CN103201380A - 新岩藻糖基转移酶及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自Akkermansia muciniphila和来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的编码/表示新的α-1，3-岩藻糖基转移酶的核酸序列和氨基酸序列。本发明还提供利用所述α-1，3-岩藻糖基转移酶产生岩藻糖基化的产物的用途和方法，所述岩藻糖基化的产物诸如寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂，特别是3-岩藻糖基乳糖。
Description
本发明涉及新岩藻糖基转移酶及它们的应用。
多种(糖)蛋白、(糖)脂或寡糖为了展现特定的生物活性需要存在特定的岩藻糖基化的结构。例如，多种细胞内识别机制需要岩藻糖基化的寡糖：例如，为了被细胞粘附分子(诸如L-选凝素)结合，特定的细胞结构必须包括岩藻糖基化的糖类。关于具有生物功能的岩藻糖基化的结构的另一个实例是形成ABO血型系统的结构。此外，治疗性(糖)蛋白代表着最快速发展的一类药物试剂，其中，其药物代谢动力学特性和稳定性归因于它们的聚糖。
由于其复杂的性质和固有的化学特性，糖缀合物的化学合成是一种大的挑战并且与巨大的困难相关。与蛋白和核酸不同(它们的自动化合成仪可商购得到)，聚糖-姑且不说糖缀合物-(尚且)不能使用一般的商购系统合成。除了对控制立体化学的需要之外，形成特定的连接也是困难的。
考虑到与糖缀合物的化学合成或组合的酶/化学合成相关的复杂性，最近的方法已经使用糖基转移酶来酶促合成包含寡糖残基的(糖)蛋白和(糖)脂。
岩藻糖基转移酶，其属于糖基转移酶的酶家族，在脊椎动物、无脊椎动物、植物和细菌中广泛表达。它们催化来自供体(通常是鸟苷-二磷酸岩藻糖(GDP-岩藻糖))的岩藻糖残基转移到接受体上，接受体包括寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂。这样岩藻糖基化的接受体底物参与多种生物学和病理学过程。
已经鉴定了一些岩藻糖基转移酶，例如，在细菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中，在哺乳动物，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)和曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)中，以及在植物中，由此，基于岩藻糖添加的位点，岩藻糖基转移酶分类成α1，2，α1，3/4和O-岩藻糖基转移酶。
在哺乳动物中，GDP-岩藻糖在细胞质中通过从头合成和补救途径合成。通过从头合成，GDP-甘露糖通过两种酶转化为GDP-岩藻糖。而补救途径利用游离的胞质岩藻糖作为底物。在细胞中，GDP-岩藻糖集中在囊泡中，并且被岩藻糖基转移酶识别为供体底物。
由于许多商业重要性的寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂的生物活性取决于特定的岩藻糖残基的存在，本领域对于有效合成或制备具有需要的寡糖残基的糖缀合物存在需求。
因此，本发明的一个目的是提供这样的工具和方法，通过其可以以有效、节约时间和成本的方式制备岩藻糖基化的底物，产生大量的所需要的底物。
根据本发明，这一目的特别是通过提供一种编码具有α-1，3岩藻糖基转移酶活性的多肽并且包含选自由下列各项组成的组的序列或由选自由下列各项组成的组的序列组成的分离的多核苷酸：
a)所附序列表中的SEQ ID Nos.1，3或5；
b)与SEQ ID Nos.1，3或5互补的核酸序列；
c)在严格条件下与a)和b)中定义的核酸序列杂交的核酸序列或它们的互补链。
本发明所述的多核苷酸表示物种Akkermansia muciniphila和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的岩藻糖基转移酶，其中SEQ ID No.1表示新鉴定的Akkermansia muciniphila的岩藻糖基转移酶的多核苷酸序列，其中SEQ ID Nos.3和5表示两种新鉴定的脆弱拟杆菌的岩藻糖基转移酶的多核苷酸序列。
由于通过使用新鉴定的岩藻糖基转移酶，可以进行天然不发生的反应，所以，新鉴定的岩藻糖基转移酶具有令人吃惊的作用：在本发明的范围内，已经发现上述鉴定的α-1，3岩藻糖基转移酶能够利用乳糖作为底物，并且能够产生岩藻糖基化的寡糖，特别是3-岩藻糖基乳糖。迄今为止，还没有任何一种已知的从细菌分离的α-1，3岩藻糖基转移酶显示是利用乳糖作为天然底物用以产生岩藻糖基乳糖。因此，新鉴定的岩藻糖基转移酶用于产生岩藻糖基化的寡糖的适用性是非常令人惊讶的，并且因此，其应用代表一种优异的工具，用以容易、高效和成本节约地产生例如人乳寡糖(HMOs)诸如岩藻糖基乳糖。目前，已经在结构上表征了超过80种属于HMOs的化合物；它们代表一类作用为益生元的复杂寡糖。另外，HMO与上皮表位的结构同源性解释了针对细菌病原体的保护特性。在婴儿的胃肠道中，HMOs选择性供养选定的细菌菌株的生长，并且因此在母乳喂养的婴儿中引发独特的肠道小型生物群的生长。
由于直到现在，这些寡糖的结构复杂性已然阻碍其合成生产，HMOs的主要来源仍然是人乳。因此，对于容易不费力可获得的HMOs存在需求，其可以通过利用本文所述的令人惊讶地适用的岩藻糖基转移酶来提供。
