CN118056009A - 分离的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

涉及一种分离的多肽及其用于制备蛋白偶联物的用途。

Description

分离的多肽及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及分离的多肽及其应用。
背景技术
糖基转移酶是一类催化糖基转移至不同受体分子(如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上)的酶，在医药产品、工业催化、食品和农业等领域都有着很多的应用。比如，通过糖基转移酶合成寡糖，相比于化学合成方法，具有高度选择性、反应条件温和、产率高等优势。另一方面，通过糖基转移酶对治疗性蛋白(如抗体)进行修饰和改造，能够有效改变和调控其药效和功能。
近年来，科学家们通过开发和改造糖基转移酶，如半乳糖基转移酶，提高其对糖及其衍生物的催化活性，逐渐拓展了其在制备抗体偶联药物(ADC，Antibody-Drug conjugate)中的应用。ADC是将具有生物活性和或药学活性的小分子药物偶联至抗体上而产生的。其将小分子的药效通过抗体进行靶向的释放，实现了靶向杀伤的功能。高效地构建均一，并具有良好活性的ADC仍是该领域的一项难点。相比于其他定点偶联方案，通过糖基转移酶进行制备ADC无需对抗体事先进行序列改造，具有独特的优势。然而目前使用的糖基转移酶因其催化活性的限制，只能将极有限的反应官能团(如叠氮基，炔基)催化转移至蛋白(例如，抗体)上，从一定程度上限制了其的应用。另一方面，由于酶催化活性的限制，阻碍了高效地获得接近理论MAR(MOI to antibody ratio)值的、高度均一的抗体偶联药物。
由此，亟需开发具有高催化活性的糖基转移酶，将更多的目的分子(MOI)更高效地转移至蛋白(例如，抗体)上。
发明内容
岩藻糖基化是生物体内一类重要的糖基化修饰，岩藻糖转移酶是一类能够岩藻糖转移至目的分子上的酶，具有很多的潜在应用方向。
本申请提供了一种基于幽门螺杆菌α-1,3岩藻糖基转移酶(GenBank登录号AAD07710.1)的变体(例如，本申请的分离的多肽)，与文献报道的α-1,3岩藻糖基转移酶HpFT-4HR(SEQ ID NO：11)(Wu P.et.al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106,16096)相比，该变体令人惊讶地极大提升了催化岩藻糖或岩藻糖衍生物转移的活性。特别地，在催化 岩藻糖基衍生物(Fuc*)转移至具有包含-GlcNAc(Fuc) b-GalX所示结构的糖链的蛋白(例如，抗体)上时，相比于HpFT-4HR(SEQ ID NO：11)，本申请的变体的催化活性得到了极大提升。本申请还提供了一种使用所述变体制备蛋白质偶联药物(例如，抗体偶联药物)的方法，该方法能够更加高效快速地制备MAR(MOI to antibody ratio)接近理论值的、高度均一的偶联物。例如，在某些情况下，所制备得到的蛋白偶联物的MAR值在约3.2-4.0之间。例如，在某些情况下，所制备得到的蛋白偶联物的MAR值在约3.6-4.0之间。例如，在某些情况下，所制备得到的蛋白偶联物的MAR值在约1.6-2.0之间。例如，在某些情况下，所制备得到的蛋白偶联物的MAR值在约1.8-2.0之间。
一方面，本申请提供了一种分离的多肽，其包含催化活性区域和1个或多个七肽重复片段，所述催化活性区域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述七肽重复片段包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且在所述分离的多肽中，所述七肽重复片段的数量不超过3个。
在某些实施方式中，在所述多肽中，所述催化活性区域位于所述七肽重复片段的N端。
在某些实施方式中，在所述多肽中，所述七肽重复片段的数量为1个。
在某些实施方式中，所述多肽中包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述多肽中，所述七肽重复片段的数量为2个，且所述2个七肽重复片段彼此直接连接。
在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述多肽中，所述七肽重复片段的数量为3个，且所述3个七肽重复片段依次直接连接。
在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述多肽还包含标签序列。在某些实施方式中，所述标签序列为亲和纯化标签。
在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO:3-5以及8-10中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码本申请所述的分离的多肽。例如，所述核酸分子包含SEQ ID NO:25-30中任一项所示的核酸序列。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述核酸分子的核酸序列。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含和/或表达本申请所述的分离的多肽，本申 请所述的核酸分子，和/或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种催化制剂，其包含本申请所述的分离的多肽。
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请所述的分离的多肽。
另一方面，本申请提供了一种转移岩藻糖和/或岩藻糖衍生物的的方法，其包括使用本申请所述的分离的多肽，本申请所述的核酸分子，本申请所述的载体，和/或本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供了本申请所述的分离的多肽在制备蛋白偶联物中的用途。
另一方面，本申请提供了一种制备蛋白偶联物的方法，所述方法包括使用本申请所述的分离的多肽，本申请所述的核酸分子，本申请所述的载体，本申请所述的细胞，和/或本申请所述的催化制剂。
在某些实施方式中，所述方法包括：在本申请所述的分离的多肽和/或本申请所述的催化制剂存在的条件下，将供体Q-Fuc*与具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白质接触以获得蛋白偶联物，所述蛋白偶联物具有包含式(II)所示结构的糖链：
-GlcNAc(Fuc) b-GalX，式(I)；
其中，
所述GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；
Fuc为岩藻糖，b为0或1；
GalX为任选被取代的半乳糖，即GalX为半乳糖或者被取代的半乳糖；
Fuc*包含结构Fuco-MOI，其中，Fuco的结构如式(III)所示： MOI为包含活性物质(AM)的目的分子，且所述MOI连接在式(III)左端，Q为二磷酸核糖核苷酸。
在某些实施方式中，所述蛋白质包含Fc区和/或抗原结合部分，所述GalX与所述GlcNAc之间通过β-1,4糖苷键连接，所述Fuc与所述GlcNAc之间通过α-1,6糖苷键连接，并且所述Fuc*与所述GlcNAc之间通过α-1,3糖苷键连接。
在某些实施方式中，所述GalX为半乳糖。
在某些实施方式中，所述GalX为被取代的半乳糖，且所述半乳糖中位于C2、C3、C4和/或C6位置的一个或多个羟基被取代。
在某些实施方式中，所述GalX为被取代的半乳糖，且所述半乳糖中位于C2位置的羟基被取代。
在某些实施方式中，所述GalX为单糖。
在某些实施方式中，所述GalX被取代基Rg 1取代，Rg 1为选自下组的基团：氢、卤素、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH、-CN、C 1-C 24烷基、C 3-C 24环烷基、C 2-C 24烯基、C 5-C 24环烯基、C 2-C 24炔基、C 7-C 24环炔基、C 2-C 24(杂)芳基、C 3-C 24烷基(杂)芳基，和C 3-C 24(杂)芳基烷基；其中，所述烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和/或(杂)芳基烷基各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 1取代，和/或各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 2间隔；其中，每个所述Rs 1各自独立地为选自下组的基团：卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH和-CN；每个所述Rs 2各自独立地为选自下组的基团：-O-、-S-、 其中，所述Rs 3为选自下组的基团：氢、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基，其中所述C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基任选地被取代。
在某些实施方式中，所述GalX被取代基 取代，
其中：t为0或1；Rg 2为选自下组的基团：C 1-C 24亚烷基、C 3-C 24亚环烷基、C 2-C 24亚烯基、C 5-C 24亚环烯基、C 2-C 24亚炔基、C 7-C 24亚环炔基、C 2-C 24(杂)亚芳基、C 3-C 24烷基(杂)亚芳基和C 3-C 24(杂)芳基亚烷基，其中，所述亚烷基、亚环烷基、亚烯基、亚环烯基、亚炔基、亚环炔基、(杂)亚芳基、烷基(杂)亚芳基和/或(杂)芳基亚烷基各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 1取代，和/或各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 2间隔，
所述Rg 3为选自下组的基团：氢、卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH、-CN、C 1-C 24烷基、C 3-C 24环烷基、C 2-C 24烯基、C 5-C 24环烯基、C 2-C 24炔基、C 7-C 24环炔基和C 2-C 24(杂)芳基，其中所述烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基和/或(杂)芳基各自独立地任选被一个或多个Rs 1取代，
其中，
每个所述Rs 2各自独立地选自-O-、-S-、 所述Rs 3为选自下组的基团：氢、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基，其中所述C 1-C 24烷基、C 2- C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基任选地被取代，且
每个所述Rs 1各自独立地为选自下组的基团：卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH和-CN。
在某些实施方式中，所述式(I)中的GlcNAc与所述蛋白质中的天冬酰胺残基直接连接。
在某些实施方式中，所述蛋白质的糖链中包含甘露糖，且所述式(I)中的GlcNAc与所述糖链中的甘露糖直接连接。
在某些实施方式中，所述蛋白质包含Fc区，且所述糖链与所述Fc区的天冬酰胺残基连接。
在某些实施方式中，所述蛋白质包含Fc区，且所述糖链与所述Fc区中CH 2结构域的天冬酰胺残基连接。
在某些实施方式中，所述蛋白质包含Fc区，且所述糖链连接于所述Fc区的N297位置，其中所述位置根据Kabat中的EU索引编号确定。
在某些实施方式中，所述蛋白质是包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白。
在某些实施方式中，所述蛋白质是单克隆抗体。
在某些实施方式中，所述蛋白质是IgG抗体。
在某些实施方式中，所述Q为二磷酸鸟苷(GDP)、二磷酸尿苷(UDP)和/或二磷酸胞苷(CDP)。
在某些实施方式中，所述Q为二磷酸鸟苷(GDP)。
在某些实施方式中，所述活性物质AM包含生物活性物质、药学活性物质、化学反应活性物质和/或酶反应活性物质。
在某些实施方式中，所述活性物质AM为化学反应活性物质和/或酶反应活性物质。
在某些实施方式中，所述活性物质AM为功能基团X 1，且X 1包含能够参与生物正交连接反应的功能官能团。
在某些实施方式中，所述能够参与生物正交连接反应的功能官能团选自下组中的一种或多种：叠氮基、末端炔基、环炔基、四嗪基、1,2,4-三嗪基、末端烯基、环烯基、酮基、醛基、羟胺基、巯基、马来酰亚胺基以及它们的功能性衍生物。
在某些实施方式中，所述能够参与生物正交连接反应的功能官能团选自下组中的一种或多种：
在某些实施方式中，所述活性物质AM为生物活性物质和/或药学活性物质P 1。
在某些实施方式中，所述P 1包含选自下组中的一种或多种物质：细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素、放射性核素、金属螯合剂、荧光染料、生物素、寡核苷酸和多肽。
在某些实施方式中，所述活性物质AM为药学活性物质P 1。
在某些实施方式中，所述P 1包含选自下组中的一种或多种物质：细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素、放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸和多肽。
在某些实施方式中，所述P 1包含细胞毒素。
在某些实施方式中，所述P 1包含细胞毒素，且所述细胞毒素选自下组中的一种或多种：DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和微管蛋白抑制剂。
在某些实施方式中，所述P 1包含细胞毒素，且所述细胞毒素选自下组中的一种或多种：吡咯并苯二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)及其衍生物、奥瑞他汀(auristatin)及其衍生物、美登木素(maytansinoids)及其衍生物、杜卡霉素(duocarmycin)及其衍生物、tubulysin及其衍生物、烯二炔(enediyene)及其衍生物、阿霉素(doxorubicin)及其衍生物、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂(pyrrole-based kinesin spindle protein inhibitor)及其衍生物、卡奇霉素(calicheamicin)及其衍生物、鹅膏蕈碱(amanitin)及其衍生物和喜树碱(camptothecin)及其衍生物。
在某些实施方式中，所述P 1包含细胞毒素，且所述细胞毒素选自下组中的一种或多种：MMAE和DXd。
在某些实施方式中，所述MOI还包含连接子L，所述L用于将所述AM与所述Fuco相连。
在某些实施方式中，所述连接子L具有结构J-(Sp) n，其中n为0或1，J为结合子，Sp为间隔子，且所述J与所述Fuco直接连接。
在某些实施方式中，所述J为选自下组的结构： 其中Rf为-CH 2-、-NH-或-O-，其中前述结构的左端与所述Fuco直接连接。
在某些实施方式中，所述J为 且其左端与所述Fuco直接连接。
在某些实施方式中，所述J为 且其左端与所述Fuco直接连接。
在某些实施方式中，所述间隔子Sp包含可裂解部分。
在某些实施方式中，所述可裂解部分选自下组中的一种或多种：酸不稳定可裂解部分、氧化还原活性可裂解部分、光活性可裂解部分和蛋白酶水解可裂解部分。
在某些实施方式中，所述可裂解部分选自下组中的一种或多种：vc-PAB和GGFG。
在某些实施方式中，所述间隔子Sp不包含可裂解部分。
在某些实施方式中，所述Q-Fuc*为Q-Fuco-L-AM。
在某些实施方式中，所述Q-Fuc*为Q-Fuco-J-(Sp) n-AM，其中n为0或1。
在某些实施方式中，所述Q-Fuc*为Q-Fuco-J-(Sp) n-X 1，n为0或1。
在某些实施方式中，所述Q-Fuc*为Q-Fuco-J-(Sp) n-P 1，n为0或1。
在某些实施方式中，所述n为1。在某些实施方式中，所述n为0。
在某些实施方式中，所述GalX选自下组：
在某些实施方式中，获得的所述蛋白偶联物包含1至20个式(II)所示的结构。
在某些实施方式中，获得的所述蛋白偶联物包含2个或4个式(II)所示的结构。
在某些实施方式中，所述蛋白偶联物包含4个式(II)所示的结构。
在某些实施方式中，获得的所述蛋白偶联物的结构如式(IV)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc 区。
在某些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：使具有G 0(F) 0,1，G 1(F) 0,1和/或G 2(F) 0,1糖型的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白(例如糖蛋白)，该蛋白的结构如式(V)所示： 其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在某些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：使具有G 0(F) 0,1糖型的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白(例如，糖蛋白)，该蛋白的结构如式(V)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在本申请的方法的某些实施方式中，所述蛋白偶联物可包含2个式(II)所示的结构。
