CN103003438B - 减少蛋白质糖基化的方法和过程及其蛋白质 - Google Patents
减少蛋白质糖基化的方法和过程及其蛋白质 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103003438B CN103003438B CN201080063624.8A CN201080063624A CN103003438B CN 103003438 B CN103003438 B CN 103003438B CN 201080063624 A CN201080063624 A CN 201080063624A CN 103003438 B CN103003438 B CN 103003438B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- pmt1
- insulin
- pmt5
- glycosylation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及降低由毕赤酵母生产的胰岛素或胰岛素类似物前体分子的O-糖基化水平的方法。本发明通过破坏蛋白甘露糖基转移酶(PMT)基因提供了包括毕赤酵母尤其是巴斯德毕赤酵母的甲醇营养型酵母的基因工程敲除菌株,且使它们能够生产糖基化减少的异源性蛋白质。本发明考虑了用于转化甲醇营养型酵母的载体,这些载体包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、和PMT6基因的编码序列。本发明的PMT失活菌株已经保藏在MTCC,Chandigarh。这些菌株是PMT1/GS115(MTCC?5515)、PMT4/GS115(MTCC?5516)、PMT5/GS115(MTCC?5517)以及PMT6/GS115(MTCC5518)。
Description
技术领域
本发明涉及破坏巴斯德毕赤酵母的蛋白甘露糖基转移酶(PMT)基因,从而减少由毕赤酵母生产的胰岛素前体分子的O-糖基化水平。本发明提供了甲醇营养型酵母的基因工程敲除菌株,包括毕赤酵母尤其是巴斯德毕赤酵母,能够生产糖基化减少的异源性蛋白质。本发明考虑了用于转化甲醇营养型酵母的载体,这些载体包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、和PMT6基因的编码序列。
背景技术
已经在多种微生物表达系统中生产了胰岛素、胰岛素类似物和/或衍生物的重组形式。目前生物体,例如大肠杆菌,酿酒酵母,已经用于商业化生产重组人胰岛素及其衍生物。由于这些系统的某些缺点,例如低表达水平,在下游纯化中的困难等,甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母已经有利地用作蛋白质表达系统。该表达系统提供了若干优点例如高表达,处理简单,生产成本低,高密度培养(US6800606)。
因为酵母表达系统易于生长,快速并且可按比例放大,它们是广泛使用的;然而,一些酵母表达系统产生了不一致的结果,并且有时难以实现高产率。显示较大前途的一种酵母表达系统是甲醇营养型酵母,巴斯德毕赤酵母。与其他真核生物表达系统相比较,因为毕赤酵母不存在与动物细胞培养中生产蛋白质的细菌或病毒污染问题相关的内毒素问题,它有许多优点(Cino,AmBiotechLab,May1999)。
虽然多个优点归因于基于酵母的表达系统,例如巴斯德毕赤酵母,这个系统主要的一个缺点是得到蛋白质的翻译后修饰,其随后在终产物中以杂质形式存在,该终产物难以纯化。虽然存在许多已知的蛋白质翻译后修饰,翻译后修饰的最常用形式还是糖基化(HartG.W,Glycosylation,Curr.Opin.Cell.Biol1992;4:1017)。根据表达系统糖基化可以是N-连接的或O-连接的(GemmillTRetal.,OverviewofN-andO-linkedoligosaccharidestructuresfoundinvariousyeastspecies,BiochemicaetBiophysicaActa,1999;1426:227)。糖基化影响蛋白质构象的稳定性、免疫原性、清除率、保护避免蛋白质水解以及改善蛋白质溶解度(WalshG,Biopharmaceuticalbenchmarks2006,NatureBiotechnology,2006;24:769)。
在酵母中,在高尔基体中糖支链的修饰涉及通过不同的甘露糖酶转移酶进行甘露糖残基的一系列添加(“外部链”糖基化)。所述外部链糖基化的结构是生物体特异性的。这类糖基化通常是不期望的,因为在碳水化合物组成以及分子量两个方面,均会导致重组蛋白质产物的异质性,这可能使蛋白质纯化复杂化。它还可以使蛋白质变成高度免疫原性或可以引起不期望的变应性反应。
虽然在改善生物技术制造方面有很大进步,对于每种蛋白质没有统一的解决方案。用于特异性治疗蛋白质的制造方法需要新颖的以及创造性的对问题的解决方案,它们对于该蛋白质或蛋白质家族可以是特异性的。
因此,期待以下的基因工程甲醇营养型酵母菌株,例如巴斯德毕赤酵母,其中可以操纵蛋白质的糖基化,基本上是减少,并且可以从中生产具有哺乳动物样翻译后模式的重组糖蛋白质,而不影响期望的终产物的产率。
发明内容
因此,本发明涉及减少从甲醇营养型酵母生产的蛋白质的糖基化的方法,所述方法通过失活选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的组中的至少一个或多个基因能够实现,所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因具有与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列,所述序列编码蛋白甘露糖基转移酶或其功能性部分;一种包含选自下组的蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分的载体,所述组包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因,所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分别具有与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列,所述载体整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基转移酶在宿主中,优选在甲醇营养型酵母中的表达;用于生产甲醇营养型酵母的敲除菌株的方法,其中(a)一种载体并入了能够同源重组的核酸序列,所述同源重组的核酸序列包含编码选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的组中的基因的至少一个的目标核酸序列和编码选择标记的核酸序列,所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分别具有与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列,(b)在允许在所述载体中编码目标基因的DNA与在宿主细胞中编码目标基因的DNA之间发生同源重组的条件下培养细胞,从而导致破坏宿主细胞中的目标基因,(c)用失活的目标基因来选择宿主细胞;从上述方法生产的蛋白质;一种甲醇营养型酵母敲除菌株,具有选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的组中至少一个失活基因,所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分别具有与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列;如上所述的PMT1基因失活菌株;如上所述的PMT4基因失活菌株;如上所述的PMT5基因失活菌株;如上所述的PMT6基因失活菌株;从如上所述敲除菌株生产的蛋白质;从根据权利要求23所述的敲除菌株生产的蛋白质,其中该敲除菌株是MTCC5515(保藏日期2010年1月18日)、MTCC5516(保藏日期2010年1月18日)、MTCC5517(保藏日期2010年1月18日)、MTCC5518(保藏日期2010年1月18日)或其任何修饰菌株中的一种;以及根据上面说明中任一项所述的蛋白质,其中所述蛋白质显示改变的糖基化。