按照本发明，术语“多核苷酸”一般是指任意的多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者是修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括，但不限于，单链和双链DNA，作为单链和双链区的混合物或单链、双链和三链区的混合物的DNA，单链和双链的RNA，和作为单链和双链区的混合物的RNA，包含可以是单链、或更典型地是双链或三链区、或是单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂种分子。另外，“多核苷酸”用在本文中是指包含RNA或DNA或包含RNA和DNA二者的三链区。在该区域中的链可以是来自相同的分子或来自不同的分子。该区域可以包括一种或多种分子的全部，但是更典型地仅包括一些分子的区域。三螺旋区分子中的一种通常是寡核苷酸。当用于本文时，术语“多核苷酸”还包括包含一个或多个修饰的碱基的上述DNAs或RNAs。因此具有由于稳定性或由于其他原因而修饰的主链的DNAs或RNAs是“多核苷酸”，如该术语在本文中的用意。并且，包含不常见的碱基诸如肌苷或修饰的碱基如三苯甲基化的碱基(仅举两例)的DNAs或RNAs是多核苷酸，如该术语在本文中所用。应该理解，已经对DNA和RNA进行了用于本领域技术人员已知的多种有用的目的的很多种修饰。术语“多核苷酸”用在本文中包括多核苷酸的这样化学、酶促或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式，所述细胞包括，例如简单细胞和复杂细胞。此外，“多核苷酸”还包括通常称为寡核苷酸的短的多核苷酸。
“多肽”是指包含两个以上通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸的任意的肽或蛋白。“多肽”是指短链(通常称为肽、寡肽和寡聚物)和较长链(通常称为蛋白)二者。多肽可以包含除20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)修饰的那些，也包括通过化学修饰技术修饰的那些。这样的修饰在基础教科书和更详细的专著中以及多卷研究文献中充分描述，并且其对于本领域技术人员是公知的。应该理解，在给定的多肽中，相同类型的修饰可以以相同的程度或不同的程度存在于给定多肽中的数个位点上。此外，给定的多肽可以包含多种类型的修饰。修饰可以在多肽的任意位置发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。修饰包括，例如，乙酰化作用、酰化作用、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素结构部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化作用、形成共价交联、形成焦谷氨酸、甲酰化作用、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化作用、氧化作用、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化作用、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化作用、羟基化和ADP-核糖基化、硒化(selenoylation)、转移RNA介导的向蛋白添加氨基酸，诸如精氨酸化，和泛蛋白化。多肽可以是分支的或有或无分支的环状的。环状、分支的和分支环状的多肽可以由天然翻译后过程形成，并且也可以通过完全合成法制得。
“分离的”意指“通过人工”由其天然状态改变，即，如果其天然存在，则其已经由其原始环境改变或从其原始环境中移出，或者二者。例如，天然存在于活的生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质分开的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，如该术语在本文中所用。类似地，“合成的”序列，如该术语在本文中所用，意指合成产生而不是从天然来源直接分离的任意序列。“重组”意指通过将来自一种物种的基因移植或剪接到不同物种的宿主生物体的细胞中而制备的遗传改造的DNA。所述DNA变成宿主遗传组成的一部分并且进行复制。
术语“编码多肽的多核苷酸”用在本文中包括这样的多核苷酸，其包括编码本发明的多肽的序列，特别是编码具有SEQ ID Nos.2，4和6所示的氨基酸序列的α-1，3-岩藻糖基转移酶的序列。该术语还包括这样的多核苷酸，其包括编码多肽的单一连续区域或不连续区域(例如，通过整合的噬菌体或插入序列或编辑而打断)以及还可以包含编码和/或非编码序列的另外的区域。
“变体”作为术语用在本文中，是分别与参照多核苷酸或多肽不同但是保留基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸变体在核苷酸序列上与另一种参照多核苷酸不同。变体的核苷酸序列中的变化可以改变或可以不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可以导致由参照序列编码的多肽的氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短，如下文所讨论那样。典型的多肽变体在氨基酸序列上与另一种参照多肽不同。通常，不同有限制，以使参照多肽和变体的序列整体上紧密相似，并且在许多区域中是相同的。变体和参照多肽可以在氨基酸序列上通过任意组合的一个或多个置换、添加、缺失而不同。置换或插入的氨基酸残基可以是可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者其可以是不是已知天然存在的变体。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可以通过诱变技术、通过直接合成和通过本领域技术人员已知的其他重组方法制得。
