CN110121355A - 用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物 - Google Patents

用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN110121355A
CN110121355A CN201780069241.3A CN201780069241A CN110121355A CN 110121355 A CN110121355 A CN 110121355A CN 201780069241 A CN201780069241 A CN 201780069241A CN 110121355 A CN110121355 A CN 110121355A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fgf21
amino acid
fusion protein
pharmaceutical composition
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780069241.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110121355B (zh
Inventor
洪憪娜
金埈焕
崔铉浩
金度勋
金台旺
吴世雄
宋武泳
金锺均
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yuhan Corp
Original Assignee
Yuhan Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yuhan Corp filed Critical Yuhan Corp
Publication of CN110121355A publication Critical patent/CN110121355A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110121355B publication Critical patent/CN110121355B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/225—Calcitonin gene related peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明提供了用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物。特别地，本发明提供了包含生物活性蛋白和FGF21突变蛋白的融合蛋白；以及包含所述融合蛋白的药物组合物，其有效地用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化。本发明的药物组合物具有抑制炎性细胞和成纤维细胞增殖的作用，并因此可有效地用作用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物。

Description

用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的 药物组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物。特别地，本发明涉及包含生物活性蛋白和FGF21突变蛋白的融合蛋白；以及包含所述融合蛋白的药物组合物，其有效地预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化。
背景技术
肝病有多种病因，例如病毒或细菌感染、酒精或有毒物质、脂肪或重金属的过量积累、异常免疫应答等。这些原因可诱发病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、中毒性肝炎、自身免疫性肝病等。此外，一些肝病可通过慢性进展而进展为肝硬化、肝纤维化和肝癌。
急性肝病(例如急性病毒性肝炎或中毒性肝炎)引起严重的疲劳、食欲不振、黄疸等，并且可异常进展为急性肝功能衰竭，如果不进行肝移植，其可导致死亡。在另一些方面，进展缓慢的慢性肝病(例如慢性病毒性肝炎和脂肪性肝病)多为无症状的，并且患者在日常生活中可未感到明显的不便，然而，肝纤维化可正在进行，并且慢性肝病可在未意识到的情况下进展为肝硬化和肝癌。根据韩国肝硬化患病率统计，估计2012年肝硬化患病率在成人中为0.5％，并且在65岁或年龄更高的人中为约1.0％。这是基于在医疗机构中诊断的病史调查的调查表的结果，因此肝硬化的实际患病率可能更高。在韩国最常见的肝硬化原因是病毒性肝炎，且第二常见原因是酒精性肝病。
如果任何原因使得肝损伤持续重复，则无论存在或不存在症状，都存在发生肝硬化、纤维化和肝癌的巨大风险。一旦肝硬化已发生，则即使进行治疗，也难以将硬化的肝恢复至其原来的状态。
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由31个氨基酸组成的肠降血糖素(incretin)激素，其由肠道中的L细胞在受到食物等刺激时分泌。其生物效应通过经由GLP-1受体的细胞内信号传导产生，所述GLP-1受体是在靶组织(例如胰腺的β细胞、脑等)中表达的G蛋白偶联受体。血液中分泌的GLP-1具有小于2分钟的非常短的半衰期，这是由酶二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)对N端氨基酸的切割导致的活性损失引起。由于GLP-1基于血糖水平刺激胰腺中β细胞中的胰岛素分泌，因此其对降低血糖具有强烈的作用而不诱导低血糖症。此外，在多种动物模型和人中，GLP-1的施用导致体重减轻，已知这是由于其对食欲抑制的作用使得食物摄入降低而引起的。通过胰腺中β细胞中表达的GLP-1受体，GLP-1诱导β细胞的增殖并且通过抑制由糖脂毒性引起的细胞死亡来增强β细胞的生存力。胰高血糖素的过量分泌会升高血糖，已知这是糖尿病患者高血糖的原因之一。此外，已知GLP-1作用于胰腺中的α-细胞以通过抑制蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)蛋白特异性胰高血糖素的分泌来抑制空腹血糖升高。
毒蜥外泌肽-4(Exendin-4)是临床上重要的GLP-1受体激动剂。毒蜥外泌肽-4是具有39个氨基酸残基的多肽，并且通常在希拉毒蜥(Gila Monster lizard)的唾液腺中产生。已知毒蜥外泌肽-4与GLP-1具有52％的氨基酸序列同源性，并与哺乳动物中的GLP-1受体相互作用(Thorens et al.(1993)Diabetes 42：1678-1682)。已经显示毒蜥外泌肽-4在体外刺激胰岛素产生细胞分泌胰岛素，并且在等摩条件下诱导的胰岛素产生细胞的胰岛素释放强于GLP-1。虽然毒蜥外泌肽-4强烈地刺激胰岛素分泌以降低啮齿动物和人二者的血糖水平，并且作用持续时间长于GLP-1，但毒蜥外泌肽-4在没有GLP-1的哺乳动物中显示出抗原性，因为其具有在这样的动物中不熟悉的表位。
已经在临床上证实了GLP-1和毒蜥外泌肽-4类似物(例如，利拉鲁肽和艾塞那肽)在人中改善葡萄糖控制的能力。已经报道了GLP-1通过抑制凋亡和诱导增殖来提高β细胞量。此外，还已经报道了GLP-1作为抑制胃酸分泌和胃排空的肠激素发挥作用，同时增强饱腹感信号，从而降低食欲。GLP-1的这样的作用可解释当向患有2型糖尿病的患者施用GLP-1类似物时所观察到的体重减轻。此外，GLP-1在啮齿动物中缺血之后显示出心脏保护作用。
已经进行了多种尝试以开发长效的GLP-1类似物。临床上证实的长效GLP-1类似物包括度拉鲁肽(dulaglutide)(WO 2005/000892)和阿必鲁肽(albiglutide)(WO 2003/059934)。度拉鲁肽是Fc融合的GLP-1类似物，且阿必鲁肽是白蛋白融合的GLP-1类似物，二者均具有允许每周施用一次的药代动力学特征。这两种药物在每周施用一次时具有降低血糖和减轻体重的优异作用，并且当与艾塞那肽和利拉鲁肽相比时，在治疗方面也提供了极大改善的便利性。
同时，在肝中合成的成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是已知在葡萄糖和脂质稳态中发挥重要作用的激素。FGF21在表达FGF21特异性受体(即，FGF受体)和β-klotho复合物二者的肝、脂肪细胞、胰腺β细胞、脑中的下丘脑和肌肉组织中显示出药理学作用。已报道了在多种糖尿病和代谢性疾病的非人灵长类和鼠模型中，FGF21可以以胰岛素非依赖性方式降低血糖水平、减轻体重并降低血液中的甘油三酯和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)浓度。此外，已知FGF21还具有改善胰岛素敏感性的作用，并且因此其具有作为新抗糖尿病或抗肥胖治疗剂之靶标的高潜力(WO 2003/011213)。
因此，为了开发基于FGF21的新抗糖尿病药，已经尝试了通过一些氨基酸的替换、插入和缺失来基于野生型FGF21序列构建FGF21突变体，以改善其生物学活性和体内稳定性(参见WO2010/065439)。然而，由于FGF21具有非常短的半衰期，如果直接用作生物治疗剂，其被证明是有问题的(Kharitonenkov，A.et al.，Journal of Clinical Investigation115：1627-1635，2005)。FGF21的体内半衰期在小鼠中为1至2小时，并且在猴中为2.5至3小时。因此，对于以其当前形式用作糖尿病之治疗剂的FGF21，需要每日施用。
已经报道了尝试提高FGF21重组蛋白之体内半衰期的多种方法。一个这样的实例是将聚乙二醇(PEG)(即，聚合物材料)连接至FGF21以提高其分子量，从而抑制肾排泄并提高体内滞留时间(参见WO2012/066075)。另一种方法尝试通过将其与结合人白蛋白的脂肪酸融合来改善半衰期(参见WO2012/010553)。另外的实例尝试通过产生激动剂抗体来在维持与野生型FGF21等同的药理学活性的同时延长半衰期，所述激动剂抗体单独地或作为与β-klotho的复合物与人FGF受体特异性结合(参见WO2012/170438)。在另一个实例中，通过制备长效融合蛋白来改善半衰期，其中IgG的Fc区与FGF21分子结合(参见WO2013/188181)。
在可用于产生长效药物的多种技术中，广泛使用了Fc融合技术，因为其具有较少的使用其他方法时见到的缺点，例如在延长体内半衰期的同时诱导免疫应答或毒性。为了开发作为长效治疗药物的Fc融合的FGF21蛋白，应满足以下条件。
第一，应使由融合引起的体外活性的降低最小化。FGF21的N端和C端二者都参与FGF21的活性。就此而言，已知FGF21融合蛋白的活性根据融合位置而变化很大。因此，其中突变被引入到FGF21中的Fc融合的FGF21融合蛋白的活性可根据融合的存在/不存在或位置而变化。第二，应通过融合延长体内半衰期以实现使得在人中能够以每周一次的间隔施用的药代动力学特征。第三，考虑到在施用生物药物之后在大多数患者中可预期免疫原性，因此应使由融合接头或突变引起的免疫原性风险最小化。第四，不应存在由融合的位置或突变的引入而引起的稳定性问题。第五，由于取决于融合的免疫球蛋白的同种型可发生不希望的免疫应答，因此防止此类应答的解决方案是必需的。
已经报道了通过将免疫球蛋白G(IgG)的Fc区与FGF21分子连接来开发长效融合蛋白的尝试(参见WO 2013/188181)。在其中Fc与野生型FGF21的N端融合的一种Fc-FGF21结构的情况下，尽管与野生型FGF21相比在体外活性方面没有明显差异，但是已知由于蛋白质的体内降解，其半衰期非常短。为了解决此问题，已经尝试通过在FGF21的特定位点位置处引入数个突变以抵抗蛋白质降解来延长体内半衰期。然而，随着多个突变的引入，免疫原性风险可提高。相比之下，在其中Fc与FGF21分子的C端融合的FGF21-Fc结构的情况下，已知当与Fc-FGF21结构相比时，存在着由在该位点处的融合引起的活性的显著降低。
取决于作用机制和体内的靶组织，与单一施用相比，GLP-1和FGF21的组合施用可具有协同作用，并且预期了潜在优异的抗糖尿病效力和额外的优点。已经研究和报道了组合施用GLP-1和FGF21或GLP-1/FGF21融合蛋白的作用(参见WO 2010/142665和WO 2011/020319)。
为了开发包含GLP-1和FGF21的融合蛋白，多个问题必须被解决。由于野生型GLP-1和野生型FGF21具有非常短的体内半衰期，所以其需要每天施用至少一次，即使开发为治疗剂也是如此。因此，需要长效技术(例如Fc融合)以便开发长效融合蛋白以改善患者的便利性。在用于GLP-1和FGF21的两种靶标的双功能药物中，引入突变对于维持药物的活性和体内稳定性是必要的，并且应解决与每种突变引起的活性、结构或稳定性的变化相关的问题。应很好地平衡GLP-1和FGF21两种靶标的药物效应，并且需要考虑了体外活性、药代动力学特征、动物模型中的药理学效力以及甚至人中效力的临床评价的药物设计来用于该目的。融合蛋白具有不可存在于人体中的结构，并且与用于单一靶标的融合蛋白相比在结构上是复杂的。此外，由于需要突变或接头改造来平衡两种靶标，因此形成聚集复合物的可能性可升高，并且可需要进一步的蛋白质改造来防止这种情况。此外，由于新的突变序列或复杂的结构，潜在的免疫原性可提高，应解决或避免这些。
本发明人努力解决了上述问题，并且结果，已经开发了有效用于治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的融合蛋白，并完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的药物组合物。
问题的解决方案
根据本发明的一个目的，提供了用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的药物组合物，其包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：68)；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：69)；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：70)；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同一种或更多种上述突变(1)至(5)；以及
(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。