本发明涉及生产糖基化减少的蛋白质的方法,所述方法涉及对甲醇营养型酵母菌株进行基因修饰并且使它们能够生产糖基化减少的蛋白质的载体用途。
在一个优选实施方式中,本发明的失活载体包括编码蛋白甘露糖基转移酶(PMT,长萜基磷酸甘露糖蛋白甘露糖基转移酶蛋白质,E.C.2.4.1.109)的核苷酸序列或其功能性部分,并且能够破坏或失活甲醇营养型酵母菌株中的蛋白甘露糖基转移酶或功能性部分。优选的核苷酸序列是在SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5中表示的编码PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因的核苷酸序列以及它的功能性部分,其被选择用于破坏在SEQID6、SEQID7、SEQID8、SEQID9、SEQID10中分别表示的基因。
根据在本发明中提出的方法,可以将能够表达异源性蛋白质的核苷酸序列引入到甲醇营养型酵母菌株中,该菌株在前面已经以逐步方式用本发明的一种或多种载体进行转化。这种酵母菌株可以连续地或同时地用本发明的一种或多种载体进行转化。另外,可以用一种或多种本发明的失活载体来转化甲醇营养型酵母菌株,这些载体包括如在序列表中表示的编码蛋白甘露糖基转移酶的核苷酸序列。
还提供了使用本方法和载体产生的甲醇营养型酵母菌株,以及从这类基因修饰菌株产生的蛋白质。
使用本发明方法生产的异源性蛋白质产物,即具有降低O-糖基化的蛋白质,也是本发明的一部分。
根据本发明最显著的方面,所期望的终产物的产率保持不受影响。
本发明另外的目的和优点将在随后的说明书中部分地提出,并且部分地从该说明书明显看出或可以从本发明的实践中得知。可以通过在所附权利要求书中具体指出的手段以及组合来实现并达到这些目标和优点。
结合在本文中并且构成本申请一部分的附图说明了在本发明中有用的多种属性,并且与说明书一起用于说明形成本发明关键点的多种显著属性。
附图说明
图1:当将PMT基因亚克隆到pPICZα中时得到的克隆。
道1=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL184质粒(1775+576bp片段),
道2=在BstEII限制性酶作用下消化的PMBL184质粒(线性2351bp片段),
道3=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL185质粒(1930+431bp片段),
道4=在KpnI限制性酶作用下消化的PMBL185质粒(线性2361bp片段),
道5=标记,λDNAEcoRI和HindIII消化,
道6=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL186质粒(1923+428bp片段),
道7=在XmnI限制性酶作用下消化的PMBL186质粒(线性2351bp片段),
道8=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL187质粒(1929+437bp片段),
道9=在BstEII限制性酶作用下消化的PMBL187质粒(线性2366bp片段),
道10=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL188质粒(1929+497bp片段),并且
道11=在NdeI限制性酶作用下消化的PMBL188质粒(线性2426bp片段)。
图2a:pMBL184描述了在pPICZα中克隆的PMT1破坏基因。BstEII限制性位点用于将该质粒线性化。
图2b:敲除型BICC#9104,其中PMT1基因被破坏,道1和13=λ标记,道18=BICC#9104。
图2(c):通过用HindIII限制性酶消化基因组DNA以及使用PMT1破坏片段作为探针得到的DNA印迹。
道M=1kbDNA标记,
道1=生产胰岛素前体的亲代克隆#11,
道2=生产PMT1敲除型胰岛素前体的克隆#11,
道3=生产胰岛素前体的亲代克隆#8,
道4=生产PMT1敲除型胰岛素前体的克隆#8,
道5=生产胰岛素类似物前体的亲代克隆,
道6=生产PMT1敲除型胰岛素类似物前体的克隆以及质粒对照。
图3a:pMBL188描述了在pPICZα质粒中克隆的PMT6破坏基因。NdeI限制性位点用于将该质粒线性化。
图3b:PMT6基因敲除的PCR证实结果。
道1=DNA标记,1kb梯子,
道2=使用InsteZRP和PMT6DSCHK的亲代克隆PCR(无产物),
道3=使用InsteZRP和PMT6DSCHK的BICC#9107PCR(895bp产物),
道4=使用TEFDSRP和SPMT6DCFP的亲代克隆PCR(无产物),
道5=使用TEFDSRP和SPMT6DCFP的BICC#9107PCR(639bp产物),
道6=使用ISCHKFP和PMT6DSCHK的BICC#9107PCR(835bp产物)。
图4a:pMBL186描述了在pPICZα质粒中克隆的PMT4破坏基因。XcmI限制性位点用于将该质粒线性化。
图4b:破坏的PMT4基因的PCR证实结果。
道1=使用InsteZRP和PMT4DSCHK的亲代克隆PCR(无产物,-ve对照),
道2=使用InsteZRP和PMT6DSCHK的阳性对照PMT6#79(895bp产物),
道3=使用InsteZRP和PMT4DSCHK的BICC#9105PCR(981bp产物)(第4次传代培养),
道4=使用TEFDSRP和SPMT4DCFP的BICC#9105PCR(649bp产物)(第4次传代培养),
道5=1kb梯状DNA标记,
道6=使用InsteZRP和PMT4DSCHK的BICC#9105PCR(981bp产物)(第一次传代培养),
道7=使用TEFDSRP和SPMT4DRP的BICC#9105PCR(649bp产物)(第一次传代培养)。
图5a:pMBL187描述了在pPICZα质粒中克隆的PMT5破坏基因。BstEII限制性位点用于将该质粒线性化。
图5b:PMT5破坏克隆的PCR筛选
道1和13=DNA分子量标记
道2-12和14-21是筛选的不同的PMT5破坏基因。
图6a:pMBL185描述了在pPICZα质粒中克隆的PMT2破坏基因。KpnI限制性位点用于将该质粒线性化。
图6b:PMT2基因敲除阳性筛选。
图7:色谱图的重叠,表明PMT1/胰岛素克隆的糖基化减少。
图8:RPHPLC谱图,表明在PMT1基因失活之前和之后胰岛素类似物1的糖基化谱图。
图9:RPHPLC谱图,表明在PMT1基因失活之前和之后胰岛素类似物2的糖基化谱图。
随附序列表的说明
SEQID1:PMT1的核苷酸编码序列
SEQID2:PMT2的核苷酸编码序列
SEQID3:PMT4的核苷酸编码序列
SEQID4:PMT5的核苷酸编码序列
SEQID5:PMT6的核苷酸编码序列
SEQID6:PMT1的破坏序列
SEQID7:PMT2的破坏序列
SEQID8:PMT4的破坏序列
SEQID9:PMT5的破坏序列
SEQID10:PMT6的破坏序列
具体实施方式
