Arg Glu Asp Val
130 135 140
Arg Thr Glu Leu Phe Arg Ala Leu Glu Ala Val Arg Leu Gln Asn Asn
145 150 155 160
Ser Cys Glu Pro Cys Pro Thr Ser Trp Leu Ser Phe Glu Gly Ser Cys
165 170 175
Tyr Phe Phe Ser Val Pro Lys Thr Thr Trp Ala Ala Ala Gln Asp His
180 185 190
Cys Ala Asp Ala Ser Ala His Leu Val Ile Val Gly Gly Leu Asp Glu
195 200 205
Gln Gly Phe Leu Thr Arg Asn Thr Arg Gly Arg Gly Tyr Trp Leu Gly
210 215 220
Leu Arg Ala Val Arg His Leu Gly Lys Val Gln Gly Tyr Gln Trp Val
225 230 235 240
Asp Gly Val Ser Leu Ser Phe Ser His Trp Asn Gln Gly Glu Pro Asn
245 250 255
Asp Ala Trp Gly Arg Glu Asn Cys Val Met Met Leu His Thr Gly Leu
260 265 270
Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Ser Glu Lys Asp Gly Trp Ile Cys Glu
275 280 285
Lys Arg His Asn Cys
290
<210>2
<211>482
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Lys Cys Phe Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Glu Phe Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
35 40 45
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val ValVal Asp Val Ser His Glu Asp
50 55 60
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
65 70 75 80
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
85 90 95
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
100 105 110
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
115 120 125
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
130 135 140
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
165 170 175
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
180 185 190
Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
195 200 205
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
210 215 220
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230 235 240
Lys Ser Arg Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ala Ala Leu Leu Asp Gly His
245 250 255
Asp Leu Leu Arg Thr Asn Ala Ser Lys Gln Thr Ala Ala Leu Gly Ala
260 265 270
Leu Lys Glu Glu Val Gly Asp Cys His Ser Cys Cys Ser Gly Thr Gln
275 280 285
Ala Gln Leu Gln Thr Thr Arg Ala Glu Leu Gly Glu Ala Gln Ala Lys
290 295 300
Leu Met Glu Gln Glu Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg Glu Arg Val Thr
305 310 315 320
Gln Gly Leu Ala Glu Ala Gly Arg Gly Arg Glu Asp Val Arg Thr Glu
325 330 335
Leu Phe Arg Ala Leu Glu Ala Val Arg Leu Gln Asn Asn Ser Cys Glu
340 345 350
Pro Cys Pro Thr Ser Trp Leu Ser Phe Glu Gly Ser Cys Tyr Phe Phe
355 360 365
Ser Val Pro Lys Thr Thr Trp Ala Ala Ala Gln Asp His Cys Ala Asp
370 375 380
Ala Ser Ala His Leu Val Ile Val Gly Gly Leu Asp Glu Gln Gly Phe
385 390 395 400
Leu Thr Arg Asn Thr Arg Gly Arg Gly Tyr Trp Leu Gly Leu Arg Ala
405 410 415
Val Arg His Leu Gly Lys Val Gln Gly Tyr Gln Trp Val Asp Gly Val
420 425 430
Ser Leu Ser Phe Ser His Trp Asn Gln Gly Glu Pro Asn Asp Ala Trp
435 440 445
Gly Arg Glu Asn Cys Val Met Met Leu His Thr Gly Leu Trp Asn Asp
450 455 460
Ala Pro Cys Asp Ser Glu Lys Asp Gly Trp Ile Cys Glu Lys Arg His
465 470 475 480
Asn Cys
<210>3
<211>1449
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
atgaagtgct ttttgtactt agctttttta ttcatcgggg tgaattgcga attcacatgc 60
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 120
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 180
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 240
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 300
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 360
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 420
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 480
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 540
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggccc cttcttcctc 600
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 660
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 720
aaatctagaa aggcctccac ggagcgcgcg gcgctgcttg acggccacga cctgctgagg 780
acaaacgcct cgaagcagac ggcggcgctg ggtgccctga aggaggaggt cggagactgc 840
cacagctgct gctcggggac gcaggcgcag ctgcagacca cgcgcgcgga gcttggggag 900
gcgcaggcga agctgatgga gcaggagagc gccctgcggg aactgcgtga gcgcgtgacc 960
cagggcttgg ctgaagccgg caggggccgt gaggacgtcc gcactgagct gttccgggcg 1020
ctggaggccg tgaggctcca gaacaactcc tgcgagccgt gccccacgtc gtggctgtcc 1080
ttcgagggct cctgctactt tttctctgtg ccaaagacga cgtgggcggc ggcgcaggat 1140
cactgcgcag atgccagcgc gcacctggtg atcgttgggg gcctggatga gcagggcttc 1200
ctcactcgga acacgcgtgg ccgtggttac tggctgggcc tgagggctgt gcgccatctg 1260
ggcaaggttc agggctacca gtgggtggac ggagtctctc tcagcttcag ccactggaac 1320
cagggagagc ccaatgacgc ttgggggcgc gagaactgtg tcatgatgct gcacacgggg 1380
ctgtggaacg acgcaccgtg tgacagcgag aaggacggct ggatctgtga gaaaaggcac 1440
aactgctga 1449
Claims (10)
1.LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述含有LSECtin的融合蛋白为LSECtin与人IgG的融合蛋白。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述LSECtin为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
5.如权利要求1至4中任一所述的应用，其特征在于：所述癌细胞为结肠癌细胞。
6.一种抑制结肠癌肝转移的药物，其活性成分为LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述含有LSECtin的融合蛋白为LSECtin与人IgG的融合蛋白。
8.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于：所述LSECtin为序列表的序列1所示的蛋白质；所述含有LSECtin的融合蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述含有LSECtin的融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
10.如权利要求6至9中任一所述的药物，其特征在于：所述癌细胞为结肠癌细胞。
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