CN113151211B - 一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种α‑1,3‑岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3‑岩藻糖基乳糖的应用。α‑1,3‑岩藻糖基转移酶突变体与SEQID NO:1具有至少90％的核苷酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID NO:1的第46、128、129或132位中的至少一个或者对应的位置，突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。本发明制备的α‑1,3‑岩藻糖基转移酶突变体在在基因工程化的细胞中合成3‑岩藻糖基乳糖产量可高达10.96g/L，比野生型菌株FutA提高了64.5倍，提升3‑岩藻糖基乳糖产量的效果显著。

Description

一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩 藻糖基乳糖的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用。
背景技术
母乳低聚糖(HMO)是母乳中第三丰富的固体成分（仅次于脂肪和乳糖），含量为5~15g/L，具有调节免疫，帮助大脑发育及调节肠道菌群等功能，有助于婴幼儿成长发育。其中，3-岩藻糖基乳糖（3-FL）也具有许多与健康肠道生态系统相关的益处。但是目前3-FL的产量远低于2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL），尽管2'-FL和3-FL都遵循一个共同的途径来生产GDP-L-岩藻糖。
岩藻糖基化是生物体内一类常见的糖基化修饰，在许多复杂的生理过程中发挥着不可替代的重要作用，许多含岩藻糖基的异常糖链结构与肿瘤的发生和发展密切相关。在人乳中富含岩藻糖基化的寡糖，是重要的益生元，具有增强婴儿免疫力、促进大脑发育等功能。因此，岩藻糖类寡糖和糖缀合物的合成日益受到科学家和医药公司的重视，岩藻糖基转移酶（FucT）催化糖苷键合成具有高度的区域选择性和立体选择性，与化学法相比具有条件温和、产率高、分离纯化等一系列优点，在合成岩藻糖相关的化合物中具有重要价值。
为了提高3-FL的产量和效率，现有许多学者通过基因工程来提高3-FL的产量。例如，韩国专利《발명의명칭α-1,3-푸코실락토오즈의대량생산방법》KR101794971B1；WIPO专利《Method for producing 3-fucosyllactose using corynebacterium glutamicum》WO2018194411A1；中国专利《利用谷氨酸棒状杆菌的3-岩藻糖基乳糖的生产方法》CN110662842A；欧洲专利《Production of fucosylated oligosaccharides in Bacillus》EP3751003A1等。基因工程可以提高GDP-L-岩藻糖的积累从而提高3-FL的产量，同时也存在一定的缺陷，有研究表明，α-1,3-岩藻糖基转移酶的能力有限，即使GDP-L-岩藻糖的胞内浓度很高，也很难和乳糖结合大量生成3-FL，这可能也是导致3-FL的产量低下的原因。
α-1,3-岩藻糖基转移酶是生物合成具有生物活性的3-FL的必须物质，然而，α-1,3-岩藻糖基转移酶（1,3-FTs）的工程原理尚不清楚，α-1,3-岩藻糖基转移酶（FutA）的活性和不溶性表达较低等原因均阻碍了3-FL的生产，降低了3-FL的含量。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明的第一方面提供了一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，所述α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体与SEQ ID NO:1具有至少90%的核苷酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID NO:1的第46、128、129或132位中的至少一个或者对应的位置，所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。
本发明以Helicobacter pylori 26695的α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA （GenBankaccession number：AAD07447.1）为模板，将其核苷酸序列编码C端的膜锚定区去除，然后在缺失C端膜锚定区将七肽重复区域延长至8个获得核苷酸序列，再对核苷酸序列进行了密码子优化，最后突变获得α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，本发明的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体在基因工程化的细胞中合成3-岩藻糖基乳糖产量可高达10.96g/L，比野生型的α-1,3-岩藻糖基转移酶的产量提高了64.5倍，提升3-岩藻糖基乳糖产量的效果显著，具有较高的应用价值。
作为本发明所述α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的优选实施方式，所述的突变为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：
第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代；或
第46位丝氨酸被亮氨酸取代；或
第128位丙氨酸被天冬酰胺取代；或
第129位组氨酸被天冬氨酸取代；或
第129位组氨酸被谷氨酸取代；或
第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
第132位酪氨酸被亮氨酸取代。
作为本发明所述α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的优选实施方式，所述的突变选自如下任一组合：
1)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第129位组氨酸被天冬氨酸取代；或
2)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第129位组氨酸被谷氨酸取代；或
3)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代和第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代；或
4)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代和第46位丝氨酸被亮氨酸取代；或