术语“α-1，3-岩藻糖基转移酶或岩藻糖基转移酶”或编码“α-1，3-岩藻糖基转移酶或岩藻糖基转移酶”的核酸/多核苷酸是指催化来自供体底物例如GDP-岩藻糖的岩藻糖以α-1，3-连接转移到接受体分子上的糖基转移酶。接受体分子可以是糖(carbohydrate)、寡糖、蛋白或(糖)蛋白、或脂质或(糖)脂，并且可以是例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖或它们的任意组合。在本发明的范围内，这些术语还包括核酸/多核苷酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和种间同系物，其具有与由选自SEQ ID Nos.1，3或5的核酸编码的多肽、或与选自SEQ ID Nos.2，4或6的氨基酸序列优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多个氨基酸的区域具有超过约60％的氨基酸序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
另外，α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽可以通过添加或缺失肽序列而改变，从而改变其活性。例如，多肽序列可以与α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽融合，从而实现另外的酶活性。备选地，可以删除氨基酸，从而去除或改变蛋白的活性。蛋白可以被修饰以缺失α-1，3-岩藻糖基转移酶的酶活性但是在结构上仍然保留其三维结构。这样的修饰有效用于开发针对α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽的抗体。
另外，α-1，3-岩藻糖基转移酶基因产物可以包括代表功能等价的基因产物的蛋白或多肽。所述等价的α-1，3-岩藻糖基转移酶基因产物可以在由上述α-1，3-岩藻糖基转移酶基因序列编码的氨基酸序列内包含氨基酸残基的缺失、添加或置换，但是其导致沉默改变，因此产生功能等价的α-1，3-岩藻糖基转移酶基因产物。氨基酸置换可以基于所涉及的残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；平面中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本发明的情形中，“功能等价物”，用在本文中是指能够展现与由上述α-1，3-岩藻糖基转移酶基因序列编码的内源性α-1，3-岩藻糖基转移酶基因产物基本相似的体内活性的多肽，这通过多种标准判断，包括但不限于，抗原性，即，与抗-α-1，3-岩藻糖基转移酶抗体结合的能力，免疫原性，即，产生能够结合α-1，3-岩藻糖基转移酶蛋白或多肽的抗体的能力，以及酶活性。
α-1，3-岩藻糖基转移酶蛋白、多肽以及在翻译过程中或之后差异性修饰的衍生物(包括片段)也在本发明的范围之内。此外，非典型氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为置换或添加引入到α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽序列中。
使用本领域公知的技术通过重组DNA技术可以产生α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽。本领域技术人员公知的方法可以用来构建包含α-1，3-岩藻糖基转移酶编码序列和适当的转录翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约(1989)中所述的技术。
“寡糖”作为术语用在本文中并且按本领域常规理解，是指包含少量、典型地为三个至十个简单糖(即，单糖)的糖类聚合物。
按照本发明的另一个方面，提供包含如上文给出的编码具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸序列的载体，其中所述核酸序列可操作地与由转化该载体的宿主细胞识别的控制序列连接。在一个特别优选的实施方案中，所述载体是表达载体，并且按照本发明的另一个方面，所述载体可以以质粒、黏端质粒、噬菌体、脂质体或病毒的形式存在。
对于重组生产，宿主细胞可以被遗传改造以包含表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。向宿主细胞中引入多核苷酸可以通过多种标准实验室手册中所述的方法实现，所述标准实验室手册诸如Davis等，BasicMethods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)，(1986)，和Sambrook等，1989，同前所述。
因此，本发明所述的多核苷酸可以例如包含在载体中，所述载体将稳定转化/转染到宿主细胞中。在所述载体中，本发明的多核苷酸处在例如可诱导的启动子的控制下，以使所述基因/多核苷酸的表达可以被特异性靶向，并且如果需要，所述基因可以以这种方式过量表达。
很多种表达系统可以用来产生本发明的多肽。所述载体特别包括染色体、附加体或病毒来源的载体，例如，来源于细菌质粒的载体，来源于噬菌体的载体，来源于转座子的载体，来源于酵母附加体的载体，来源于插入元件的载体，来源于酵母染色体元件的载体，来源于病毒的载体，和来源于它们的组合的载体，诸如来源于质粒和噬菌体遗传元件的那些，诸如黏端质粒和噬菌粒。表达系统构建体可以包含调节以及引起表达的控制区。在这一点上，通常，适于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任意系统或载体可以用于表达。适当的DNA序列可以通过多种公知的常规技术中的任一种插入到表达系统中，所述技术诸如例如Sambrook等(见上文)中所述的那些技术。
因此，本发明还涉及一种具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的分离的多肽，所述多肽由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成：
(a)SEQ ID NO：2，4或6所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2，4或6所示的氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中所述等位基因变体由在严格条件下与SEQ ID Nos.1，3或5所示的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；