此外，根据本发明的另一个目的，提供了用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的药物组合物，其包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：68)；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：69)；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：70)；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同一种或更多种上述突变(1)至(5)；以及
(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。
此外，根据本发明的另一个目的，提供了本发明的药物组合物用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的用途。
此外，根据本发明的另一个目的，提供了本发明的药物组合物用于制备用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物的用途。
此外，根据本发明的另一个目的，提供了用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的方法，其包括向对象施用本发明的融合蛋白的步骤。
发明的有益效果
用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的本发明药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；以及免疫球蛋白Fc区，所述药物组合物具有抑制炎性细胞和成纤维细胞增殖的作用，并因此可有效地用作用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物。
附图简述
图1A是示出了使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系，作为包含FGF21突变蛋白的融合蛋白(下文中称为“FGF21突变体融合蛋白”)的DFD4、DFD5、DFD6、DFD7、DFD9和DFD13的体外活性的图。没有FGF21突变体融合蛋白显示出由于突变的引入引起的活性显著降低。
图1B是示出了使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系，作为包含FGF21突变体融合蛋白的融合蛋白的DFD6、DFD13、DFD18、DFD72、DFD73和DFD74的体外活性的图。没有FGF21突变体融合蛋白显示出由于突变的引入引起的活性显著降低。
图1C是示出了使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系，作为包含FGF21突变体融合蛋白的融合蛋白的DFD6和DFD6(大肠杆菌)的体外活性的图。没有FGF21突变体融合蛋白显示出由于突变的引入引起的活性显著降低。
图2A是示出了使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系，作为向其中引入了连接FGF21的N端和Fc区的接头的FGF21突变体融合蛋白的DFD3和DFD4的体外活性的图。尽管根据接头序列而在活性方面显示出微小差异，但没有FGF21突变体融合蛋白显示出活性显著降低。
图2B是示出了使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系，作为向其中引入了连接FGF21的N端和Fc区的接头的FGF21突变体融合蛋白的DFD1和DFD13的体外活性的图。尽管根据接头序列而在活性方面显示出微小差异，但没有FGF21突变体融合蛋白显示出活性显著降低。
图3是示出了使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系，RGE(Amgen)、Fc-FGF21(Lilly)和DFD1的体外活性的图。DFD1和RGE(Amgen)具有相似的活性，而Fc-FGF21(Lilly)具有为其他蛋白质的两倍高的体外活性。
图4A是FGF21突变体融合蛋白DFD4的尺寸排阻色谱分析的结果。
图4B是在其中引入了EIRP突变的FGF21突变体融合蛋白DFD13的尺寸排阻色谱分析的结果。
图4C是使用尺寸排阻色谱比较DFD4和DFD13的高分子量聚集体的建议含量(HMW％)以验证FGF21的EIRP突变对融合蛋白稳定性的影响的图。证实了与DFD4相比，DFD13在初始阶段和超过2周之后的时间点与更低比例的高分子量聚集体(HMW％)相关，表明EIRP突变的引入改善了FGF21突变体融合蛋白的稳定性，从而显著降低HMW％。
图5示出了皮下施用FGF21突变体融合蛋白之后96小时中随时间血液中每种蛋白质的浓度。数据表示为平均值和标准偏差。
图6A是示出了在饮食诱导的肥胖小鼠模型中单次施用DFD18之后从施用点至第14天以克为单位表示的体重的变化的图。DFD18显示出优异的体重减轻效果。数据表示为平均值和平均值的标准误差。
图6B是示出了在饮食诱导的肥胖小鼠模型中单次施用DFD18之后从施用点至第14天以％为单位表示的体重的变化的图。DFD18显示出优异的体重减轻效果。数据表示为平均值和平均值的标准误差。
图7是示出了使用在其中过表达人GLP-1受体的CHO细胞系，根据将GLP-1突变体和GLP-1的C端连接至Fc区的铰链，融合蛋白的体外GLP-1活性的图。通常来说，包含GLP-1(A2G)序列的融合蛋白(DFD23)显示出为包含其他GLP-1突变体序列的其他融合蛋白的2至3倍低的活性。在包含GLP-1(A2G)序列以外的突变序列的融合蛋白之间未显示出GLP-1活性的显著差异。
图8A是示出了DFD59、DFD69、DFD112和DFD114的GLP-1活性的图。使用在其中过表达人GLP-1受体的CHO细胞系测量三种融合蛋白(DFD69、DFD112和DFD114)和不包含FGF21的Fc融合的GLP-1突变体的体外GLP-1活性。三种融合蛋白显示出相似的EC50值，并且Fc融合的GLP-1突变体(DFD59)显示出为融合蛋白的约2倍高的活性。
图8B是示出了DFD69、DFD112和DFD114的FGF21活性的图。使用在其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系测量根据FGF21突变体的融合蛋白的体外活性。证实了在这三种融合蛋白中FGF21部分的体外活性相似。
图9A是示出了在皮下施用之后，融合蛋白DFD69、DFD112和DFD114的FGF21部分的随时间的血清药物浓度的图。数据表示为平均值和标准偏差。
图9B是示出了在皮下施用之后，融合蛋白DFD59、DFD69、DFD112和DFD114的GLP-1部分的随时间的血清药物浓度的图。数据表示为平均值和标准偏差。
图10A是示出了在饮食诱导的肥胖小鼠模型中以4天的间隔重复皮下施用DFD114、DFD112、DFD74或DFD72持续2周之后血清甘油三酯(triglyceride，TG)的变化的图。与对照组相比，融合蛋白和FGF21突变体融合蛋白的施用显示出降低血清脂质的作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。在单因素ANOVA之后通过Dunnet多重比较检验进行统计分析(***：P＜0.001，相对于载剂对照)。
图10B是示出了在饮食诱导的肥胖小鼠模型中以4天的间隔重复皮下施用DFD114、DFD112、DFD74或DFD72持续2周之后血清总胆固醇(total cholesterol，TC)的变化的图。与对照组相比，融合蛋白和FGF21突变体融合蛋白的施用显示出降低血清脂质的作用(***：P＜0.001，相对于载剂对照)。
图10C是示出了在饮食诱导的肥胖小鼠模型中以4天的间隔重复皮下施用DFD114、DFD112、DFD74或DFD72持续2周之后肝中甘油三酯(TG)的变化的图。与对照组相比，FGF21突变体融合蛋白的施用显示出在肝中的降低脂质作用(*：P＜0.05，***：P＜0.001，相对于载剂对照)。
图11示出了通过在饮食诱导的肥胖小鼠模型中以4天的间隔重复皮下施用DFD114或DFD112持续2周获得的肝的组织病理学照片。与对照组相比，融合蛋白的施用显示出降低肝脂肪变性的作用。
图12A是示出了在甲硫氨酸胆碱缺乏(methionine choline deficient，MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112和DFD72持续4周之后ALT水平的变化的图。与对照组相比，在融合蛋白处理的组中ALT水平以剂量依赖性方式降低，并且在FGF21突变体融合蛋白处理的组中ALT水平也降低。数据表示为平均值和平均值的标准误差。在单因素ANOVA之后通过Dunnet多重比较检验进行统计分析(###：P＜0.001，相对于MCS对照，**：P＜0.01，***：P＜0.001，相对于MCD对照)。
图12B是示出了在甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112和DFD72持续4周之后AST水平的变化的图。与对照组相比，在融合蛋白处理的组中AST水平以剂量依赖性方式降低，并且在FGF21突变体融合蛋白处理的组中AST水平也降低(###：P＜0.001，相对于MCS对照，**：P＜0.01，相对于MCD对照)。
图12C是示出了在甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112和DFD72持续4周之后炎症水平的变化的图。与对照组相比，在融合蛋白处理的组中炎症水平以剂量依赖性方式降低，并且在FGF21突变体融合蛋白处理的组中炎症水平也降低(###：P＜0.001，相对于MCS对照，***：P＜0.001，相对于MCD对照)。
图13A是示出了在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112和DFD72持续4周之后α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)(肝中的纤维化相关指标)的变化的图。与甲硫氨酸胆碱标准(methionine cholinestandard，MCS)对照组相比，在MCD对照组中α-SMA的表达提高。在另一方面，与对照组相比，在融合蛋白处理的组和FGF21突变体融合蛋白处理的组中α-SMA水平降低。数据表示为平均值和平均值的标准误差。在单因素ANOVA之后通过Dunnet多重比较检验进行统计分析(###：P＜0.001，相对于MCS对照，***：P＜0.001，相对于MCD对照)。
图13B是示出了在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112和DFD72持续4周之后转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)(肝中的纤维化相关指标)的变化的图。与MCS对照组相比，在MCD对照组中TGF-β的表达提高。在另一方面，与对照组相比，在融合蛋白处理的组和FGF21突变体融合蛋白处理的组中TGF-β水平降低(###：P＜0.001，相对于MCS对照，***：P＜0.001，相对于MCD对照)。
图13C是示出了在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112和DFD72持续4周之后天狼星红(Picrosirius Red)染色(肝中的纤维化相关指标)的结果的图。与MCS对照组相比，在MCD对照组中胶原蛋白的量升高。在另一方面，与对照组相比，在融合蛋白处理的组和FGF21突变体融合蛋白处理的组中天狼星红水平降低(###：P＜0.001，相对于MCS对照，**：P＜0.01，相对于MCD对照)。
图14示出了肝的组织病理学照片。肝组织中的脂肪显著降低。
图15A是示出了在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后ALT水平(血液生化指标)的变化的图。与对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清ALT降低作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。在单因素ANOVA之后通过Dunnet多重比较检验进行统计分析(***：P＜0.001)。
图15B是示出了在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后AST水平的变化的图。与对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清AST降低作用(***：P＜0.001)。
图15C是示出了在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后TG的变化的图。与对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清TG降低作用(*：P＜0.05，***：P＜0.001)。
图15D是示出了在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后TC水平的变化的图。与对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清TC降低作用(***：P＜0.001)。
图16A提供了示出在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后，肝中施用之前和施用之后NAFLD活动度评分(NAFLDactivity score，NAS)的变化的图。当施用融合蛋白时，与施用之前评分相比，施用之后NAFLD活动度评分降低。
图16B提供了示出在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后，肝中施用之前和施用之后肝纤维化评分的变化的图。当施用融合蛋白时，与施用之前评分相比，施用之后肝纤维化评分降低。
图17A是示出了在硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)诱导的肝纤维化大鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后ALP水平(血液生化指标)的变化的图。与TAA对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清ALP降低作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。在单因素ANOVA之后通过Dunnet多重比较检验进行统计分析(###：P＜0.001，相对于正常对照，**：P＜0.01，相对于TAA对照)。
图17B是示出了在硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化大鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后GGT水平(血液生化指标)的变化的图。与TAA对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清GGT降低作用(###：P＜0.001，相对于正常对照，*：P＜0.05，相对于TAA对照)。
图17C是示出了在硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化大鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后T-BIL水平(血液生化指标)的变化的图。与对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到血清T-BIL降低作用(##：P＜0.01，相对于正常对照，*：P＜0.05，相对于TAA对照)。
图17D是示出了在硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化大鼠模型中以2天的间隔重复皮下施用DFD112持续8周之后肝中纤维化区域的变化的图。与对照组相比，当施用融合蛋白时，观察到纤维化区域减小作用(###：P＜0.001，相对于正常对照，***：P＜0.001，相对于TAA对照)。
实施本发明的最佳方式
在下文中，将详细地说明本发明。
作为活性成分包含在根据本发明的用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物中的融合蛋白包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：68)；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：69)；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：70)；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同一种或更多种上述突变(1)至(5)；以及
(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。
融合蛋白还可包含生物活性蛋白或其突变体或片段。
特别地，作为活性成分包含在根据本发明的用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物中的融合蛋白包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：68)；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：69)；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：70)；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同一种或更多种上述突变(1)至(5)；以及
(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。
野生型FGF21蛋白是已知在葡萄糖和脂肪稳态中发挥重要作用的激素，可来源于哺乳动物(例如人、小鼠、猪或猴等)，优选地来自人。更优选地，野生型FGF21蛋白可以是具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型人FGF21蛋白。
FGF21突变蛋白中包含的突变可优选地是：EIRP、TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种；TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种与EIRP突变的组合；EIRP、TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种与A180E突变的组合；或TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种、EIRP突变和A180E突变的组合。此外，FGF21突变蛋白可具有与野生型FGF21蛋白相比其中N端或C端的1至10个氨基酸缺失的构象。更优选地，FGF21突变蛋白可包含SEQ ID NO：6至23中任一个所示氨基酸序列。还更优选地，FGF21突变蛋白可包含SEQ ID NO：6至23中任一个所示氨基酸序列，并且还具有与野生型FGF21蛋白相比其中N端或C端的1至10个氨基酸缺失的构象。
在融合蛋白中，FGF21突变蛋白的通过突变引入的天冬酰胺(N)残基可以是糖基化的。
生物活性蛋白可以是选自以下的生物活性蛋白：胰岛素、C-肽、瘦素、胰高血糖素、胃泌素、胃抑多肽(gastric inhibitory polypeptide，GIP)、胰淀素(amylin)、降钙素、胆囊收缩素(cholecystokinin)、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白-6(bone morphogeneticprotein-6，BMP-6)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)、催产素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、鸢尾素(irisin)、含III型纤连蛋白结构域蛋白5(fibronectin type III domain-containing protein 5，FNDC5)、爱帕琳肽(apelin)、脂连蛋白(adiponectin)、C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素(resistin)、内脂素(visfatin)、网膜素、视黄醇结合蛋白-4(retinol binding protein-4，RBP-4)、肠高糖素(glicentin)、血管生成素、白介素-22(IL-22)、毒蜥外泌肽-4和生长激素。优选地，生物活性蛋白可以是选自GLP-1、其突变体和毒蜥外泌肽-4的生物活性蛋白。特别地，融合蛋白可同时显示出GLP-1的作用和FGF21蛋白的作用。
本文中使用的术语“胰岛素”是指由胰腺的β细胞合成和分泌的蛋白质，其是在维持血液中恒定的葡萄糖水平中发挥作用的激素。当血糖水平高时分泌胰岛素，这允许血液中的葡萄糖进入到细胞中来以糖原的形式储存，并抑制肝细胞中的葡萄糖产生。其还有助于在脂肪组织中将葡萄糖氧化和转化成脂肪酸。在肌肉中，其促进氨基酸的吸收以合成蛋白质。肾上腺素和胰高血糖素通过提高血糖水平充当胰岛素的拮抗剂。
本文中使用的术语“C-肽”是指连接胰岛素原的A链和B链的肽。C-肽与胰岛素一起由胰腺细胞的分泌颗粒分泌，但不在血液中降解，因此其用作胰腺的胰岛素分泌功能的指标。
本文中使用的术语“瘦素”是指由脂肪组织分泌的将身体脂肪维持在恒定水平的激素。由脂肪组织分泌的瘦素作用于脑以抑制食欲并激活体内代谢，从而减轻体重。
本文中使用的术语“胰高血糖素”是指由胰腺合成和分泌的蛋白质，其是响应于降低的血糖水平而分泌的以发挥提高血糖水平之作用的激素。胰高血糖素由29个氨基酸残基组成，由朗格汉斯岛(Langerhans islet)的α细胞分泌。
本文中使用的术语“胃泌素”是指在胃的远端分泌的激素，其诱导胃酸分泌和胰液的产生，并促进胃、小肠和大肠的运动。
本文中使用的术语“胃泌素抑制多肽(gastrin-inhibiting polypeptide)”是指抑制所有胃分泌的线性多肽。
本文中使用的术语“胰淀素”是指由胰腺β细胞合成和分泌的激素，其像胰岛素一样调节葡萄糖代谢。
本文中使用的术语“降钙素”是指调节血液中钙水平的甲状腺激素。降钙素是由32个氨基酸组成的多肽，由甲状腺C细胞分泌。
本文中使用的术语“胆囊收缩素”是指由十二指肠和空肠的I细胞产生的由33个氨基酸组成的激素。胆囊收缩素表现出加速脾收缩和促进胰酶分泌的作用，并且抑制胃酸分泌。
本文中使用的术语“肽YY”是肽酪氨酸酪氨酸(peptide tyrosine tyrosine)的缩写，其是指由大肠和回肠的细胞响应于饮食而分泌的由36个氨基酸组成的多肽。
本文中使用的术语“神经肽Y”是指由36个氨基酸组成的羧基末端胺化的生物活性肽。神经肽Y广泛分布于脊椎动物的中枢和外周神经系统，并且在交感神经系统中调节血压，并参与脊椎动物中枢神经系统中的内分泌或自主神经控制、摄食行为、记忆和昼夜节律。
本文中使用的术语“成骨蛋白6”，也称为BMP-6，是指直接参与骨形成的蛋白质。
本文中使用的术语“成骨蛋白9”，也称为BMP-9，是指直接参与骨形成的蛋白质。
本文中使用的术语“胃泌酸调节素”是指由黏膜的壁细胞(mural cell)分泌的由37个氨基酸组成的多肽。胃泌酸调节素具有强烈的抑制食欲作用。
本文中使用的术语“催产素”是指由9个氨基酸组成的激素，其在分娩期间促进子宫收缩并在母乳喂养期间有助于乳汁分泌。
本文中使用的术语“GLP-1”是指由肠L细胞在受到食物等刺激时分泌的由31个氨基酸组成的肠降血糖素激素。例如，GLP-1蛋白可如SEQ ID NO：42的氨基酸序列所示。
GLP-1的突变体可例如由SEQ ID NO：43至46中任一个的氨基酸序列表示。
本文中使用的术语“鸢尾素”是指在运动期间由肌肉分泌并且通过血流到达脂肪细胞以分解脂肪(例如将白色脂肪细胞转化为棕色脂肪细胞)的激素。鸢尾素由112个氨基酸组成，其是被称为FNDC5的膜蛋白的截短片段。
本文中使用的术语“FNDC5”是含III型纤连蛋白结构域蛋白5的缩写，并且是指鸢尾素的前体物质。
本文中使用的术语“爱帕琳肽”是指由APLN基因编码的肽。爱帕琳肽由脂肪组织合成和分泌，并且具有与胰岛素相同的功能。
本文中使用的术语“脂连蛋白”是指由脂肪细胞分泌的蛋白质，其改善胰岛素抵抗。
本文中使用的术语“CTRP家族”是指C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白，其是脂肪因子(adipokine)家族之一并且主要作用于肝和肌肉组织以调节葡萄糖和脂质代谢等。
本文中使用的术语“抵抗素”是指最近发现的由脂肪细胞分泌的脂肪因子，其是由108个氨基酸组成的蛋白质并且已知为在脂肪分化期间升高并且能够抑制脂肪细胞分化的物质。
本文中使用的术语“内脂素”是指由脂肪组织产生和分泌的脂肪因子之一，其是52kDa的蛋白质。
本文中使用的术语“网膜素”是指由脂肪组织产生和分泌的脂肪因子之一，其是具有抗炎作用的蛋白质。
本文中使用的术语“视黄醇结合蛋白-4”是指由脂肪细胞分泌的蛋白质，其携带改善胰岛素抵抗的维生素A。
本文中使用的术语“肠高糖素(glycetin)”是指消化道中的主要肠高血糖素(enteroglucagon)，其由69个氨基酸组成，包含第33至66位氨基酸之间的胰高血糖素的所有29个氨基酸。
本文中使用的术语“血管生成素”，也称为ANG，是指在血管或血管内皮细胞生长期间或在体内创伤愈合期间发挥作用的蛋白质。
本文中使用的术语“IL-22”，也称为IL-TIF，是指由IL-22基因编码的蛋白质。IL-22由响应于上皮细胞的细菌抗原而活化的自然杀伤细胞或T细胞分泌。
本文中使用的术语“Fc区”、“Fc片段”或“Fc”是指包含免疫球蛋白的重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)但不包含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区以及轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。此外，本文中使用的术语“Fc区突变体”是指通过替换Fc区的部分氨基酸或通过组合不同类型的Fc区而制备的突变体。
免疫球蛋白Fc区可以是构成抗体的完整Fc区、其片段或Fc区突变体。另外，Fc区包含单体或多聚体形式的分子，并且还可包含重链恒定区的铰链区。Fc区突变体可被修饰以防止铰链区处的切割。此外，Fc的铰链序列可在一些氨基酸序列中具有替换以降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)或补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。此外，Fc铰链序列的部分氨基酸序列可被替换以抑制Fab区的重排。可去除在Fc的C端处的赖氨酸(K)。
优选地，免疫球蛋白Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgD Fc区中的任一种；或者是为其组合的杂合Fc。此外，杂合Fc可包含IgG4区和IgD区。此外，杂合Fc区可包含IgD Fc的CH2和铰链序列的一部分，以及IgG4 Fc的CH2和CH3序列。
此外，本发明的Fc片段可以是野生型糖基化链、比野生型糖基化程度更高的链、比野生型糖基化程度更低的链、或去糖基化链的形式。糖基化链的提高、降低或去除可通过本领域中已知的常规方法(例如化学方法、酶促方法和使用微生物的遗传工程方法)来进行。
优选地，免疫球蛋白Fc区可如选自SEQ ID NO：24至26、47和48的氨基酸序列所示。
融合蛋白可包含从N端至C端依次连接的生物活性蛋白、免疫球蛋白Fc区和FGF21突变蛋白。此外，融合蛋白可包含从N端至C端依次连接的FGF21突变蛋白、免疫球蛋白Fc区和生物活性蛋白。优选地，融合蛋白可包含从N端至C端依次连接的生物活性蛋白、免疫球蛋白Fc区和FGF21突变蛋白。
此外，融合蛋白可包含从N端至C端依次连接的GLP-1突变蛋白、免疫球蛋白Fc区和FGF21突变蛋白。此外，融合蛋白可包含从N端至C端依次连接的FGF21突变蛋白、免疫球蛋白Fc区和GLP-1突变蛋白。优选地，融合蛋白可包含从N端至C端依次连接的GLP-1突变蛋白、免疫球蛋白Fc区和FGF21突变蛋白。
此外，融合蛋白还可包含接头。
融合蛋白可以是其中FGF21突变蛋白与免疫球蛋白Fc区的N端或C端直接连接或者FGF21突变蛋白通过接头与免疫球蛋白Fc区连接的形式。
在这样的情况下，接头可与Fc片段的N端、C端或游离基团(free radical)连接，并且还可与FGF21突变蛋白的N端、C端或游离基团连接。当接头是肽接头时，连接可发生在任何区域中。例如，接头可与免疫球蛋白Fc区的C端和FGF21突变蛋白的N端连接以形成免疫球蛋白Fc区与FGF21突变蛋白的融合蛋白。
此外，本发明的融合蛋白可以是其中生物活性蛋白与融合蛋白的免疫球蛋白Fc区的N端连接的形式。