5)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代和第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代；或
6)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代和第46位丝氨酸被被亮氨酸取代；或
7)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
8)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
9)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
10)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代；或
11)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
12)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
13)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
14)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被天冬氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代；或
15)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
16)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
17)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
18)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代；或
19)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
20)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
21)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
22)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第129位组氨酸被谷氨酸取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代；或
23)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代；或
24)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第46位丝氨酸被亮氨酸取代；或
25)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
26)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
27)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
28)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代；或
29)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
30)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
31)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
32)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代、第46位丝氨酸被亮氨酸取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代；或
33)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第132位酪氨酸被异亮氨酸取代；或
34)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第132位酪氨酸被色氨酸取代；或
35)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第132位酪氨酸被缬氨酸取代；或
36)包含第128位丙氨酸被天冬酰胺取代和第132位酪氨酸被亮氨酸取代。
本发明对获得的核苷酸序列进行了密码子优化，最后突变获得α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，本发明的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体在基因工程化的细胞中合成3-岩藻糖基乳糖产量较高。
当对核苷酸序列进行了定点饱和突变，将核苷酸序列的第128位残基Ala→Asn（丙氨酸被天冬酰胺取代），其获得的菌株（该菌株命名为A128N），生产出的3-岩藻糖基乳糖的产量达6.19 g/L，比野生型菌株FutA提高了36.4倍。
在第128位残基Ala→Asn（丙氨酸被天冬酰胺取代）的基础上，将第129位残基His→Asp（组氨酸被天冬氨酸取代），第46位残基Ser→Leu（丝氨酸被亮氨酸取代），第132位残基Tyr→Trp（酪氨酸被色氨酸取代），其获得的菌株（命名为NDWLuΔ101FutA）生产出的3-岩藻糖基乳糖的产量高达10.96g/L，比野生型菌株FutA提高了64.5倍。
本发明的第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体。
在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上用于下一步纯化与分析的分子标签，如组氨酸标签等。
本发明的第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括如上述的多核苷酸。
在一优选实施例中，表达载体选自pETDuet-1。
本发明的第四方面提供了一种基因工程化的细胞，所述细胞包括上述的表达载体或如上述的多核苷酸。
作为本发明所述细胞的优选实施方式，所述细胞包括大肠杆菌。
在一优选实施例中，基因工程化的细胞可以为大肠杆菌、链霉菌、酵母菌等宿主微生物。
在一优选实施例中，基因工程化的细胞为大肠杆菌。
本发明的第五方面提供了上述α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体在制备3-岩藻糖基乳糖中的应用。
本发明的第六方面提供了一种提高α-1,3-岩藻糖基转移酶催化活性的方法，在生物酶法催化体系中，使用上述的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体。
在一优选实施例中，所述的生物酶法催化体系为体外酶法或全细胞催化。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用，利用本发明的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体可以显著提高3-岩藻糖基乳糖的产量，其3-岩藻糖基乳糖的产量可高达10.96g/L，比野生型菌株FutA提高了64.5倍。
附图说明
图1为本发明α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体在大肠杆菌中生产3-岩藻糖基乳糖的流程示意图；
图2为质粒pRSF-CBGW的结构示意图；
图3为FutA菌株、Δ45FutA和Δ101FutA区域示意图，其中左侧代表催化区，中间代表七肽重复区域，右侧代表C端膜锚定区；
图4为本发明α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体大肠杆菌中生产3-岩藻糖基乳糖的产量图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂所建议的条件。
本发明人经过研究筛选，获得了一组新型的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，其在基因工程化的细胞内合成3-岩藻糖基乳糖产量显著提高。
本发明的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％至100％范围内的任意核苷酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID NO:1的第第46、128、129或132位中的至少一个或者对应的位置。
本发明还提供了编码本发明α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
生物酶法催化体系为一类利用生物酶为催化剂，实现氧化、合成、水解等功能，制备或生产相应大分子或小分子化合物的过程，现有主要的生物酶法反应系统包括，体外酶法、全细胞催化、固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。
体外酶法催化是指酶在体外作为催化剂进行工业生产。
全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。
本发明所得到的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体来源于Helicobacter pylori 26695的α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA （GenBank accession number: AAD07447.1）。
实施例1、构建含有α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA野生型菌株
1) 以Escherichia coli BL21 (DE3)宿主菌，将宿主菌基因组上的基因wcaj、lacZ lacA敲除；此外，大肠杆菌体内3-岩藻糖基乳糖是在GDP-fucose合成酶的作用合成的，因此需要构建表达合成GDP-L-岩藻糖的质粒pRSF-CBGW，该质粒是将基因manB、manC、gmd和wcaG依次插入pRSFDuet-1中获得，质粒pRSF-CBGW由本实验室提供（可参见图1和图2），具体敲除步骤可参见CN111808790A；
2)构建表达α-1,3-岩藻糖基转移酶的质粒载体，以fucA-F、fucA-R为引物对（见表1），将α-1,3-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列通过相应的酶切位点（NcoⅠ/HindⅢ）插入质粒pETDuet-1上，再将相应的质粒和pRSF-CBGW转化至菌株FL-001获得可以生产3-岩藻糖基乳糖的工程菌株。
以来自Helicobacter pylori 26695的α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA （GenBankaccession number: AAD07447.1）为模板，将其表达在质粒pETDuet-1上获得质粒pET-FutA，再同质粒pRSF-CBGW转化至菌株FL-001获得野生型菌株FutA。
表1
Primer名称 序列号 序列（5’-3’）
fucA-F SEQ ID NO:2 ACGCCATGGATGATGCATTC
fucA-R SEQ ID NO:3 CGCAAGCTTAGGCGTTATATTTCTGAC
实施例2、α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的制备
1）缺失C端膜锚定区：
以α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA（GenBank accession number: AAD07447.1）为模板，将其核苷酸序列编码C端的膜锚定区去除，将其表达在质粒pETDuet-1获得质粒pET-Δ45FutA，将该质粒与pRSF-CBGW共同转化入菌株FL-001获得菌株（命名为Δ45FutA），该菌株在大肠杆菌中生产3-岩藻糖基乳糖的产量为1.29 g/L，比野生型的菌株FutA提高了7.6倍。
2）七肽重复区域延长至8个：
在步骤1）α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA缺失C端膜锚定区的基础上将其七肽重复区域（DDLRVNY）延长至8个，表达在质粒pETDuet-1上获得质粒pET-Δ101FutA，将该质粒与pRSF-CBGW共同转化入菌株FL-001获得菌株（命名为Δ101FutA），该菌株在大肠杆菌中生产3-岩藻糖基乳糖的产量为2.03 g/L，比野生型的菌株FutA提高了11.9倍。其中FutA菌株、Δ45FutA和Δ101FutA区域结构如图3所示。
3）密码子优化及点突变
将步骤2）获得菌株Δ101FutA，将其核苷酸序列进行密码子优化（利用在线工具http://www.jcat.de/），获得菌株（uΔ101FutA）（其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示），该菌株在大肠杆菌中生产3-岩藻糖基乳糖的产量为2.91 g/L，比野生型的菌株FutA提高了17.1倍。
将密码子优化后的核苷酸序列进行点突变，在第128位残基进行定点饱和突变，Ala→Asn（丙氨酸被天冬酰胺取代），获得菌株（该菌株命名为A128N），该菌株在大肠杆菌中生产3-岩藻糖基乳糖的产量为6.19 g/L，比野生型的菌株FutA提高了36.4倍。
在菌株A128N的基础上，将第129、46、132位残基上的氨基酸进行单点饱和突变，发现第129位点的His突变为Asp和Glu效果最好，第46位点的Ser突变为Phe和Leu效果最好，第132位点的Tyr突变为Ile、Trp、Val和Leu效果最好；将提高生产3-岩藻糖基乳糖产量的突变体进行累加组合，逐一表达，纯化，表征，所有组合突变与野性型的菌株FutA均表现出3-岩藻糖基乳糖产量提高的效果，表2详细记载了组合突变获得36个突变体。
表2
突变位点 突变体 H129 S46 Y132 3-岩藻糖基乳糖 (g/L)
uΔ101FutA 2.91
A128N 6.19
A128N1 D 8.19
A128N2 E 8.19
A128N3 D F 10.07
A128N4 D L 9.71
A128N5 E F 10.21
A128N6 E L 10.09
A128N7 D F I 10.46
A128N8 D F W 10.48
A128N9 D F 10.71
A128N10 D F L 10.54
A128N11 D L I 10.75
A128N12 D L W 10.96
A128N13 D L V 10.55
A128N14 D L L 10.55
A128N15 E F I 10.38
A128N16 E F W 10.48
A128N17 E F V 10.60
A128N18 E F L 10.58
A128N19 E L I 10.79
A128N20 E L W 10.45
A128N21 E L V 10.55
A128N22 E L L 10.17
A128N23 F 7.72
A128N24 L 7.45
A128N25 F I 9.19
A128N26 F W 7.97
A128N27 F V 8.07
A128N28 F L 7.18
A128N29 L I 8.31
A128N30 L W 10.03
A128N31 L V 8.51
A128N32 L L 8.62
A128N33 I 7.25
A128N34 W 7.12
A128N35 V 7.21
A128N36 L 7.18
由表2可知，本发明α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体最优突变位点组合为：第128位残基上Ala→Asn（丙氨酸被天冬酰胺取代），第129位残基上His→Asp（组氨酸被天冬氨酸取代），第46位残基上Ser→Leu（丝氨酸被亮氨酸取代），第132位残基上Tyr→Trp（酪氨酸被色氨酸取代），获得菌株（命名为NDWLuΔ101FutA），该菌株在大肠杆菌中生产出的3-岩藻糖基乳糖的产量高达10.96g/L，比野生型菌株FutA提高了64.5倍（参考图4）。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院合肥物质科学研究院
<120> 一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用
<130> 20210224
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1266
<212> DNA
<213> NDWLuΔ101FutA菌株的核苷酸序列
<400> 1
atgttccagc cgctgctgga cgctttcatc gaatctgctt ctatcgaaaa aatggcttct 60
aaatctccgc cgccgccgct gaaaatcgct gttgctaact ggtggggtga cgaagaaatc 120
aaagaattca aaaaactggt tctgtacttc atcctgtctc agcgttacgc tatcaccctg 180
caccagaacc cgaacgaatt ctctgacctg gttttctcta acccgctggg tgctgctcgt 240
aaaatcctgt cttaccagaa caccaaacgt gttttctaca ccggtgaaaa cgaatctccg 300
aacttcaacc tgttcgacta cgctatcggt ttcgacgaac tggacttcaa cgaccgttac 360
ctgcgtatgc cgctgtacta caacgacctg cactggaaag ctgaactggt taacgacacc 420
accgctccgt acaaactgaa agacaactct ctgtacgctc tgaaaaaacc gtctcaccac 480
ttcaaagaaa accacccgaa cctgtgcgct gttgttaacg acgaatctga cctgctgaaa 540
cgtggtttcg cttctttcgt tgcttctaac gctaacgctc cgatgcgtaa cgctttctac 600
gacgctctga actctatcga accggttacc ggtggtggtt ctgttcgtaa caccctgggt 660
tacaaagttg gtaacaaatc tgaattcctg tctcagtaca aattcaacct gtgcttcgaa 720
aactctcagg gttacggtta cgttaccgaa aaaatcctgg acgcttactt ctctcacacc 780
atcccgatct actggggttc tccgtctgtt gctaaagact tcaacccgaa atctttcgtt 840
aacgttcacg acttcaacaa cttcgacgaa gctatcgact acatcaaata cctgcacacc 900
cacccgaacg cttacctgga catgctgtac gaaaacccgc tgaacaccct ggacggtaaa 960
gcttacttct accaggacct gtctttcaaa aaaatcctgg acttcttcaa aaccatcctg 1020
gaaaacgaca ccatctacca caaattctct acctctttca tgtgggaata cgacctgcac 1080
aaaccgctgg tttctatcga cgacctgcgt gttaactacg acgacctgcg tgttaactac 1140
gacgacctgc gtgttaacta cgacgacctg cgtgttaact acgacgacct gcgtgttaac 1200
tacgacgacc tgcgtgttaa ctacgacgac ctgcgtgtta actacgacga cctgcgtgtt 1260
aactac 1266
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> fucA-F
<400> 2
acgccatgga tgatgcattc 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> fucA-R
<400> 3
cgcaagctta ggcgttatat ttctgac 27
<210> 4
<211> 1266
<212> DNA
<213> uΔ101FutA菌株的核苷酸序列
<400> 4
atgttccagc cgctgctgga cgctttcatc gaatctgctt ctatcgaaaa aatggcttct 60
aaatctccgc cgccgccgct gaaaatcgct gttgctaact ggtggggtga cgaagaaatc 120
aaagaattca aaaaatctgt tctgtacttc atcctgtctc agcgttacgc tatcaccctg 180
caccagaacc cgaacgaatt ctctgacctg gttttctcta acccgctggg tgctgctcgt 240
aaaatcctgt cttaccagaa caccaaacgt gttttctaca ccggtgaaaa cgaatctccg 300
aacttcaacc tgttcgacta cgctatcggt ttcgacgaac tggacttcaa cgaccgttac 360
ctgcgtatgc cgctgtacta cgctcacctg cactacaaag ctgaactggt taacgacacc 420
accgctccgt acaaactgaa agacaactct ctgtacgctc tgaaaaaacc gtctcaccac 480
ttcaaagaaa accacccgaa cctgtgcgct gttgttaacg acgaatctga cctgctgaaa 540
cgtggtttcg cttctttcgt tgcttctaac gctaacgctc cgatgcgtaa cgctttctac 600
gacgctctga actctatcga accggttacc ggtggtggtt ctgttcgtaa caccctgggt 660
tacaaagttg gtaacaaatc tgaattcctg tctcagtaca aattcaacct gtgcttcgaa 720
aactctcagg gttacggtta cgttaccgaa aaaatcctgg acgcttactt ctctcacacc 780
atcccgatct actggggttc tccgtctgtt gctaaagact tcaacccgaa atctttcgtt 840
aacgttcacg acttcaacaa cttcgacgaa gctatcgact acatcaaata cctgcacacc 900
cacccgaacg cttacctgga catgctgtac gaaaacccgc tgaacaccct ggacggtaaa 960
gcttacttct accaggacct gtctttcaaa aaaatcctgg acttcttcaa aaccatcctg 1020
gaaaacgaca ccatctacca caaattctct acctctttca tgtgggaata cgacctgcac 1080
aaaccgctgg tttctatcga cgacctgcgt gttaactacg acgacctgcg tgttaactac 1140
gacgacctgc gtgttaacta cgacgacctg cgtgttaact acgacgacct gcgtgttaac 1200
tacgacgacc tgcgtgttaa ctacgacgac ctgcgtgtta actacgacga cctgcgtgtt 1260
aactac 1266

Claims (7)

1.一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体以SEQ ID NO:4为基础，在SEQ ID NO:4的46、128、129、132位上同时发生组合突变；
其中，组合突变选择如下任一组合：
1）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为异亮氨酸；
2）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为色氨酸；
3）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为亮氨酸；
4）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为异亮氨酸；
5）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为色氨酸；
6）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为缬氨酸；
7）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为天冬氨酸和第132位由酪氨酸突变为亮氨酸；
8）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为异亮氨酸；
9）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为色氨酸；
10）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为缬氨酸；
11）第46位由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为亮氨酸；
12）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为异亮氨酸；
13）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为色氨酸；
14）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为缬氨酸；
15）第46位由丝氨酸突变为亮氨酸、第128位由丙氨酸突变为天冬酰胺、第129位由组氨酸突变为谷氨酸和第132位由酪氨酸突变为亮氨酸。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞包括如权利要求3所述的表达载体或如权利要求2所述的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌。
6.如权利要求1所述的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体在制备3-岩藻糖基乳糖中的应用。
7.一种提高α-1,3-岩藻糖基转移酶催化活性的方法，其特征在于，在生物酶法催化体系中，使用如权利要求1所述的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体。
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