本发明涉及通过失活选自下组的至少一种或多种基因能够降低从甲醇营养型酵母生产的蛋白质糖基化的方法,所述组包括分别与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因,所述序列编码蛋白甘露糖基转移酶或其功能性部分。
在本发明的一个实施方式中,该甲醇营养型酵母属于毕赤酵母。
在本发明的另一个实施方式中,该甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。
在本发明的一个另外实施方式中,该蛋白质是通过式I表示的
X–B–Y–A
其中,
X是包括至少一个氨基酸的前导肽序列,
B是胰岛素分子B链的氨基酸序列,它的衍生物或类似物,
Y是包括至少一个氨基酸的连接肽,
A是胰岛素分子A链的氨基酸序列,它的衍生物或类似物,
并且该A和B链可以通过氨基酸取代、缺失和/或添加进行修饰。
在本发明的另一个实施方式中,该糖基化模式是O-糖基化。
在本发明的另一个实施方式中,该糖基化降低至少10%至约99%。
在本发明的另一个实施方式中,该糖基化降低25%。
在本发明的另一个实施方式中,该糖基化降低65%。
本发明涉及包含选自下组的蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分的载体,所述组包括分别与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因,将所述载体整合到同源性基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基转移酶在宿主中,优选在甲醇营养型酵母中的表达。
在本发明的一个实施方式中,减少或改变甲醇营养型酵母生产的蛋白质上糖基化的方法包括用上述载体转化所述酵母。
在本发明的另一个实施方式中,该甲醇营养型酵母属于毕赤酵母。
在本发明的另一个实施方式中,该甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。
本发明涉及用于生产甲醇营养型酵母敲除菌株的方法,其中(a)一种载体并入了能够同源重组的核酸序列,所述同源重组的核酸序列包含编码选自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的组中的基因的至少一个的目标核酸序列和编码选择标记的核酸序列,所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分别具有与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列,(b)在允许在所述载体中编码目标基因的DNA与在宿主细胞中编码目标基因的DNA之间发生同源重组的条件下培养细胞,从而导致破坏宿主细胞中的目标基因,(c)用失活的目标基因来选择宿主细胞。
本发明进一步涉及从根据前述权利要求中任一项所述的方法生产的蛋白质。
本发明进一步涉及甲醇营养型酵母的敲除菌株,所述菌株具有选自下组的至少一种失活基因,该组包括分别与SEQIDNo.1、2、3、4和5表示的核苷酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6。
本发明涉及如上所述的PMT1基因失活菌株,具有登录号MTCC5515。
本发明进一步涉及如上所述的PMT4基因失活菌株,具有登录号MTCC5516。
本发明涉及如上所述的PMT5基因失活菌株,具有登录号MTCC5517。
本发明进一步涉及如上所述的PMT6基因失活菌株,具有登录号MTCC5518。
在本发明的一个实施方式中,与在未改变的宿主菌株中表达的蛋白质产物相比,所述宿主菌株产生糖基化水平减少的蛋白质。
在本发明的另一个实施方式中,该糖基化减少至少25%。
在本发明的另一个实施方式中,该糖基化减少至少65%。
本发明涉及从如上所述的敲除菌株生产的蛋白质。
本发明涉及从根据权利要求23所述的敲除菌株生产的蛋白质,其中该敲除菌株是MTCC5515、MTCC5516、MTCC5517、MTCC5518或它们任何修饰菌株中的一种。
在本发明的一个实施方式中,该选择性标记是博莱霉素抗性标记。
在本发明的另一个实施方式中,该蛋白质是胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素前体分子。
在本发明的另一个实施方式中,所生产的蛋白质是异源性蛋白质产物。
在本发明的另一个实施方式中,该蛋白质显示改变的糖基化。
在本发明的另一个实施方式中,所期望的蛋白质终产物的产率保持不受影响。
现在将详细地参考本发明目前优选的实施方式,它们与下面实施例一起用于说明本发明的原理。
列出下面的实施例以帮助理解本发明,而不旨在,并且不应理解成以任何方式限制其范围。这些实施例不包括对构建载体、将编码多肽的基因插入这类载体中或将得到的质粒引入到宿主内中所使用的常规方法的详细说明。这些实施例还不包括对用于分析由这类宿主载体系统生产的多肽所使用的常规方法的详细说明。这类方法是本领域普通技术人员熟知的并且在许多出版物中进行了描述,包括通过举例方式。
标准技术用于不同的重组DNA技术、转化(例如,电穿孔、脂质体转染)以及测定。这些重组技术和步骤通常是根据本领域熟知的常规方法以及如在贯穿本说明书所引用和讨论的各种一般性以及更具体的参考文献中所描述的进行的。参见例如Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001),它通过引用结合在此。
在说明本发明以及提出权利要求中,可以根据在此列出的定义来使用下面术语。
除非在此另外定义,否则在本发明中使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。另外地,除非上下文另外要求,否则单数术语包括复数并且复数术语包括单数。本发明的方法和技术通常是根据本领域熟知的常规方法来完成的。总体上,结合使用的命名法以及在本文所述的分子和细胞生物学、生物化学、蛋白质和核酸化学以及杂交技术是熟知的并且是本领域中常用的。本发明的方法和技术通常是根据本领域熟知的常规方法来完成的。
如在本文中使用的“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或它们的部分。术语“蛋白质”、“肽”以及“多肽”可互换地使用。
根据本发明优选实施方式的异源性蛋白质是胰岛素或胰岛素类似物前体分子。
编码异源性蛋白质的DNA是通过式I表示的
X–B–Y–A
其中,
X是包括至少一个氨基酸的前导肽序列,
B是胰岛素分子B链的氨基酸序列,它的衍生物或类似物,
Y是包括至少一个氨基酸的连接肽,
A是胰岛素分子A链的氨基酸序列,它的衍生物或类似物,
并且所述A和B链可以通过氨基酸取代、缺失和/或添加进行修饰。
如在本文中使用的术语“C-肽”或“连接肽”包括胰岛素C-肽的所有形式,包括天然或合成的肽。这类胰岛素C-肽可以是人类肽,或可以是来自其他动物种以及属,优选哺乳动物。因此包括天然胰岛素C-肽的变异体以及修饰,只要它们保存胰岛素C-肽的活性即可。修饰蛋白质或肽的序列,同时保持它们有用的活性是本领域已知的,并且可以使用本领域中标准的并且在文献中广泛说明的技术(例如,随机或定点诱变,切割以及连接核酸等)来实现这一点。因此,天然胰岛素C-肽序列的功能等效变异体或衍生物可以根据本领域熟知的技术容易地制备,并且包括具有天然胰岛素C-肽功能性(例如生物学)活性的肽序列。所有这类胰岛素C-肽的类似物、变异体、衍生物或片段特别地包括在本发明的范围内,并且包含在术语“胰岛素C-肽”下。
连接序列可以是具有至少两个氨基酸的任何序列。连接区域可以包括从2至25、2至15、2至12或2至10个氨基酸残基,虽然长度不是关键性的并且可以方便地或根据选项进行选择,或可以无连接物。
该连接肽可以是在前两个氨基酸代表“RR”的条件下包括至少两个氨基酸的任何序列。