在某些实施方式中，所述蛋白偶联物的结构如式(VI)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗 体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在某些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：用内切糖苷酶处理包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，得到经处理的所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白；使所述经处理的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的糖蛋白，该糖蛋白的结构如式(VII)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在某些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：用内切糖苷酶和α1,6岩藻糖苷酶处理包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，得到经处理的所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白；使所述经处理的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的糖蛋白，该糖蛋白的结构如式(VII)所示
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0，且所述糖链连接在所述含有Fc区抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在某些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：使所获得的蛋白偶联物与Y 1-L’-P 1’反应，以获得包含生物活性物质和/或药学活性物质P 1'的蛋白偶联物，其中所述Y 1是能够与所述X 1发生连接反应的官能团，L'为连接子。
另一方面，本申请还提供了通过本申请所述的方法制备得到的蛋白偶联物。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白偶联物的MAR在约3.2-4.0之间或约1.6-2.0之间。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白偶联物的MAR在约3.6-4.0之间或约1.8-2.0之 间。
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含一种或多种本申请所述的蛋白偶联物。
在某些实施方式中，本申请所述的组合物还包含药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的蛋白偶联物，和/或本申请所述的组合物。
另一方面，本申请提供了本申请所述的蛋白偶联物和/或本申请所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是不同HpFT变体将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-G 2F上的效率对比。
图2显示的是不同HpFT变体将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-(Fucα1,6)(Galβ1,4)GlcNAc上的效率对比。
图3显示的是不同HpFT变体将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-(Fucα1,6)(GalNAzβ1,4)GlcNAc上的效率对比。
图4显示的是不同酶变体将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc上的效率对比。
图5显示的是HpFT-4HR和HFT6将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-G 2F及Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc上的效率对比。A)HpFT-4HR和HFT6将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-G 2F上的效率对比。B)HpFT-4HR和HFT6将GDP-Fuc*转移到Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc上的效率对比。
图6显示的是HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAzP 4Biotin和GDP-FAmP 4Biotin转移到Trastuzumab-G 2F(A)及Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(B)上的效率对比。
图7显示的是HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmSucMMAE转移到Trastuzumab-G 2F (A)及Durvalumab-G 2F(B)上的效率对比。
图8显示的是HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmSucMMAE转移到Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(A)及Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(B)上的效率对比。
图9显示的是HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmSucMMAE转移到Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc上的效率对比。
图10显示的是使用HpFT-2HR制备获得的抗体偶联物的质谱分析。
图11显示的是本申请所述Q-Fuc*的一些示例性结构。
图12显示的是本申请中使用到的一些化合物的结构。
图13显示的是本申请的示例性蛋白偶联物的体外活性检测。
图14显示的是用本申请的方法制备的蛋白偶联物的示意图。
图15显示的是本申请的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白上的示例性糖型。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“标签序列”通常是指被整合(例如，连接)到目标蛋白质(例如，抗体)中的另一个分子实体(例如，另一个氨基酸序列标签)。例如，所述标签序列可以是可检测的标记，例如经放射标记的氨基酸或者经生物素化的多肽，其能被标记的抗生物素蛋白检测到(例如带有荧光标记或酶活性的抗生物素蛋白链菌素，可通过光学方法或比色法检测到)。例如，标签序列可以包括但不限于：放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)，荧光标签(例如FITC、罗丹明、镧磷光剂)，酶标签(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素基团，预先选定的能被第二个受体识别的多肽抗原表位(例如亮氨酸拉链互补序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、附加表位)，磁性试剂例如钆螯合物，毒素例如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒、鬼臼噻吩甙、长春新碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、盐酸米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾丸酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。在某些实施方式中，所述标签序列可以是亲和纯化标签，例如多聚组氨酸标签(His标签)，Arg标签、FLAG标签、3xFlag标签、链霉亲和素 标签、纳米标签、SBP标签、c-myc标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、GST标签和/或MBP标签。
在本申请中，术语“蛋白偶联物”通常是指与第二部分(例如治疗剂或细胞毒性剂的)化学连接的蛋白质。
在本申请中，术语“分离的多肽”通常是指一种如下的多肽，其1)已经与在自来源细胞分离时与其一起天然存在的多核苷酸、脂质、碳水化合物、或其它材料的至少约50％分离，2)不与在自然界中与所述“分离的多肽”连接的分子的整个或部分连接(通过共价或非共价相互作用)，3)与在自然界中不与其连接的分子可操作连接(通过共价或非共价相互作用)，或者4)在自然界中不存在。例如，所述分离的多肽基本上没有存在于其自然环境中的会干扰其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的任何其它污染性多肽或其它污染物。
在本申请中，术语“直接连接”通常是指连接位点不包含另外的化合物(例如，其他糖基)或接头。例如，一个分子或实体与另一个直接连接，可以指二者之间不存在另外的分子或实体。例如，直接连接可以指一个部分与另一部分连接而没有任何中间部分或接头。例如，GlcNAc与蛋白质(如抗体)的氨基酸残基直接连接一般是指GlcNAc通过共价键与该蛋白质的氨基酸残基连接，例如通过N-糖苷键与酰胺氮键连接该蛋白质的氨基酸(如天冬酰胺氨基酸)侧链上的原子。在本申请中，当GlcNAc与蛋白质的氨基酸“间接连接”时，GlcNAc与蛋白质的氨基酸之间通常存在至少一个单糖部分。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括该限定之后的内容，但并不排除没有具体提到的其他内容，即在本申请中通常应理解为一种开放式的限定。
除非本文另有说明或者上下文清楚地有相反含义，否则本文所用的术语“一个”、“一种”、“该/所述”以及本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)所使用的类似术语应理解为既包括单数，又包括复数。
本申请说明书和权利要求书中所公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本申请说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括所有非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体以及对映异构体的任何混合物、外消旋体或其他形式。当化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构的形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发 明不限于该具体的互变异构体。
未取代的烷基具有通式C nH 2n+1并且可以是直链的或支链的。未取代的烷基也可以包含环状部分，并因此具有相应的通式C nH 2n-1。任选地，所述烷基被一个或多个在本申请中进一步指定的取代基取代。烷基的实例包括，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
芳基可包含六至十二个碳原子并可包含单环和双环结构。任选地，所述芳基可以被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。芳基的实例为苯基和萘基。
芳基烷基和烷基芳基可包含至少七个碳原子并且可包含单环和双环结构。任选地，所述芳基烷基和烷基芳基可被一个或多个在本申请中进一步指定的取代基取代。芳基烷基可以为，例如苄基。烷基芳基可以为，例如4-叔丁基苯基。
在本申请中，术语“杂芳基”通常是指5-12个原子的芳族单环或多环基团，其具有至少一个包含选自N，O，和S的一个、两个或三个环杂原子的芳环，并且余下的环原子是C。杂芳基的一个或两个环碳原子可以被羰基取代。
杂芳基烷基和烷基杂芳基包含至少三个碳原子(即至少C3)并且可包含单环和双环结构。任选地，杂芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。
当芳基表示为(杂)芳基时，该表示法意指包括芳基和杂芳基。类似地，烷基(杂)芳基意指包括烷基芳基和烷基杂芳基，(杂)芳基烷基意指包括芳基烷基和杂芳基烷基。因此C 2-C 24(杂)芳基应理解为包括C 2-C 24杂芳基和C 6-C 24芳基。类似地，C 3-C 24烷基(杂)芳基意指包括C 7-C 24烷基芳基和C 3-C 24烷基杂芳基，并且C 3-C 24(杂)芳基烷基意指包括C 7-C 24芳基烷基和C 3-C 24杂芳基烷基。
除非另有说明，烷基、烯基、烯烃、炔烃、(杂)芳基、(杂)芳基烷基和烷基(杂)芳基可被一个或多个选自下述的取代基取代：C 1-C 12烷基、C 2-C 12烯基、C 2-C 12炔基、C 3-C 12环烷基、C 5-C 12环烯基、C 7-C 12环炔基、C 1-C 12烷氧基、C 2-C 12烯氧基、C 2-C 12炔氧基、C 3-C 12环烷氧基、卤素、氨基、氧代，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间隔或中断。
在本申请中，术语“炔基”通常包含碳-碳三键。含有一个三键的未取代的炔基具有通式C nH 2n-3。末端炔基是其中三键位于碳链末端位置的炔基。任选地，炔基被一个或多个在本申请中进一步指定的取代基取代，和/或被选自氧、氮和硫的杂原子间隔或中断。炔基的实例包括，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、辛炔基等。
在本申请中，术语“环炔基”通常是指具有规定数目碳原子和一或多个碳-碳三键的不饱和的单环、双环或三环烃环。例如，C 7-C 12环炔基是指具有7－12个碳原子的环炔基。在某些实施方案中，环炔基在环中具有一个碳-碳三键。在其它实施方案中，环炔基在环中具有一个以上的碳-碳三键。环炔基的代表性示例包括但不限于环庚炔基，环辛炔基等。
在本申请中，术语“杂环炔基”通常是被选自氧、氮和硫的杂原子间隔或中断的环炔基。任选地地，杂环炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。杂环炔基的实例为氮杂环辛炔基(azacyclooctynyl)。
当烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、(杂)环炔基被任选地地取代时，所述基团独立地任选地被一个或多个独立地选自下述的取代基取代：C 1-C 12烷基、C 2-C 12烯基、C 2-C 12炔基、C 3-C 12环烷基、C 1-C 12烷氧基、C 2-C 12烯氧基、C 2-C 12炔氧基、C 3-C 12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基被任选地地取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间隔或中断。
在本申请中，术语“糖”通常是指单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。术语“糖衍生物”在申请中通常是指单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcNH 2)、半乳糖胺(GalNH 2)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、唾液酸(Sia)(也被称为N-乙酰神经氨酸(NeuNAc))、和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖醛酸(IdoA)。糖衍生物的实例也包括本申请中表示为GalX的化合物，其可以为半乳糖或半乳糖衍生物。糖衍生物的实例也包括本申请中表示为Fuc*的化合物，其可以为岩藻糖衍生物。
在本申请中，术语“核苷酸”以其常见的科学含义使用。术语“核苷酸”指的是由核碱基、五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)和一个、两个或三个磷酸基组成的分子。不含磷酸基时，核碱基和糖构成了核苷。因此，核苷酸也被称为核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。核碱基可以为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。核苷酸的实例包括二磷酸核糖核苷酸，例如尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)。
在本申请中，术语“蛋白”和“蛋白质”可互换使用，通常以其常见的科学含义使用。在申请中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包括天然的氨基酸，但也可包括非天然的氨基酸。
在本申请中，术语“糖蛋白”以其常见的科学含义使用，并且指的是含有一个或多个共价键合至蛋白质上的单糖或低聚糖链(“糖链”)的蛋白质。糖链可以连接到蛋白质的羟基上(O-连接-糖链)，例如连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基上；或者连接到蛋白质的酰氨基上(N-糖蛋白)，例如天冬酰胺或精氨酸；或者连接到蛋白质的碳上(C-糖蛋白)，例如色氨酸。糖蛋白可以包含多于一个糖链，可以包含一个或多个单糖和一个或多个低聚糖糖链的组合，并且可以包含N-连接、O-连接和C-连接的糖链的组合。据估计，超过50％的所有蛋白质具有一些糖基化的形式，因此可被描述为糖蛋白。
在本申请中，术语“糖链”通常是指连接至蛋白质的单糖或低聚糖链。因此，术语糖链指的是糖蛋白的糖类部分。糖链通过一个糖的C-1碳连接在蛋白质上，所述糖链可以不含其他取代基(单糖)或者可以在其一个或多个羟基上被进一步取代(低聚糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。然而，当更长的聚糖连接在蛋白质上时，所述聚糖在本申请中也被认为是糖链。
糖蛋白的糖链可以是单糖。通常，糖蛋白的单糖糖链由共价键合至蛋白质的单个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)或岩藻糖(Fuc)组成。糖链也可以为低聚糖。
糖蛋白的低聚糖链可以是直链的或支链的。在低聚糖中，直接连接在蛋白质上的糖称为核心糖。在低聚糖中，未直接连接在蛋白质上且连接在至少两个其他糖上的糖被称为内糖。在低聚糖中，未直接连接在蛋白质上但连接在单个其他糖上——即在其一个或多个其它羟基上没有连接到其它糖上——的糖被称为末端糖。为了避免疑义，在糖蛋白的低聚糖中可以存在多个末端糖，但是通常仅存在一个核心糖。
糖链可以为O-连接的糖链、N-连接的糖链或C-连接的糖链。在O-连接的糖链中，单糖或低聚糖糖链键合在所述蛋白质的氨基酸中的O原子上，通常经由丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基。在N-连接的糖链中，单糖或低聚糖糖链经由所述蛋白质的氨基酸中的N原子键合在蛋白质上，通常经由天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)侧链上的酰胺氮。在C-连接的糖链中，单糖或低聚糖糖链键合在所述蛋白质的氨基酸中的C原子上，通常键合在色氨酸(Trp)的C原子上。
直接连接在蛋白质上的低聚糖的末端被称作糖链的还原端。所述低聚糖的另一端被称作糖链的非还原端。
对于O-连接的糖链，存在很多不同的链。天然存在的O-连接的糖链通常具有丝氨酸或苏氨酸-连接的α-O-GalNAc部分，其还可以被半乳糖、唾液酸和/或岩藻糖取代。携带糖链 取代基的羟基化氨基酸可以是蛋白质中任何氨基酸序列的一部分。
对于N-连接的糖链，存在很多不同的链。天然存在的N-连接的糖链通常具有天冬酰胺-连接的β-N-GlcNAc部分，转而在其C4-OH上进一步与β-GlcNAc连接，然后在其C4-OH上进一步与β-Man连接，继而在其C3-OH和C6-OH上进一步与α-Man连接，形成五糖Man 3GlcNAc 2。核心GlcNAc部分还可以在其C6-OH上与α-Fuc连接。五糖Man 3GlcNAc 2是大多数N-连接的糖蛋白的常见的低聚糖框架并可以进一步和其他糖进行连接，包括但不限于Man、GlcNAc、Gal和唾液酸。在侧链上被糖链修饰的天冬酰胺通常是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X为除了脯氨酸以外的任何氨基酸且Ser/Thr为丝氨酸或苏氨酸。
在本申请中，术语“抗体”通常是指通过免疫系统产生的能够识别并与特定抗原结合的蛋白质或其抗原结合片段。抗体是糖蛋白的一个实例。术语抗体在本申请中以其最广泛的意思使用并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。抗体也包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌抗原的抗体。在本申请中。术语“抗体”通常包括完整的抗体，但也包括抗体片段，例如来自经裂解的抗体的抗体Fab片段、(Fab’) 2、Fv片段或Fc片段，scFv-Fc片段，小抗体(minibody)，纳米抗体(nanobody)、双特异性抗体(diabody)或scFv。此外，术语“抗体”也包括经工程化或遗传学改造的抗体和/或抗体的衍生物。在一些实施方式中，抗体被称为免疫球蛋白并且包括各种类别和同种型，例如IgA(IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgG(IgG1、IgG3和IgG4)等。在本申请中，术语“抗体”可包括多克隆抗体和单克隆抗体及其功能片段。抗体包括保留特异性结合表位的能力的经修饰或衍生的抗体变体。抗体能够选择性地结合靶抗原或表位。在本申请中，抗体可以来自任何来源，例如小鼠或人，包括其嵌合抗体，例如，抗体可以是人源化的。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指含有来自非人动物抗体的部分或全部CDR的抗体，并且抗体的框架和恒定区含有来自人抗体序列的氨基酸残基。
抗体、抗体片段和基因改造的抗体均可以通过本领域已知的方法获得。合适的市售抗体包括但不限于利妥昔单抗(Rituximab)、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿仑珠单抗、阿达木单抗、托西莫单抗-I131、西妥昔单抗、替伊莫单抗(ibrituximabtiuxetan)、奥马佐单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、帕木单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、卡那奴单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、度伐利尤单抗(Durvalumab)和布妥昔 单抗(brentuximab)。
在本申请中，术语“治疗”通常是指获得期望的药理和/或生理效果。该效果在完全地或部分地预防疾病或其症状方面可能是预防性的，和/或在疾病和/或由该疾病引起的副作用的部分或完全治愈方面可能是治疗性的。本申请中所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并包括预防疾病在受试者中发生，所述受试者可能易感染疾病但是还未被诊断出患有该疾病；抑制疾病，即阻止其发展；缓解疾病，即引起疾病的消退。
在本申请中，术语“缀合物”通常是指由独立的部分接合在一起形成的任何物质。在缀合物中，所述独立的部分可以在一个或多个活性位点处彼此连接。此外，所述独立的部分可以共价或非共价地彼此缔合或连接，并显示出各种化学计量摩尔比。本申请中的缀合物可包含肽、多肽、蛋白质、在体内代谢成活性剂的前药、聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子和/或放射性同位素。
在本申请中，术语“Fc区”通常是指免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域和/或铰链区。在本申请中，术语“Fc区”包括任何多肽(或编码此类多肽的核酸)，无论其生产方式如何。
在本申请中，术语“Fc融合蛋白”通常是指包含Fc区和其他部分(例如，其他多肽或蛋白质)的融合蛋白。在某些实施例中，该其他部分可以是具有生物活性的蛋白质。例如，该其他部分可以是治疗性蛋白。例如，该其他部分可以是细胞因子。
在本申请中，术语“GlcNAc”或“N-乙酰葡糖胺”可以互换地使用，通常是指单糖葡萄糖的酰胺衍生物，通常通过β-(1,4)键线性聚合。
糖基化通常是指碳水化合物，即糖基供体，与另一个分子(糖基受体)的羟基或其他官能团相连的反应。在一些实施方案中，糖基化主要特别是指将聚糖连接到蛋白质或其他有机分子的酶促过程。蛋白质中的糖基化可以在糖基键、糖基结构、糖基组成和/或糖基长度等方面进行修饰。糖基化可以包括N-连接糖基化、O-连接糖基化、磷酸丝氨酸糖基化、C-甘露糖基化、形成GPI锚(glypiation)和/或化学糖基化。相应地，蛋白质的糖基化寡糖可以是N-连接寡糖、O-连接寡糖、磷酸丝氨酸寡糖、C-甘露糖基化寡糖、糖基化寡糖和/或化学寡糖。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的、可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之 外，构成该群体的个体抗体是相同的。
在本申请中，术语“IgG”通常是指免疫球蛋白或其功能衍生物。本领域技术人员将理解免疫球蛋白重链被分为γ、μ、α、δ和ε(γ、μ、α、δ、ε)以及其中的一些亚型(例如γ1-γ4或α1-α2)。正是这条链的性质决定了抗体的“同种型”，分别为IgG、IgM、IgD、IgA或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等已被很好地表征并且已知赋予功能特异性。人IgG的典型特征是Fc区重链CH2区Asn297位(根据Kabat的EU编号)的糖基化。
在本申请中，术语“Asn297”或“N297”可互换地使用，通常是指抗体Fc区第297位(根据Kabat的EU编号规则编号)的天冬酰胺。Asn297可以与一种或多种寡糖连接。
在本申请中，术语“Fuc*α1,3GlcNAc连接”通常是指Fuc*的Fuco和GlcNAc之间的连接，将Fuco的C1位连接到GlcNAc的C3位，例如一般通过-O-连接。
在本申请中，术语“GalXβ1,4GlcNAc连接”通常是指任选被取代的半乳糖GalX和GlcNAc之间的连接，将GalX的C1位连接到GlcNAc的C4位，例如，一般通过-O-连接。
在本申请中，术语“目的分子”和“MOI”可互换地使用，通常是指具有所需特性的分子。所需特性可以是物理特性或化学特性，例如反应活性、稳定性、溶解性、结合活性、抑制活性、毒性和/或可降解性等。MOI可包含具有所需生物活性和/或反应性官能团的任何物质，其可用于将药物连入本申请的蛋白偶联物中。例如，MOI可以包含活性物质(AM)。例如，活性物质可以是治疗剂、诊断剂、药理学剂和/或生物活性剂，例如细胞毒素、细胞抑制剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、抗生素、荧光团、生物素标签、肽、蛋白质或其任意组合。在某些情况下，活性物质(AM)可以是化学活性物质。例如，化学活性物质可以是可以与另一个化学官能部分反应形成共价键的化学官能部分。例如，化学活性物质可能能够参与连接反应。在一些情况下，活性物质可以是酶活性物质，其可以在酶的存在下与相应的功能官能团反应形成共价键。
在本申请中，术语“MAR”又指“MOI与抗体的比率”，通常用来表示蛋白偶联物(如抗体偶联物)中目的分子数量与蛋白质分子数量的比值。另一方面，当目的分子中包含药物分子(Drug)时，MAR又称为DAR(“Drug to antibody ratio”)，通常用来表示蛋白偶联物(如抗体偶联物)中药物分子数量与蛋白质分子数量的比值。
在本申请中，术语“官能团”通常是指能够与另一个基团反应的基团。官能团可用于将试剂(例如，没有反应活性或具有低反应活性的试剂)连入本申请的蛋白质缀合物中。例如，官能团可以是化学基团或具有化学和/或酶促反应性的残基。在一些实施例中，官能团可以 是能够在连接反应中反应的基团。
在本申请中，术语“岩藻糖基转移酶”通常是指可以将L-岩藻糖从岩藻糖供体底物(如鸟苷二磷酸-岩藻糖)转移到受体底物的酶或其功能片段或变体。受体底物可以是另一种糖，例如包含GlcNAc-Gal(LacNAc)的糖，如在N-糖基化或在O-糖基化的情况下。术语“岩藻糖基转移酶”可以包括其任何功能片段，或其催化结构域，以及具有催化活性结构域的功能变体(例如、突变体、同种型)。岩藻糖基转移酶的例子可以是α-1,3岩藻糖基转移酶，其可以识别GlcNAc-Gal作为底物。术语“岩藻糖基转移酶”可以源自各种物种，例如哺乳动物(例如人类)、细菌、线虫或吸虫。
在本申请中，术语“药学活性物质”通常是指任何在药学上有用或具有药效的物质。在本申请中，药物活性物质可以不包含可检测试剂(例如，具有可检测物理或化学部分的试剂，和/或仅用于本申请中的检测目的)。在本申请中，药物活性物质可不包含荧光标记物。例如，药物活性物质可以是能够减轻、治疗、预防疾病或延迟疾病进程的药剂。所述疾病可以是与异常细胞增殖和/或细胞功能障碍相关的疾病。例如，所述疾病可以是肿瘤和/或免疫系统疾病。
在本申请中，术语“生物正交连接反应”通常是指用于制备本申请所述蛋白偶联物的化学反应。该反应特异性发生在位于蛋白质特定位置处(例如位于蛋白质的寡糖上)的第一功能官能团和与所述功能官能团部分对应的第二功能官能团之间。所述第一功能官能团与所述第二功能官能团通常被称为是一对生物正交连接反应对。通常，位于蛋白质特定位置的第一个功能官能团很容易与蛋白质其他部分的其他基团区分开来。通常，除了特定位置的第一功能官能团外，第二功能官能团不会与该蛋白质的其他部分反应。例如，叠氮基是能够参与生物正交连接反应的功能官能团。与之互补的DBCO或BCN基团可以与叠氮基特异性反应，而不会与蛋白质上的其他基团发生交叉反应。许多具有合适反应性、化学选择性和/或生物相容性的化学反应性功能官能团可用于生物正交连接反应。能够参与生物正交连接反应的基团可以选自但不限于叠氮基、末端炔基、环状炔基、四嗪基、1,2,4-三嗪基、末端烯基、环状烯基、酮基、醛基、羟基氨基、巯基、N-马来酰亚胺基及它们的功能衍生物(参见Bertozzi CR,et.al Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,6974；Chin JW,et.al ACS Chem.Biol.2014,9,16；van Del FL,et.al Nat.Commun.,2014,5,5378；Prescher JA,et.al Acc.Chem.Res.2018,51,1073；Devaraj NK.ACS Cent.Sci.2018,4,952；Liskamp RMJ,et.al Chem.Sci.,2020,11,9011)。此处的功能衍生物可以指是经过修饰的功能官能团，其具有与未修饰的功能官能团相近或者更高的反应活性。例如，亚甲基叠氮基 可以是叠氮基 的一种功能衍生物。
在本申请中，亲本多肽或蛋白的“功能性变体”通常与亲本多肽或蛋白质具有实质或显著的序列同一性或相似性，该功能性变体保留其亲本多肽或蛋白质的至少一部分功能。例如，酶的功能性变体以与亲本酶相似的程度、相同的程度或更高的程度保留酶活性。就亲本多肽或蛋白质而言，功能性变体可以是例如与其在氨基酸序列上具有约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多，或约99％或更多的序列同一性。在一些情况下，功能性变体可以是与亲本多肽或蛋白有至少一个氨基酸不同的多肽。例如，功能性变体可以是通过在亲本多肽或蛋白质上添加、缺失或取代一个或多个氨基酸获得的，例如1-200、1-100、1-50、1-40、1-30,1-20,1-15,1-14,1-13,1-12,1-11,1-10,1-9,1-8,1-7,1-6,1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸。
在本申请中，亲本多肽或蛋白的“功能性片段”通常是指下述肽或多肽(包括但不限于酶)，其包含亲本多肽或蛋白质的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个连续氨基酸残基或至少350个连续氨基酸残基，其中所述功能性片段具有其亲本多肽或蛋白的至少一部分功能。例如，亲本酶的“功能性片段”以与亲本酶相似的程度、相同的程度或更高的程度保留酶活性。
发明详述
分离的多肽、核酸分子、载体、细胞、催化制剂
一方面，本申请提供了一种分离的多肽。所述分离的多肽可包含催化活性区域和1个或多个七肽重复片段。所述催化活性区域可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述七肽重复片段可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且在所述分离的多肽中，所述七肽重复片段的数量不超过3个(例如，可以为1个，为2个或3个)。
例如，源自幽门螺杆菌的野生型α1,3岩藻糖基转移酶(GenBank登录号AAD07710.1)包含10个七肽重复片段(例如，每个所述七肽重复片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，当对其C末端进行截短后(例如，截去7-9个七肽重复片段)，可获得本申请所述的分离的多肽。
在某些情况下，所述催化活性区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在某些情况下，每个所述七肽重复片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本申请所述的分离多肽中，所述催化活性区域可位于所述七肽重复片段的N端。例如，所述催化活性区域的C端可与所述七肽重复片段的N端直接或间接连接。
在本申请所述的分离多肽中，所述七肽重复片段的数量可以为1个。在这种情况下，所述催化活性区域可位于该七肽重复片段的N端，例如，该催化活性区域的C端可与该七肽重复片段的N端直接或间接连接。
例如，本申请所述的分离多肽可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述分离的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本申请所述的分离多肽中，所述七肽重复片段的数量可以为2个。例如，所述2个七肽重复片段彼此可直接连接。例如，第一个七肽重复片段的C端可直接与第二个七肽重复片段的N端直接(例如，通过肽键)连接。例如，在本申请的分离的多肽中，所述催化活性区域的C端可以与所述第一个七肽重复片段的N端直接连接，所述第一个七肽重复片段的C端可直接与第二个七肽重复片段的N端直接连接。
例如，本申请所述的分离多肽可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，本申请所述分离多肽的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4所示。
在本申请所述的分离多肽中，所述七肽重复片段的数量可以为3个。例如，所述3个七肽重复片段可顺次直接连接。例如，第一个七肽重复片段的C端可直接与第二个七肽重复片段的N端直接(例如，通过肽键)连接，所述第二个七肽重复片段的C端可直接与第三个七肽重复片段的N端直接(例如，通过肽键)连接。例如，在本申请的分离的多肽中，所述催化活性区域的C端可以与所述第一个七肽重复片段的N端直接连接，所述第一个七肽重复片段的C端可直接与第二个七肽重复片段的N端直接连接，所述第二个七肽重复片段的C端可直接与第三个七肽重复片段的N端直接连接。
例如，本申请所述的分离多肽可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。例如，本申请所述分离多肽的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:5所示。
本申请所述的分离多肽还可以包含标签序列，例如亲和纯化标签序列。所述亲和纯化标签序列可以包括，例如但不限于多聚组氨酸标签，Arg标签、FLAG标签、3xFlag标签、链霉亲和素标签、纳米标签、SBP标签、c-myc标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、GST标签和/或MBP标签。
例如，本申请所述的分离的多肽可包含SEQ ID NO:3-5和8-10中任一项所示的氨基酸序列。例如，本申请所述的分离的多肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:3-5和8-10中任一项所示。
本申请的分离的多肽还涵盖其功能性变体和/或功能性片段。
本申请还提供了一种或多种分离的核酸分子，其可编码本申请所述的分离的多肽。例如，编码本申请所述的分离的多肽的核酸分子可包含SEQ ID NO:25-30中任一项所示的核苷酸序列。在某些情况下，编码所述分离的多肽的核酸序列如SEQ ID NO:25-30中任一项所示。
本申请还提供了载体(例如，一种或多种载体)，其可包含本申请所述核酸分子的核酸序列。例如，所述一个或多个核酸分子可被包含在一个载体中，也可以被包含在多个载体中。每个载体中可包含一种本申请的核酸分子，也可以包含多种本申请的核酸分子。所述载体可以为，例如质粒。
本申请还提供了一种细胞，其可包含和/或表达本申请所述的分离的多肽，本申请所述的核酸分子，和/或本申请所述的载体。所述细胞可以为，例如原核细胞或真核细胞。例如，所述细胞可以为细菌(如，大肠杆菌)。所述细胞还可以为真核微生物如丝状真菌或酵母细胞，无脊椎动物细胞，脊椎动物细胞(例如，哺乳动物细胞，如CHO细胞，人细胞等)。
本申请还提供了一种催化制剂，其可包含本申请所述的分离的多肽。本申请的催化制剂还可以包含本申请所述的核酸分子、载体和/或细胞。本申请的催化制剂中还可包含其他催化剂(例如，合适的金属离子，其他糖基转移酶，例如半乳糖转移酶，如β1,4半乳糖转移酶，糖苷酶，如内切糖苷酶等，α1,6岩藻糖苷酶，如Alfc等)。
制备方法
本申请还提供了一种转移岩藻糖和/或岩藻糖衍生物的方法，其包括使用本申请所述的分离的多肽(例如，氨基酸序列如SEQ ID NO:3-5和8-10中任一项所述的分离的多肽)，本申请所述的核酸分子(例如，核酸序列如SEQ ID NO:25-30中任一项所述的分离的核酸分子)，本申请所述的载体，和/或本申请所述的细胞。
本申请还提供了本申请所述的分离的多肽在制备蛋白偶联物中的用途。
例如，本申请提供了一种制备蛋白偶联物的方法，所述方法包括使用本申请所述的分离的多肽，本申请所述的核酸分子，本申请所述的载体，本申请所述的细胞，和/或本申请所述的催化制剂。
本申请所述的制备方法可包括：在本申请所述的分离的多肽和/或本申请所述的催化制剂存在的条件下，将供体Q-Fuc*与具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白质接触以获得蛋白偶联物，所述蛋白偶联物具有包含式(II)所示结构的糖链：
-GlcNAc(Fuc) b-GalX，式(I)；
其中，
所述GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；
Fuc为岩藻糖，b为0或1；
GalX为任选地被取代的半乳糖；
Fuc*包含结构Fuco-MOI，其中，Fuco的结构如式(III)所示： MOI为包含活性物质(AM)的目的分子，且所述MOI连接在式(III)左端，Q为二磷酸核糖核苷酸。
在某些实施方式中，所述蛋白质包含Fc区和/或抗原结合部分，所述GalX与所述GlcNAc之间通过β-1,4糖苷键连接，所述Fuc与所述GlcNAc之间通过α-1,6糖苷键连接，并且所述Fuc*与所述GlcNAc之间通过α-1,3糖苷键连接。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述GalX可以为任选被取代的半乳糖，例如，所述GalX可以为不经取代的半乳糖或经取代的半乳糖。例如，所述GalX可以为经取代的半乳糖，所述半乳糖中位于C2、C3、C4和/或C6位置的一个或多个羟基可以被取代。在某些情形中，所述GalX可以为被取代的半乳糖，且所述半乳糖中位于C2位置的羟基可以被取代。
例如，所述GalX可以为单糖。所述单糖可以是，例如，不能再被简单水解成更小的糖类的分子。例如，所述单糖可以为单糖衍生物，但仅含有一个核心单糖骨架。例如，同时含有Gal和GlcNAc的LacNAc不是单糖。
例如，所述GalX可以被取代基Rg 1取代，所述Rg 1可以为选自下组的基团：氢、卤素、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH、-CN、C 1-C 24烷基、C 3-C 24环烷基、C 2-C 24烯基、C 5-C 24环烯基、C 2-C 24炔基、C 7-C 24环炔基、C 2-C 24(杂)芳基、C 3-C 24烷基(杂)芳基，和C 3-C 24(杂)芳基烷基；其中，所述烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和/或(杂)芳基烷基可以各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 1取代，和/或可以各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 2间隔。每个所述Rs 1可以各自独立地为选自下组的基团：卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH和-CN。每个所述Rs 2可以各自独立地 为选自下组的基团：-O-、-S-、 其中，所述Rs 3可以为选自下组的基团：氢、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基，其中所述C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基可以任选地被取代。
例如，所述GalX可以是C2位被取代的半乳糖，例如其可以是 又例如，所述GalX可以是C2位被取代的半乳糖，例如其可以是
例如，所述GalX可以被取代基 取代，其中：t可以为0或1；Rg 2为选自下组的基团：C 1-C 24亚烷基、C 3-C 24亚环烷基、C 2-C 24亚烯基、C 5-C 24亚环烯基、C 2-C 24亚炔基、C 7-C 24亚环炔基、C 2-C 24(杂)亚芳基、C 3-C 24烷基(杂)亚芳基和C 3-C 24(杂)芳基亚烷基。其中，所述亚烷基、亚环烷基、亚烯基、亚环烯基、亚炔基、亚环炔基、(杂)亚芳基、烷基(杂)亚芳基和/或(杂)芳基亚烷基可以各自独立地任选地被一个或多个取代基Rs 1取代，和/或各自独立地任选地被一个或多个取代基Rs 2间隔。所述Rg 3为选自下组的基团：氢、卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH、-CN、C 1-C 24烷基、C 3-C 24环烷基、C 2-C 24烯基、C 5-C 24环烯基、C 2-C 24炔基、C 7-C 24环炔基和C 2-C 24(杂)芳基，其中所述烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基和/或(杂)芳基各自独立地任选地被一个或多个Rs 1取代。每个所述Rs 2可以各自独立地选自-O-、-S-、 所述Rs 3为选自下组的基团：氢、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基，其中所述C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基任选地被取代。每个所述Rs 1可以各自独立地选自卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH和-CN。
例如，所述GalX可以是C2位被取代的半乳糖，比如其可以是 又例如，所述GalX可以是C2位被取代的半乳糖，比如其可以是 又例如，所述GalX可以 是C2位被取代的半乳糖，比如其可以是 在本申请所述的制备方法中，所述式(I)中的GlcNAc可以与所述蛋白质中的天冬酰胺残基直接连接。
在某些情形中，在本申请所述的制备方法中，所述蛋白质的糖链中可以包含甘露糖，且所述式(I)中的GlcNAc可以与所述糖链中的甘露糖直接连接。
在本申请所述的制备方法中，所述蛋白质可以包含Fc区，且所述糖链可以与所述Fc区的天冬酰胺残基连接。
在本申请所述的制备方法中，所述蛋白质可以包含Fc区，且所述糖链可以与所述Fc区中CH 2结构域的天冬酰胺残基连接。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述蛋白质可以包含Fc区，且所述糖链可连接于所述Fc区的N297位置，其中所述位置根据Kabat中的EU索引编号确定。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述蛋白质可以是包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白。例如，所述蛋白质可以是单克隆抗体。例如，所述蛋白质可以是IgG抗体。
例如，所述抗体可以是曲妥珠单抗Trastuzumab，其重链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:20所示，其轻链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:19所示。
例如，所述抗体可以是利妥昔单抗Rituximab，其重链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:22所示，其轻链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:21所示。
例如，所述抗体可以是度伐利尤单抗Durvalumab，其重链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:24所示，其轻链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:23所示。
在本申请所述的制备方法中，所述Q可以为二磷酸鸟苷(GDP)、二磷酸尿苷(UDP)和/或二磷酸胞苷(CDP)。例如，所述Q可以为二磷酸鸟苷(GDP)。
在本申请所述的制备方法中，所述活性物质AM可以包含生物活性物质、药学活性物质、化学反应活性物质和/或酶反应活性物质。例如，所述活性物质AM可以为化学反应活性物质和/或酶反应活性物质。
又例如，所述活性物质AM可以为功能基团X 1，且X 1包含能够参与生物正交连接反应的功能官能团。例如，所述能够参与生物正交连接反应的功能官能团可以选自下组中的一种或多种：叠氮基、末端炔基、环炔基、四嗪基、1,2,4-三嗪基、末端烯基、环烯基、酮基、醛基、羟胺基、巯基、马来酰亚胺基以及它们的功能性衍生物。例如，所述能够参与生物正 交连接反应的功能官能团可以选自下组中的一种或多种
例如，所述活性物质AM可以为生物活性物质和/或药学活性物质P 1。在本申请所述的制备方法中，所述活性物质AM可以为药学活性物质P 1。例如，所述P 1包含选自下组中的一种或多种物质：细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素、放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸和多肽。在某些情形中，所述P 1包含细胞毒素。
例如，所述P 1可以选自下组中的一种或多种：DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和微管蛋白抑制剂。
例如，所述P 1可包含细胞毒素，且所述细胞毒素可选自下组中的一种或多种：吡咯并苯二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)及其衍生物、奥瑞他汀(auristatin)及其衍生物、美登木素(maytansinoids)及其衍生物、杜卡霉素(duocarmycin)及其衍生物、tubulysin及其衍生物、烯二炔(enediyene)及其衍生物、阿霉素(doxorubicin)及其衍生物、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂(pyrrole-based kinesin spindle protein inhibitor)及其衍生物、卡奇霉素(calicheamicin)及其衍生物、鹅膏蕈碱(amanitin)及其衍生物和喜树碱(camptothecin)及其衍生物。
例如，所述P 1可包含细胞毒素，且所述细胞毒素可选自下组中的一种或多种：MMAE(一甲基瑞奥西汀E)和DXd(依喜替康衍生物)。
在本申请所述的制备方法中，所述MOI可以包含连接子L。所述L可用于将所述AM与所述Fuco相连，例如，在形成偶联物的过程中，所述L可位于所述AM与所述Fuco之间。
在某些实施方式中，所述连接子L可具有结构J-(Sp) n，其中n为0或1，J为结合子，Sp为间隔子，且所述J与所述Fuco直接连接。J其功能可以是将所述Fuco与所述Sp、或者所述AM连接起来。例如，所述L可以由所述J与所述Sp(例如，n为1)组成，所述结合子J将所述Fuco和所述Sp连接起来。例如，所述L可以由所述J组成(n为0)，所述结合子J将所述Fuco与所述AM直接连接起来。
例如，所述J可以为选自下组的结构中的一种： 其中Rf为-CH 2-、-NH-或-O-，其中前述结构的左端可与所述Fuco直接连接。
例如，所述J可以为 其中该结构的左端可与所述Fuco直接连接。
例如，所述J可以为 其中该结构的左端可与所述Fuco直接连接。
在某些实施方案中，本申请中的分离的多肽在催化包含J结构为 的Q-Fuc*转移时，有着更好的催化活性。例如，实施例22和23中对比了本申请中的分离的多肽在催化含有不同J结构的Q-Fuc*(例如，GDP-Fuc*)时的催化效率。
例如，本申请的间隔子Sp可以是连接结合子J和所述AM的一个结构部分。
例如，本申请的间隔子Sp可包含可裂解部分。例如，所述可裂解部分可选自下组中的一种或多种：酸不稳定可裂解部分、氧化还原活性可裂解部分、光活性可裂解部分和蛋白酶水解可裂解部分。例如，所述可裂解部分可选自下组中的一种或多种：vc-PAB、GGFG和二硫键。
在某些实施方式中，所述间隔子Sp不包含可裂解部分，例如，所述Sp是不可裂解的。
通常，所述间隔子Sp可具有下述一项或者多项功能：i)调节AM和Fuco之间的距离；ii)调节Fuc*结构的亲水性或疏水性；iii)调节Fuc*结构的刚性和柔性；或iv)当所述Sp中包含可裂解部分时，其可在特定条件下断裂并将活性分子(AM)释放。
例如，示例性的Sp结构可选自下列结构： 其中，前述结构的右端可以和所述J相连接，而其左端可以和活性分子AM相连接。
例如，所述Q-Fuc*可以为Q-Fuco-L-AM。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述Q-Fuc*可以为Q-Fuco-J-(Sp) n-AM，其中n可以为0或1。例如，所述n可以是0。又例如，所述n可以是1。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述Q-Fuc*可以为Q-Fuco-J-(Sp) n-X 1，其中n可以为0或1。例如，n可以是0。又例如，所述n可以是1。例如，本申请的图11中列举了一些示例性的所述Q-Fuco-J-(Sp) n-X 1的结构，如GDP-FAz，GDP-FAmAz和GDP-FAmP 4Tz。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述Q-Fuc*可以为Q-Fuco-J-(Sp) n-P 1，其中n可以为0或1。例如，所述n可以是0。又例如，所述n可以是1。例如，本申请的图11中列举了一些示例性的Q-Fuco-J-(Sp) n-P 1的结构，例如GDP-FAmAzP 4MMAE，GDP-FAmSucMMAE，和GDP-FAmAzP 4DXd。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述GalX可以选自下组中的一种或多种：
根据本申请所述的制备方法，所获得的所述蛋白偶联物可包含1至20个式(II)所示的结构。例如，约2-20个，约3-20个，约4-20个，约5-20个，约6-20个，约7-20个，约8-20个，约9-20个，约10-20个，约11-20个，约12-20个，约13-20个，约14-20个，约15-20个，约16-20个，约17-20个，约18-20个，或者约19-20个式(II)所示的结构。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述蛋白偶联物可包含约2个或4个式(II)所示的结构。
例如，在本申请所述的制备方法中，所述蛋白偶联物可包含约4个式(II)所示的结构。
在本申请所述的制备方法中，所获得的所述蛋白偶联物的结构可以如式(IV)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在某些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：使具有G 0(F) 0,1，G 1(F) 0,1和/或G 2(F) 0,1糖型的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白(例如，糖蛋白)，该蛋白的结构如式(V)所示： 其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
例如，所述合适的催化剂可以为β1,4半乳糖转移酶或其功能性变体。例如，所述合适的催化剂可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
例如，对于治疗性的单克隆抗体,在其Fc区297位的天冬酰胺(即本申请所述的N297位)上通常具有保守的N-糖基化修饰。这种修饰的糖基一般由多种单糖组成，其可具有双天线结构。通常情况下，所述N-糖基化修饰的90％以上由G 0(F) 0,1，G 1(F) 0,1和G 2(F) 0,1糖型组成。因此，可先通过前述步骤获得式(V)所示结构的糖蛋白。
例如，本申请所述的方法还可包括下述步骤：使具有G 0(F) 0,1糖型的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的糖蛋白，该糖蛋白的结构如式(V)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
例如，所述合适的催化剂可以为β1,4半乳糖转移酶或其功能性变体。例如，所述合适的催化剂可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请所述的制备方法中，所述蛋白偶联物可以包含2个式(II)所示的结构。
例如，所述蛋白偶联物的结构可以如式(VI)所示：
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
例如，本申请所述的方法还可包括下述步骤：用内切糖苷酶处理包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，得到经处理的所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白；使所述经处理的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的糖蛋白，该糖蛋白的结构如式(VII)所示
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。例如，所述合适的催化剂可以为β1,4半乳糖转移酶或其功能性变体。例如，所述合适的催化剂可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。例如，所述内切糖苷酶可以为Endo S,Endo S2,Endo A,Endo F,Endo M, Endo D，Endo H和/或他们的功能性变体。例如，所述内切糖苷酶可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的方法还可包括下述步骤：用内切糖苷酶和α1,6岩藻糖苷酶处理包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，得到经处理的所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白；使所述经处理的抗体和/或Fc融合蛋白在β1,4半乳糖转移酶或其功能性变体存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的糖蛋白，该糖蛋白的结构如式(VII)所示
其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0，且所述糖链连接在所述含有Fc区抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。例如，所述合适的催化剂可以为β1,4半乳糖转移酶或其功能性变体。例如，所述合适的催化剂可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。例如，所述内切糖苷酶可以为Endo S,Endo S2,Endo A,Endo F,Endo M,Endo D，Endo H和/或他们的功能性变体。例如，所述内切糖苷酶可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。例如，所述α1,6岩藻糖苷酶可以为BfFucH、Alfc，BKF和/或它们的功能性变体。例如，所述α1,6岩藻糖苷酶可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本申请所述方法还可包括下述步骤：使所获得的蛋白偶联物与Y 1-L’-P 1’反应，以获得包含生物活性物质和/或药学活性物质P 1'的蛋白偶联物，其中所述Y 1是能够与所述X 1发生连接反应的官能团，L'为连接子。例如，该蛋白偶联物可包含功能官能团X 1，其可与所述Y 1发生连接反应。其中，连接子L'可以是连接Y 1和P 1'的结构。例如，P1’可以包含毒素分子。例如，图12中展示的DBCO-PEG 4-vc-PAB-MMAE和TCO-PEG 4-vc-PAB-MMAE为示例性的Y 1-L’-P 1’结构。
通过本申请的方法制备得到的一种或多种蛋白偶联物或其组合，可具有约3.2-4.0或者1.6-2.0的MAR值。
通过本申请的方法制备得到的一种或多种蛋白偶联物或其组合，可具有约3.6-4.0或者1.8-2.0的MAR值。
例如，通过本申请的方法制备得到的一种或多种蛋白偶联物或其组合，可具有约3.2-4.0 的MAR值。例如，通过本申请的方法制备得到的一种或多种蛋白偶联物或其组合，可具有约3.6-4.0的MAR值。
又例如，通过本申请的方法制备得到的一种或多种蛋白偶联物或其组合，可具有约1.6-2.0的MAR值。又例如，通过本申请的方法制备得到的一种或多种蛋白偶联物或其组合，可具有约1.8-2.0的MAR值。
蛋白偶联物、组合物及医药用途
另一方面，本申请提供了通过本申请所述的方法制备得到的蛋白偶联物和/或多种所述蛋白偶联物的组合。
另一方面，本申请提供了具有生物学和/或药学活性的蛋白偶联物，其通过使用具有化学和/或酶反应活性的蛋白偶联物制备得到，所述具有化学和/或酶反应活性的蛋白偶联物通过本申请所述的方法制备得到。例如，可通过本申请所述的制备方法制备获得具有化学和/或酶反应活性的蛋白偶联物，然后使用该具有化学和/或酶反应活性的蛋白偶联物制备得到所述具有生物学和/或药学活性的蛋白偶联物。
例如，所述蛋白偶联物可包含约4个式(II)所示的结构。
例如，所获得的所述蛋白偶联物的结构可以如式(IV)所示： 其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为所述任选地被取代的半乳糖， 为抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
在某些情形中，所述蛋白偶联物可以包含2个式(II)所示的结构。
例如，所述蛋白偶联物的结构可以如式(V)所示： 其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选地被取代的半乳糖， 为抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋 白的Fc区。
本申请还提供了一种组合物，所述组合物可包含本申请所述的分离的多肽，本申请所述的核酸分子，本申请所述的载体，本申请所述的细胞，本申请所述的催化制剂和/或本申请所述的蛋白偶联物。
本申请的组合物还可包含一种或多种药学上可接受的佐剂或助剂。例如，所述佐剂或助剂可包含赋形药、粘合剂、崩散剂、填充剂(稀释剂)、滑润剂、助流剂(流动增强剂)、浓缩助剂、颜料、甜味剂、防腐剂、悬浮/分散剂、膜形成器/包衣、调味剂和/或印刷墨水等。
本申请的组合物还可以包含一种或多种其他活性物质，例如，化学活性物质、生物学活性物质和/或酶活性物质等。
另一方面，本申请提供了本申请所述的蛋白偶联物和/或本申请所述的组合物用于制备药物的用途。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法可包括向有需要的受试者施用本申请所述的蛋白偶联物，和/或本申请所述的组合物(例如，药物组合物)。
另一方面，本申请提供了本申请所述的蛋白偶联物和/或本申请所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物可用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的多肽、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
材料和方法
蛋白质分子量质谱分析
利用Xevo G2-XS QTOF质谱仪(Waters Corporation)，进行蛋白的分子量分析。该质谱仪配备有电喷雾电离源(ESI)及Acuqity UPLC I-Class plus系统(Waters Corporation)。纯化后的蛋白用Waters ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱( 1.7μm,2.1mm x 100mm)进行分离和脱盐。流动相A为0.1％甲酸/水溶液，流动相B为含0.1％甲酸水的乙腈，流速为0.2mL/min。用Waters Unify软件(version 1.9.4,Waters Corporation)进行数据分析。
HpFT(Helicobacter pyloriα-1,3-Fucosyltransferase，幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶)变体的克隆、表达及纯化
HpFT-4HR(其包含催化活性区域、4个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨 基酸序列如SEQ ID NO:11所示)的克隆、表达及纯化参考Wu P.et.al报道的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106,16096)。
通过基因合成编码HpFT-6HR(其包含催化活性区域、6个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)、HpFT-3HR(其包含催化活性区域、3个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)、HpFT-2HR(其包含催化活性区域、2个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)、HpFT-1HR(其包含催化活性区域、1个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)、HpFT-0HR(其包含催化活性区域以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示)、HpFT-4HR(M4)(其催化活性区域中具有S46F、A128N、H129E和Y132I四位点突变，其包含4个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)和HpFT-4HR(M7)(其催化活性区域中具有S46F、A128N、H129E、Y132I、Y200N、E341D和V369A七位点突变，其包含4个七肽重复序列以及C端融合的His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)的核酸序列，并通过NdeI和BamHI酶切位点将该核酸序列插入至pET24b载体中(南京金斯瑞)。用构建好的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养经转化后的重组细菌，在37℃下培养至当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.2mM，然后继续在25℃，200rpm的条件下孵育16小时进行蛋白诱导表达。诱导后的菌体经离心后，悬浮于裂解缓冲液中(25mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM氯化钠，20mM咪唑，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))。将悬浮后的细胞经超声裂解，然后用Ni-NTA填料(GE Healthcare)进行纯化。收集纯度大于90％主组分，然后透析至保存缓冲液中(25mM Tris，pH 7.5，150mM氯化钠，5％甘油)。
BGalT1(Y289L)(Bovineβ-1,4-galactosyltransferase I，牛β-1,4-半乳糖基转移酶带有Y289L突变)，EndoS(Streptococcus pyogenes endoglycosidase S，酿脓链球菌内切糖苷酶S)，Alfc(Lactobacillus caseiα-1,6-fucosidase Alfc，干酪乳杆菌α-1,6-岩藻糖苷酶)及HFT6(Human fucosyltransferase-6，人岩藻糖基转移酶6)的克隆、表达及纯化
参考Qasba P.K et.al.报道的方法(J.Biol.Chem.2002,277(23):20833-20839；Prot.Expr.Fur.2003,30,219.)克隆、表达及纯化BGalT1(Y289L)(SEQ ID NO:16)，参考Collin,M.et.al报道的方法(EMBO J.2001,20,3046；Infect.Immun.2001,69,7187)克隆、表达及纯化EndoS(SEQ ID NO:17)，参考Wang L.,et.al报道的方法(Methods Mol.Biol. 2018,19,367)克隆、表达及纯化Alfc(SEQ ID NO:18)，以及参考Moremen K.W et al.报道的方法(Nat Chem.Biol.2018,14,156)克隆、表达及纯化HFT6(SEQ ID NO:15)。
实施例1 合成GDP-FAz
参考Wu P.,et.al报道的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106,16096)合成GDP-FAz。并通过Bio-Gel P-2Gel柱，使用50mM碳酸氢铵溶液为洗脱液完成纯化。
HRMS(ESI-):C 16H 24N 8O 15P 2(M-H +)计算值为629.0764,实测值为629.0785。
实施例2 合成GDP-FAm
将100mg GDP-FAz溶于8.75mL甲醇/水(体积比1:1.5)溶液中，然后向体系中加入5mg钯碳，抽真空置换氢气，并将体系压力保持在0.28MPa。在室温下搅拌反应4h，过滤、浓缩和冻干得到白色固体(84.8mg，88％)。HRMS(ESI-):C 16H 26N 6O 15P 2(M-H +)计算值603.0859,实测值603.0874。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.10(s,1H),5.92(d,J＝6.1Hz,1H),4.97(t,J＝7.6,1H),4.76-4.73(m,1H),4.51(dd,J＝5.2,3.4Hz,1H),4.37-4.34(m,1H),4.23-4.21(m,2H),3.96(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H),3.92-3.91(m,1H),3.70(dd,J＝10.0,3.3Hz,1H),3.63(dd,J＝10.0,7.6Hz,1H),3.31(dd,J＝13.4,9.6Hz,1H),3.24(dd,J＝13.4,3.1Hz,1H).
实施例3 合成GDP-FAmAz
向600μL GDP-FAm(100mM水溶液)中依次加入200μL NaHCO 3(200mM水溶液)，780μL THF(四氢呋喃)和220μL NHS-azide(西安点化科技)(100mM THF溶液)。在室温下搅拌反应过夜，并通过薄层色谱法监测。通过制备型高效液相色谱(Pre-HPLC)纯化，得到白色固体产物(8.7mg，63％)。HRMS(ESI-):C 18H 27N 9O 16P 2(M-H +)计算值686.0978，实测值686.1002。 1H NMR(400MHz,D 2O):δ8.10(s,1H),5.92(d,J＝6.0Hz,1H),4.92(t,J＝7.9Hz,1H),4.78-4.76(m,1H),4.52(dd,J＝5.2,3.4Hz,1H),4.35-4.34(m,1H),4.23-4.21(m,2H),4.00(s,2H),3.87(d,J＝3.2Hz,1H),3.71(dd,J＝8.8,3.9Hz,1H),3.66(dd,J＝10.0,3.3Hz,1H),3.62-3.57(m,2H),3.32(dd,J＝14.0,8.6Hz,1H).
实施例4 合成GDP-FAmP 4Biotin
向500μL GDP-FAm(100mM水溶液)中依次加入500μL NaHCO 3(200mM水溶液)、1.95mL THF和550μL NHS-PEG 4-Biotin(西安点化科技)(100mM THF溶液)。在室温下搅拌反应4h，通过薄层色谱法监测。通过Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(20.5mg，38％)。HRMS(ESI-):C 37H 61N 9O 22P 2S(M-H +)计算值1076.3054,实测值 1076.3068。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.12(s,1H),5.92(d,J＝6.1Hz,1H),4.93(t,J＝7.8Hz,1H),4.78-4.77(m,1H),4.59(dd,J＝7.9,4.6Hz,1H),4.53(dd,J＝5.2,3.4Hz,1H),4.39(dd,J＝7.9,4.4Hz,1H),4.35-4.34(m,1H),4.22(dd,J＝5.4,3.4Hz,2H),3.87(d,J＝3.1Hz,1H),3.76(t,J＝6.3Hz,2H),3.69-3.66(m,14H),3.63-3.60(m,3H),3.59-3.56(m,1H),3.38(t,J＝5.3Hz,2H),3.32-3.26(m,2H),2.97(dd,J＝13.1,5.0Hz,1H),2.77(d,J＝13.0Hz,1H),2.56(t,J＝6.2Hz,2H),2.26(t,J＝7.3Hz,2H),1.74-1.51(m,4H),1.42-1.34(m,2H).
实施例5 合成GDP-FAzP 4Biotin
向400μL GDP-FAz(50mM水溶液)中依次加入400μL CuSO 4/BTTP(5mM/10mM水溶液)、210μL propargyl-PEG 4-Biotin(西安点化科技)(100mM甲醇溶液)和40μL抗坏血酸钠(250mM水溶液)，在室温下搅拌反应5h，通过薄层色谱法监测。然后，加入2mM BCS(2,9-二甲基-4,7-二苯基-1,10-邻二氮杂菲二磺酸二钠盐)淬灭反应。通过Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(14.4mg，60％)。HRMS(ESI-):C 37H 59N 11O 21P 2S(M-H +)计算值1086.3010，实测值1086.3040。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.15(s,1H),8.11(s,1H),5.89(d,J＝6.0Hz,1H),4.94-4.90(m,1H),4.77-4.76(m,1H),4.73-4.68(m,1H),4.65(d,J＝3.1Hz,2H),4.62-4.59(m,1H),4.58-4.56(m,1H),4.53-4.51(m,1H),4.38(dd,J＝8.0,4.4Hz,1H),4.34-4.31(m,1H),4.25-4.16(m,2H),4.05-4.02(m,1H),3.82(s,1H),3.72-3.65(m,14H),3.61(t,J＝5.3Hz,2H),3.37(t,J＝5.2Hz,2H),3.30-3.25(m,1H),2.96(dd,J＝13.1,5.0Hz,1H),2.77-2.72(m,1H),2.24(t,J＝7.3Hz,2H),1.74-1.49(m,4H),1.40-1.32(m,2H).
实施例6 合成GDP-FAmP 4Tz
向200μL GDP-FAm(100mM水溶液)中依次加入200μL NaHCO 3(200mM水溶液),780μL THF以及220μL NHS-PEG 4-Tz(100mM THF溶液)。在室温搅拌反应4h，通过薄层色谱法进行监测。通过Pre-HPLC纯化，得到粉色固体产物(9.9mg，48％)。HRMS(ESI-):C 36H 52N 10O 21P 2(M-H +)计算值1021.2711,实测值1021.2725。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.17-8.13(m,2H),8.00(s,1H),7.06-7.02(m,2H),5.76(d,J＝5.6Hz,1H),4.91(t,J＝7.7Hz,1H),4.67(t,J＝5.4Hz,1H),4.49(dd,J＝5.1,3.7Hz,1H),4.30-4.28(m,1H),4.27-4.25(m,2H),4.21-4.19(m,2H),3.95-3.93(m,2H),3.84-3.83(m,1H),3.80-3.78(m,2H),3.74-3.71(m,2H),3.70-3.57(m,13H),3.51(dd,J＝14.1,4.2Hz,1H),3.24(dd,J＝14.0,8.6Hz,1H),3.00(s,3H),2.49(t,J＝6.3Hz,2H).
实施例7 合成GDP-FAmSucMMAE
合成GDP-FAmSucMMAE的反应路线如下所示：
NH 2-vc-PAB-MMAE的合成参考Tang,F.,et.al报道的方法(Org.Biomol.Chem.2016,14,9501)。
Acid-Suc-vc-PAB-MMAE。将丁二酸酐(120mg，1.12mmol)和NH 2-vc-PAB-MMAE(833mg，0.74mmol)溶于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(15mL)和THF(15mL)溶液中。室温下搅拌5h，期间用薄层色谱法进行监控。经Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(683mg，75％)。HRMS(ESI-):C 62H 98N 10O 15(M-H +)计算值1221.7140，实测值1221.7146。
OSu-Suc-vc-PAB-MMAE。将Acid-Suc-vc-PAB-MMAE(833mg，0.74mmol)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(644mg，5.596mmol)溶于DMF(15mL)和THF(15mL)溶液，搅拌条件下加入EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)(1284mg，6.698mmol)。室温下搅拌反应3h，通过薄层色谱法进行监测。经Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(565mg，77％)。HRMS(ESI+):C 66H 101N 11O 17(M+Na +)计算值1342.7269,实测值1342.7283。
GDP-FAmSucMMAE。将OSu-Suc-vc-PAB-MMAE(346mg，0.262mmol)溶于12mL DMF，搅拌下分别加入400uL DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)和GDP-FAm(190mg，0.315mmol)(溶于30mL水)中。室温搅拌反应5h，期间用薄层色谱法进行监控。经Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(104.3mg，22％)。HRMS(ESI-):C 78H 122N 16O 29P 2((M- 2H+)/2)计算值为903.3947，实测值为903.3959。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ8.16(s,1H),7.48-7.40(m,3H),7.37-7.28(m,5H),7.22-7.14(m,1H),5.9(d,J＝6.0Hz,1H),5.30-5.14(m,1H),5.06-5.00(m,1H),4.76-4.68(m,2H),4.63-4.59(m,1H),4.51-4.49(m,1H),4.46-4.30(m,4H),4.21-4.04(m,6H),3.76-3.63(m,2H),3.57-3.53(m,2H),3.45-3.14(m,14H),3.11-3.05(m,4H),2.94-2.90(m,3H),2.66-2.44(m,6H),2.16-2.01(m,3H),1.94-1.76(m,4H),1.68-1.47(m,4H),1.36-1.14(m,8H),1.06(d,J＝6.6Hz,2H),0.97-0.89(m,10H),0.85-0.77(m,10H),0.66(t,J＝7.8Hz,2H),0.48(d,J＝6.6Hz,1H)。
实施例8 合成GDP-FAmAzP 4MMAE
向200μL GDP-FAmAz(50mM水溶液)中依次加入200μL CuSO 4/BTTP(5mM/10mM水溶液)，210μL propargyl-PEG 4-vc-PAB-MMAE(联宁生物)(50mM甲醇溶液)和20μL抗坏血酸钠(250mM水溶液)，在室温下搅拌反应5h，通过薄层色谱法进行监测。然后，加入2mM BCS淬灭反应。通过Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(16.8mg，82％)。HRMS(ESI+):C 88H 139N 19O 33P 2((M+2Na +)/2)计算值1048.9521,实测值1048.9533。
实施例9 合成GDP-FAmAzP 4DXd
合成GDP-FAmAzP 4DXd的反应路线如下所示：
GGFG-Acid合成参考专利(Yamaguchi,T.,et al.,EP3677589A1)。
Propargyl-PEG 4-GGFG-Acid。向5mL DMF溶解的GGFG-Acid溶液中(98.4mg，0.23mmol)，加入0.2mL DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)和propargyl-PEG 4-OSu(99.6mg，0.28mmol)。在室温下搅拌过夜，通过薄层色谱法进行监测。通过Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(114.8mg，75％)。HRMS(ESI-):C 30H 43N 5O 12(M-H +)计算值664.2835，实测值 664.2808。
Propargyl-PEG 4-GGFG-DXd。向5mL DMF溶解的propargyl-PEG 4-GGFG Acid溶液中(66.6mg，0.1mmol)加入0.1mL DIPEA，依喜替康(43.5mg，0.1mmol)以及PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)(104.9mg，0.2mmol)。在室温下搅拌反应2h，通过薄层色谱法进行监测。通过Pre-HPLC纯化，得到浅黄色固体产物(70.6mg，65％)。HRMS(ESI+):C 54H 63FN 8O 15(M+Na +)计算值1105.4289，实测值1105.4255。
GDP-FAmAzP 4DXd。向200μL GDP-FAmAz(50mM水溶液)中依次加入200μL CuSO 4/BTTP(5mM/10mM水溶液)，210μL propargyl-PEG 4-GGFG-DXd(50mM甲醇溶液)，以及20μL抗坏血酸钠(250mM水溶液)。在室温下搅拌反应5h，通过薄层色谱法进行监测。然后，加入2mM BCS淬灭反应。通过Pre-HPLC纯化，得到白色固体产物(12.1mg，68％)。HRMS(ESI-):C 72H 90FN 17O 31P 2((M-2H +)/2)计算值883.7651，实测值883.7651。 1H NMR(400MHz,D 2O)δ7.97(s,2H),7.21(s,1H),7.11-7.03(m,4H),6.86(d,J＝7.0Hz,2H),5.68(d,J＝5.7Hz,1H),5.59-5.55(m,1H),5.45-5.40(m,1H),5.29-5.25(m,1H),5.20(s,1H),4.95-4.91(m,2H),4.70-4.53(m,7H),4.46(t,J＝4.1Hz,1H),4.37-4.31(m,2H),4.26-4.17(m,4H),3.86-3.57(m,26H),3.34-3.28(m,1H),3.10-3.06(m,1H),2.97-2.88(m,1H),2.78-2.73(m,1H),2.56-2.50(m,3H),2.39-2.29(m,1H),2.09(s,3H),1.93-1.82(m,2H),0.94(t,J＝7.3,3H)。
实施例10 Trastuzumab-G 2F的制备
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度8mg/mL)，UDP-galactose(二磷酸尿苷半乳糖)(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应48h。随后通过protein A树脂(金斯瑞)对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-G 2F(148712Da,>90％)。
Trastuzumab的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
实施例11 Durvalumab-G 2F的制备
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Durvalumab(终浓度8mg/mL)，UDP-galactose(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应48h。随后通过protein A树脂(金斯瑞)对反应 液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Durvalumab-G 2F(149618Da,>90％)。
Durvalumab的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
实施例12 Trastuzumab-(Fucα1,6)(Galβ1,4)GlcNAc的制备
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度5mg/mL)，及EndoS(终浓度0.05mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应1h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-galactose(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应72h。随后通过protein A树脂(金斯瑞)对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(Fucα1,6)(Galβ1,4)GlcNAc(146193Da，>90％)。
实施例13 Trastuzumab-(Fucα1,6)(GalNAzβ1,4)GlcNAc的制备
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度5mg/mL)，及EndoS(终浓度0.05mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应1h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-GalNAz(二磷酸尿苷-N-乙酰叠氮氨基半乳糖)(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应24h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(Fucα1,6)(GalNAzβ1,4)GlcNAc(146373Da,>90％)。
实施例14 Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc的制备
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度5mg/mL)，EndoS(终浓度0.05mg/mL)，以及Alfc(终浓度1.5mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应24h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-GalNAz(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(146077Da,>90％)。
实施例15 Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc的制备
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Durvalumab(终浓度5 mg/mL)，EndoS(终浓度0.05mg/mL)，以及Alfc(终浓度1.5mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应24h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-GalNAz(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(146973Da,>90％)。
实施例16 Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc的制备
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度5mg/mL)，EndoS(终浓度0.05mg/mL)，以及Alfc(终浓度1.5mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应24h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-galactose(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应24h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc(145909Da,>90％)。
实施例17 不同的HpFT将GDP-FAmP 4Biotin转化到Trastuzumab-G 2F的反应效率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-G 2F(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及不同的HpFT酶(HpFT-4HR，HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)，HpFT-6HR，HpFT-3HR，HpFT-2HR，HpFT-1HR，或HpFT-0HR)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应3h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc(N-乙酰-D-乳糖胺)，并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率＝(MAR0峰强度*0+MAR1峰强度*1+MAR2峰强度*2+MAR3峰强度*3+MAR4峰强度*4)/4*(MAR0峰强度+MAR1峰强度+MAR2峰强度+MAR3峰强度+MAR4峰强度)*100％。结果显示在图1中，由其可知，较HpFT-4HR相比，HpFT-3HR，HpFT-2HR，及HpFT-1HR的催化活性均有显著提升。其中HpFT-2HR具有最高的催化活性。
实施例18 不同的HpFT将GDP-FAmP 4Biotin转化到Trastuzumab-(Fucα1,6)(Galβ1,4)GlcNAc的反应效率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab- (Fucα1,6)(Galβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及不同HpFT酶(HpFT-4HR，HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)，HpFT-6HR，HpFT-3HR，HpFT-2HR，HpFT-1HR或HpFT-0HR)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应1h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNA并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率＝(MAR0峰强度*0+MAR1峰强度*1+MAR2峰强度*2)/2*(MAR0峰强度+MAR1峰强度+MAR2峰强度)*100％。结果显示在图2中，由其可知，较HpFT-4HR相比，HpFT-3HR，HpFT-2HR及HpFT-1HR的催化活性均有显著提升。HpFT-0HR与HpFT-4HR相比活性显著下降。HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)和HpFT-6HR与HpFT-4HR相比活性变化并不明显。
实施例19 不同的HpFT将GDP-FAmP 4Biotin转化到Trastuzumab-(Fucα1,6)(GalNAzβ1,4)GlcNAc的反应效率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(Fucα1,6)(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及不同HpFT酶(HpFT-4HR，HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)，HpFT-6HR，HpFT-3HR，HpFT-2HR，HpFT-1HR或HpFT-0HR)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应3h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算方式同实施例18。结果显示在图3中，由其可知，较HpFT-4HR相比，HpFT-3HR，HpFT-2HR，及HpFT-1HR的催化活性均有显著提升。其中HpFT-2HR和HpFT-1HR催化活性相对最高。HpFT-0HR与HpFT-4HR相比活性显著下降。HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)和HpFT-6HR与HpFT-4HR相比活性变化较小。
实施例20 不同的HpFT将GDP-FAmP 4Biotin转化到Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc的反应效率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及不同HpFT酶(HpFT-4HR，HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)，HpFT-6HR，HpFT-3HR，HpFT-2HR，HpFT-1HR或HpFT-0HR)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应 3h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算方式同实施例18。结果显示在图4中，由其可知，较HpFT-4HR相比，HpFT-3HR，HpFT-2HR，及HpFT-1HR的催化活性均有显著提升。其中HpFT-2HR和HpFT-1HR催化活性相对最高。HpFT-0HR与HpFT-4HR相比活性显著下降。HpFT-4HR(M4)，HpFT-4HR(M7)和HpFT-6HR与HpFT-4HR相比活性变化较小。
实施例21 HpFT-4HR和HFT6将GDP-FAmP 4Biotin转移到Trastuzumab-G 2F及Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc上的反应效率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-G 2F或Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-4HR或HFT6(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应6h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。针对Trastuzumab-G 2F的转化率计算同实施例17，针对Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc的转化率计算同实施例18。结果显示在图5中，由其可知，幽门螺杆菌来源的岩藻糖基转移酶HpFT-4HR活性远高于人来源的岩藻糖基转移酶HFT6。在Trastuzumab-G 2F上，HFT6展示出很低的催化活性。而在Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc上，HFT6几乎没有观察到催化活性。值得一提的是，用人来源的岩藻糖基转移酶HFT6在制备抗体偶联物时，由于其低效率很难获得高的转化率，从而难以获得接近理论MAR值的、均一的偶联物，从而限制了其在制备抗体物中的应用。
实施例22 HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmP 4Biotin或GDP-FAzP 4Biotin转化到Trastuzumab-G 2F的反应效率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-G 2F(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin或GDP-FAzP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR或HpFT-4HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应6h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算同实施例17。结果显示在图6(A)中，由其可知，HpFT-2HR与HpFT-4HR相比，其催化GDP-FAmP 4Biotin以及GDP-FAzP 4Biotin转移的活性都有 显著提高。另一方面，HpFT-2HR和HpFT-4HR催化GDP-FAmP 4Biotin转移的活性显著高于其催化GDP-FAzP 4Biotin转移的活性。
实施例23 HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmP 4Biotin或GDP-FAzP 4Biotin转化到Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc的反应速率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmP 4Biotin或GDP-FAzP 4Biotin(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR或HpFT-4HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应6h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算同实施例18。结果显示在图6(B)中，由其可知，HpFT-2HR与HpFT-4HR相比，其催化GDP-FAmP 4Biotin以及GDP-FAzP 4Biotin转移的活性都有显著提高。另一方面，HpFT-2HR和HpFT-4HR催化GDP-FAmP 4Biotin转移的活性显著高于其催化GDP-FAzP 4Biotin转移的活性。
实施例24 HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmSucMMAE转化到Trastuzumab-G 2F或Durvalumab-G 2F的反应速率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-G 2F或Durvalumab-G 2F(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR或HpFT-4HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应3h、6h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算同实施例17。结果显示在图7中，由其可知，较HpFT-4HR，HpFT-2HR催化含有细胞毒素的GDP-FAmSucMMAE转移至Trastuzumab-G 2F(图7A)或Durvalumab-G 2F(图7B)上的活性有极大提高。
实施例25 HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmSucMMAE转化到Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc或Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc的反应速率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc或Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR或HpFT-4HR(终浓度0.5mg/mL)， 并将上述混合液于30℃反应3h、6h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算同实施例18。结果显示在图8中，由其可知，较HpFT-4HR，HpFT-2HR催化含有细胞毒素的GDP-FAmSucMMAE转移至Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(图8A)或Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(图8B)的活性有极大的提升。
实施例26 HpFT-2HR和HpFT-4HR将GDP-FAmSucMMAE转化到Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc的反应速率对比
在40mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc(终浓度2mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR或HpFT-4HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应1h、2h，每组设置三个平行。到达反应时间点后，向反应溶液中加入10mM LacNAc并通过脱盐柱(Zeba TM Spin Desalting Columns/2ml/40K，赛默飞世尔科技)终止反应，最后通过质谱检测，并计算转化率。转化率计算同实施例18。结果显示在图9中，由其可知，较HpFT-4HR，HpFT-2HR催化含有细胞毒素的GDP-FAmSucMMAE转移至Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc的活性有极大的提升。
实施例27 用HpFT-2HR制备Trastuzumab-G 2F-Fuc*抗体偶联物
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-G 2F(终浓度3mg/mL)，GDP-Fuc*(GDP-FAmAz、GDP-FAmP 4Tz、GDP-FAmSucMMAE或GDP-FAmAzP 4DXd)(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应16-48h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，分别显示主峰为Trastuzumab-G 2F-FAmAz(149687Da，MAR 4)、Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz(151032Da，MAR 4)、Trastuzumab-G 2F-FAmSucMMAE(154178Da，MAR 4)及Trastuzumab-G 2F-FAmAzP 4DXd(154017Da，MAR4)。对于Trastuzumab-G 2F-FAmSucMMAE，除了分子量为154178Da的主峰外，还有一个分子量为153414Da的小峰，为vc-PAB部分在质谱分析中断裂所致。类似的碎片峰同时出现在下文中含有vc-PAB部分的抗体偶联物上。
结果显示在图10A-10D中，显示获得的抗体偶联物均具有很好的均一性，MAR均在3.6-4.0之间。
实施例28 使用HpFT-2HR制备Durvalumab-G 2F-Fuc*抗体偶联物
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Durvalumab-G 2F(终浓度3mg/mL)，GDP-Fuc*(GDP-FAmP 4Tz或GDP-FAmAzP 4DXd)(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应24-48h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，分别显示主峰为Durvalumab-G 2F-FAmP 4Tz(151925Da，MAR 4)、Durvalumab-G 2F-FAmAzP 4DXd(154917Da，MAR 4)。对于Durvalumab-G 2F-FAmAzP 4DXd，除了分子量为154917Da的主峰外，还有一个分子量为153590Da的小峰，为一个抗体分子上连接了三分子FAmAzP 4DXd的MAR3产物。结果显示在图10I–10J中，显示获得抗体偶联物均具有很好的均一性，MAR均在3.6-4.0之间。
实施例29 使用HpFT-2HR制备Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-Fuc*(GDP-FAmSucMMAE或GDP-FAzP 4Biotin)(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应2-16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，分别显示主峰为Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(148634Da，MAR 2)、Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAzP 4Biotin(147192Da，MAR 2)。结果显示在图10E-10F中，显示获得抗体偶联物均具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例30 使用HpFT-2HR制备Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc-Fuc*
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-Fuc*(GDP-FAmP 4Tz或GDP-FAmSucMMAE)(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应12-16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，分别显示主峰为Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc-FAmP 4Tz(147228Da，MAR 2)、Trastuzumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(148800Da，MAR 2)。结果显示在图10G和图10N中，显示获得抗体偶联物均具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例31 使用HpFT-2HR制备Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Durvalumab-(GalNAzβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(149703Da，MAR 2)。结果显示在图10H中，显示获得抗体偶联物具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例32 使用HpFT-2HR“一锅法”制备Rituximab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP 4MMAE
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Rituximab(终浓度3mg/mL)，EndoS(终浓度0.05mg/mL)，以及Alfc(终浓度1mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应24h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-galactose(终浓度5mM)，GDP-FAmAzP 4MMAE(终浓度1.5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，以及HpFT-2HR(0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Rituximab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP 4MMAE(148140Da，MAR2)。结果显示在图10K中，显示获得抗体偶联物具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
Rituximab的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
实施例33 使用HpFT-2HR制备Trastuzumab-(GalNH 2β1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度5mg/mL)，EndoS(终浓度0.05mg/mL)，以及Alfc(终浓度1.5mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应24h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-GalNH 2(二磷酸尿苷-2-氨基半乳糖)(终浓度5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，以及BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应48h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，即可所获得修饰后的目标抗体Trastuzumab-(GalNH 2β1,4)GlcNAc。然后，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入上述Trastuzumab-(GalNH 2β1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及 HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(GalNH 2β1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(148632Da，MAR2)。结果显示在图10L中，显示获得抗体偶联物具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例34 使用HpFT-2HR“一锅法”制备Trastuzumab-(GalNAcβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab(终浓度3mg/mL)，EndoS(终浓度0.05mg/mL)，以及Alfc(终浓度1mg/mL)，并将上述混合液于37℃反应24h。然后，向以上反应溶液中依次加入UDP-GalNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺)(终浓度5mM)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1.5mM)，氯化锰(终浓度5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，BGalT1(Y289L)(终浓度0.5mg/mL)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃继续反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(GalNAcβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(148716Da，MAR2)。结果显示在图10M中，显示获得抗体偶联物具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例35 用HpFT-1HR制备Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-1HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应6h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(148634Da，MAR 2)。获得抗体偶联物具有很好的均一性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例36 用HpFT-3HR制备Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE
在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-FAmSucMMAE(终浓度1.5mM)，氯化镁(终浓度20mM)，以及HpFT-3HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应6h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(148634Da，MAR 2)。获得抗体偶联物具有很好的均一 性，MAR在1.8-2.0之间。
实施例37 用Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz制备Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz-TCO-MMAE
在1×PBS(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz(终浓度1mg/mL)，TCO-PEG 4-vc-PAB-MMAE(终浓度0.5mM)(联宁生物)，并将上述混合液于室温反应4h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz-TCO-MMAE(157007Da，DAR 4)。获得抗体偶联物具有很好的均一性，DAR在3.6-4.0之间。
实施例38 用Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz制备Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz-DBCO-MMAE
首先，在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，依次加入Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc(终浓度3mg/mL)，GDP-FAmAz(终浓度1mM)，氯化镁(终浓度5mM)，以及HpFT-2HR(终浓度0.5mg/mL)，并将上述混合液于30℃反应6h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，即可所获得修饰后的目标抗体Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz。
然后，在1×PBS(pH 7.0)缓冲液中，依次加入上述Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(终浓度1mg/mL)，DBCO-PEG 4-vc-PAB-MMAE(终浓度0.5mM)(联宁生物)，并将上述混合液于室温反应16h。随后通过protein A树脂对反应液进行纯化，进而获得修饰后的目标抗体。经质谱鉴定，显示主峰为Trastuzumab-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz-DBCO-MMAE(149705Da，DAR 2)。结果显示在图10O中，显示获得抗体偶联物具有很好的均一性，DAR在1.8-2.0之间。
实施例39 Trastuzumab-G 2F-FAmSucMMAE及Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz-TCO-MMAE在SK-Br-3和MDA-MB-231细胞上的体外药效评价
将SK-Br-3(Her2+)细胞培养在含10％胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养基(Gibco)中，将MDA-MB-231(Her2-)细胞培养在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)中。选取培养状态良好的两种细胞分别种植在96孔板中，每孔细胞数约5000个，接种结束后，将96孔板放置于37℃含5％CO 2的恒温细胞培养箱中培养24h。培养结束后去除96孔板内的培养基，补加200μL添加有药物(Trastuzumab,Trastuzumab-G 2F- FAmSucMMAE,或Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz-TCO-MMAE)的新鲜培养基(终浓度依次为100nM，10nM，1nM，0.05nM，0.1nM，0.05nM，0.01nM，0.001nM和0nM)。加样结束后，将96孔板放回恒温细胞培养箱中继续孵育72h。孵育结束后，利用 Luminescent Cell Viability Assay(Promega)检测试剂盒，检测待测药物对SK-Br-3和MDA-MB-231的杀伤效果。结果显示在图13中，结果表明Trastuzumab-G 2F-FAmSucMMAE和Trastuzumab-G 2F-FAmP 4Tz-TCO-MMAE对SK-Br-3(Her2+)细胞有很强的杀伤效果，而对MDA-MB-231(Her2-)细胞无明显杀伤效果。

Claims (82)

  1. 一种分离的多肽，其包含催化活性区域和1个或多个七肽重复片段，所述催化活性区域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述七肽重复片段包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且在所述分离的多肽中，所述七肽重复片段的数量不超过3个。
  2. 根据权利要求1所述的分离的多肽，在所述多肽中，所述催化活性区域位于所述七肽重复片段的N端。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽，其中所述七肽重复片段的数量为1个。
  4. 根据权利要求3所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽，其中所述七肽重复片段的数量为2个，且所述2个七肽重复片段彼此直接连接。
  6. 根据权利要求5所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
  7. 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽，其中所述七肽重复片段的数量为3个，且所述3个七肽重复片段依次直接连接。
  8. 根据权利要求7所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的分离的多肽，其还包含标签序列。
  10. 根据权利要求9所述的分离的多肽，其中所述标签序列为亲和纯化标签。
  11. 根据权利要求1-10中任一项所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:3-5以及8-10中任一项所示的氨基酸序列。
  12. 一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽。
  13. 载体，其包含权利要求12所述核酸分子的核酸序列。
  14. 细胞，其包含和/或表达权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽，权利要求12所述的核酸分子，和/或权利要求13所述的载体。
  15. 催化制剂，其包含权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽。
  16. 组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽。
  17. 一种转移岩藻糖和/或岩藻糖衍生物的方法，其包括使用权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽，权利要求12所述的核酸分子，权利要求13所述的载体，和/或权利要求14所述的细胞。
  18. 权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽在制备蛋白偶联物中的用途。
  19. 一种制备蛋白偶联物的方法，所述方法包括使用权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽，权利要求12所述的核酸分子，权利要求13所述的载体，权利要求14所述的细胞，和/或权利要求15所述的催化制剂。
  20. 根据权利要求19所述的方法，其包括：
    在权利要求1-11中任一项所述的分离的多肽和/或权利要求15所述的催化制剂存在的条件下，将供体Q-Fuc*与具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白质接触以获得蛋白偶联物，所述蛋白偶联物具有包含式(II)所示结构的糖链：
    -GlcNAc(Fuc) b-GalX，式(I)；
    其中，
    所述GlcNAc为N-乙酰葡糖胺；
    Fuc为岩藻糖，b为0或1；
    GalX为任选被取代的半乳糖；
    Fuc*包含结构Fuco-MOI，其中，Fuco的结构如式(III)所示： MOI为包含活性物质(AM)的目的分子，且所述MOI连接在式(III)左端，Q为二磷酸核糖核苷酸。
  21. 根据权利要求20所述的方法，所述蛋白质包含Fc区和/或抗原结合部分，所述GalX与所述GlcNAc之间通过β-1,4糖苷键连接，所述Fuc与所述GlcNAc之间通过α-1,6糖苷键连接，并且所述Fuc*与所述GlcNAc之间通过α-1,3糖苷键连接。
  22. 根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述GalX为半乳糖。
  23. 根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述GalX为被取代的半乳糖，且所述半乳糖中位于C2、C3、C4和/或C6位置的一个或多个羟基被取代。
  24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述GalX为被取代的半乳糖，且所述半乳糖中位于C2位置的羟基被取代。
  25. 根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述GalX为单糖。
  26. 根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述GalX被取代基Rg 1取代，Rg 1为选自下组的基团：氢、卤素、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH、-CN、C 1-C 24烷基、C 3-C 24环烷基、C 2-C 24烯基、C 5-C 24环烯基、C 2-C 24炔基、C 7-C 24环炔基、C 2-C 24(杂)芳基、C 3-C 24烷基(杂)芳基，和C 3-C 24(杂)芳基烷基；
    其中，所述烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和/或(杂)芳基烷基各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 1取代，和/或各自独立地 任选被一个或多个取代基Rs 2间隔；
    其中，每个所述Rs 1各自独立地为选自下组的基团：卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH和-CN；
    每个所述Rs 2各自独立地为选自下组的基团：-O-、-S-、 其中，所述Rs 3为选自下组的基团：氢、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基，其中所述C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基任选地被取代。
  27. 根据权利要求23-25中任一项所述的方法，所述GalX被取代基 取代，
    其中：
    t为0或1；
    Rg 2为选自下组的基团：C 1-C 24亚烷基、C 3-C 24亚环烷基、C 2-C 24亚烯基、C 5-C 24亚环烯基、C 2-C 24亚炔基、C 7-C 24亚环炔基、C 2-C 24(杂)亚芳基、C 3-C 24烷基(杂)亚芳基和C 3-C 24(杂)芳基亚烷基，其中，所述亚烷基、亚环烷基、亚烯基、亚环烯基、亚炔基、亚环炔基、(杂)亚芳基、烷基(杂)亚芳基和/或(杂)芳基亚烷基各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 1取代，和/或各自独立地任选被一个或多个取代基Rs 2间隔，所述Rg 3为选自下组的基团：氢、卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH、-CN、C 1-C 24烷基、C 3-C 24环烷基、C 2-C 24烯基、C 5-C 24环烯基、C 2-C 24炔基、C 7-C 24环炔基和C 2-C 24(杂)芳基，其中所述烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基和/或(杂)芳基各自独立地任选被一个或多个Rs 1取代，
    其中，
    每个所述Rs 2各自独立地选自-O-、-S-、 所述Rs 3为选自下组的基团：氢、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基，其中所述C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基和C 3-C 24环烷基任选地被取代，且
    每个所述Rs 1各自独立地为选自下组的基团：卤素、-OH、-NH 2、-SH、-N 3、-COOH和-CN。
  28. 根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述式(I)中的GlcNAc与所述蛋白质 中的天冬酰胺残基直接连接。
  29. 根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的糖链中包含甘露糖，且所述式(I)中的GlcNAc与所述糖链中的甘露糖直接连接。
  30. 根据权利要求20-29中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含Fc区，且所述糖链与所述Fc区的天冬酰胺残基连接。
  31. 根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含Fc区，且所述糖链与所述Fc区中CH 2结构域的天冬酰胺残基连接。
  32. 根据权利要求20-31中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含Fc区，且所述糖链连接于所述Fc区的N297位置，其中所述位置根据Kabat中的EU索引编号确定。
  33. 根据权利要求20-32中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白。
  34. 根据权利要求20-33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是单克隆抗体。
  35. 根据权利要求20-34中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是IgG抗体。
  36. 根据权利要求20-35中任一项所述的方法，其中所述Q为二磷酸鸟苷(GDP)、二磷酸尿苷(UDP)和/或二磷酸胞苷(CDP)。
  37. 根据权利要求20-36中任一项所述的方法，其中所述Q为二磷酸鸟苷(GDP)。
  38. 根据权利要求20-37中任一项所述的方法，其中所述活性物质AM包含生物活性物质、药学活性物质、化学反应活性物质和/或酶反应活性物质。
  39. 根据权利要求20-38中任一项所述的方法，其中所述活性物质AM为化学反应活性物质和/或酶反应活性物质。
  40. 根据权利要求20-39中任一项所述的方法，其中所述活性物质AM为功能基团X 1，且X 1包含能够参与生物正交连接反应的功能官能团。
  41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述能够参与生物正交连接反应的功能官能团选自下组中的一种或多种：叠氮基、末端炔基、环炔基、四嗪基、1,2,4-三嗪基、末端烯基、环烯基、酮基、醛基、羟胺基、巯基、马来酰亚胺基以及它们的功能性衍生物。
  42. 根据权利要求40-41中任一项所述的方法，其中所述能够参与生物正交连接反应的功能官能团选自下组中的一种或多种：
  43. 根据权利要求20-38中任一项所述的方法，其中所述活性物质AM为生物活性物质和/或药学活性物质P 1。
  44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述活性物质AM为药学活性物质P 1。
  45. 根据权利要求43-44中任一项所述的方法，其中所述P 1包含选自下组中的一种或多种物质：细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素、放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸和多肽。
  46. 根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述P 1包含细胞毒素。
  47. 根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中所述P 1包含细胞毒素，且所述细胞毒素选自下组中的一种或多种：DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和微管蛋白抑制剂。
  48. 根据权利要求43-47中任一项所述的方法，其中所述P 1包含细胞毒素，且所述细胞毒素选自下组中的一种或多种：吡咯并苯二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)及其衍生物、奥瑞他汀(auristatin)及其衍生物、美登木素(maytansinoids)及其衍生物、杜卡霉素(duocarmycin)及其衍生物、tubulysin及其衍生物、烯二炔(enediyene)及其衍生物、阿霉素(doxorubicin)及其衍生物、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂(pyrrole-based kinesin spindle protein inhibitor)及其衍生物、卡奇霉素(calicheamicin)及其衍生物、鹅膏蕈碱(amanitin)及其衍生物和喜树碱(camptothecin)及其衍生物。
  49. 根据权利要求43-48中任一项所述的方法，其中所述P 1包含细胞毒素，且所述细胞毒素选自下组中的一种或多种：MMAE和DXd。
  50. 根据权利要求20-49中任一项所述的方法，其中所述MOI还包含连接子L，所述L用于将所述AM与所述Fuco相连。
  51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述连接子L具有结构J-(Sp) n，其中n为0或1，J为结合子，Sp为间隔子，且所述J与所述Fuco直接连接。
  52. 根据权利要求51所述的方法，其中所述J为选自下组的结构： 其中Rf为-CH 2-、-NH-或-O-，其中前述结构的左端与所述Fuco直接连接。
  53. 根据权利要求51-52中任一项所述的方法，其中所述J为 且其左端与所述Fuco直接连接。
  54. 根据权利要求51-52中任一项所述的方法，其中所述J为 且其左端与所述Fuco直接连接。
  55. 根据权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述间隔子Sp包含可裂解部分。
  56. 根据权利要求55所述的方法，其中所述可裂解部分选自下组中的一种或多种：酸不稳定可裂解部分、氧化还原活性可裂解部分、光活性可裂解部分和蛋白酶水解可裂解部分。
  57. 根据权利要求55-56中任一项所述的方法，其中所述可裂解部分选自下组中的一种或多种：vc-PAB和GGFG。
  58. 根据权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述间隔子Sp不包含可裂解部分。
  59. 根据权利要求20-58中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*为Q-Fuco-L-AM。
  60. 根据权利要求20-59中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*为Q-Fuco-J-(Sp) n-AM，其中n为0或1。
  61. 根据权利要求20-42和50-60中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*为Q-Fuco-J-(Sp) n-X 1，n为0或1。
  62. 根据权利要求20-38和43-60中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*为Q-Fuco-J-(Sp) n-P 1，n为0或1。
  63. 根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中n为1。
  64. 根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中n为0。
  65. 根据权利要求20-64中任一项所述的方法，所述GalX选自下组：
  66. 根据权利要求20-65中任一项所述的方法，其中获得的所述蛋白偶联物包含1至20个式(II)所示的结构。
  67. 根据权利要求20-66中任一项所述的方法，其中获得的所述蛋白偶联物包含2个或4个式(II)所示的结构。
  68. 根据权利要求20-27和29-67中任一项所述的方法，其中所述蛋白偶联物包含4个式 (II)所示的结构。
  69. 根据权利要求68所述的方法，其中获得的所述蛋白偶联物的结构如式(IV)所示：
    其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
  70. 根据权利要求69所述的方法，其还包括下述步骤：
    使具有G 0(F) 0,1，G 1(F) 0,1和/或G 2(F) 0,1糖型的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白，该蛋白的结构如式(V)所示：
    其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
  71. 根据权利要求69所述的方法，其还包括下述步骤：
    使具有G 0(F) 0,1糖型的包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白，该蛋白的结构如式(V)所示：
    其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖， 为甘露糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，c为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
  72. 根据权利要求20-28和30-67中任一项所述的方法，其中所述蛋白偶联物包含2个式(II)所示的结构。
  73. 根据权利要求72所述的方法，其中所述蛋白偶联物的结构如式(VI)所示：
    其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
  74. 根据权利要求73所述的方法，其还包括下述步骤：
    用内切糖苷酶处理包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，得到经处理的所述包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白；
    使所述经处理的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的蛋白，该蛋白的结构如式(VII)所示
    其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为所述任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0或1，且所述糖链连接在所述含有Fc区抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
  75. 根据权利要求73所述的方法，其还包括下述步骤：
    用内切糖苷酶和α1,6岩藻糖苷酶处理包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，得到经处理的所述包含Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白；
    使所述经处理的抗体和/或Fc融合蛋白在合适的催化剂存在的条件下与UDP-GalX接触，以获得具有包含式(I)所示结构的糖链的糖蛋白，该糖蛋白的结构如式(VII)所示
    其中， 为N-乙酰葡糖胺， 为岩藻糖，GalX为任选被取代的半乳糖， 为含有Fc区的抗体和/或Fc融合蛋白，b为0，且所述糖链连接在所述含有Fc区抗体和/或Fc融合蛋白的Fc区。
  76. 根据权利要求40-42，50-61和63-75中任一项所述的方法，其还包括下述步骤：使所获得的蛋白偶联物与Y 1-L’-P 1’反应，以获得包含生物活性物质和/或药学活性物质P 1'的蛋白偶联物，其中所述Y 1是能够与所述X 1发生连接反应的官能团，L'为连接子。
  77. 通过权利要求20-76中任一项所述的方法制备得到的蛋白偶联物。
  78. 根据权利要求77所述的蛋白偶联物，其MAR在约3.2-4.0之间或约1.6-2.0之间。
  79. 组合物，其包含一种或多种权利要求77-78中任一项所述的蛋白偶联物。
  80. 根据权利要求79所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
  81. 预防、缓解和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求77-78中任一项所述的蛋白偶联物，和/或权利要求79-80中任一项所述的组合物。
  82. 权利要求77-78中任一项所述的蛋白偶联物和/或权利要求79-80中任一项所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
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