(c)SEQ ID No.2，4或6所示的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中所述直向同源物由在严格条件下与SEQ ID Nos.1，3或5所示的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；和
(d)SEQ ID No.2，4或6所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含至少10个连续的氨基酸，并且其中所述片段具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性。
术语“严格条件”是指探针与其靶标子序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情形中是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。通常，这样选择严格条件：在限定的离子强度和pH，低于特定序列的热解链点(Tm)约15C。Tm是与靶序列互补的探针有50％与靶序列平衡杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。示例性的严格杂交条件可以如下述：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，在42C温育，或者，5x SSC，1％SDS，在65C温育，洗涤是在0.2x SSC和0.1％SDS中在65C进行。
此外，本发明涉及包含上文定义的载体的宿主细胞，特别是选自由真菌(包括酵母)、细菌、昆虫、动物和植物细胞组成的组的宿主细胞。如果所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，则其是特别优选的。
当用在本文中时，术语“宿主细胞”目前定义为已经转化或转染外源多核苷酸序列或者能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。
多种宿主-表达载体系统可以用来表达本发明的α-1，3-岩藻糖基转移酶基因编码序列。所述宿主-表达系统表示可以产生目的编码序列并且随后纯化的载体(vehicles)，还表示当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，在原位展示本发明的α-1，3-岩藻糖基转移酶基因产物的细胞。
例如，多种适当的表达系统和宿主可以在WO98/55630中找到，其涉及由幽门螺杆菌分离的岩藻糖基转移酶，其公布明确引用在本文中。
按照本发明的另一个方面，编码具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸适应相应细胞的密码子应用。
本发明涉及用于产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂的方法，所述方法包括下述步骤：
a.提供本发明所述的具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽，
b.使包含含有岩藻糖残基的供体底物和接受体底物(包含单糖或寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂)的混合物与步骤a所述的具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽在所述多肽催化来自所述供体底物的岩藻糖残基转移到所述接受体底物上的条件下接触，由此产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂。
按照本发明，用于产生岩藻糖基化的寡糖的方法可以在不含细胞的系统中或在包含细胞的系统中进行。允许底物与α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽反应足够的时间并且在足以允许形成酶产物的条件下反应。应该理解，这些条件将取决于底物和酶的量和纯度、系统是不含细胞的还是基于细胞的系统而变化。本领域技术人员能够容易地调整这些变量。
在不含细胞的系统中，本发明的多肽、接受体底物、供体底物以及根据具体情况而定的其他反应混合物成分(包括其他的糖基转移酶和辅助酶)通过混合在水性反应介质中而组合。酶可以在溶液中游离使用，或者可以结合或固定在支持物如聚合物上，底物可以添加到所述支持物上。例如，支持物可以填充在柱子中。
用于合成岩藻糖基化的寡糖的包含细胞的系统可以包括重组修饰的宿主细胞。
因此，本发明还涉及一种用于产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂的方法，所述方法包括下述步骤：
a.在允许产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂并且允许表达具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的适当的营养条件下，生长上文所述的宿主细胞；
b.在步骤a同时或之后提供包含岩藻糖残基的供体底物和包含寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂的接受体底物，以使在所述宿主细胞中表达的α-1，3-岩藻糖基转移酶催化来自所述供体底物的岩藻糖残基转移到接受体底物上，由此产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂；和
c.从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离所述岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
在本发明所述的方法中，所述供体底物可以是GDP-岩藻糖。如果所述供体底物是GDP-岩藻糖，则其是特别优选的。
按照本发明的一个方面，所述接受体底物选自N-乙酰葡糖胺、N-乙酰乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖或它们的任意组合。特别地，乳糖作为接受体底物是优选的。
术语“底物”用在本文中意指可以被本发明的多肽作用产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂的任意物质或不同物质的组合。
允许底物与α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽反应足够的时间并且在足以允许形成酶产物的条件下反应。这些条件将取决于底物和酶的量和纯度、系统是不含细胞的还是基于细胞的系统而变化。本领域技术人员能够容易地调整这些变量。
按照本发明所述的方法的一个方面，通过使其在宿主细胞内产生的方式在步骤b中提供供体底物。为做到此，在宿主细胞中同时表达例如将添加到宿主细胞中的岩藻糖转化为GDP-岩藻糖的酶。该酶可以是，例如，双官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如来自脆弱拟杆菌的Fkp，或是一种分离的岩藻糖激酶连同一种分离的岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的组合，如已知它们来自一些物种，包括智人(Homo sapiens)、猪(Sus scrofa)和褐家鼠(Rattus norvegicus)。
备选地，在步骤b中，所述供体底物可以添加在培养基中/宿主细胞中或者通过细胞自身代谢产生。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法包括下述步骤：
a)在适当的营养条件下生长通过转化或转染包含选自下列各项的核酸序列的宿主细胞：i)所述的序列表中的SEQ-ID-No.1，3或5，ii)与SEQ ID No.1，3或5互补的核酸序列，和iii)在严格条件下与i)和ii)中定义的核酸序列杂交的核酸序列或它们的互补链，以使选自i)、ii)和iii)的核酸序列表达为具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的肽；
b)在步骤a同时或之后提供包含岩藻糖残基的供体底物和包含寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂的接受体底物，以使在所述宿主细胞中表达的α-1，3-岩藻糖基转移酶催化来自所述供体底物的岩藻糖残基转移到所述接受体底物上，由此产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂；和
c)从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离所述岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
在本发明所述的方法中，在宿主细胞中表达的肽展示α-1，3-岩藻糖基转移酶活性，并且因此将来自供体(例如，鸟苷-二磷酸岩藻糖(GDP-岩藻糖))的岩藻糖残基转移到接受体上，所述接受体包括寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂。以这种方式，这样被岩藻糖基化的接受体底物可以用作食品添加剂，用于婴儿食品的补充物，或者作为治疗性或药物活性化合物。利用新型的方法，可以容易地且有效地提供岩藻糖基化的产物，无需复杂的、费时且费成本的合成方法。
当用于本文时，术语“分离的”意指从基因表达系统收获、收集或分隔通过本发明所述的α-1，3-岩藻糖基转移酶产生的产物。
因此，本发明还涉及通过本发明所述的方法得到的岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂，以及上述多核苷酸、载体或多肽用于生产岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的用途。
按照另一个实施方案，所述岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的产生通过异源或同源表达编码α-1，3岩藻糖基转移酶的多核苷酸的方式进行。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语通常具有本发明所属领域的普通技术人员常规理解的相同意思。通常，本文所用的命名法和上述以及下述在细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤是本领域公知且常规使用的那些。标准的技术用于核酸和肽的合成。通常，酶反应和纯化步骤按照供应商的说明书进行。
本发明还涵盖本文公开的多核苷酸序列的片段。
其他的优点见于实施方案和附图的描述。
无需说明的是，上述特点和在下文中仍要解释的特点不仅以各自指明的组合使用，而且以其他组合或其自身使用，而不背离本发明的范围。
本发明的一些实施方案在附图中举例说明并且在下述描述中更详细地解释。在附图中：
图1显示在大肠杆菌JM109(DE3)中来自pDEST14-amuc0760co的Amuc0760co表达；将来自粗提物的15μg可溶蛋白在15％SDS-PAGE上分离，并且用考马斯亮蓝染色；
图2显示通过蛋白质印迹检测His-标记的Amuc0760co；
图3显示pDEST14-amuc0760co的载体图谱，即，通过Gateway-反应将编码新α-1，3-岩藻糖基转移酶Amuc0760co的密码子优化的基因amuc0760co克隆到pDEST14(Invitrogen)中(A)；pDEST14-fucT6的载体图谱，即，通过Gateway-反应将来自脆弱拟杆菌的编码新α-1，3-岩藻糖基转移酶FucT6的基因fucT6克隆到pDEST14(Invitrogen，德国)中(B)；和pDEST14-fucT7的载体图谱，即，通过Gateway-反应将来自脆弱拟杆菌的编码新α-1，3-岩藻糖基转移酶FucT7的基因fucT7克隆到pDEST14(Invitrogen，德国)中(C)。
图4显示pACYC-amuc0760co的载体图谱，即，将编码新α-1，3-岩藻糖基转移酶Amuc0760co的密码子优化的基因amuc0760co克隆到pACYCDuet-1(Novagen，通过NcoI/PstI)中(A)；pACYC-fucT6的载体图谱，即，将来自脆弱拟杆菌的编码新α-1，3-岩藻糖基转移酶FucT6的密码子优化的基因fucT6通过NcoI/BamHI克隆到pACYCDuet-1(Novagen，UK)中(B)；和pACYC-fucT7的载体图谱，即，将来自脆弱拟杆菌的编码新α-1，3-岩藻糖基转移酶FucT7的密码子优化的基因fucT7通过NcoI/EcoRI克隆到pACYCDuet-1(Novagen，UK)中(C)。
图5显示基因amuc0760co和蛋白Amuc0760co的DNA序列和氨基酸序列；
图6显示基因fucT6和蛋白FucT6的DNA序列和氨基酸序列；
图7显示基因fucT7和蛋白FucT7的DNA序列和氨基酸序列；
图8显示使用薄层层析(移动相丁醇/丙酮/乙酸/水(35/35/7/23))和二苯胺苯胺染色溶液(2％二苯胺，2％苯胺，10％磷酸，在甲醇中)通过BioGel P-2凝胶渗透层析分析3-岩藻糖基乳糖纯化；和
图9显示HPLC色谱；通过Phenomenex Rezex RCM Ca2+柱分离，用水作为洗脱剂(在80℃0.6ml/min30分钟)，并且通过折射率检测器(Shimadzu，德国)检测(A)；和HPLC色谱；通过Dionex CarboPac PA1柱分离，用50mM NaOH作为洗脱剂(在30℃1ml/min30分钟)，并且通过电化学检测器DECADE II(Antec Leyden，Netherlands)检测(B)。
实施例
基因的克隆
将编码岩藻糖基转移酶Amuc0760的基因密码子优化并且通过GenScript，Piscataway，新泽西(USA)合成。使用编码用于Gateway-克隆的attB-位点的两个侧连序列(5’-序列：GGGGACAAGTTTGTACAAAAA-AGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACC(SEQ ID No.7)，3’-序列：TAGG-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC(SEQ ID No.8))，通过GenScript将其克隆到pUC57中。按照供应商(Invitrogen GmbH，德国)提供的手册进行Gateway-转移到载体pDES T14(Invitrogen GmbH，德国)(见图3A)中。使用引物GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-GAAGGAGATACAACCATGGGCCATCACCATCATCACCACAAAACG-CTGAAAATTAGCTTTC(SEQ ID No.9)和GGGGACCACTTTGTACAA-GAAAGCTGGGTC(SEQ ID No.10)从pUC57-amuc0760co扩增编码N端His-标记的Amuc0760co的多核苷酸。使用引物GGGGACAAGTTTGTAC-AAAAAAGCAGGCTTC(SEQ ID No.11)和GGGGACCACTTTGTACAA-GAAAGCTGGGTC(SEQ ID No.12)从pUC57-amuc0760co扩增编码C端His-标记的amuc0760co的多核苷酸。
分别使用引物GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGA-AGGAGATACAACCATGTGTGATTGCTTGTCTATCATATTG(SEQ ID No.13)/GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATTTTCTATCA-AACAATTGAGAATAATATTC(SEQ ID No.14)和GGGGACAAGTTTGT-ACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGGATATATTGAT-TCTTTTTTATAATACGATG(SEQ ID No.15)/GGGGACCACTTTGTACA-AGAAAGCTGGGTCCATATCCCTCCCAATTTTAGTTCG(SEQ ID No.16)从脆弱拟杆菌NCTC9343的基因组DNA扩增编码岩藻糖基转移酶FucT6和FucT7的基因，并且还使用Gateway技术(Invitrogen GmbH，德国)克隆到pDEST14中(见图3B和3C)。
岩藻糖基转移酶的表达
将基因amuc0760co，fucT6和fucT7另外克隆到表达载体pACYCDuet-1(Novagen，UK)中。对于通过NcoI/PstI的限制性的amuc0760co的克降和随后的连接，使用引物AGCTAGCCATGGGCAA-AACGCTGAAAATTAGCTTTCTG(SEQ ID No.17)和AGCTAGCTGCA- GTTAGCGACGCAGGCGATTTTTC(SEQ ID No.18)(限制性位点下划线表示)，并且将得到的产物称为pACYC-amuc0760co(见图4A)。使用引物GATCACCATGGGCTGTGATTGCTTGTCTATCATATTG(SEQ ID No.19)和GATCAGGATCCTTATTTTCTATCAAACAATTGAGAATAATATTC(SEQ ID No.20)(限制性位点下划线表示)通过NcoI/BamHI克隆fucT6，得到pACYC-fucT6(见图4B)，使用引物GATCACCATGGATATATTGATT-CTTTTTTATAATACGATGTGG(SEQ ID No.21)和GATCAGAATTCTCA-TATCCCTCCCAATTTTAGTTCGTG(SEQ ID No.22)(限制性位点下划线表示)通过NcoI/EcoRI克隆fucT7，得到pACYC-fucT7(见图4C)。
用上述适当的质粒转化大肠杆菌菌株JM109(DE3)或BL21(DE3)ΔlacZ。通过接种环的方式接种5ml2YT培养基并且在37℃和180rpm生长过夜。用来自过夜培养物的4ml接种于400ml2YT并且在37℃和180rpm生长至达到OD660＝0.5。通过加入0，1mM IPTG诱导表达并且在28℃和180rpm继续生长过夜。收获细胞，并且以4v/w重悬在50mM Tris-HClpH7，5+5mM MgCl2中，或当用于通过Ni Sepharose FF柱(HisPrep FF16/10，GE Healthcare，瑞典)纯化时，以4v/w重悬在20mM Tris-HCl pH7，5+500mM NaCl+30mM咪唑中。加入多至细胞沉淀的六倍重量的玻璃珠，将细胞悬浮液涡旋5分钟两次，之间将细胞悬浮液置于冰上5分钟。破碎后，通过以15000x g离心10分钟去除细胞碎片。将得到的上清用于在SDS-PAGE上分析或用于通过Ni Sepharose FF纯化。
通过蛋白质印迹检测
如上述表达His-标记的Amuc0760co。将来自粗细胞提取物的10mg蛋白在10％SDS凝胶上分离。使用袖珍型转印迹槽(Mini Trans-Blot tank)(Bio-Rad，德国)按照由供应商提供的手册将蛋白印迹到PVDF膜上。使用His-标记抗体HRP缀合物试剂盒(His-Tag Antibody HRP Conjugate Kit)(Novagen，UK)按照供应商提供的说明书在印迹上检测His-标记的Amuc0760co(见图2)。
岩藻糖基化的化合物的生产
用携带适当的岩藻糖基转移酶基因的pACYC转化细胞大肠杆菌BL21(DE3)lacZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP。在具有适当的抗生素的2YT平板上生长集落。生长每个菌株的5ml过夜培养物(具有抗生素的2YT)，并且从该培养物，每种接种30ml矿物培养基至1％。生长细胞，用甘油作为碳源，并且在OD600＝0.2，用0.1mM IPTG诱导，并且加入20mM乳糖和20mM岩藻糖。通过TLC和HPLC分析监测3-岩藻糖基乳糖的产生。与来自Akkermansia muciniphila的Amuc0760co的表达以及来自脆弱拟杆菌的FucT6和FucT7的表达相比较，通过表达来自幽门螺杆菌的FutA产生的3-岩藻糖基乳糖(3-FL)的量的比较显示在下表1中：
表1：使用来自幽门螺杆菌的α-1，3-岩藻糖基转移酶FutA、来自Akkermansia muciniphila的Amuc0760co和来自脆弱拟杆菌的FucT6和FucT7的3-岩藻糖基乳糖产量的量的比较
| 岩藻糖基转移酶 | 产量3-FL[mM] |
| 无(阴性对照) | 0 |
| FutA(幽门螺杆菌) | 3,83 |
| Amuc0760co(Akkermansia muciniphila) | 5,39 |
| FucT6(脆弱拟杆菌) | 4,95 |
| FucT7(脆弱拟杆菌) | 6,89 |
从表1可以看出，与来自幽门螺杆菌的α-1，3-岩藻糖基转移酶FutA(其属于现有技术)相比，当使用本发明所述的α-1，3-岩藻糖基转移酶(即，来自于Akkermansia muciniphila的Amuc0760co和来自于脆弱拟杆菌的FucT6和FucT7)时，岩藻糖基化的产物3-岩藻糖基乳糖的量显著更高。
岩藻糖基化产物的纯化
如上述产生的3-岩藻糖基乳糖以几个步骤纯化。第一步是通过吸附到活性炭上的纯化。将来自生产步骤的培养物上清应用到活性炭床上。收集流过液并且分析，但是没有检测到剩余的3-岩藻糖基乳糖。为了去除非特异性结合的培养基化合物，诸如例如盐和氨基酸，将床用蒸馏水洗涤(流出液中没有3-FL)。然后，用96％乙醇洗脱3-FL和剩余的乳糖和岩藻糖。随后在旋转蒸发器中将乙醇蒸发，并且剩余物通过10kDa横向流组件(Microdyn Nadir，德国)过滤。剩余的盐通过电透析去除，然后通过用横向流组件(Pall，德国)过滤去除内毒素。然后，使用填装成具有釉料的520mm x428mm玻璃柱的凝胶渗透层析物质Biogel P-2(BioRad，德国)，以克单位规格将3-FL与乳糖和岩藻糖分离。3-FL的纯化通过薄层层析监测(见图8)。汇集仅含有3-岩藻糖基乳糖的级分并且冷冻干燥。
产物性质的验证
通过1H-NMR和质谱来分析使用本发明所述的岩藻糖基转移酶产生的纯化的3-岩藻糖基乳糖。得到的光谱与预计的3-FL光谱一致。除此之外，使用不同的HPLC法来验证得到的3-FL的性质。一种方法是使用Phenomenex Rezex RCM Ca2+柱用水作为洗脱剂(在80℃0.6ml/min30分钟)进行分离并且通过折射率检测器(Shimadzu，德国)检测(见图9A)。另一种方法是通过Dionex CarboPac PA1柱用50mM NaOH作为洗脱剂(在30℃1ml/min35分钟)进行分离并且通过电化学检测器DECADE II(Antec Leyden，荷兰)检测(见图9B)。
Claims (16)
1.分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽并且包含选自由下列各项组成的组的序列：
a)所附序列表中的SEQ ID Nos.1，3或5；
b)与SEQ ID Nos.1，3或5互补的核酸序列；
c)在严格条件下与a)和b)中定义的核酸序列杂交的核酸序列或它们的互补链。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，所述多核苷酸由SEQ ID Nos.1，3或5组成，编码具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
3.载体，所述载体包含根据权利要求1或2所述的编码具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接到被所述载体转化的宿主细胞识别的控制序列。
4.具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的分离的肽，所述分离的肽由选自由下列各项组成的组的氨基酸序列组成：
(a)SEQ ID NO：2，4或6所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2，4或6所示的氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中所述等位基因变体由在严格条件下与SEQ ID Nos.1，3或5所示的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；
(c)SEQ ID No.2，4或6所示的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中所述直向同源物由在严格条件下与SEQ ID Nos.1，3或5所示的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；和
(d)SEQ ID No.2，4或6所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含至少10个连续的氨基酸。
5.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求3所述的载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自由真菌、细菌、昆虫、动物和植物细胞组成的组，其中所述真菌包括酵母。
7.根据权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
8.根据权利要求5-7中的任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述编码具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸适应相应细胞的密码子应用。
9.权利要求1或2中任一项所述的多核苷酸、或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的多肽用于生产岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的生产通过异源或同源表达所述编码α-1，3-岩藻糖基转移酶的多核苷酸的方式进行。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其特征在于，所述岩藻糖基化的寡糖是3-岩藻糖基乳糖。
12.用于生产岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂的方法，所述方法包括下述步骤：
a.提供如权利要求4所述的具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽，
b.使步骤a的具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽与包含供体底物和接受体底物的混合物在所述多肽催化来自所述供体底物的岩藻糖残基转移到所述接受体底物上的条件下接触，由此产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂，其中所述供体底物包含岩藻糖残基，所述接受体底物包含单糖或寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂。
13.用于生产岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和(糖)脂的方法，所述方法包括下述步骤：
a.在允许产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂并且允许表达具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的适当的营养条件下，生长权利要求5-8所述的宿主细胞；
b.在步骤a同时或之后提供包含岩藻糖残基的供体底物和包含单糖或寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂的接受体底物，以使所述α-1，3-岩藻糖基转移酶多肽催化来自所述供体底物的岩藻糖残基转移到所述接受体底物上，由此产生岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白或(糖)脂；和
c.从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离所述岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述供体底物是GDP-岩藻糖。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述GDP-岩藻糖通过在所述宿主细胞中同时表达的酶或通过所述宿主细胞的代谢而提供。
16.通过权利要求9-11中任一项的用途或通过权利要求12-15中任一项的方法得到的岩藻糖基化的寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
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