根据本发明其他实施方式的多肽在本文中称为具有甘精胰岛素(insulinglargine)活性,例如甘精胰岛素被认为具有人类胰岛素结构两个改变的氨基酸序列:通过重组DNA技术产生的将人类胰岛素A链位置A21处的天然天冬氨酸取代为氨基酸甘氨酸,以及将两个精氨酸分子添加到人类胰岛素B链的COOH末端。任何胰岛素(包括甘精胰岛素)的主要作用是调节葡萄糖代谢。胰岛素和它的类似物通过刺激周边葡萄糖吸收(尤其是在骨骼肌以及脂肪内)以及通过抑制肝脏葡萄糖生产降低了血糖水平。
术语“插入失活”是指通过插入外源DNA来破坏基因的编码区,导致基因功能的丧失。这广泛地用于基因技术中以允许在转化后容易地选择重组体。
术语“敲除”是指破坏基因,其中该破坏导致天然基因的功能性失活;天然基因或其一部分的缺失,或天然基因中的突变。具体地关于本发明,“敲除”是指破坏PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因。
可以根据本领域已知有效的多种方法中的任何一种来制备敲除菌株。例如,可以将包含期望的核酸缺失序列的同源目标基因序列5'和3'的同源重组载体转化到宿主细胞中。理想地,当同源重组时,可以产生期望的目标酶基因敲除。
“同源重组”是指在两个DNA分子配对染色体之间在相同或基本上相同核苷酸序列的位点处交换DNA片段。在同源重组中,进入的DNA与包含基本上同源的DNA序列的基因组中的位点相互作用并且整合到其中。在非同源(“随机”或“非法”)整合中,进入的DNA不整合在基因组中同源序列处而是在别处,在许多潜在位置中的一处。
例如,使用或不使用可选择标记和/或阴性可选择标记,可以使用突变体、功能性或非功能性基因、侧接与内源性目标基因同源的DNA(例如,编码区侧接目标基因)、体内转化编码目标基因不期望的形式的细胞。通过靶向同源重组插入DNA构建体导致内源性基因失活。
如在本文中使用的,术语“同源性”是指i)具有与给定的原始蛋白质或肽的序列基本上类似的(即,至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或98%)氨基酸序列以及保持原始蛋白质或肽的期望功能的蛋白质或肽,或ii)具有与给定核酸的序列基本上类似(即,至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或98%)的序列以及保持原始核酸序列的期望功能的核酸。在本发明以及公开的所有实施方式中,任何公开的蛋白质、肽或核酸可以用保持期望功能的同源或基本上同源的蛋白质、肽、或核酸来取代。在本发明以及公开的所有实施方式中,当公开任何核酸时,应当假设本发明还包括杂交到公开的核酸上的所有核酸。
“功能性部分”是指基本上保持全长蛋白质酶活性的PMT基因片段。“基本上”是指保留了全长PMT的至少约40%,或优选地至少50%或更高的酶活性。
当将它放在与另一种核酸序列功能性关系中时,核酸是“可操作地连接”的。因此,编码序列“可操作地连接”到控制序列是指一种结构,其中编码序列可以在这些序列的控制下表达并且其中所连接的DNA序列是连续的。
如在本文中使用的术语“表达”是指一种过程,通过该过程基于基因的核酸序列生产了多肽。该过程包括转录和翻译二者。
一方面,分离的核酸分子包括与编码PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因的DNA分子具有至少约80%核酸序列一致性,可替代地至少约81%核酸序列一致性,可替代地至少约82%核酸序列一致性、可替代地至少约83%核酸序列一致性、可替代地至少约84%核酸序列一致性、可替代地至少约85%核酸序列一致性、可替代地至少约86%核酸序列一致性、可替代地至少约87%核酸序列一致性、可替代地至少约88%核酸序列一致性、可替代地至少约89%核酸序列一致性、可替代地至少约90%核酸序列一致性、可替代地至少约91%核酸序列一致性、可替代地至少约92%核酸序列一致性、可替代地至少约93%核酸序列一致性、可替代地至少约94%核酸序列一致性、可替代地至少约95%核酸序列一致性、可替代地至少约96%核酸序列一致性、可替代地至少约97%核酸序列一致性、可替代地至少约98%核酸序列一致性以及可替代地至少约99%核酸序列一致性的核苷酸序列。
可替代地,可以通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math2:482的局部识别算法,通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的识别比对算法,通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444是寻找相似性方法,通过计算机实现这些算法(在WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的BLAST、FASTA、GAP、BESTFIT以及TFASTA,GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison,Wis.),或通过检查进行用于比较的序列优化比对。适合确定百分比序列一致性以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST以及BLAST2.0算法,在Altschuletal.(1977)Nucl.AcidsRes.25:33893402以及Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403410中对它们进行说明。
更具体地,本发明是针对核酸序列,适当地分离的核酸序列,它包括或包含至少SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5、它们的变异体或它们的部分,或PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因(包括变异体或部分)中的至少一种。本发明还针对在严格条件下能够与这些核酸序列杂交的分离核酸序列。
本发明提供了包括编码在本文中所述基因中任一项的DNA载体。还提供了包含任何这类载体的宿主细胞。作为举例,宿主细胞可以是细菌的、真菌的,或哺乳动物的。
本发明还针对重组宿主细胞,其中如上定义核酸序列的至少一部分被破坏从而导致重组宿主细胞,与相应的亲代重组宿主细胞相比,该重组宿主细胞生产降低水平糖基化的胰岛素前体。重组表达细胞选自原核以及真核宿主。真核宿主包括酵母细胞(例如,酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)、哺乳动物细胞或植物细胞。对于本领域普通技术人员而言,细菌以及真核细胞可从许多不同来源得到包括商业来源,例如美国典型培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC;Rockville,Md.)。用于重组蛋白质表达的细胞商业来源还提供了使用这些细胞的说明书。表达系统的选择取决于针对表达的多肽所期望的特征。
最优选地涉及本发明的多个方面,最优选的宿主细胞是甲醇营养型酵母。可以使用本发明修饰的甲醇营养型酵母的菌株包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母菌株,例如毕赤酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、或球拟酵母属的酵母。优选的甲醇营养型酵母是毕赤酵母属。可以用本方法修饰的甲醇营养型酵母菌株还包括已经改造用来表达感兴趣的一种或多种异源性蛋白质的那些甲醇营养型酵母菌株。可以通过用本发明的一种或多种载体转化这类菌株来降低从之前这些基因工程菌株表达的异源性蛋白质上的糖基化。
可以使用标准技术将宿主细胞或生物体工程化用来表达重组蛋白质或肽。例如,可以从质粒或从插入到宿主基因组中的异源基因来表达重组蛋白质。