当接头和Fc分别表达并随后连接时，接头可以是本领域中已知的交联剂。交联剂的一些实例可包括1，1-双(重氮基乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、亚氨酸酯(包括N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如4-叠氮基水杨酸和二琥珀酰亚胺基酯(例如3，3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)))，以及双官能马来酰亚胺(例如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷)，但不限于此。
此外，接头可以是肽。优选地，接头可以是由10至30个氨基酸残基组成的肽。
此外，丙氨酸可额外连接至接头的末端。优选地，接头可以是具有SEQ ID NO：2至5中任一个所示氨基酸序列的肽。
融合蛋白可以是其中FGF21突变蛋白的二聚体或多聚体(其中一个或更多个FGF21突变蛋白连接在一起)与免疫球蛋白Fc区连接的形式。另外，融合蛋白可以是其中两个或更多个免疫球蛋白Fc区相连的二聚体或多聚体的形式，其中免疫球蛋白Fc区具有与其连接的FGF21突变蛋白。
此外，特别地，融合蛋白可如SEQ ID NO：36至39中任一个的氨基酸序列所示。更特别地，其可如SEQ ID NO：36、37或39的氨基酸序列所示。
另外，融合蛋白可以是优选具有SEQ ID NO：58至67中任一个所示氨基酸序列的肽。更优选地，融合蛋白可以是具有SEQ ID NO：65、66或67所示氨基酸序列的肽。
FGF21突变蛋白还可包含1至10个氨基酸的突变，以用于降低野生型FGF21蛋白的免疫原性。免疫原性可通过本领域中已知的常规方法预测。例如，可通过使用例如iTopeTM和TCEDTM方法来筛选蛋白质的潜在免疫原性。
此外，用于使免疫原性最小化的突变可通过本领域中已知的常规方法来设计。例如，当通过进行EpiScreenTM分析来观察免疫原性以评价潜在的免疫原性时，可通过T细胞表位作图来鉴定诱导免疫原性的氨基酸序列，并且可通过计算机预测(in silicoprediction)来设计具有最小化免疫原性的突变体。
融合蛋白可用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化。
特别地，肝炎可以是急性病毒性肝炎、慢性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、暴发性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。特别地，肝硬化可以是酒精性肝硬化或原发性胆汁性肝硬化。
此外，药物组合物还可包含药用载体。药用载体可以是任何载体，只要其是适合于将抗体递送至患者的无毒材料即可。例如，可包含蒸馏水、醇、脂肪、蜡和无活性固体作为载体。可药用辅料(缓冲剂、分散剂)也可包含在药物组合物中。在这些制剂中，融合蛋白的浓度可差别很大。
特别地，药物组合物可包含用于改变、维持或保持组合物的pH、渗量(osmolarity)、黏度、透明度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透性的配制材料。对于合适的制剂，其还可包含氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(例如，硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、增量剂(bulking agent)(例如，甘露糖醇或甘氨酸)、螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(ethyelenediaminetetraacetic acid，EDTA))、复合剂(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐反离子(例如，钠)、防腐剂(例如，苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(例如，甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)、助悬剂、表面活性剂或湿润剂(例如，普朗尼克类；PEG；山梨聚糖酯；聚山梨酯，例如聚山梨酯20或聚山梨酯80；曲通(triton)；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapol))、稳定性改进剂(例如，蔗糖或山梨糖醇)、生长促进剂(例如，碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾；或甘露糖醇、山梨糖醇)、递送载剂、稀释剂、赋形剂和/或药用辅料，但不限于此。
此外，本发明还提供了用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的方法，其包括向需要治疗的对象施用本发明的药物组合物。这样的方法可包括将有效量的本发明融合蛋白施用于具有肝炎(例如急性病毒性肝炎、慢性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、暴发性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH))的症状的哺乳动物。其还可包括将有效量的本发明融合蛋白施用于具有肝硬化(例如酒精性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化)和肝纤维化之症状的哺乳动物。
本发明的药物组合物可通过任何途径施用。本发明的组合物可通过任何合适的方式直接(例如，表面地，通过注射、移植施用到组织区域中，或通过表面施用)或全身(例如，通过经口或肠胃外施用)提供给动物。当通过静脉内、皮下、经眼(ophthalmic)、腹膜内、肌内、经口、经直肠、眶内、脑内、颅内、椎管内(intraspinal)、室内、鞘内、池内、囊内、鼻内或气雾剂施用来肠胃外提供本发明的组合物时，所述组合物优选地是水性的或可包含生物学上可适用的体液悬液或溶液的部分。因此，由于其在生物学上可适用，载体或载剂可添加至组合物并且被递送给患者。因此，通常可包含生物学上合适的盐水溶液作为制剂的载体(例如体液)。
此外，施用频率可根据待使用的制剂中融合蛋白的药代动力学参数而变化。通常来说，医师将施用组合物直至达到实现期望效果的施用剂量。因此，组合物可作为单位剂量施用(具有一定时间间隔的至少两个剂量)(可包含或可不包含相同量的靶融合蛋白)或通过经由移植装置或导管的持续注射而施用。添加合适施用剂量的精密度可由本领域技术人员常规地进行，并且对应于其常规执行的工作范围。
另外，人中融合蛋白的优选单位剂量可以是0.01μg/kg至100mg/kg体重，并且更优选1μg/kg至10mg/kg体重。虽然这是最佳量，但是单位剂量可根据待治疗的疾病或存在/不存在不良作用而变化。尽管如此，最佳施用剂量可通过进行常规实验来确定。融合蛋白的施用可通过定期推注注射、外部储库(例如，静脉内袋)或者来自内部来源(例如，生物可蚀性植入物)的持续静脉内、皮下或腹膜内施用来进行。
此外，本发明的融合蛋白可与其他生物活性分子一起施用于对象接受者。融合蛋白和其他分子的最佳组合、剂型和最佳剂量可通过本领域中公知的常规实验来确定。
本发明提供了包含融合蛋白作为有效成分的本发明药物组合物用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的用途。
本发明提供了包含融合蛋白作为有效成分的本发明药物组合物用于制备用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物的用途。
在另一方面，本发明提供了编码融合蛋白的分离的核酸分子。所述分离的核酸分子可选自DNA、RNA和mRNA，并且特别地，其可以是DNA。
在这样的情况下，由于密码子冗余性，编码融合蛋白的分离的核酸分子可具有彼此不同的序列。此外，只要分离的核酸可产生融合蛋白，则可根据期望目的适当地修饰分离的核酸，或者可向分离的核酸的N端或C端添加核苷酸。
分离的核酸分子可包含例如SEQ ID NO：71至80中任一个所示核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了包含分离的核酸分子的表达载体。
本文中使用的术语“表达载体”是指包含核酸序列的载体，其适合于转化宿主细胞并指导或控制插入的异源核酸序列的表达。表达载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、黏粒、RNA载体、病毒载体、及其类似物。病毒载体的一些实例包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，但不限于此。
本文中使用的术语“异源核酸序列的表达”或靶蛋白的“表达”是指插入的DNA序列的转录、mRNA转录物的翻译，以及Fc融合蛋白产物、抗体或抗体片段的产生。
可用的表达载体可以是RcCMV(Invitrogen，Carlsbad)或其突变体。可用的表达载体可包含用于促进靶基因在哺乳动物细胞中持续转录的人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子和用于增强转录后RNA稳定性水平的牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列。在本发明的一个示例性实施方案中，表达载体是pAD15，其是经修饰的RcCMV载体。
在另一方面，本发明提供了包含表达载体的宿主细胞。
本文中使用的术语“宿主细胞”是指可将重组表达载体引入其中的原核细胞或真核细胞。本文中使用的术语“转化”或“转染”是指通过本领域中已知的多种技术将核酸(例如，载体)引入到细胞中。
合适的宿主细胞可用本发明的DNA序列转化或转染，并且可用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的实例包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、HeLa细胞、CAP细胞(人羊水来源的细胞)和COS细胞。
具体实施方式
在下文中，将参照实施例详细描述本发明的一些示例性实施方案。然而，根据本发明的这些实施例可以以许多不同的形式进行修改，并且本发明的范围不应被解释为限于本文中列出的实施例。
制备例1.包含FGF21突变蛋白的融合蛋白的制备和纯化
制备例1-1.用于表达FGF21突变蛋白的表达载体的制备
为了改善Fc-FGF21结构中的FGF21的稳定性、活性和药代动力学特征，进行了FGF21的突变研究。
具体地，基于FGF21蛋白的三维结构分析，对预期显著影响蛋白质活性的LLLE区(从SEQ ID No.1的FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸)和GPSQG区(从SEQ ID No.1的FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸)以及A180区来设计蛋白质突变体。
引入到FGF21蛋白中的每个突变的位置、序列信息、目标和预期效果列于下表1中。在表1中，N表示糖基化天冬酰胺(N)。
[表1]
此外，包含表1中所述突变的FGF21突变蛋白列于下表2中。
[表2]
SEQ ID NO FGF21突变蛋白的序列
6 FGF21(EIRP)
7 FGF21(TGLEAV)
8 FGF21(TGLEAN)
9 FGF21(G170N)
10 FGF21(G174N)
11 FGF21(EIRP，TGLEAV)
12 FGF21(EIRP，TGLEAN)
13 FGF21(EIRP，G170N)
14 FGF21(EIRP，G174N)
15 FGF21(EIRP，A180E)
16 FGF21(TGLEAV，A180E)
17 FGF21(TGLEAN，A180E)
18 FGF21(G170N，A180E)
19 FGF21(G174N，A180E)
20 FGF21(EIRP，TGLEAV，A180E)
21 FGF21(EIRP，TGLEAN，A180E)
22 FGF21(EIRP，G170N，A180E)
23 FGF21(EIRP，G174N，A180E)
将编码氨基酸的核苷酸加载至表达载体以使从N端至C端依次表达融合的载体、接头和FGF21突变蛋白。每种FGF21突变体融合蛋白的物质代码、引入到FGF21中的突变的序列、融合载体的序列和接头序列列于下表3中。在表3中，N表示糖基化天冬酰胺(N)。
[表3]
为了产生FGF21突变体融合蛋白，通过基于每种蛋白质的氨基酸序列咨询BioneerCorporation(Korea)来合成编码每种FGF21突变蛋白的核苷酸序列。将NheI和NotI限制酶序列添加至编码每种FGF21突变蛋白的核苷酸序列的5’端和3’端，并将用于蛋白质翻译的起始密码子和能够将所表达蛋白质分泌至细胞外的前导序列(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA)紧挨5’端的限制酶序列插入。将终止密码子紧挨编码每种FGF21突变体融合蛋白的核苷酸序列插入。通过使用NheI和NotI两种限制酶将编码每种FGF21突变体融合蛋白的核苷酸序列克隆到pTrans-空表达载体中。具有包含CMV启动子、pUC来源的复制起点、SV40来源的复制起点和氨苄西林抗性基因的简单结构的pTrans-空表达载体购自CEVEC Pharmaceuticals(Germany)。
同时，在DFD6(大肠杆菌表达)和Fc-FGF21融合蛋白RGE(Amgen)的情况下，将编码每种融合蛋白的核苷酸序列插入到pET30a表达载体中以用于大肠杆菌表达。
制备例1-2.用于表达FGF21突变体融合蛋白的质粒DNA的构建
用制备例1-1中构建的每种表达载体转化大肠杆菌以获得大量待用于表达的质粒DNA。通过热休克用每种表达载体转化细胞壁削弱的大肠杆菌细胞，并将转化体平板接种在LB板上以获得菌落。将如此获得的菌落接种到LB培养基中，在37℃下培养16小时，并以100mL的体积获得包含每种表达载体的每种大肠杆菌培养物。将如此获得的大肠杆菌离心以去除培养基，并随后添加P1、P2、P3溶液(QIAGEN，目录号：12963)以破裂细胞壁，从而获得其中蛋白质和DNA分离的DNA悬液。通过使用Qiagen DNA纯化柱从如此获得的DNA悬液中纯化质粒DNA。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定洗脱的质粒DNA，并通过使用nanodrop装置(Thermoscientific，Nanodrop Lite)来测量浓度和纯度。将如此获得的DNA用于表达。
制备例1-3.融合蛋白在CAP-T细胞中的表达
用制备例1-2中获得的每种质粒DNA类型转染人细胞系。通过使用PEI溶液(Polyplus，目录号：101-10N)将每种质粒DNA类型转导到已经在PEM培养基(Lifetechnologies)中培养的CAP-T细胞(CEVEC)中。通过使用Freestyle293表达培养基(Invitrogen)将DNA和PEI溶液的混合溶液与细胞悬液混合，在37℃下培养5小时，并添加PEM培养基。在37℃下培养5至7天之后，将培养物离心以除去细胞，并获得包含FGF21突变体融合蛋白的上清液。
制备例1-4.FGF21突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
用表达DFD6(大肠杆菌)和RGE(Amgen)融合蛋白的每种质粒DNA转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。将表达每种融合蛋白的经转化大肠杆菌接种到20mL的LB培养基中，在37℃下摇动培养15小时，并随后将一部分培养基接种到100mL的LB培养基中，并在37℃下摇动培养16小时。在培养完成之后，将培养物离心以获得大肠杆菌沉淀物，并随后使用高压细胞破碎仪破碎细胞以获得包涵体。
通过洗涤和洗脱然后进行蛋白质重折叠过程来纯化所获得的包涵体。具体地，将所获得的包涵体用包含0.5％Triton X-100、50mM Tris、1mM EDTA和0.1M NaCl的缓冲溶液(pH 8.0)洗涤2至3次以除去细菌蛋白质，并随后重悬于包含8M尿素、50mM Tris和1mM DTT的8M尿素缓冲液中。由于8M尿素缓冲液中的蛋白质完全变性，因此如下进行蛋白质重折叠过程。
首先，通过用20mM甘氨酸pH 9.0缓冲液逐步稀释来从8M尿素缓冲液中除去尿素。从2M尿素开始，添加硫酸铜(CuSO4)至80μM的浓度以诱导蛋白质的稳定的结构折叠。将完成重折叠过程的蛋白质悬浮于PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，将悬液用0.22μm过滤器过滤以除去杂质，并随后加载到蛋白A亲和色谱柱中。将柱用1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤，并随后使用100mM甘氨酸缓冲溶液(pH 3.0)洗脱蛋白质以制备DFD6(大肠杆菌)融合蛋白。
在RGE(Amgen)融合蛋白的情况下，将完成重折叠过程的蛋白质悬浮于50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)中，将悬液用0.22μm过滤器过滤以除去杂质，并随后加载到阴离子交换树脂柱(HQ 50μm，Thermo Fisher Scientific)中。将柱用50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)洗涤，并随后沿浓度梯度施加50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)以洗脱RGE(Amgen)融合蛋白。将通过阴离子交换树脂获得的RGE(Amgen)融合蛋白与硫酸铵混合至1M的浓度，并随后使用疏水相互作用色谱柱(苯基琼脂糖凝胶(phenyl sepharose)FF，GE Healthcare)进行纯化。具体地，将柱用包含1M硫酸铵的50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)洗涤，沿浓度梯度施加50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)，并通过10％Tris-甘氨酸凝胶电泳分析洗脱的级分。用考马斯亮蓝R在轻轻摇动下将凝胶染色，并收集包含高纯度FGF21突变体融合蛋白的级分，并随后使用最终缓冲溶液(1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4)在4℃下透析过夜。在完成透析之后，在4℃下使用30,000 MW截留离心过滤器以3,000rpm浓缩所获得的蛋白质储备溶液。通过BCA定量分析测量FGF21突变体融合蛋白的浓度。
制备例1-5.FGF21突变体融合蛋白的纯化
将蛋白A亲和色谱柱(GE Healthcare)用1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)平衡。将制备例1-3中获得的包含每种FGF21突变体融合蛋白的培养物上清液用0.2μm过滤器过滤，并随后加载到蛋白A亲和色谱柱中。将柱用1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤，并随后使用100mM甘氨酸缓冲溶液(pH 3.0)洗脱蛋白质。使用阴离子交换树脂柱(HQ 50μm，ThermoFisher Scientific)纯化通过亲和色谱获得的融合蛋白。在从柱上洗脱FGF21突变体融合蛋白之前，将阴离子交换树脂柱用50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)平衡。具体地，在用50mMTris缓冲溶液(pH 8.0)洗涤柱之后，沿浓度梯度分配50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)，并分析洗脱的级分。使用尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC-HPLC)分析每种洗脱的级分，并收集包含高纯度FGF21突变体融合蛋白的级分。根据制备例1-4中所述的方法进行浓缩和定量分析。
实验例1.融合蛋白的体外活性
实验例1-1.FGF21突变对蛋白质活性的影响
测量制备例1中制备的融合蛋白DFD4、DFD5、DFD6、DFD6(大肠杆菌)、DFD7、DFD9、DFD13、DFD18、DFD72、DFD73和DFD74的体外活性。
具体地，使用经修饰以过表达人β-klotho(FGF21的共同受体)的HEK293细胞系(Yuhan Corporation，Korea)评价融合蛋白的体外FGF21活性。为了评价活性，将制备例1-4和1-5中制备的包含融合蛋白的浓缩物以3μM的浓度进行3倍系列稀释。在已于血清缺乏状态下培养5小时之后，将过表达人β-klotho的细胞系用稀释的融合蛋白处理20分钟，并随后在室温下在60rpm的搅拌下通过添加细胞裂解缓冲液(Cisbio/Cat#64ERKPEG)裂解30分钟。将细胞裂解物溶液与可检测细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK)和磷酸化ERK的抗体(Cisbio/Cat#64ERKPEG)混合，并将混合物在室温下保持2小时。使用荧光检测器(TECAN/GENiosPro)检测荧光。通过比较其EC50值测量融合蛋白的活性。结果示于图1A至1C中。
如图1A至1C中所示，证实了通过向野生型FGF21蛋白中引入突变序列制备的融合蛋白的体外活性未受到抑制，并且每种融合蛋白的活性彼此相似。通过在大肠杆菌中表达的DFD6(大肠杆菌)样品和在动物细胞中表达的DFD6样品还证实了，通过向野生型FGF21蛋白中引入N-糖基化突变制备的融合蛋白的体外活性未受到抑制。
实验例1-2.接头序列对蛋白质活性的影响
测量制备例1中制备的融合蛋白DFD1、DFD3、DFD4和DFD13的体外活性。
具体地，根据实验例1-1中所述的方法使用制备例1-5中制备的包含融合蛋白的浓缩物来测量融合蛋白的FGF21活性。结果示于图2A和2B中。
如图2A和2B中所示，证实了虽然根据接头序列显示的活性略有差异，但没有FGF21突变体融合蛋白显示出活性显著降低。
实验例1-3.DFD1、RGE(Amgen)和Fc-FGF21(Lilly)的实验结果
测量制备例1中制备的融合蛋白DFD1以及对照蛋白RGE(Amgen)和Fc-FGF21(Lilly)的体外活性。
具体地，根据实验例1-1中所述的方法使用制备例1-5中制备的包含融合蛋白的浓缩物以及对照蛋白测量融合蛋白的FGF21活性。结果示于图3中。
如图3中所示，证实了DFD1和RGE(Amgen)具有相似的体外活性，而Fc-FGF21(Lilly)具有为其他蛋白质的2倍高的体外活性。
实验例2.融合蛋白稳定性的评价
实验例2-1.评价稳定性的实验方法
为了测量在样品制备的初始阶段蛋白质聚集体的量，使用尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)方法量化高分子量聚集体(％HMW)。结果示于图4A至4C中。
具体地，将TosoHaas型TSK-GEL G3000SWXL柱用于SEC-HPLC方法。通过使缓冲溶液(1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4)以1mL/分钟的流量流动以使柱平衡。将制备例1-5中制备的DFD4和DFD13蛋白储备溶液在4℃下使用30,000MW截留离心过滤器以3000rpm浓缩至20mg/mL或更高的目标浓度。在通过BCA定量分析测量每个样品的浓度之后，将样品用缓冲溶液(1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4)稀释至20mg/mL的终浓度。为了测量DFD4和DFD13的初始HMW％，用1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4将20mg/ml样品稀释至1mg/ml的浓度。然后，将每100μl稀释的样品进样到SEC-HPLC柱中并进行分析。对于每个样品的稳定性评价，在将样品在5℃、25℃和37℃下储存两周时，在第4天、第8天和第14天使用SEC-HPLC方法测量样品的％HMW。
如图4A至4C中所示，证实了与DFD4相比，DFD13在初始阶段和直至2周的时间点具有更低量的高分子量聚集体(HMW％)，表明EIRP突变的引入改善了FGF21突变体融合蛋白的稳定性，从而显著降低HMW％。
实验例2-2.稳定性结果
为了研究引入到FGF21的原序列LLLE(98-101)中的EIRP突变对稳定性的影响，根据实验例2-1中所述的方法测量DFD4(SEQ ID NO：29)和DFD13(SEQ ID NO：35)的稳定性。下表4中总结了DFD4和DFD13的零小时样品(初始阶段；第0天)以及4、8和14天储存样品的分析结果(在表4中，N.D.表示“未检测到”)。
[表4]
DFD4和DFD13在20mg/mL的浓度下2周的稳定性(％HMW)
如表4中所示，在初始阶段(第0天)％HMW的量对于DFD4为0.91％，并且对于DFD13为0.56％。在25℃的储存条件下2周之后，对于DFD4，％HMW的量提高至8.83％，但在DFD13中没有观察到。与DFD4相比，DFD13在初始阶段和2周时显示具有较低的％HMW率。发现由于引入EIRP突变，FGF21突变体融合蛋白的HMW％率极大降低。
实验例3.融合蛋白的药代动力学测量
实验例3-1.药代动力学测量的实验方法
将购自Orient BIO Co.(Korea)的6周龄雄性ICR小鼠分组(n＝3/血液采集时间)，使得在药物处理之前一天的平均体重相似。此后，分别以1mg/kg(在RGE的情况下为2mg/kg)的单次皮下剂量施用受试物质。然后，分别在注射之后1、4、8、12、24、48、72和96小时采集血液样品。使用对FGF21蛋白的N端和C端具有免疫反应性的完整人FGF21ELISA试剂盒(F1231-K01，Eagle Biosciences，USA)测量血液中完整全长FGF21蛋白的浓度。测量直至将每种融合蛋白皮下注射到小鼠中之后96小时采集的血液中样品的浓度，并计算每种物质的药代动力学参数。
实验例3-2.药代动力学活性测量的结果
基于示出了小鼠中血液中每种蛋白质的浓度相对于皮下施用融合蛋白之后时间的图(图5)，计算药代动力学参数。数据示于下表5中。
[表5]
基于指示药物暴露水平的曲线下面积(area under the curve，AUC)比较和评价融合蛋白的药代动力学特征。
如表5中所示，在将DFD4与DFD13以及DFD6与DFD73进行比较时，确定了EIRP序列的引入导致AUC值提高约10％至20％。将DFD9与DFD4进行比较，TGLEAV的引入导致AUC的值提高约6倍。
此外，TGLEAN、G170N和G174N突变被设计用于通过FGF21的C端部分(已知在体内其在FGF21的C端蛋白水解)的N-糖基化改善持久性的目的。验证了相对于每种对照物质通过N-糖基化提高AUC。事实上，为了验证通过N-糖基化的AUC提高作用，与在大肠杆菌中产生的未糖基化的物质DFD6(大肠杆菌)进行了比较。在本文中，发现在人细胞系中产生的DFD6显示出是大肠杆菌产生的DFD6的3倍或更高的AUC水平，表明通过糖基化改善了药代动力学特征。
将在Amgen Co.的专利(WO 2009/149171)中公开的突变A180E引入至在其中引入了TGLEAV或G170N的突变体(例如DFD13和DFD73)中以获得DFD18和DFD74。在本文中，发现AUC额外提高约2至3倍。
总结上述结果，与野生型FGF21融合蛋白DFD9相比，多种突变体及其组合的引入导致药代动力学参数得到改善。显示出最高AUC值的融合蛋白是在其中引入了EIRP、G170N和A180E的DFD74，其显示为DFD9的约45倍高的AUC。此外，考虑到RGE的施用剂量，即2mg/kg，发现DFD74显示出比Amgen的RGE更好的药物暴露。通过突变序列的总体药代动力学改善效果总结在下表6中。
[表6]
实验例4.在饮食诱导的肥胖小鼠中融合蛋白的活性
实验例4-1.用于评价在饮食诱导的肥胖小鼠中活性的实验方法
在饮食诱导的肥胖小鼠中评价DFD18(一种FGF21突变体融合蛋白)的体重减轻作用。对于饮食诱导的肥胖模型，C57BL/6J小鼠购自Central Lab.Animal Inc.并以包含60kcal％脂肪的高脂肪饮食(Research diet)饲喂8至12周。将小鼠分组(n＝8/组)以在药物处理(第0天)之前一天具有相似的体重平均值，并随后皮下施用30nmol/kg的样品一次。随后，进行30nmol/kg剂量的单次皮下施用，然后观察与作为溶剂的磷酸缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)相比体重的变化。
实验例4-2.在饮食诱导的肥胖小鼠中的蛋白质活性
对于单次施用30nmol/kg DFD18之后饮食诱导的肥胖小鼠模型中随时间的体重变化，证实了体重减轻作用持续到施用之后第10天，并且最大体重减轻(约18％)出现在施用之后第11天，其维持直至第14天(图6A和6B)。
制备例2.融合蛋白的制备和纯化
制备例2-1.用于表达融合蛋白的表达载体的制备
为了鉴定GLP-1突变蛋白的序列和与其融合的Fc铰链的序列对体外活性、药代动力学特征和药理学效力的影响，设计了Fc融合的GLP-1突变蛋白的多种序列。GLP-1突变蛋白的序列列于下表7中。
[表7]
SEQ ID NO GLP-1突变蛋白的序列
43 GLP-1(A2G)
44 GLP-1(GE)
45 GLP-1(GG)
46 GLP-1(GEG)
此外，Fc融合的GLP-1突变体的序列列于表8中。
[表8]
SEQ ID NO Fc融合的GLP-1突变蛋白
49 DFD52：GLP1(A2G)-HyFc5
50 DFD53：GLP1(A2G)-HyFc40
51 DFD54：GLP1(GE)-HyFc5
52 DFD55：GLP1(GE)-HyFc40
53 DFD56：GLP1(GG)-HyFc5
54 DFD57：GLP1(GG)-HyFc40
55 DFD58：GLP1(GEG)-HyFc5
56 DFD59：GLP1(GEG)-HyFc40
在表8中，HyFc5是指SEQ ID NO：47，并且HyFc40是指SEQ ID NO：48。为了研究GLP-1突变蛋白和FGF21突变蛋白的序列、与GLP-1突变体融合的Fc铰链的序列、在FGF21突变蛋白与Fc之间连接的接头的序列对体外活性、药代动力学特征和药理学效力的影响，设计了融合蛋白的多种序列。包含GLP-1突变蛋白和FGF21突变蛋白的融合蛋白的序列列于下表9中。每种融合蛋白包含从N端至C端依次连接的GLP-1突变蛋白、免疫球蛋白Fc区、接头和FGF21突变蛋白。
[表9]
具体地，基于每种蛋白质的氨基酸序列，在咨询Bioneer Corporation(Korea)之后合成编码每种融合蛋白的核苷酸序列。将NheI和NotI限制酶序列添加至编码每种融合蛋白之核苷酸序列的5’端和3’端，并将用于蛋白质翻译的起始密码子和能够将所表达蛋白质分泌到细胞外的前导序列(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA)紧挨5’端的限制酶序列插入。将终止密码子紧挨编码每种融合蛋白的核苷酸序列插入。通过使用NheI和NotI两种限制酶将编码每种融合蛋白的核苷酸序列克隆到pTrans-空表达载体中。具有包含CMV启动子、pUC来源的复制起点、SV40来源的复制起点和氨苄西林抗性基因的简单结构的pTrans-空表达载体购自CEVEC Pharmaceuticals(Germany)。
制备例2-2.用于表达Fc融合的GLP-1突变体和融合蛋白的质粒DNA的构建
用制备例2-1中构建的每种表达载体转化大肠杆菌以获得大量待用于表达的质粒DNA。用每种表达载体转化通过热休克使细胞壁削弱的大肠杆菌细胞，并将转化体平板接种在LB板上以获得菌落。将如此获得的菌落接种到LB培养基中，在37℃下培养16小时，并以100mL的体积获得包含每种表达载体的每种大肠杆菌培养物。将此后获得的大肠杆菌离心以去除培养基，并随后添加P1、P2、P3溶液(QIAGEN，目录号：12963)以破裂细胞壁，从而获得其中蛋白质和DNA分离的DNA悬液。通过使用Qiagen DNA纯化柱从如此获得的DNA悬液中纯化质粒DNA。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定洗脱的质粒DNA，并使用nanodrop装置(ThermoScientific，Nanodrop Lite)测量浓度和纯度。将如此获得的DNA用于表达。
制备例2-3.Fc融合的GLP-1突变体和融合蛋白在CAP-T细胞中的表达
用制备例2-2中获得的每种质粒DNA转化人细胞系。通过使用PEI溶液(Polyplus，目录号：101-10N)将每种质粒DNA类型转导到已经在PEM培养基(Life Technologies)中培养的CAP-T细胞(CEVEC)中。使用Freestyle293表达培养基(Invitrogen)将DNA和PEI溶液的混合溶液与细胞悬液混合，在37℃下培养5小时，并添加PEM培养基。在37℃下培养5至7天之后，将培养物离心以除去细胞，并获得包含每种蛋白质的上清液。
制备例2-4.Fc融合的GLP-1突变体和融合蛋白的纯化
将蛋白A亲和色谱柱(GE Healthcare)用1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)平衡。将制备例2-3中获得的包含每种Fc融合的GLP-1突变体和融合蛋白的培养物上清液用0.2μm过滤器过滤，并随后加载到蛋白A亲和色谱柱中。将柱用1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤，并随后使用100mM甘氨酸缓冲溶液(pH 3.0)洗脱蛋白质。使用阴离子交换树脂柱(HQ 50μm，Thermo Fisher Scientific)纯化通过亲和色谱获得的蛋白质。在向其加载从亲和色谱洗脱的蛋白质之前，将阴离子交换树脂柱用50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)平衡。
在用50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)洗涤柱之后，沿浓度梯度分配50mM Tris缓冲溶液(pH 8.0)，并分析洗脱的级分。使用尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)分析每种洗脱的级分，并收集包含高纯度Fc融合的GLP-1突变体和融合蛋白的级分并使用最终缓冲溶液(1×PBS，1mMEDTA，pH 7.4)在4℃透析过夜。在完成透析之后，在4℃下使用30,000MW截留离心过滤器以3,000rpm浓缩所获得的蛋白质储备溶液。通过BCA定量分析测量每种蛋白质的浓度。
实验例5.融合蛋白的体外活性
实验例5-1.DFD23、DFD24、DFD25、DFD26、DFD27、DFD28和DFD29的活性
测量融合蛋白DFD23、DFD24、DFD25、DFD26、DFD27、DFD28和DFD29的体外GLP-1活性。具体地，购买过表达人GLP-1受体的CHO细胞系(Eurofins，HTS163C2)并将其用于评价融合蛋白的GLP-1活性。为了评价活性，将包含融合蛋白的样品(在制备例2-4中制备的蛋白质储备溶液；下文中称为“样品”)以25nM的浓度进行4倍系列稀释。在将人GLP-1受体过表达的CHO细胞系处理30分钟之后，测量产生的细胞内cAMP(Cisbio，62AM4PEB)。通过比较EC50值评价每种蛋白质的活性。
如图7中所示，包含GLP-1(A2G)序列的融合蛋白显示出为包含其他GLP-1突变体序列的融合蛋白的约1/2～1/3的活性。除GLP-1(A2G)序列之外，在包含突变序列的融合蛋白之间没有观察到GLP-1活性的显著差异。
实验例5-2.DFD59、DFD69、DFD112和DFD114的活性
测量制备例2中制备的融合蛋白DFD69、DFD112和DFD114以及DFD59(Fc融合的GLP-1突变体)的体外GLP-1活性。具体地，购买过表达人GLP-1受体的CHO细胞系(Eurofins，HTS163C2)并将其用于评价融合蛋白的GLP-1活性。为了评价活性，将包含每种融合蛋白的样品以25nM的浓度进行4倍系列稀释。在将人GLP-1受体过表达的CHO细胞系处理30分钟之后，测量所产生的细胞内cAMP(Cisbio，62AM4PEB)。
如图8A和8B中所示，通过比较EC50值来评价每种蛋白质的活性。三种融合蛋白显示出相似的EC50值，并且DFD59(不包含FGF21突变体)显示出为融合蛋白的约2倍高的活性。
接下来，测量DFD69、DFD112和DFD114中FGF21部分的体外活性。具体地，使用过表达人β-klotho(FGF21的共同受体)的HEK293细胞系评价融合蛋白中FGF21部分的体外活性。为了评价活性，将包含每种融合蛋白的样品以3μM的浓度进行3倍系列稀释。在已于血清缺乏状态下培养5小时之后，将人β-klotho过表达的HEK293细胞系处理20分钟，然后在室温下在60rpm的搅拌下通过添加细胞裂解缓冲液(Cisbio/Cat#64ERKPEG)裂解细胞30分钟。将细胞裂解物溶液与可检测ERK和磷酸化ERK的抗体混合，并将混合物在室温下保持2小时。使用荧光检测器(TECAN/GENiosPro)检测荧光。通过比较其EC50值测量活性。
证实了融合蛋白DFD69、DFD112和DFD114的FGF21部分的体外活性相似，如图8A和8B中所示。
实验例6.融合蛋白的药代动力学评估
实验例6-1.用于药代动力学评估的实验方法
将购自Orient BIO(Korea)的6周龄雄性ICR小鼠分组(n＝3/血液采样时间)以在药物处理之前一天具有相似的体重平均值，并用1mg/kg体积的各样品皮下施用一次。分别在注射之后1、4、8、12、24、48、72、96、144、192和240小时采集血液样品。分别基于FGF21部分和GLP-1-Fc部分测量血液中每种融合蛋白的浓度。使用对FGF21蛋白的N端和C端具有免疫反应性的完整人FGF21 ELISA试剂盒(F1231-K01，Eagle Biosciences，USA)测量血液中融合蛋白的完整全长FGF21部分的浓度。此外，如通过ELISA分析确定的，使用对GLP-1和Fc的N端具有免疫反应性的抗体测量血液中融合蛋白的活性GLP-1-Fc部分的浓度。测量直至将每种蛋白质单次皮下注射到小鼠中之后240小时采集的血液样品中每种蛋白质的FGF21和GLP-1-Fc部分的浓度，并计算每种蛋白质的药代动力学参数。
实验例6-2.药代动力学活性结果
基于在小鼠中单次皮下施用每种蛋白质之后随时间的血液中每种活性物质的浓度(图9A和9B)，计算融合蛋白的FGF21和GLP-1-Fc部分的药代动力学参数。数据示于下表10中。
[表10]
基于指示药物暴露水平的曲线下面积(AUC)比较和评价每种融合蛋白的药代动力学特征。
如表10中所示，对于FGF21部分的药代动力学参数，DFD114显示出最高的药物暴露程度(AUC)和半衰期，且DFD112显示出次最高的AUC值，然后是DFD69。与DFD69相比，DFD114显示出AUC值提高约2倍或更高。对于GLP-1-Fc部分的药代动力学，包含相同GLP-1突变体序列的四种蛋白质(DFD59、DFD69、DFD112和DFD114)显示出相似的AUC值。
实验例7.对饮食诱导的肥胖小鼠中非酒精性脂肪性肝炎的融合蛋白活性的评价
实验例7-1.对饮食诱导的肥胖小鼠中非酒精性脂肪性肝炎的活性的评价方法
在饮食诱导的肥胖小鼠模型中评价融合蛋白DFD114和DFD112以及FGF21突变体融合蛋白DFD74和DFD72的脂肪性肝炎和脂质改善作用。
为了诱导饮食诱导的肥胖，用包含60kcal％脂肪的高脂肪饮食(Research diet)饲喂C57BL/6J小鼠约37周，以制备患有脂肪性肝炎的肥胖小鼠模型。将小鼠分组(n＝6/组)，使得在药物处理之前一天的平均体重相似。此后，以3或10nmol/kg的剂量以4天的间隔3次施用DFD114、DFD112、DFD74和DFD72，持续2周。
通过相同的方法向对照组皮下施用用于制备受试药物的溶剂(Dulbecco磷酸缓冲盐水，DPBS，Gibco，USA)。在最后一次施用之后4天，将动物禁食过夜并从后腔静脉采集血液，并在吸入麻醉和剖腹术之后取出肝组织。用从采集的血液样品中分离的血清样品进行血液生化测试，并通过修整、脱水、石蜡包埋、切片等将经固定的肝组织制备成标本。用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)对所制备的标本进行染色，并使用光学显微镜(Olympus，ECLIPSE E600)观察组织病理学变化。
实验例7-2.对饮食诱导的肥胖小鼠中非酒精性脂肪性肝炎的活性评价结果
为了评价融合蛋白和FGF21突变体融合蛋白的脂肪性肝炎和脂质改善作用，在饮食诱导的肥胖小鼠模型中以3或10nmol/kg的剂量以4天的间隔重复施用DFD114、DFD112、DFD74和DFD72，持续2周。然后，分析血清和肝组织中的脂质变化，并观察组织病理学变化。
如图10A至10C中所示，在重复皮下施用融合蛋白DFD114和DFD112以及FGF21突变体融合蛋白DFD74和DFD72之后，测量血清中的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)。结果，与载剂对照组相比，血清甘油三酯和总胆固醇水平降低，并且肝组织中甘油三酯水平也降低。
如图11中所示，在重复皮下施用融合蛋白DFD114和DFD112之后进行的组织病理学检查显示，与载剂对照组相比，肝组织中的脂质显著降低。
实验例8.在MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠中融合蛋白的活性评价
实验例8-1.在MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠中的活性评价方法
为了在非酒精性脂肪性肝炎模型中评价融合蛋白和FGF21突变体融合蛋白的炎症和纤维化降低作用，在MCD模型中评价了DFD112和DFD72的作用。
甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)的饮食诱导的非酒精性肝病动物模型是用于评价非酒精性脂肪性肝炎的广泛使用的模型之一。通过饲喂缺乏在β-氧化和极低密度脂蛋白(verylow density lipoprotein，VLDL)合成中发挥重要作用的甲硫氨酸和胆碱的饮食诱导伴有肝纤维化的脂肪性肝炎。已知这与人脂肪性肝炎病理学模型相似。为了诱导脂肪性肝炎模型，以向C57BL/6饲喂MCD饮食10天并随后饲喂MCS饮食4天的方式交替地自由地提供MCD饮食和甲硫氨酸胆碱标准(MCS)饮食17周。
在施用受试物质之前将动物称重，并随机分组，使得每组的平均体重尽可能均匀地分布。在每组分配10只小鼠之后，以2天的间隔皮下施用3、10和30nmol/kg DFD112以及10nmol/kg DFD72，持续4周。在MSC对照组和MCD饮食对照组中，通过相同的方法以2天的间隔向小鼠皮下施用用于制备受试物质的溶剂(Dulbecco磷酸缓冲盐水，DPBS，Gibco，USA)，持续4周。
在重复施用受试物质4周之后，将小鼠禁食过夜并从后腔静脉采集血液，并在吸入麻醉和剖腹术之后取出肝组织。用从采集的血液样品中分离的血清样品进行血液生化测试，并通过一般组织处理过程经经固定的肝组织制备成标本。然后，进行苏木精和伊红(H&E)和免疫组织化学染色，并使用光学显微镜(Olympus，BX53)观察组织病理学变化。
实验例8-2.在MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠中的活性评价结果
向MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠以2天的间隔重复施用3、10和30nmol/kg融合蛋白DFD112和10nmol/kg FGF21突变体融合蛋白DFD72，持续4周。然后，进行血液生化检查和组织病理学检查以评价对非酒精性脂肪性肝炎的作用。
如图12A至12C中所示，与饲喂正常饮食的MCS对照组相比，在其中诱导非酒精性脂肪性肝炎的MCD对照组显示出显著更高的作为肝损伤指标的丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)(p＜0.001)。与MCD对照组相比，在施用DFD112的组中血清AST和ALT水平以剂量依赖性方式降低。此外，在组织病理学检查中，与MCS对照组相比，MCD对照组显示出显著更高的炎症水平(p＜0.01)。与MCD对照组相比，当施用DFD112时，炎症水平以剂量依赖性方式降低。
如图13A至13C和图14中所示，为了评价融合蛋白对肝纤维化的作用，使用免疫组织化学染色对作为肝纤维化指标的肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子-β(TGF-β)进行染色，并通过图像分析进行定量。与MCS对照组相比，MCD对照组中α-SMA和TGF-β的表达提高(p＜0.001)。与MCD对照组相比，当施用DFD112和DFD72时，α-SMA和TGF-β的表达降低。此外，使用天狼星红染色对肝组织中的胶原蛋白进行染色，并通过图像分析进行定量。结果，MCD对照组中胶原蛋白的量高于MCS对照组(p＜0.001)，并且与MCD对照组相比，当施用DFD112和DFD72时，观察到肝组织中胶原蛋白的降低趋势。
实验例9.在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠中融合蛋白的活性评价
实验例9-1.在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠中融合蛋白活性评价的方法
为了在非酒精性脂肪性肝炎模型中评价融合蛋白的炎症和纤维化降低作用，在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中评价DFD112的作用。
通过用包含40％脂肪、40％碳水化合物和2％胆固醇的高脂肪饮食(Researchdiet)饲喂C57BL/6小鼠约30周来制备具有肥胖和非酒精性脂肪性肝炎的小鼠模型。在药物处理之前约3周进行肝组织的组织病理学检查，并在施用之前测量ALT和AST水平以及体重。选择实验动物使得非酒精性脂肪性肝炎诱导程度和体重均匀地分布，并将其分组。每组分配12只小鼠，并以3或10nmol/kg的剂量以2天的间隔重复地皮下施用DFD112，持续8周。在对照组中，通过相同的方法注射用于制备受试物质的溶剂(Dulbecco磷酸缓冲盐水，DPBS，Gibco，USA)。
在最后一次施用之后，将小鼠禁食过夜并从后腔静脉采集血液，并在吸入麻醉和剖腹术之后取出肝组织。用从采集的血液样品中分离的血清样品进行血液生化测试。将经固定的肝组织制备成标本，并用苏木精和伊红(H&E)或天狼星红对所制备的标本进行染色，并观察组织病理学变化。
实验例9-2.在饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠中融合蛋白的活性评价结果
以3或10nmol/kg的剂量以2天的间隔向饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪性肝炎小鼠重复施用DFD112，持续8周。然后，进行血液生化和组织病理学检查以评价对非酒精性脂肪性肝炎的作用。
如图15A至15D中所示，在施用DFD112的组中，作为肝损伤指标的血清ALT和AST水平降低至正常水平(p＜0.001)。与载剂对照组相比，血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平也显著降低(p＜0.05或p＜0.001)。
如图16A至16B中所示，来自施用之前和施用之后的组织病理学检查结果显示，在重复施用8周的载剂对照组中，施用之后NAFLD活动度评分(NAS)(作为对非酒精性脂肪性肝炎等级进行分类的指标)与施用之前评分相比提高或维持。在另一方面，在DFD112施用组中，所有对象中的NAFLD活动度评分与施用之前评分相比显著降低。另外，在纤维化程度评价时，对照组中的纤维化程度与施用之前程度相比维持或恶化，而在DFD112施用组中观察到显著的改善效果(p＜0.05)。
实验例10.在TAA诱导的肝纤维化大鼠中融合蛋白活性的评价
实验例10-1.在TAA诱导的肝纤维化大鼠中融合蛋白活性的评价方法
在通过饮用水诱导肝纤维化的大鼠模型中评价DFD112的作用以评价融合蛋白的肝纤维化降低作用。
通过向Wistar大鼠提供包含硫代乙酰胺(TAA)的饮用水约14周来制备肝纤维化模型。在施用受试物质之前将动物称重，并随机分组，使得每组的平均体重尽可能均匀地分布。在每组分配8只大鼠之后，以2天的间隔重复地皮下施用30nmol/kg的DFD112，持续8周。持续提供TAA饮用水直至施用结束。正常对照组从测试开始到施用结束饲喂正常饮用水，而TAA对照组从测试开始到施用结束饲喂TAA饮用水。
在施用结束之后，将小鼠禁食过夜并从后腔静脉采集血液，并在吸入麻醉和剖腹术之后取出肝组织。用从采集的血液样品中分离的血清样品进行血液生化测试，并将经固定的肝组织制备成标本并用天狼星红进行染色，并观察组织病理学变化以比较肝实质的纤维化程度。
实验例10-2.在TAA诱导的肝纤维化大鼠中融合蛋白活性评价的方法
向TAA诱导的肝纤维化大鼠以2天的间隔重复施用30nmol/kg融合蛋白DFD112，持续8周，并通过血液生化测试和组织病理学检查评价对肝纤维化的作用。
如图17a至17d中所示，与提供正常饮用水的对照组相比，其中诱导肝纤维化的TAA对照组显示出显著更高水平的作为肝损伤指标的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)和总胆红素(totalbilirubin，T-bil)(p＜0.01或p＜0.001)。
观察到与TAA对照组相比，DFD112施用使ALT、GGT和T-bil水平显著降低。组织病理学检查显示，与正常对照组相比，TAA对照组中用天狼星红染色阳性染色的肝纤维化区域的比例显著提高。此外，观察到与TAA对照组相比，DFD112施用使肝纤维化区域的比例显著降低(p＜0.001)。

Claims (23)

1.用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的药物组合物，其包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ IDNO：68)；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQID NO：69)；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQID NO：70)；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同一种或更多种上述突变(1)至(5)；以及
(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合蛋白还包含生物活性蛋白或其突变体或片段。
3.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述FGF21突变蛋白的通过突变引入的氨基酸残基N是糖基化的。
4.权利要求2所述的药物组合物，其中所述生物活性蛋白是选自以下的生物活性蛋白：胰岛素、C-肽、瘦素、胰高血糖素、胃泌素、胃抑多肽(GIP)、胰淀素、降钙素、胆囊收缩素、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白-6(BMP-6)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、胃泌酸调节素、催产素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、鸢尾素、含III型纤连蛋白结构域蛋白5(FNDC5)、爱帕琳肽、脂连蛋白、Clq和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素、内脂素、网膜素、视黄醇结合蛋白-4(RBP-4)、肠高糖素、血管生成素、白介素-22(IL-22)、毒蜥外泌肽-4和生长激素。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述生物活性蛋白是选自GLP-1、其突变体和毒蜥外泌肽-4的生物活性蛋白。
6.权利要求5所述的药物组合物，其中GLP-1的突变体具有SEQ ID NO：43至46中任一个所示氨基酸序列。
7.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述野生型FGF21蛋白具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。
8.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述FGF21突变蛋白具有SEQ ID NO：6至23中任一个所示氨基酸序列。
9.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述融合蛋白还包含接头。
10.权利要求9所述的药物组合物，其中所述接头将所述FGF21突变蛋白连接至所述免疫球蛋白Fc区。
11.权利要求10所述的药物组合物，其中所述接头与所述免疫球蛋白Fc区的C端和所述FGF21突变蛋白的N端连接。
12.权利要求10所述的药物组合物，其中所述接头是由10至30个氨基酸残基组成的肽。
13.权利要求12所述的药物组合物，其中所述接头具有SEQ ID NO：2至5中任一个所示氨基酸序列。
14.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgD的Fc区中的任一种，或者是包含其组合的杂合Fc。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中所述杂合Fc包含IgG4区和IgD区。
16.权利要求2所述的药物组合物，其中所述融合蛋白包含从N端至C端依次连接的所述生物活性蛋白、所述免疫球蛋白Fc区和所述FGF21突变蛋白。
17.权利要求16所述的药物组合物，其中在所述免疫球蛋白Fc区与所述FGF21突变蛋白之间还连接有接头。
18.权利要求17所述的药物组合物，其中所述接头与所述免疫球蛋白Fc区的C端和所述FGF21突变蛋白的N端连接。
19.权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合蛋白如选自SEQ ID NO：36、37和39的任一种氨基酸序列所示。
20.权利要求2所述的药物组合物，其中所述融合蛋白如选自SEQ ID NO：65、66和67的任一种氨基酸序列所示。
21.权利要求1或2所述的药物组合物用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的用途。
22.权利要求1或2所述的药物组合物用于制备用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的组合物的用途。
23.用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的方法，其包括向对象施用权利要求1或2所述药物组合物的步骤。
CN201780069241.3A 2016-11-10 2017-11-10 用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物 Active CN110121355B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160149866 2016-11-10
KR10-2016-0149866 2016-11-10
PCT/KR2017/012726 WO2018088838A1 (en) 2016-11-10 2017-11-10 Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110121355A true CN110121355A (zh) 2019-08-13
CN110121355B CN110121355B (zh) 2023-09-12

Family

ID=62110477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780069241.3A Active CN110121355B (zh) 2016-11-10 2017-11-10 用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US11179440B2 (zh)
EP (1) EP3568149A4 (zh)
JP (2) JP7328891B2 (zh)
KR (1) KR20180052545A (zh)
CN (1) CN110121355B (zh)
AU (1) AU2017358289A1 (zh)
BR (1) BR112019009581A2 (zh)
CA (1) CA3042512A1 (zh)
MX (1) MX2019005380A (zh)
WO (1) WO2018088838A1 (zh)
ZA (1) ZA201903306B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143242A (zh) * 2023-10-30 2023-12-01 南京佰抗生物科技有限公司 抗Galectin-3蛋白的单克隆抗体组合物及应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170049319A (ko) * 2015-10-28 2017-05-10 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
EA201992516A1 (ru) 2017-04-21 2020-04-09 Юхан Корпорейшн Способ получения бифункциональных белков и их производных
CN112566655A (zh) 2018-06-21 2021-03-26 赛诺菲 具有优化的活性比率的fgf21化合物/glp-1r激动剂组合
CN115322794A (zh) 2020-01-11 2022-11-11 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物
CN113956344A (zh) * 2021-10-14 2022-01-21 江南大学 一种新型治疗肝癌的fgf类似物及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006094727A (ja) * 2004-09-28 2006-04-13 Masaki Kamakura 細胞増殖促進作用及び器官再生促進作用を有すポリペプチドをコードする遺伝子
CN101732715A (zh) * 2008-11-07 2010-06-16 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用
US20120053135A1 (en) * 2010-08-26 2012-03-01 Shuguang Hospital Affiliated With Shanghai University Of Traditional Chinese Medicine Drug composition for treating chronic liver disease and its application
US20120052069A1 (en) * 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
CN103860565A (zh) * 2012-12-10 2014-06-18 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种治疗肝纤维化的药物组合物
CN105288592A (zh) * 2015-11-02 2016-02-03 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备肝纤维化治疗药物中的应用
WO2016048995A2 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Salk Institute For Biological Studies Fgf19 truncations and mutants and uses thereof
WO2016114633A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Yuhan Corporation Long-acting fgf21 fusion proteins and pharmaceutical composition comprising the same

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
WO1990002175A1 (en) 1988-08-16 1990-03-08 Novo Nordisk A/S A method of producing polypeptides by culturing eukaryotic cells in the presence of protease inhibitors
US5851800A (en) 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
AU2002322394A1 (en) 2001-07-30 2003-02-17 Eli Lilly And Company Method for treating diabetes and obesity
EP1463752A4 (en) 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
BRPI0411132B8 (pt) 2003-06-12 2021-05-25 Lilly Co Eli protéina de fusão heteróloga e seus usos
US20070265200A1 (en) 2004-03-17 2007-11-15 Eli Lilly And Company Glycol Linked Fgf-21 Compounds
WO2008102923A1 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Sk Chemicals Co., Ltd. Process for producing and purifying factor viii and its derivatives
EP2185178B1 (en) 2007-08-03 2017-08-23 Eli Lilly And Company Use of an fgf-21 compound and a glp-1 compound for the treatment of obesity
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010065439A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
CN116925238A (zh) 2009-02-03 2023-10-24 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
HRP20240135T1 (hr) * 2009-05-05 2024-04-12 Amgen Inc. Fgf21 mutanti i njihove upotrebe
JP2012529463A (ja) 2009-06-11 2012-11-22 ノヴォ ノルディスク アー／エス ２型糖尿病を治療するための、ｇｌｐ−１とｆｇｆ２１との組合せ
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN102791730A (zh) 2010-01-22 2012-11-21 诺沃—诺迪斯克有限公司 低度o-糖基化的fgf21的制备方法
CN103415300B (zh) 2010-07-20 2018-02-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 N‑末端修饰的fgf21化合物
US9023791B2 (en) * 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
US20140213512A1 (en) 2011-08-31 2014-07-31 Amgen Inc. Method of Treating or Ameliorating Type 1 Diabetes Using FGF21
TW201315742A (zh) 2011-09-26 2013-04-16 Novartis Ag 治療代謝病症之雙功能蛋白質
WO2013131091A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2015038938A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents and compositions thereof
EA036697B1 (ru) * 2014-10-24 2020-12-09 Бристол-Майерс Сквибб Компани Модифицированные полипептиды fgf-21 и их применение
KR20170049320A (ko) 2015-10-28 2017-05-10 주식회사유한양행 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20170049319A (ko) * 2015-10-28 2017-05-10 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
EP3596130A4 (en) 2017-03-14 2020-12-30 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. DOUBLE TARGET FUSION PROTEINS WITH FC PORTION OF AN IMMUNE LOBULIN
EA201992516A1 (ru) 2017-04-21 2020-04-09 Юхан Корпорейшн Способ получения бифункциональных белков и их производных

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006094727A (ja) * 2004-09-28 2006-04-13 Masaki Kamakura 細胞増殖促進作用及び器官再生促進作用を有すポリペプチドをコードする遺伝子
CN101732715A (zh) * 2008-11-07 2010-06-16 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 LSECtin及其融合蛋白在制备抑制癌细胞向肝转移药物中的应用
US20120052069A1 (en) * 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
US20120053135A1 (en) * 2010-08-26 2012-03-01 Shuguang Hospital Affiliated With Shanghai University Of Traditional Chinese Medicine Drug composition for treating chronic liver disease and its application
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
CN103860565A (zh) * 2012-12-10 2014-06-18 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种治疗肝纤维化的药物组合物
WO2016048995A2 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Salk Institute For Biological Studies Fgf19 truncations and mutants and uses thereof
WO2016114633A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Yuhan Corporation Long-acting fgf21 fusion proteins and pharmaceutical composition comprising the same
CN105288592A (zh) * 2015-11-02 2016-02-03 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备肝纤维化治疗药物中的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143242A (zh) * 2023-10-30 2023-12-01 南京佰抗生物科技有限公司 抗Galectin-3蛋白的单克隆抗体组合物及应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020502053A (ja) 2020-01-23
US11179440B2 (en) 2021-11-23
EP3568149A4 (en) 2020-07-22
ZA201903306B (en) 2020-09-30
RU2019117767A3 (zh) 2021-01-28
JP7328891B2 (ja) 2023-08-17
EP3568149A1 (en) 2019-11-20
AU2017358289A1 (en) 2019-06-20
RU2019117767A (ru) 2020-12-10
KR20180052545A (ko) 2018-05-18
BR112019009581A2 (pt) 2019-10-08
CA3042512A1 (en) 2018-05-17
CN110121355B (zh) 2023-09-12
JP2023002571A (ja) 2023-01-10
US20190314452A1 (en) 2019-10-17
WO2018088838A1 (en) 2018-05-17
MX2019005380A (es) 2019-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7453943B2 (ja) 長時間作用型ｆｇｆ２１融合タンパク質およびそれを含む医薬組成物
US20220002368A1 (en) Dual function proteins comprising fgf21 mutant protein and pharmaceutical composition comprising same
CN110121355A (zh) 用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物
CN107995914A (zh) 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法与用途
US11858975B2 (en) Multi-domain active protein for treating metabolic diseases
CN113603794A (zh) 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
KR20160088656A (ko) 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
RU2795548C2 (ru) Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, включающая слитые белки
WO2022143516A1 (zh) 一种人glp-1多肽变体及其应用
WO2022143515A1 (zh) 一种人glp-1多肽变体及其应用
NZ794313A (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
NZ794312A (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40012348

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant