CN102791730A - 低度o-糖基化的fgf21的制备方法 - Google Patents
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Abstract
FGF21在酿酒酵母pmt2敲除株系中的表达显著地减少了O-糖基化,但并不降低表达水平。在mkc7敲除株系中的表达可降低FGF21及其类似物的降解。在位点R17和R36上的点突变可降低FGF21及其类似物在酵母内表达时的降解。
Description
发明领域
本发明涉及一种制备成纤维细胞生长因子21(FGF21)及其类似物的特殊方法,以及紧密相关的方面。
发明背景
成纤维细胞生长因子是表达于发育中组织及成熟组织中的多肽。它们涉及到数个生理机制,包括例如代谢调节和细胞分化。存在具有超过20种成纤维细胞生长因子的一整个家族(FGF家族)。包括FGF19、FGF21和FGF23的三个FGF家族成员构成了一个亚家族,该亚家族具有涉及代谢调节的内分泌因子的功能。
成纤维细胞生长因子21或FGF-21,这里简称为FGF21,优先在肝脏内表达并且表现出激素样的代谢作用。
数十年来,已经可能重组制备大范围的肽和蛋白质,举例来说在细菌(如大肠埃西氏菌)或酵母(如酿酒酵母)中制备。在酵母中表达的蛋白质经常是被O-糖基化的。在药用蛋白质中,通常应该避免O-糖基化。举例来说,当在酵母中重组制备时,人FGF21被高度O-糖基化。
US 2002/0068325的权利要求1涉及了一种在真菌中生产异源蛋白质的方法,该方法包括提供受体真菌细胞,其中在所述细胞中的质量控制机制被修饰,使得不完全折叠的异源蛋白质在内质网中不被降解;然后将多核苷酸表达构建体引入所述受体真菌细胞内。按照其权利要求8,所述受体细胞在包括选自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6的基因的甘露糖基转移酶基因进行了修饰。所述美国专利申请没有涉及FGF。
发明目的
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一项缺点,或是提供有用的选择。
本发明的另一个方面涉及提供一种有效制备FGF21及其类似物的方法。
本发明的另一个方面涉及提供一种制备具有低度O-糖基化或没有O-糖基化的FGF21及其类似物的重组方法。
本发明的另一个方面涉及提供一种重组方法,在该方法中FGF21及其类似物的降解被降低。
定义
天然人FGF21蛋白的序列可以从UNIPROT数据库中得到,登录号为Q9NSA1。209个氨基酸的前体蛋白包括信号肽(氨基酸1-28)和成熟蛋白(氨基酸29-209)。该成熟人蛋白以SEQ ID NO:1(氨基酸1-181)包含于本文中,该信号肽如SEQ ID NO:2(氨基酸1-28)所示。
本文中提到的术语FGF21的“类似物”,即FGF21类似物,是指一种多肽,该多肽是或者可以是由天然人FGF21蛋白(特别是由SEQ ID NO:1)通过氨基酸序列的修饰所得出或衍生出来的。这样的修饰、修改或改变可包括一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。被取代、缺失和/或添加的氨基酸的数目总共优选不超过10个,优选不超过8个,更优选不超过6个。举例来说,氨基酸可以在C-末端、在N-末端或在氨基酸序列内部添加和/或缺失。优选氨基酸在C-末端和/或N-末端,更优选在N-末端添加和/或缺失。具有C-末端或N-末端氨基酸缺失的氨基酸序列也可被称为截断序列,正如本领域中已知的。同样地,添加入序列内部的氨基酸可被称为插入序列。术语FGF21类似物指的是具有降葡萄糖作用的化合物。所述降葡萄糖作用可如WO 2010/0841169,尤其是涉及3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的能力测定的实施例8中所描述的来检测。优选地,所述FGF21类似物与人FGF21具有至少90%的同一性,优选具有至少95%同一性。该同一性可如WO2010/084169,尤其是第10和11页所描述的来检测。
这里,术语“PMT”(蛋白甘露糖转移酶)指的是一类酶,该类酶将第一个甘露糖连接在蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基上,产生O-糖基化甘露糖树。然而,并不是蛋白质中所有的丝氨酸或苏氨酸残基都被O-糖基化。PMT家族至少有6种酶(Pmtp1-6)。它们被分为三个亚家族,每一个亚家族以Pmt1p、Pmt2p或Pmt4p来表示。
这里,术语“敲除”指的是可读框的缺失。所述缺失或者可以是可读框的缺失,或者是可读框被标记取代。‘标记’指的是经典酵母遗传学中使用的用于基因缺失以及取代另一基因取代的基因,后者可根据其活性而被选择出来,例如TRP1或KanMX4。
在一个实施方式中,这里涉及的所有的氨基酸和氨基酸残基都是可用核苷酸的三联密码(“密码子”)编码的氨基酸和氨基酸残基,因此相应的FGF21类似物可经重组制备。
这里,术语“PMT1”指的是蛋白甘露糖基转移酶1。
这里,术语“PMT2”指的是蛋白甘露糖基转移酶2。
这里,术语“PMT4”指的是蛋白甘露糖基转移酶4。
这里,术语“PEP4”指的是蛋白肽酶A。
这里,术语“YPS1”指的是YPS1-编码的天冬氨酸蛋白酶酵母天冬酶1(也被称为YAP3)。
这里,术语“MKC7”指的是糖基-磷脂酰肌醇-关联的天冬氨酰基蛋白酶7。
这里,术语“TRP1”指的是磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶1。
这里,术语“kanMX”指的是来自Tn903的基因,该基因赋予被转化的酵母对氨基糖苷类抗生素G418的抵抗性。
这里,术语“标记”指的是可根据基因产物的活性可被选择出来的基因。
发明简述
简要地说,本发明如权利要求和下面的条款所描述。
FGF21及其类似物(例如具有N-末端氨基酸延伸的类似物)可在酿酒酵母中表达。这些N-末端氨基酸延伸可由多达约20个氨基酸,优选多达约15个氨基酸构成,并且所有的氨基酸都是可由三联密码编码并且重组制备的氨基酸。在本发明中,这就需要株系设计,在该株系设计中得到PMT2、PEP4和YPS1被破坏的株系。该株系可使用传统的依赖于同源重组的技术来设计,从而允许在各自的位点上进行特异性整合。FGF21及其类似物(例如具有N-末端延伸或突变的类似物)被编码在酿酒酵母表达载体上,该载体可在酿酒酵母中保持。为了将FGF21类似物导向分泌途径,可在重组表达载体内提供包括信号肽的前原序列(例如MF-ɑ前原前导序列)。该序列以正确的阅读框与编码FGF21类似物的DNA连接。该信号肽确保分泌到培养基。将二碱基氨基酸序列置于FGF21类似物序列的上游并邻近该序列,以确保所述前原序列在分泌到培养基之前由FGF21类似物上剪切下来。所述剪切可能通过Kex2p活性来实现。该FGF21类似物可从培养基上获得。
令人惊讶的是,本发明的发明人已发现:当使用野生型酵母时出现的O-糖基化的FGF21及其类似物的问题通过破坏表达株系中的PMT2而得以解决。通过从野生型酵母株系中缺失PMT2,FGF21及其类似物的O-糖基化得到降低。
发明详述
在野生型酿酒酵母株系中表达FGF21已经被证明存在着FGF21及其类似物被高度O-糖基化的问题。本发明描述了通过在pmt2敲除的酵母株系中表达FGF21及其类似物来解决这个问题。这是一种株系,其中编码蛋白甘露糖基转移酶2(Pmt2p)的宿主PMT2基因以不可逆的方式被去除。
在野生型酵母中,编码Pmt2p的基因可通过常规技术被破坏,该技术依赖于同源重组,允许野生型PMT2基因通过将缺失型等位基因整合于PMT2基因座来进行特异性取代,使用另一个基因作为选择标记。所述选择标记是可根据其活性而被选择出的基因,例如TRP1、KanMX4或其它标记。
随后,FGF21及其类似物可由在该敲除酵母株系中的表达质粒所表达,导致O-糖基化降低。为了避免所表达蛋白被降解,将pmt2敲除和蛋白酶PEP4、YPS1 (YAP3)和MKC7 (YPS2)基因敲除结合起来是有利的。
通常,将DNA以适当方向以及正确的阅读框内插入表达载体(例如质粒)内用于表达。然后将该载体通过标准技术引入宿主,该载体通常需要根据转化的宿主细胞来选择。
然后,根据此处所披露的教导,经本发明所使用的重组DNA所转化的宿主细胞在本领域技术人员所知的合适的条件下培养足够的时间,从而允许有待按照本发明的方法生产的FGF21及其类似物表达和分泌。本领域的技术人员能够选择培养基与合适的培养条件,从而在培养后自培养基获得FGF21。
有用的酵母质粒载体包括cPOT (Kjeldsen
等. Gene 170: 107-112, 1996)和YEp13、YEp24 (Rose和Broach, Methods in Enzymol.
185: 234-279, 1990)、以及pG质粒(Schena 等. Methods in Enzy-mol.
194: 289-398, 1991)。
转化酿酒酵母的方法包括原生质球转化、醋酸锂转化和电穿孔,参照Methods
in Enzymol. 194 (1991)。优选地,转化方法如本发明实施例所述。
酿酒酵母的合适启动子包括MFα1启动子、半乳糖诱导型启动子(例如GAL1、GAL7和GAL10启动子)、糖酵解酶启动子(包括TPI1和PGK1启动子)、TRP1启动子、CYC1启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、ADH1启动子和HSP启动子。适合毕赤酵母属(Pichia)使用的启动子是AOX1 (甲醇利用)启动子。
转录终止信号优选为真核基因的3’侧翼序列,该序列含有合适的转录终止和多聚腺苷化的信号。合适的3’侧翼序列可以是例如天然连接到所用的表达控制序列(即相应于启动子)的基因的3’侧翼序列。
用于提供所需FGF21或其类似物的分泌性表达的DNA构建体包含DNA序列,该序列包括通过酵母加工信号连接到多肽的前导序列。该前导序列含有用于蛋白质在内质网上转运的信号肽(“前序列”),并且可选择地含有附加序列(“原序列”),该附加序列在多肽被释放至周围的培养基之前,在酵母细胞内可或不可被剪切。有用的前导序列是酿酒酵母MFα1p、MFα1*、Yap3p、Bar1p和Hsp150p的信号肽和克鲁维酵母(S. kluyveri)的MFα信号肽和酿酒酵母MFα1、Yap3p、Prcp、Hsp150p以及克鲁维酵母MFα的前原序列,以及WO 92/11378、WO 90/10075和WO 95/34666所描述的合成前导序列。
编码所需FGF21或其类似物的DNA序列可以是基因组或cDNA来源的,例如按照标准技术(见,例如Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989),通过制备基因组或cDNA文库,然后使用合成的寡核苷酸探针通过杂交来筛选出编码全部或部分所述多肽的DNA序列来获得。编码FGF21或其类似物的DNA序列也可通过已建立的标准方法来合成制备,所述方法例如由Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letters 22 (1981),
1859-1869中所描述的亚磷酰胺法,或由Matthes等在EMBO Journal 3 (1984), 801-805中所描述的方法。该DNA序列也可使用特异性的引物通过聚合酶链反应来制备,例如US 4,683,202或由Saiki等在Science 239 (1988), 487-491中所述。
在该pmt2敲除株系中FGF21或其类似物的表达与使用非pmt2敲除株系的表达水平相比,在表达水平上并没有任何实质的量的改变,但是,如上面所述的,显著地降低了O-糖基化。
在本发明的一个实施方式中,FGF21或其类似物的表达用YPS1、PEP4和PMT2敲除的酵母株系进行。
在本发明的一个实施方式中,FGF21或其类似物的表达用YPS1、PEP4和MKC7敲除的酵母株系进行。
在本发明的一个实施方式中,FGF21或其类似物的表达用YPS1、PEP4、MKC7和PMT2敲除的酵母株系进行。
在本发明的一个实施方式中,FGF21类似物含有在17位和/或36位上的丙氨酸或组氨酸。因此,降解的程度被降低。
如果是制备人FGF21,则本发明的方法在所获得的O-糖基化FGF21和非O-糖基化FGF21的比值(重量/重量)低于约20%、优选低于约10%、更优选低于约5%、再更优选低于约2%的条件下进行。类似地,在制备FGF21类似物时,该条件也适用。
本发明的
优选方面
为了总结和补充上述内容,本发明特点如下所述:
1. 一种在酵母中重组表达人FGF21及其类似物的方法,其中所用的酵母是pmt2敲除株系。
2. 按照条款1的方法,其中制备具有N-末端延伸的FGF21类似物。
3. 按照条款1的方法,其中所用的酵母是酿酒酵母。
4. 按照条款1或2的方法,其中所用的酵母是pep4敲除株系。
5. 按照前述任一条款的方法,其中所用的酵母是yps1敲除株系。
6. 按照前述任一条款的方法,其中所用的酵母是mkc7敲除株系。
7. 按照前述任一条款的方法,其中所述酵母在外源DNA序列得到表达的条件下进行培养,并且回收所需的FGF21或其类似物。
8. 按照前述任一条款的方法,其中所述FGF21被分泌至培养基内。
9. 按照前述任一条款的方法,其中所述敲除pmt2的酵母株系使用TRP1标记或KanMX4标记、优选TRP1标记来制备。
10. 按照前述任一条款的方法,所述一方面产生的O-糖基化的FGF21或其类似物与另一方面产生的非O-糖基化的FGF21或其类似物的比值(重量/重量)低于约20%,优选低于约10%,更优选低于约5%,再更优选低于约2%。
11. 按照前述任一条款的方法,其中所制备的FGF21类似物在R17和/或R36位上发生了突变。
12. 按照前述任一条款的方法,其中所制备的FGF21类似物在R17和/或R36位上发生了突变,优选获得在酵母表达中的低降解。
13. 按照前述方法的任一项方法所制备的人FGF21。
14. 本文所述的任意新的特征或特征的组合,尤其是在条款或权利要求中所描述的特征。
结合所述的一个或多个条款以及实施方式,还可选择地结合一个或多个下述的权利要求,得出进一步的实施方式,本发明涉及所述条款、实施方式和权利要求的所有可能的组合。
提供以下的实施例用于说明,而非限制。
实施例
通用程序。
所有的表达质粒都是cPOT型的,类似于EP 171,142中所描述的那些质粒。这些是基于2μ的表达载体,其特征在于含有非洲栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces
pombe)的磷酸丙糖异构酶基因(POT),用于在酿酒酵母中进行质粒选择和稳定化。该质粒还含有酿酒酵母磷酸丙糖异构酶的启动子和终止子。这些序列与质粒pKFN1003(WO 90/10075所描述的)中的相应序列相似。为了便于克隆不同的融合蛋白,编码MFα1前原前导序列的DNA序列被改变加入了NcoI位点,被称为MFα1*前原前导序列。这样,NcoI-Xbal片段被编码FGF21构建体或其类似物的构建体的NcoI-Xbal片段简单地取代。这种NcoI-Xbal片段可按照标准技术使用合成的寡核苷酸以及PCR所合成。除了α-前导序列(alpha-leader)以外,其它前导序列也可使用。
酵母转化株及其衍生物通过转化宿主酿酒酵母来制备。该酵母株系在液体YPGGE(1%细菌用酵母抽提物,2%细菌用蛋白胨,2%半乳糖,2%甘油,1%乙醇)中生长至O.D.值在600nm为0.6。离心得到100ml的培养物,用10ml的水清洗,再次离心并重新悬浮于含有1.0M山梨糖醇、25mM Na2EDTA pH 8.0和6.7mg/ml二硫苏糖醇的10ml溶液中。该悬浮液在30℃下孵育15分钟,经离心,细胞重新悬浮于含有1.0 M山梨糖醇、10mM Na2EDTA、0.1M柠檬酸钠, pH 5.8和2mg Glucanex
200G (Novozyms)的10ml溶液中。该悬浮液在30℃下孵育30分钟,细胞经离心收集,在10ml的1.2M山梨糖醇和10ml的CAS(1.0M山梨醇糖、10mM CaCI2、10mM Tris
HCI,pH 7.5)中清洗,然后重新悬浮于2ml的CAS中。为了转化,1ml的CAS悬浮细胞与约0.1mg的质粒DNA混合,置于室温下15分钟。加入1ml的(20%聚乙二醇4000、10mM CaCI2,、10mM Tris
HCI、pH 7.5),混合物于室温下再放置30分钟。将混合物离心,并将沉淀重新悬浮于0.1ml的SOS(1.2 M山梨醇糖、33% v/v YPD、6.7 mM
CaCI2),在30℃下孵育2小时。随后离心悬浮液并将沉淀重新悬浮于0.5ml的1.2M的山梨醇糖中。然后,在52℃下将6ml的含有1.2M山梨糖醇加2.5%琼脂的上层琼脂(Sherman 等的SC培养基,(1982) Methods in Yeast Genetics,
Cold Spring Harbor Laboratory)加入,然后悬浮液倾倒在含有相同琼脂固化的、含有山梨糖醇的培养基的平板的顶部。
实施例
1
ME1487中的pmt1::KanMX4、pmt2::KanMX4和pmt4::KanMX4基因破坏
PMT2基因缺失且基因型为Mat a his3D1 leu2D0 lys2D0 ura3D0
yal023c::kanMX4的酵母株系BY4741-pmt2购自Euroscarf缺失株系保藏中心(Euroscarf
deletion strain collection)。在该酵母株系中,编码PMT2可读框的DNA片段被KanMX4显性选择标记所替换,所述标记赋予对抗生素G418/遗传霉素(Wach等,Yeast 10 (1994)1793-1808)的抗性。
基因组DNA由BY4741分离出,被用作标准PCR反应的模板,反应使用合成的寡核苷酸oILLa-0056: CCGTTTCGTGTACTGTTTA和oILLa-0079: GGCTAAAGGGTTCAAGAAAT,目的是为了扩增含有∆pmt2::KanMX4缺失等位基因盒的合成DNA片段。该DNA片段直接用于转化含有表达FGF21的cPOT质粒的ME1487: MATα, tpi::LEU2 pep4-3 leu2 ura3
yps1::URA3 (Egel-Mitani等. Enzyme and Microbial Technology
26 (2000), 671-677)。酵母的转化通过醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇法(Methods in Enzymology:
350, 87–96)来进行。转化后,该酵母细胞铺板于YEPD (1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)琼脂上,在30℃下孵育过夜,随后在选择性的YEPD琼脂+200mg/L G418上进行影印铺板。分离进一步于30℃孵育3天以后出现的酵母菌落,然后进行PCR分析,该分析核实了将pmt2::KanMX4等位基因正确整合入PMT2基因座,这样就证实了野生型等位基因被缺失等位基因取代。所产生的株系yDNP-255是MATα, tpi1::LEU2 pep4-3 leu2 ura3
yps1::URA3 pmt2::kanMX4。yDPN-255含有表达FGF21的cPOT质粒。
类似地,破坏PMT1和PMT4基因座,产生了以下株系:yDNP-257: MATα, tpi1::LEU2 pep4-3 leu2 ura3
yps1::URA3 pmt1::kanMX4和yDNP-260: MATα, tpi1::LEU2 pep4-3 leu2 ura3
yps1::URA3 pmt4::kanMX4。这二者均含有表达FGF21的cPOT质粒。
实施例
2
NNY574中的pmt2:: TRP1-FA基因破坏
如Horecka和Jigami所述(Horecka和Jigami Yeast 15 (1999) 1769-1774; The
trp1-FA designer deletion for PCR-based gene functional analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast
15, 1769-1774),将营养缺陷型标记trp1-FA缺失引入酿酒酵母bagground株系,以促进经典的一步敲除相关基因的实现。从TRP1基因座上缺失的片段正对应于在许多酵母载体内携带的被称为TRP1-FA的盒,并且该片段由以下组分构成:来自5’-非翻译区的141个bp、随后是TRP1可读框,随后是来自3’-非翻译区的50个bp。为了引入trp1-FA缺失,目标株系用PCR片段转化,该片段含有融合的来自TRP1-FA区域的更上游和下游的5’-和3’-非翻译区,以实现经典的一步TRP1-FA的缺失。TRP1-FA区域的缺失通过PCR得到验证。然后该株系通过用含有所述TRP1-FA盒的DNA片段转化,然后进行TRP1-FA标记表现型的选择,实现了PMT2基因的缺失,其中TRP1-FA盒的侧翼具有pmt2的5’-非翻译区和pmt2的3’-非翻译区。将pmt2::TRP1-FA等位基因重组于PMT2基因座内导致野生型PMT2基因被pmt2::TRP1-FA等位基因所取代。所分离的酵母细胞通过经典的酵母遗传学方法进行表征。正确的整合通过PCR得到了确认。
实施例
3
使用蛋白质印迹分析,检测与野生型株系相比较pmt1、pmt2和PMpmt4敲除对FGF21表达的影响。来自于分泌FGF21的培养的酵母株系的培养基样本在Mes-SDS缓冲液中的4-12%的BisTris SDS PAGE上电泳。将凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素上,然后用多克隆FGF21抗体羊FGF21(Santa Cruz sc-16842)和驴抗羊IgG-HRP第二抗体(Santa Cruz sc-2020)进行免疫染色。使用化学荧光检测法进行检测。结果显示,在野生型株系中,FGF21作为双带移动。当PMT4被缺失时对其没有影响。当PMT1被缺失时对其有一些影响,但是当PMT2被缺失后,FGF21作为单带移动且O-糖基化显著降低。
实施例
4
从宿主上缺失PMT2基因可用于在酿酒酵母中分泌性地表达FGF21类似物。在FGF21类似物中,氨基酸可被修改或改变、取代、缺失,和/或一个或多个氨基酸可添加、或者是其组合。当在PMT2基因缺失的酿酒酵母宿主中表达FGF21类似物时,O-糖基化显著降低。这可通过对分泌FGF21或FGF21类似物的酿酒酵母株系的培养的生长培养基进行蛋白质印迹分析观察到,如实施例3所描述的。当由野生型株系分泌时,FGF21及其类似物作为双带移动。当由pmt2敲除的酿酒酵母宿主表达时,该情况发生变化。人FGF21和FGF21类似物会作为单带移动。
为了进行FGF21类似物的表达,将所需的序列插入cPot表达载体,然后转化进入上面实施例3所描述的pmt2敲除的株系中。得到了含有以下突变、插入和/或延伸的FGF21类似物:
1) -1G, K56R,
K59R, K69R, K122R
2) -5G, -4S,
-3G, -2S, -1G, K56R, K59R, K69R, D102E, N121Q, K122R, M168L
3) -14E, -13E,
-12A, -11E, -10A, -9G, -8G, -7A, -6G, -5G, -4S, -3G, -2G, -1S, K56R, K59R,
K69R, K122R
4) -15E, -14E,
-13S, -12A, -11A, -10S, -9G, -8A, -7A, -6A, -5G, -4S, -3A, -2A, -1A, K56R,
K59R, K69R, K122R)
5) K56R, K59R,
K69R, K122R)
6) -5G, -4S,
-3G, -2S, -1G, K56R, K59R, K69R, K122R)
7) -1G
来自分泌以上化合物的酵母培养物的上清液经如实施例3所述的蛋白质印迹进行分析。观察到仅有用多克隆FGF21抗体显示的单带出现在蛋白质印迹上,而不是像野生型酿酒酵母中的FGF21的双带,证实了在表达株系中缺失pmt2的效果。
用于以上化合物的命名法在WO 2010/084169(特别是第6-11页)中所描述。
实施例
5
采用应用LC/MSD TOF工具(Agilent)进行的LC-MS分析,检测酵母上清液中所分泌的肽的分子量,该分析按照制造者所推荐的设置。使用附随的软件进行TIC色谱的去卷积。从去卷积化的光谱里获得全长的以及O-糖基化的种类的丰度,将其应用于估计全长肽占全长的以及被O-糖基化的FGF21总和的百分数。
本文所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)在此通过全文参照被加入,如同每一篇参考文献被独立而具体指明通过参考而引入并且在此被全文提出(法律所允许的最大程度)。
本文中引述和加入专利文献仅用于方便的目的,并不反映任何有关于这些专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的意见。在本文中提及参考文献并非承认它们构成现有技术。
本文所用的所有的标题和副标题仅仅是为了方便,不应解释为对本发明的任意限制。
本文中任意的和所有的实施例或示例性语言(例如“例如”)的使用,除非另有声明,仅仅为了更好地说明本发明而非对本发明范围的限制。说明书中的语言不应被解释为表明任意非要求保护的元素为实施本发明所必需的。
这里,“包含”一词被广泛解释为“包括”、“含有”或“由…组成”的含义(参阅 EPO guidelines C, III, 4.13)。
本发明包括被适用法律所允许的引述于权利要求和随附条款的主题的所有修改和等同物。
Claims (13)
1.一种在酵母中重组表达FGF21及其类似物的方法,其中所使用的酵母为pmt2敲除株系。
2.如权利要求1所述的方法,其中制备具有N-末端延伸的FGF21类似物。
3.如权利要求1所述的方法,其中所使用的酵母为酿酒酵母。
4.如权利要求1或2所述的方法,其中所使用的酵母为pep4敲除株系。
5.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所使用的酵母为yps1敲除株系。
6.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所使用的酵母为mkc7敲除株系。
7.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所述酵母在外源DNA序列得到表达的条件下进行培养,并且回收所需的FGF21或其类似物。
8.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所述FGF21被分泌至培养基中。
9.如前述权利要求任一项所述的方法,其中所述敲除pmt2的酵母株系使用TRP1标记或KanMX4标记、优选使用TRP1标记制备。
10.如前述权利要求任一项所述的方法,其中一方面O-糖基化的FGF21或其衍生物与另一方面的非O-糖基化的FGF21或其类似物的比值(重量/重量)低于约20%,优选低于约10%,更优选低于约5%,再更优选低于约2%。
11.如任一项所述的方法,其中所制备的FGF21类似物在R17和/或R36位上发生了突变。
12.如前述方法权利要求任一项所述的方法所制备的FGF21。
13.本发明所描述的任意新的特征或特征的组合,尤其是在说明书条款或权利要求书中所描述的特征。
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