可以用于表达外源性蛋白质的载体是本领域熟知的并且在下面进行说明。还可以使用如在本发明中说明的多种技术(例如同源或异源重组),将用于表达重组蛋白质或肽的基因插入到基因组中。携带蛋白甘露糖基转移酶基因的本发明优选的载体包括但不限于pPICZα以及pTZ57R。
另一方面,本发明提供了失活载体,当引入到甲醇营养型酵母菌株中时该失活载体失活或破坏基因,由此有助于降低在甲醇营养型酵母菌株中生产的期望蛋白质终产物的糖基化而不影响终产物的产率。
在用化合物诱导之后或当表达内源性基因或基因产物后可以表达重组蛋白质或肽。当将宿主细胞置于具体环境中时也可以表达重组蛋白质。下面对特异性启动子元件进行说明。
如在本文中使用的,术语“转化的”以及“稳定转化的”是指已经被用来结合整合到维持至少两代的游离型质粒中的非天然(异源)多核苷酸序列的细胞。
如在本文中使用的,“重组体”包括细胞或载体,它已经通过引入异源性核酸序列进行修饰或该细胞是从这样修饰的细胞衍生的。
可以通过多种方式将载体转化到宿主细胞中,包括但不限于电穿孔、病毒感染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、直接显微注射、加载DNA的脂质体以及阳离子脂质体-DNA复合物、细胞超声、使用高速微粒的基因轰击或在此所述或本领域已知的任何其他方式。
本发明还针对生产期望蛋白质的方法,包括在多种条件下以及在适合生产这种蛋白质化合物或其类似物的培养基中,在生物体中(例如毕赤酵母)进行发酵,其中已经结合了足以指导所期望终产物生产的编码多肽的基因。
已经发现的是在内质网中蛋白甘露糖基转移酶基因(PMT)催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基的O-糖基化。在本发明中已经证明的是PMT基因的破坏显著地降低了所产生的胰岛素前体分子的O-糖基化水平。PMT1基因的破坏导致胰岛素前体显示甘露糖基化降低约65%。分别破坏PMT5和PMT6基因导致胰岛素前体糖基化水平分别降低31%以及28%。PMT2以及PMT4的破坏不影响甘露糖基化。
如在本文中使用的,术语“减少表达”广义地解释为包括感兴趣蛋白质的降低生产。减少表达是指表达低于在未用本文中传授的内容改变但是在基本上相同的生长条件下生长的相应宿主菌株中正常表达的水平。在本发明的上下文中,感兴趣的酶或蛋白质是甘露糖基转移酶类,这些酶在胰岛素/胰岛素类似物前体分子的甘露糖残基的糖基化方面具有显著作用。
根据本发明的一个方面,糖基化的减少可以是至少20%、优选地至少25%、优选地至少30%、优选地至少35%、更优选地至少40%、更优选地至少45%、更优选地至少50%、更优选地至少55%、最优选地至少60%、最优选地至少65%并且最优选地至少70%。根据本发明的另一个方面,可得到的糖基化的降低是约100%。
如在本文中使用的,术语“引物”是指寡核苷酸,无论天然存在的(如在纯化的限制性消化物中)或合成生产的,当在诱导合成与一个核酸链互补的引物延伸产物的条件下(即,在核苷酸以及诱导剂例如DNA聚合酶存在下以及在适当的温度和pH下)时它能够作为合成的起始点。
在许多出版物中对PCR技术进行了说明,包括:PCR:APracticalApproach,M.J.McPhersonetal.,IRLPress(1991),PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,byInnisetal.,AcademicPress(1990),以及PCRTechnology:PrincipalsandApplicationsofDNAAmplification,H.A.Erlich,StocktonPress(1989)。
在许多美国专利中也对PCR进行了说明,包括美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188、4,889,818、5,075,216、5,079,352、5,104,792、5,023,171、5,091,310、以及5,066,584,它们通过引用结合在此。
根据本发明最显著的方面,提供了用于生产甲醇营养型酵母“敲除”菌株的方法,其中(a)一种载体结合了编码选自下组的至少一种基因的核酸序列以及编码可选择标记的核酸序列,该组由分别通过SEQID1、2、3、4和5表示的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6组成,(b)在发生同源重组的条件下培养细胞,由此破坏宿主细胞中的目标核酸序列,(c)对其中发生同源重组的细胞进行选择,以及(d)对改变的菌株中糖基化的降低水平进行评估。
用电穿孔实施巴斯德毕赤酵母的所有转化。在包含100μg/ml博莱霉素的YPD平板上选择携带博莱霉素抗性基因的载体转化体。
因此,本发明的方法导致能够生产感兴趣蛋白质的改变的酵母菌株,其中所述菌株具有选自下组的至少一种失活基因,该组包括如分别通过SEQID1、2、3、4和5表示的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6,以及(b)在例如与未改变的宿主菌株中生产的蛋白质产物相比糖基化终产物的水平降低的条件下,生长所述改变的菌株。
应当理解的是本发明不限于具体的方法、实验方案、细胞系、载体、种或属、以及所述培养基组分,因为这些可以改变。还应当理解的是在本文中使用的术语仅是用于说明具体实施方式的目的,并非旨在限制本发明的范围,本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。上面的说明是用于传授本领域普通技术人员如何实践本发明的目的,并不旨在对其所有显而易见的改变以及变更进行详细说明,当阅读本说明书时这些对于本领域的技术人员而言应当是清楚的。
PMT基因失活菌株的保藏
按照充分公开的要求,本发明的菌株已经保藏在IMTECInstituteofMicrobialTechnology,Sector39-A,Chandigarh160036,India(根据基于布达佩斯条约的国际保藏)。这些菌株是(登录号示于括号中):
通过参考下面的实施例,可以更全面地说明并理解本发明,这些实施例是以举例说明的方式给出的并非旨在以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
PMT1的破坏:
使用下面PMT1引物对涉及巴斯德毕赤酵母PMT1编码区的部分的约477bp的编码序列进行扩增
PMT1FP=5'GGATCCTAATAGCCCACTCTGATCTACCTCACT3'
PMT1RP=5'GGATCCAAAGCCCTCATGTCCATAAGCAGA3'。
在框内在正向引物中包括两个终止密码子以避免从载体中潜在的早期翻译起始位点的任何通读(read-through)。将PCR产物克隆到pTZ57R载体中,并且使用M13FP以及M13RP进行测序用来证实该克隆。使用BamHI对PMT1片段进行切除并且克隆到pPICZα中BamHI和BglII位点中。选择给出1775bp和576bp片段的克隆。
将PMT1破坏盒(disruptioncassette)转化到巴斯德毕赤酵母GS115中。使用BstEII位点将质粒线性化,该位点几乎在通过电穿孔转化到毕赤酵母菌株中的PMT1破坏片段(disruptionfragment)的中部。使用100μg/ml博莱霉素选择转化的克隆。得到几百个克隆并且将各克隆划线到YPD平板上。从每个克隆中分离基因组DNA并且进行PCR以检查正确破坏的克隆。通过PCR(参见图2b)和DNA印迹(参见图2c)来证实PMT1敲除。将选择的克隆保藏为MTCC5515。
引物序列:
InSTEzRP:5’TAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGC3’
TEFDSRP:GAGTCCGAGAAAATCTGGAAGAGT3’
ISCHKFP:5’GCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTA3’
SPMT1DCFP:5’GGACTTATGGTTCATCATTGGTGA3’
实施例2
PMT6的破坏
使用下面引物对涉及PMT6编码区的部分的约515bp的编码序列进行扩增
PMT6FP=5'GGATCCTAATAGCTTGCCGTTAAGAGATACGATGA3’
PMT6RP=5’GGATCCTGAGAATGCAAGTTTGCACCAGTA3'
在框内在正向引物中包括两个终止密码子以避免从载体中潜在的早期翻译起始位点的任何通读。将PCR产物克隆到pTZ57R载体中,使用M13FP和M13RP进行测序以证实该克隆。
将PMT6破坏盒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中。使用唯一的NdeI位点将质粒线性化,该位点几乎位于通过电穿孔转化到毕赤酵母菌株中的PMT6破坏片段的中部。使用100μg/ml博莱霉素选择转化的克隆。得到几百个克隆并且将各克隆划线到YPD平板上。从每个克隆中分离基因组DNA并且进行PCR用来筛选正确破坏的克隆(参见图3b)。将选择的克隆保藏为MTCC5518。
实施例3:
PMT4的破坏
使用下面引物对涉及PMT4编码区的部分的约516bp的编码序列进行扩增。
PMT4FP=5'GGATCCTAATAGGTTCATTTCGCTATTCTAAGCA3’
PMT4RP=5’GGATCCTTTCGACTTCAAAGGACGGGTT3'
在框内在正向引物中包括两个终止密码子以避免从载体中潜在的早期翻译起始位点的任何通读。将PCR产物克隆到pTZ57R载体中,使用M13FP和M13RP进行测序以证实该克隆。
将PMT4破坏盒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中。用唯一的XcmI位点将质粒线性化,该位点几乎位于通过电穿孔转化到毕赤酵母菌株中的PMT4破坏片段的中部。使用100μg/ml博莱霉素选择转化的克隆。得到数百个克隆并且将各克隆划线到YPD平板上。从每个克隆中分离基因组DNA并且进行PCR以筛选正确破坏的克隆(参见图4b)。将选择的克隆保藏为MTCC5516。
实例4:
PMT5的破坏:
使用引物对涉及PMT5编码区的部分的约455bp的编码序列进行扩增
PMT5FP=5'AGATCTTAATAGATCCTACCAGTGATCATTTACCT3’
PMT5RP=5’AGATCTTCACTAATTGGAAGGTCTAGAATC3'
在框内在正向引物中包括两个终止密码子以避免从载体中潜在的早期翻译起始位点的任何通读。将PCR产物克隆到pTZ57R载体中,使用M13FP和M13RP进行测序以证实该克隆。
将PMT5破坏盒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中。使用唯一的BstEII位点将质粒线性化,该位点几乎位于通过电穿孔转化到毕赤酵母菌株中的PMT5破坏片段的中部。使用100μg/ml博莱霉素选择转化的克隆。得到几百个克隆并且将各克隆划线到YPD平板上。从每个克隆中分离基因组DNA并且进行PCR以筛选正确破坏的克隆并且通过PCR证实该克隆(参见图5b)。将选择的克隆保藏为MTCC5517。
实施例5:
PMT2的破坏:
使用下面的引物组对涉及PMT2编码区的部分的约439bp的编码序列进行扩增
PMT2FP=5’GGATCCTAATAGGTGGGTTTATTTGTCACAGTA3’
Pmt2RP=5’GGATCCGAAACACCCAATCATTGTTGGCA3'
在框内在正向引物中包括两个终止密码子以避免从载体中潜在的早期翻译起始位点的任何通读。将PCR产物克隆到pTZ57R载体中,使用M13FP和M13RP进行测序以证实该克隆。
将PMT2破坏盒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中。使用唯一的KpnI位点将质粒线性化,该位点几乎位于通过电穿孔转化到毕赤酵母菌株中的PMT2破坏片段的中部。使用100μg/ml博莱霉素选择转化菌株。得到几百个克隆并且将各克隆划线到YPD平板上。从每个克隆分离基因组DNA并且进行PCR以筛选正确破坏的克隆(图6)。
实施例6:
通过PMT敲除减少胰岛素的糖基化
用胰岛素表达构建体来转化巴斯德毕赤酵母GS115从而得到克隆BICC#7743,作为糖基化水平的对照;分泌的胰岛素具有1.90-2.0的糖基化水平(视为100%)。也用胰岛素表达构建体克隆PMT敲除菌株MTCC5515、MTCC5517和MTCC5518以对比分泌的胰岛素的糖基化水平与对照。当与对照BICC#7743生产的胰岛素比较时,在糖基化方面存在显著减少(参见图7),分别为61%、31%以及28%。
克隆名称 | 菌株名称 | 糖基化水平 | 糖基化减少% |
BICC#7743 | GS115 | 1.90-2.20 | 0 |
BICC#9104 | MTCC5515 | 0.86 | 61 |
BICC#9106 | MTCC5517 | 1.5 | 31 |
BICC#9107 | MTCC5518 | 1.59 | 28 |
实施例7:
通过PMT敲除减少胰岛素类似物1的糖基化
用胰岛素表达构建体转化巴斯德毕赤酵母GS115从而得到克隆BICC#7744,作为糖基化水平的对照;分泌的胰岛素具有1.66的糖基化水平(视为100%)。也用胰岛素表达构建体克隆PMT敲除菌株MTCC5515以比较分泌的胰岛素的糖基化水平与对照。当与由对照BICC#7744生产的胰岛素类似物1比较时,在糖基化方面显著减少(图8)46%。
克隆名称 | 菌株名称 | 糖基化水平 | 糖基化减少% |
BICC#7744 | 亲本 | 1.66 | 0 |
BICC#9118 | MTCC5515 | 0.9 | 46 |
实施例8:
通过PMT敲除降低胰岛素类似物3的糖基化
用胰岛素表达构建体来转化巴斯德毕赤酵母GS115从而得到克隆BICC#7996,作为糖基化水平的对照;分泌的胰岛素具有1.92的糖基化水平(视为100%)。也用胰岛素表达构建体克隆PMT敲除菌株MTCC5515以比较分泌的胰岛素的糖基化水平与对照。当与由对照BICC#7996生产的胰岛素类似物1比较时,在糖基化方面显著减少(图9)65%。
克隆名称 | 菌株名称 | 糖基化水平 | 糖基化减少% |
BICC#7996 | 亲本 | 1.92 | 0 |
BICC#9125 | MTCC5515 | 0.67 | 65 |
Claims (21)
1.一种减少式I表示的胰岛素前体的糖基化的方法:
X–B–Y–A
其中,
X是所述胰岛素前体的前导肽序列,
B是胰岛素分子B链的氨基酸序列,
Y是包括范围为从2至25个氨基酸的连接肽,
A是胰岛素分子A链的氨基酸序列,
并且所述方法包括通过失活选自包括PMT1、PMT5和PMT6基因的组中的至少一个基因能够从甲基营养型酵母中生产由式I表示的所述胰岛素前体,所述PMT1、PMT5和PMT6基因分别为SEQIDNo.1、4和5表示的核苷酸序列,所述序列编码蛋白甘露糖基转移酶或其功能性部分。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述甲醇营养型酵母属于毕赤酵母。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述糖基化是O-糖基化。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述糖基化减少28%至65%。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述糖基化减少28%。
7.根据权利要求5所述的方法,其中所述糖基化减少65%。
8.一种包含蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分的载体,所述蛋白甘露糖基转移酶基因或其功能性部分选自包括PMT1、PMT5和PMT6基因的组,所述PMT1、PMT5和PMT6基因分别为SEQIDNo.1、4和5表示的核苷酸序列,其中所述载体为用于转化到甲醇营养型酵母中以减少或改变胰岛素前体的糖基化。
9.根据权利要求8所述的载体,其中所述甲醇营养型酵母属于毕赤酵母。
10.根据权利要求9所述的载体,其中所述甲醇营养型酵母是巴斯德毕赤酵母。
11.一种用于生产甲醇营养型酵母的敲除菌株以获得具有减少的糖基化的胰岛素前体的方法,所述方法包括:
(a)获得并入了能够同源重组的核酸序列的一种载体,所述同源重组的核酸序列包含编码选自包括PMT1、PMT5和PMT6的组中的基因的至少一个的目标核酸序列和编码用于选择标记的核酸序列,所述PMT1、PMT5和PMT6分别为SEQIDNo.1、4和5表示的核苷酸序列;
(b)在允许在所述载体中编码所述目标基因的DNA与在宿主细胞中编码所述目标基因的DNA之间发生同源重组的条件下培养细胞,从而导致破坏宿主细胞中的目标基因;
(c)用失活的目标基因来选择宿主细胞,以生产甲醇营养型酵母的敲除菌株。
12.一种由权利要求1-7或11中任一项所述的方法生产的具有减少的糖基化的胰岛素前体。
13.一种甲醇营养型酵母的敲除菌株,所述菌株具有选自包括PMT1、PMT5和PMT6的组中至少一个失活基因,所述PMT1、PMT5和PMT6分别为SEQIDNo.1、4和5表示的核苷酸序列,其中与在未改变的宿主菌株中表达的胰岛素产物相比,所述宿主菌株产生糖基化水平减少的胰岛素前体。
14.权利要求13中所述的PMT1基因失活菌株,登录号是MTCC5515。
15.权利要求13中所述的PMT5基因失活菌株,登录号是MTCC5517。
16.权利要求13中所述的PMT6基因失活菌株,登录号是MTCC5518。
17.根据权利要求13所述的敲除菌株,其中所述菌株表达糖基化减少28%至65%的胰岛素前体。
18.根据权利要求13所述的敲除菌株,其中所述菌株表达糖基化减少65%的胰岛素前体。
19.一种由根据权利要求13所述的敲除菌株生产的胰岛素前体。
20.根据权利要求19所述的由敲除菌株生产的胰岛素前体,其中所述敲除菌株是MTCC5515、MTCC5517或MTCC5518中的一种。
21.根据权利要求11所述的方法,其中所述核酸选择标记是博莱霉素抗性标记。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN332/CHE/2010 | 2010-02-10 | ||
IN332CH2010 | 2010-02-10 | ||
PCT/IN2010/000190 WO2011099028A1 (en) | 2010-02-10 | 2010-03-29 | Method of reducing glycosylation of proteins, processes and proteins thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103003438A CN103003438A (zh) | 2013-03-27 |
CN103003438B true CN103003438B (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=44367358
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201080063624.8A Expired - Fee Related CN103003438B (zh) | 2010-02-10 | 2010-03-29 | 减少蛋白质糖基化的方法和过程及其蛋白质 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8778659B2 (zh) |
EP (1) | EP2534255B1 (zh) |
JP (1) | JP5860413B2 (zh) |
CN (1) | CN103003438B (zh) |
MX (1) | MX2012009349A (zh) |
WO (1) | WO2011099028A1 (zh) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2013363266A1 (en) * | 2012-12-17 | 2015-05-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | pmt2, och1, pmt5 Mutant Cells |
WO2014195452A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
WO2015001049A1 (en) | 2013-07-04 | 2015-01-08 | Novartis Ag | O-mannosyltransferase deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof |
CN108064266A (zh) | 2014-07-21 | 2018-05-22 | 格利科斯芬兰公司 | 在丝状真菌中具有哺乳动物样n-聚糖的糖蛋白的制备 |
US11518797B2 (en) | 2014-11-11 | 2022-12-06 | Clara Foods Co. | Methods and compositions for egg white protein production |
KR102007930B1 (ko) * | 2014-12-31 | 2019-08-06 | 주식회사 엘지화학 | 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법 |
CN106282274B (zh) * | 2015-06-29 | 2021-05-11 | 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 | 一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法 |
EP3997118A4 (en) | 2019-07-11 | 2023-07-19 | Clara Foods Co. | PROTEIN COMPOSITIONS AND CONSUMABLE PRODUCTS THEREOF |
US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994004687A1 (en) * | 1992-08-14 | 1994-03-03 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Modified fungal cells and method for producing recombinant products |
WO2009105357A1 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Glycofi, Inc. | Vectors and yeast strains for protein production |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR025646A1 (es) * | 2000-09-13 | 2002-12-04 | Beta Lab Sa | Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa. |
CN101365783B (zh) * | 2005-11-15 | 2013-07-17 | 格利科菲公司 | 具有降低的o-糖基化的糖蛋白的产生 |
US8440456B2 (en) * | 2009-05-22 | 2013-05-14 | Vib, Vzw | Nucleic acids of Pichia pastoris and use thereof for recombinant production of proteins |
-
2010
- 2010-03-29 CN CN201080063624.8A patent/CN103003438B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-29 WO PCT/IN2010/000190 patent/WO2011099028A1/en active Application Filing
- 2010-03-29 MX MX2012009349A patent/MX2012009349A/es unknown
- 2010-03-29 EP EP10845651.8A patent/EP2534255B1/en not_active Not-in-force
- 2010-03-29 JP JP2012552520A patent/JP5860413B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-29 US US13/578,403 patent/US8778659B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994004687A1 (en) * | 1992-08-14 | 1994-03-03 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Modified fungal cells and method for producing recombinant products |
WO2009105357A1 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Glycofi, Inc. | Vectors and yeast strains for protein production |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103003438A (zh) | 2013-03-27 |
MX2012009349A (es) | 2013-02-11 |
US8778659B2 (en) | 2014-07-15 |
JP5860413B2 (ja) | 2016-02-16 |
WO2011099028A1 (en) | 2011-08-18 |
RU2012137953A (ru) | 2014-03-20 |
EP2534255A4 (en) | 2014-04-16 |
EP2534255A1 (en) | 2012-12-19 |
EP2534255B1 (en) | 2017-05-10 |
US20120309935A1 (en) | 2012-12-06 |
JP2013519370A (ja) | 2013-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103003438B (zh) | 减少蛋白质糖基化的方法和过程及其蛋白质 | |
CN101501209B (zh) | 具有促胰岛素活性的生物活性多肽的制备方法 | |
CN1141339A (zh) | 用解脂亚罗威阿酵母转化株表达和分泌异源蛋白质 | |
CN101679991A (zh) | 用于产生同质糖蛋白的遗传改良酵母 | |
CA2889202A1 (en) | Pichia pastoris strains for producing predominantly homogeneous glycan structure | |
CN113151211B (zh) | 一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用 | |
CN102725396A (zh) | 在缺乏二肽基氨肽酶活性的巴斯德毕赤酵母中生产治疗性蛋白的方法 | |
CN101343635B (zh) | 构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法 | |
JP5662363B2 (ja) | 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子(tfp)を明らかにする方法、タンパク質融合因子(tfp)ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法 | |
CN1526021A (zh) | N端部分为蛭素衍生物的融合蛋白在生产酵母分泌的重组蛋白中的应用 | |
CN104066841B (zh) | 表达载体和蛋白质的制造方法 | |
CN103764837A (zh) | 用于生产具有修饰的o-糖基化的蛋白的酵母菌株 | |
KR101779890B1 (ko) | 레반 과당전이효소 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 디프럭토스 언하이드리드 iv 생산방법 | |
JP2770010B2 (ja) | 酵母のマンノース−1−リン酸転移を正に制御する遺伝子ならびにこの遺伝子の欠損変異株を利用する高マンノース型中性糖鎖の製造方法 | |
CN113549560B (zh) | 一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株 | |
CN107810269A (zh) | 新颖的启动子及其用途 | |
KR20080098298A (ko) | 야로위아 리폴리티카 유래의 신규 YlMPO1 유전자 및이의 파쇄 균주를 이용한 만노스 인산이 제거된 당단백질생산 방법 | |
US9127285B2 (en) | Genetically altered ciliates and uses thereof | |
US20240084084A1 (en) | Promoter for yeast | |
RU2575607C2 (ru) | Способ снижения степени гликозилирования белков, способы и белки | |
CN1954083B (zh) | 用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴 | |
EP1913143A1 (en) | Improved protein expression | |
CN115873837A (zh) | 高表达的新型的苯丙氨酸解氨酶 | |
JP2004519239A (ja) | タンパク質発現のための調節領域を含むdna配列 | |
CN117467020A (zh) | 一种嵌合型转录激活因子及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160120 Termination date: 20180329 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |