CN103328630A - 新型岩藻糖基转移酶及其应用 - Google Patents
新型岩藻糖基转移酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103328630A CN103328630A CN2011800655811A CN201180065581A CN103328630A CN 103328630 A CN103328630 A CN 103328630A CN 2011800655811 A CN2011800655811 A CN 2011800655811A CN 201180065581 A CN201180065581 A CN 201180065581A CN 103328630 A CN103328630 A CN 103328630A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sugar
- polypeptide
- albumen
- host cell
- oligosaccharides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 title description 16
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 title description 15
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 52
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 101710098620 Alpha-1,2-fucosyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 8
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 71
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 63
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 59
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 54
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 54
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 52
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 claims description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N GDP-beta-L-fucose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N 0.000 claims description 13
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 4
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 2
- LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N GDP-L-fucose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 229940062827 2'-fucosyllactose Drugs 0.000 abstract 1
- HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 2-O-alpha-L-Fucosyl-lactose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 2-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 0.000 abstract 1
- SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N UNPD26986 Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)OC(CO)C(O)C1O SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N lactose group Chemical group OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)CO)[C@H](O1)CO GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 33
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 11
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 7
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 6
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 6
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- -1 α-1 Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- 101000885514 Arabidopsis thaliana Putative fucosyltransferase-like protein Proteins 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N N-acetyllactosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N 0.000 description 4
- HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N N-acetyllactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KFEUJDWYNGMDBV-UHFFFAOYSA-N (N-Acetyl)-glucosamin-4-beta-galaktosid Natural products OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 2
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010045674 Fucose-1-phosphate guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100037047 Fucose-1-phosphate guanylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040648 L-fucose kinase Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 description 2
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 2
- 101000966376 Staphylococcus hyicus Lipase Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 108010083136 fucokinase Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010083651 3-galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016825 Flushing Diseases 0.000 description 1
- 102100040837 Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000766145 Homo sapiens Beta-1,4-galactosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000244173 Rhabditis Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191982 Staphylococcus hyicus Species 0.000 description 1
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 101001134239 Trigonella foenum-graecum Protein MANNAN SYNTHESIS-RELATED Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- CDOJPCSDOXYJJF-CAQKAZPESA-N beta-D-GalpNAc-(1->4)-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CDOJPCSDOXYJJF-CAQKAZPESA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-KGJVWPDLSA-N beta-L-fucose Chemical compound C[C@@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-KGJVWPDLSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010079306 galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N lactulose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N 0.000 description 1
- 229960000511 lactulose Drugs 0.000 description 1
- PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N lactulose keto form Natural products OCC(=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067626 phosphatidylinositols Drugs 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940079889 pyrrolidonecarboxylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005866 tritylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/04—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及来自大肠杆菌血清群O126的核酸以及氨基酸序列，编码/代表一种新型α-1,2-岩藻糖基转移酶。本发明还提供了利用α-1,2-岩藻糖基转移酶生成岩藻糖基化产物，如寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂，尤其是在母乳中发现的寡糖如2’-岩藻糖基乳糖的应用和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型岩藻糖基转移酶及其应用。
背景技术
许多(糖)蛋白、(糖)脂、或寡糖需要特定岩藻糖基化结构的存在，以呈现特定的生物活性。例如，许多细胞间的识别机制需要岩藻糖基化寡糖：例如，为了连接细胞粘附分子如L-选择蛋白，特定的细胞结构必须包括岩藻糖基化碳水化合物。具有生物功能的岩藻糖基化结构的另一个实例是形成ABO血型系统的结构。此外，治疗性(糖)蛋白是发展最快的一类药物试剂，因此它们的药物代谢动力学性质以及稳定性归于它们的聚糖。
由于它们的复杂性以及固有的化学性质，糖结合物（glycoconjugate）的化学合成是一项主要的挑战，并且具有大量困难。不同于针对自动合成仪的可商购的蛋白质和核酸，聚糖（还）不能使用一般的商业系统合成，更不必说糖结合物。除了对于控制立体化学的需求之外，特定连接键的形成仍然很困难。
考虑到与糖结合物的化学合成或结合的酶/化学合成相关的复杂性，近年来的方法已使用糖基转移酶来酶促合成包括寡糖残基的(糖)蛋白以及(糖)脂。
属于糖基转移酶的酶家族中的岩藻糖基转移酶，广泛地在脊椎动物、无脊椎动物、植物、以及细菌中表达。它们催化岩藻糖残基从供体（通常是二磷酸鸟苷岩藻糖（GDP-岩藻糖））转移到包括寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的受体。由此得到的岩藻糖基化受体底物涉及各种生物和病理过程。
基于岩藻糖的添加部位，岩藻糖基转移酶被分类为：α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶、以及O-岩藻糖基转移酶。一些α-1,2-岩藻糖基转移酶已经被识别，例如，在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）和大肠杆菌等细菌中、在哺乳动物、漂亮新小杆线虫（Caenorhabditiselegans）和曼森血吸虫（Schistosoma mansoni）中、以及在植物中的α-1,2-岩藻糖基转移酶。这些酶的大多数或者不能在细菌系统中以活性形式表达、或者不能使用乳糖作为受体。
在哺乳动物中，GDP-岩藻糖通过从头合成（de novo synthesis）和补救途径在细胞质中合成。随着从头合成，通过两种酶将GDP-甘露糖转化为GDP-岩藻糖，同时补救途径使用游离细胞质岩藻糖作为底物。在细胞中，GDP-岩藻糖浓缩成囊泡并被岩藻糖基转移酶识别为供体底物。然而，真核糖基转移酶的异源功能表达，尤其证明了岩藻糖基转移酶在原核表达系统中表达困难。哺乳动物，尤其是来源于原核来源的人类寡糖如HMO是未知的，因而发现了使得这些寡糖极其不同的糖基转移酶。
由于许多商业上重要的寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的生物活性取决于特定岩藻糖残基的存在，因此现有技术需要有效地合成或产生具有期望的寡糖残基的糖结合物。
发明内容
因此，本发明的目的是提供工具以及方法，通过所述工具和方法，岩藻糖基化底物可以以高效、省时、以及节省成本的方式进行生产，以获得高产量的期望底物。
根据本发明，尤其是通过提供一种多核苷酸达到了该目的，所述多核苷酸可以是，例如，分离的、重组的或合成的编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸，并且包括选自以下组中的序列或由选自以下组中的序列组成，该组由以下各项组成：
a)随附序列表中的SEQ ID No.1；
b)与SEQ ID No.1互补的核酸序列；
c)在严格条件下与a)和b)中限定的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列。
根据本发明的多核苷酸（参见SEQ ID No.1）是大肠杆菌菌种血清群O126的岩藻糖基转移酶。
由于通过使用最新识别的岩藻糖基转移酶可以进行不能天然发生在源生物体中的反应，它们具有出乎意料的效果：在本发明的范围内，已经发现上述识别的α-1,2-岩藻糖基转移酶能够使用乳糖作为底物，并且能够产生岩藻糖基化寡糖，尤其是2’-岩藻糖基乳糖。至今，还没有已知的从细菌中分离的α-1,2-岩藻糖基转移酶显示使用乳糖作为天然底物用于产生岩藻糖基乳糖。因而，用于产生岩藻糖基化寡糖的最新识别的岩藻糖基转移酶的适用性极为出乎意料，因此，它的应用代表一种容易地、高效地、以及节省成本地生产诸如母乳寡糖（HMO）（如岩藻糖基乳糖）的优良工具。当今，已经表征了属于HMO的多于80种化合物的结构；它们代表一类具有益生元（prebiotic）作用的寡糖复合物。此外，HMO与上皮表位的同源结构是其对抗细菌病原体的保护性的原因。在婴儿胃肠道中，HMO选择性地提供选定的细菌菌种生长的养分，因而致使母乳喂养婴儿中的独特肠微生物群的生长。
直到现在，因为这些寡糖的结构复杂性阻碍它们的合成制备，母乳仍然是HMO的主要来源。因此，需要容易地、轻松地得到HMO，这一需求可以通过使用本文中给出的出乎意料地适用的岩藻糖基转移酶提供。
根据本发明，术语“多核苷酸”一般指的是任一种多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，所述多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸可以是未改变的RNA或DNA、或改变的RNA或DNA。“多核苷酸”包括，但不限于，单链和双链DNA，单链区和双链区混合的DNA，或单链区、双链区以及三链区混合的DNA，单链和双链RNA，以及单链区和双链区混合的RNA，包括DNA和RNA的杂交分子，所述杂交分子可以是单链的或更典型的是双链区、或三链区、或单链区和双链区的混合体。此外，本文中使用的“多核苷酸”指的是包括RNA、或DNA、或RNA和DNA的三链区。在此区域的链可以来自同一分子或来自不同的分子。该区域可以包括所有分子中的一个或多个，但更典型地只包括一些分子的一个区。三螺旋区的一个分子通常是寡核苷酸。如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”还包括如上所述的包含一个或多个改变的碱基的DNA或RNA。因此，具有出于稳定性或其它原因改变的主链的DNA或RNA是本文中意指的术语“多核苷酸”。此外，仅举两个实例，包括稀有碱基如肌苷、或者修饰碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是本文中所使用的术语多核苷酸。将理解已经对本领域技术人员熟知的用于许多有用目的的DNA和RNA进行了大量改变。如在本文中使用的术语“多核苷酸”包括如化学地、酶促地、或代谢地改变的多核苷酸的形式，以及病毒和细胞（包括，例如简单和复杂细胞）特性的DNA和RNA的化学形式。另外，“多核苷酸”还包括短的多核苷酸，通常指的是寡核苷酸。
“多肽”指的是包括两个或更多氨基酸通过肽键或改变的肽键彼此连接的任一种肽或蛋白质。“多肽”不仅指的是短链，一般指的是肽、寡肽以及寡聚物；还指的是较长的链，一般指的是蛋白质。多肽可以包括除20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程如加工以及其它转录后修饰，以及通过化学修饰技术改变的那些。在基础用书（basictext）和在详细的专著中、以及在长篇研究文献中很好地描述了这些改变，并且本领域的技术人员已经熟知。将理解相同类型的改变可以以相同或不同的程度出现在给定的多肽的一些位点。另外，给定的多肽可以包括许多类型的修饰。修饰可以发生在多肽的任何部位，包括肽主链、氨基酸侧链、以及氨基端或羧基端。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定点（anchor）的形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酰化、异戊烯化、外消旋化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒酰化、转运RNA介导的氨基酸至蛋白质的添加（如精氨酰化、遍在蛋白化）。多肽可以是支链、或带有或不带有支链的环。环、支链、以及支链环状的多肽可以由转录后的天然过程产生，并且还可以完全通过合成法制备。
“分离的”意味着从它的天然状态“通过人工”改变，即，如果天然发生，则已经从它的原始环境改变或转移、或即改变又转移。例如，在活有机体中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存物质中分离得到的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如在本文中使用的术语。类似地，“合成”序列，如在本文中使用的术语，意味着任一种通过合成产生而不是直接从天然来源分离的序列。“重组”意味着通过从一种物种中移植或剪接基因至不同种类的宿主有机体细胞中而制备的基因工程DNA。这种DNA成为宿主基因构成（makeup）的部分并被复制。
本文中使用的术语“编码多肽的多核苷酸”包括以下多核苷酸，所述多核苷酸包括编码本发明的多肽，尤其是具有SEQ ID No.2给出的氨基酸序列α-1,2-岩藻糖基转移酶的序列。术语还包括以下多核苷酸，所述多核苷酸包括编码多肽（例如，通过整合噬菌体、或插入序列、或编译而间断的）的单个连续区或不连续区、以及还可以包括编码序列和/或非编码序列的附加区域。
本文中使用的术语“变体”是分别不同于参照多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽，但是保留基本性质。多核苷酸的典型变体的核苷酸序列不同于参照多核苷酸。变体的核苷酸序列的变化可以改变或者可以不改变由参照多核苷酸编码的氨基酸序列。核苷酸变化可以产生如下所述的由参照序列编码的多肽中氨基酸的取代、添加、缺失、融合、以及截短。多肽的典型变体的氨基酸序列不同于参照多肽。一般地，不同是有限的，使得参照多肽与变体的序列接近全部相似，并且在许多区域完全相同。变体和参照多肽可以通过以任意组合的一个或多个取代、添加、缺失而具有不同的氨基酸序列。取代或插入氨基酸残基可以是或可以不是由基因密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然产生的如等位基因变体，或者可以是未被认为是天然产生的变体。多核苷酸和多肽的非天然产生的变体可以通过诱变技术、通过直接合成、以及通过本领域技术人员已知的其他的重组方法制备。
术语“α-1,2-岩藻糖基转移酶”、或“岩藻糖基转移酶”、或编码“α-1,2-岩藻糖基转移酶”或“岩藻糖基转移酶”的核酸/多核苷酸指的是催化岩藻糖从供体底物，例如GDP-岩藻糖，以α-1,2连接键转移至受体分子的糖基转移酶。受体分子可以是碳水化合物、寡糖、蛋白或糖蛋白、或脂质或糖脂；并且可以是，例如，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖、或它们的任意组合。在本发明范围内，那些术语中包括的核酸/多核苷酸、以及多肽的多态变体、等位基因、突变体、以及异种同源体，具有与由SEQ ID No.1的核酸编码的多肽或SEQ ID No.2的氨基酸序列大于约60%的氨基酸序列同一性，65%、70%、75%、80%、85%、90%，优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，优选在至少约25、50、100、200、500、1000、或更多氨基酸的区域内。
此外，可以通过肽序列的添加或缺失来改变α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽，以改变它的活性。例如，可以将多肽序列融合到α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽中，以得到增加的酶活性。可替换地，可以删除氨基酸以去除或改变蛋白活性。可以将蛋白质改变为缺乏α-1,2-岩藻糖基转移酶的酶促活性，但是仍然保留它的三维结构。这种改变将有利于针对α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽的抗体的发展。
此外，α-1,2-岩藻糖基转移酶基因产物可以包括代表功能等价基因产物的蛋白或多肽。这种等价α-1,2-岩藻糖基转移酶基因产物可以包括在由上述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因序列编码的氨基酸序列中的氨基酸残基的缺失、添加或取代，但是这会导致沉默（silent）的变化，由此产生功能等价α-1,2-岩藻糖基转移酶基因产物。氨基酸取代可以基于相关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行。例如，非极性（疏水）氨基酸包括丙胺酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、以及甲硫氨酸；平面（planar）中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺；正电荷（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸；以及负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本发明的上下文中，这里使用的“功能等价”指的是能够呈现与由上述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因序列编码的内源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因产物基本相似的体内活性的多肽，通过许多标准中的任一标准进行判断，所述标准包括，但不限于，抗原性，即结合至抗-α-1,2-岩藻糖基转移酶抗体的能力；免疫原性，即产生能够结合α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白或多肽的抗体的能力；以及酶促活性。
包含在本发明的范围内的是在翻译期间或翻译后不同地改变的α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白、多肽、及衍生物（包括片段）。此外，非典型的氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为取代或添加被引入α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽序列中。
α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽可以通过使用本领域已知的重组DNA技术产生。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建包含α-1,2-岩藻糖基转移酶编码序列的表达载体，以及合适的转录翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术、以及体内遗传重组。参见，例如，Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中描述的技术.
本文中使用的、以及如在现有技术中通常理解的术语“寡糖”指的是包含小数量的，典型的是3至10个简单糖类（即单糖）的糖类聚合物。
根据本发明的另一方面，提供的载体包括以上给出的编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸序列，其中，所述核酸序列可操作地连接至由载体转化的宿主细胞识别的控制序列。在特别优选的实施方式中，载体是一种表达载体，并且根据本发明的另一方面，载体可以以质粒、粘粒、噬菌体、脂质体、或病毒的形式存在。
另外，本发明涉及包含由如上所述的、根据本发明的多核苷酸组成的序列的宿主细胞，其中所述序列是宿主细胞的外源序列，并且其中，将所述序列整合在宿主细胞的基因组中。因此，“宿主细胞的外源”意味着在所述宿主细胞中序列不能天然产生，即，序列相对于宿主细胞是异源的。异源序列可以稳定地引入宿主细胞的基因组中，例如，通过转染、转化、或转导，其中可以根据将引入宿主细胞中的序列施用技术。本领域的技术人员已知各种技术，并且，例如公开在Sambrook et al.,1989（同上）中。因此，已引入异源序列的宿主细胞将产生根据本发明的多核苷酸编码的异源蛋白。
对于重组生产，宿主细胞可以并入遗传工程的表达系统、或其部分、或本发明的多核苷酸。将多核苷酸引入宿主细胞可以通过许多标准实验室手册如Davis et al.Basic Methods in Molecular Biology,(1986)和Sambrooket al.,1989（同上）中描述的方法实现。
因此，根据本发明的多核苷酸可以，例如，包括在将稳定地转化/转染至宿主细胞中的载体中。在该载体中，本发明的多核苷酸在例如诱导型启动子的控制下，以使基因/多核苷酸的表达可以特异性地靶向，并且，如果期望，基因可以以该方式过表达。
大量的表达系统可以用于生产本发明的多肽。这种载体，除了其它，还包括染色体的、游离型以及源于病毒的载体，例如源于细菌质粒的载体、源于噬菌体的载体、源于转座子的载体、源于酵母附加体的载体、源于插入元件的载体、源于酵母染色体元件的载体、源于病毒的载体、以及源于它们的组合的载体（如源于质粒和噬菌体基因元件的载体、如源于粘粒和噬菌粒的载体）。表达系统构建体可以包括调节以及引起表达的控制区。一般地，在这一方面，适合保持、增殖、或表达多核苷酸和/或在宿主中表达多肽的任何系统或载体可以用于表达。合适的DNA序列可以通过多种已知的和常规技术中的任一种插入表达系统中，如，例如，参见以上Sambrook et al给出的那些技术。
因此，本发明还涉及由选自以下组中的氨基酸序列组成的具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的分离多肽，该组由以下各项组成：
a)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列；
b)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列等位基因变体的氨基酸序列，其中所述等位基因变体由在严格条件下杂交至在SEQ ID No.1中所示的核酸分子的相反链的核酸分子编码；
c)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的同源体的氨基酸序列，其中所述同源体由在严格条件下杂交至在SEQ ID No.1中所示的核酸分子的相反链的核酸分子编码；以及
d)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括至少10个连续的氨基酸，并且其中所述片段具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性。
术语“严格条件”指的是探针将杂交至其靶序列而不是其它序列的条件。严格条件取决于序列，并且在不同的环境下将不同。较长的序列具体地在较高的温度下杂交。一般地，在限定的离子强度和pH下，对于特定序列的严格条件选择为比热溶解温度（Tm）约低15℃。Tm是在平衡状态下将50%的互补于靶序列的探针杂交至靶序列的温度（在限定的离子强度、pH、以及核酸浓度下）。示例性的严格杂交条件如下：50%的甲酰胺、5x SSC、以及1%的SDS，在42℃下温育；或5x SSC、1%的SDS，在65℃下温育；并用0.2x SSC以及0.1%的SDS，在65℃下冲洗。
另外，本发明涉及包含如上所定义的载体，或者包含根据本发明的多核苷酸作为引入宿主细胞基因组中的异源序列的宿主细胞，尤其是选自由以下各项组成的组中的宿主细胞：包括酵母菌的真菌、细菌、昆虫、动物细胞和植物细胞。特别地优选宿主细胞为大肠杆菌细胞。
如在本文中所使用的，术语“宿主细胞”目前被定义为已转化或转染的细胞，或者能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。
各种宿主表达载体系统可以用于表达本发明的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因密码序列。这种宿主表达系统代表运载体（vehicle），通过该运载体可以生成感兴趣的编码序列，随后纯化，还代表当通过适当的核苷酸编码序列转化或转染时，在原位产生本发明的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因产物的细胞。
许多合适的表达系统以及宿主可以在，例如，涉及来自幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶的WO/0026383和EP 1 243 647中找到，在此明确地引用了此出版物。
根据本发明的另一方面，编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸适合各细胞的密码子使用。
本发明进一步涉及根据本发明的多核苷酸、载体、或多肽分别用于生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的应用。
因此，根据应用的一个方面，所述岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的生产通过编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的多核苷酸的异源或同源表达进行。
根据应用的另一方面，岩藻糖基化寡糖是已知来自于母乳中的寡糖，如2’-岩藻糖基乳糖。
本发明还涉及用于生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供根据本发明的具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽，
b.在多肽催化岩藻糖残基从供体底物转移至受体底物的条件下，使步骤a中的具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽与包括供体底物的混合物接触，该供体底物包括岩藻糖残基，并且受体底物包括单糖或寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂，由此生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂。
根据本发明，用于生产岩藻糖基化寡糖的方法可以在无细胞系统或含细胞系统中进行。在充足条件下使底物与α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽反应足够长的时间，以使得酶促产物能够形成。应理解，无论是无细胞系统还是基于细胞的系统，这些条件将随着底物和酶的量和纯度而改变。这些变量将易于由本领域的技术人员调整。
在无细胞系统中，根据本发明的多肽、受体底物、供体底物在这种情况下可以是其它反应混合成分，包括其它糖基转移酶，并且辅酶（accessoryenzyme）通过在含水反应介质中与混合物结合。在溶液中可以使用游离酶，或者它们可以结合或固定到载体如聚合物上，并且底物可以加入载体中。载体可以，例如，堆积在柱中。
用于合成岩藻糖基化寡糖的含细胞系统可以包括重组改变的宿主细胞。
因此，本发明还涉及用于生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的方法，包括以下步骤：
a.在允许岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂生产，以及允许具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽表达的合适营养条件下，培养上述宿主细胞；
b.与步骤a同时或在步骤a之后，提供包括岩藻糖残基的供体底物以及包括寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂的受体底物，使得在所述宿主细胞中表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶催化岩藻糖残基从供体底物转移到受体底物，由此生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂；以及
c.从宿主细胞或它的生长介质中分离所述岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
根据本发明的方法，供体底物可以是GDP-岩藻糖。特别优选的供体底物为GDP-岩藻糖。
根据本发明的一个方面，受体底物选自N-乙酰葡糖胺、N-乙酰乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖、或它们的任意组合。特别地，优选乳糖为受体底物。
本文中使用的术语“底物”意味着可以通过根据本发明的多肽作用以生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂的任何物质或不同物质的组合。
在充足条件下使底物与α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽反应足够长的时间，以使得酶产物能够生成。无论系统是无细胞系统还是基于细胞的系统，这些条件将随底物和酶的量以及纯度而变化。这些变量将易于由本领域的技术人员调整。
根据本发明的方法的一个方面，供体底物由通过宿主细胞产生的步骤b提供。这样做，例如，使得被加入到宿主细胞中的岩藻糖转化成GDP-岩藻糖的酶同时在宿主细胞内表达。这种酶可以是，例如，双功能的岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶（如脆弱拟杆菌（Bacteroidesfragilis）中的Fkp）、或单独的岩藻糖激酶中的一种以及单独的岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶中的一种（如，来自包括智人（Homo sapiens）、猪（Susscrofa）、以及褐家鼠（Rattus norvegicus）等一些物种中的那些已知）的组合。
可替换地，在步骤b中，供体底物可以添加到培养基/宿主细胞中，或者通过细胞自身的代谢产生。
在还进一步的实施方式中，本发明还涉及包括以下步骤的方法：
a.在合适的营养条件下，培养转化或转染的宿主细胞以包括选自以下各项中的核酸序列：i)随附序列表中SEQ ID No.1的核酸序列；ii)与SEQID No.1互补的核酸序列；以及iii)在严格条件下与在i)和ii)中限定的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列，使得选自i)、ii)、和iii)中的核酸序列被表达为具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
b.与步骤a同时或在步骤a之后，提供包括岩藻糖残基的供体底物以及包括寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂的受体底物，使得在所述宿主细胞中表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶催化岩藻糖残基从供体底物转移到受体底物，由此生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂；以及
c.从宿主细胞或它的生长培养基中分离所述岩藻糖及化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
在根据本发明的方法中，在宿主细胞中表达的肽显示出α-1,2-岩藻糖基转移酶活性，因此，将岩藻糖残基从供体，例如，二磷酸鸟苷岩藻糖（GDP-岩藻糖）转移到包括寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的受体。以这种方式，得到的岩藻糖基化受体底物可以用作食品添加剂，用于婴儿食品的补充物，或者用作治疗或药物活性物质。通过该新方法，可以容易、有效地提供岩藻糖基化产物，而不需要复杂、耗时和消耗成本的合成过程。
如本文中使用的术语“分离”意味着从基因表达系统中获取、收集、或分离通过根据本发明的α-1,2-岩藻糖基转移酶产生的产物。
因此，本发明还涉及通过根据本发明的方法获得的岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂，还涉及上述用于生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的多核苷酸、载体、或多肽的应用。
根据又一个实施方式，所述岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的生产利用编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的多核苷酸的异源或同源（过）表达进行。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的任何普通技术人员通常理解的具有相同的意义。一般地，本文中使用的术语以及在细胞培养、分子遗传学、有机化学、核酸化学以及上述和下述杂交中的实验室规程是本领域熟知的，和通常使用的。对于核酸和肽合成使用标准方法。一般地，酶促反应和纯化步骤根据生产商的说明书进行。
本发明还涵盖了本文中公开的多核苷酸序列的片段。
实施方式和附图的描述给出进一步的优势。
上述特征以及以下将要说明的特征不仅可以以各自特定组合使用，还可以以其它组合或单独使用，而没有背离本发明的范围。
附图说明
本发明的一些实施方式描述在图形中，并且借助以下描述进行更加详细的说明。在附图中：
图1A示出了编码来自大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL的基因的DNA和氨基酸序列；
图1B示出了pET22bHIS6PropwbgL的载体图谱，即，将来自大肠杆菌O126的编码新型α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL的密码子优化基因WbgL克隆至pET22b(+)（Novagen,Darmstadt,Germany,via BamHI/XhoI）中，在经由NdeI/BamHI酶切之前，向其中加入编码N-端His-标签（His-Tag）的18bp以及来自猪葡萄球菌脂肪酶的前肽的621bp（参见以下描述的）；
图1C示出了pACYC-wbgL的载体图谱，即，将来自大肠杆菌O126的编码新型α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL的密码子优化基因wbgL克隆至pACYCDuet-1（Novagen via NcoI/BamHI）中；
图2示出了由IMAC Ni2+-NTA Sepharose柱纯化WbgL的色谱图（蓝色：在280nm下的吸收；红色：电导率；包含从柱中洗脱的His6-前肽-WbgL的部分被称为IMAC池）；
图3示出了在大肠杆菌JM109(DE3)pET22bHIS6PropwbgL的粗提物和不溶部分中、以及在His6-前肽-WbgL的纯化物的洗涤部分中His6-前肽-WbgL表达体的SDS-PAGE分析，以及纯化的His6-前肽-WbgL的SDS-PAGE分析；
图4示出了用DAB底物（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）温育之后，使用结合到辣根过氧化物酶（HRP）（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）上的单克隆抗-His6抗体检测免疫印迹上的His6-前肽-WbgL；
图5示出了用0.4mM的GDP-β-L-岩藻糖和5mM的乳糖纯化的His6-前肽-WbgL的连续分光光度测定，其中活性可以通过由NADH的氧化引起的在340nm处吸收的减弱测定；
图6示出了由通过HPAEC-PAD的WbgL反应制备2’-岩藻糖基乳糖的测定，在反应初期不存在2’-岩藻糖基乳糖（A），当WbgL与2mM的GDP-β-L-岩藻糖和5mM乳糖反应1小时后产生2’-岩藻糖基乳糖（B）；
图7示出了通过毛细管电泳法对起始于2mM的GDP-岩藻糖、5mM乳糖、以及WbgL反应混合物的分析，其中在反应初期，仅能检测到GDP-β-L-岩藻糖（A）；反应16小时之后，仅能检测到由WbgL活性释放的GDP的降解产物鸟苷（B）；
图8示出了在50mM的Tris-HCl缓冲液中在不同pH值（pH 6.8至8.4）下WbgL的相对活性；
图9示出了在起始于2mM的GDP-β-L-岩藻糖以及5mM乳糖的WbgL反应的16小时反应过程中，在不同时间点测定的2’-岩藻糖基乳糖的浓度增加；
图10示出了通过以水作为洗脱液的Phenomenex Rezex RCM Ca2+柱（在80℃下，以0.6ml/min洗脱30分钟）分离，并通过折光率检测器（Shimadzu,Germany）进行检测得到的HPLC色谱图（A）；以及通过以乙腈/水（68:32）作为洗脱液的Reprosil Carbohydrate柱（5μm 250x4.6mm）（在35℃下，以1.4ml/min洗脱20分钟）分离，并通过折光率检测器（Shimadzu,Germany）进行检测得到的HPLC色谱图（B）；
图11示出了由WbgL产生的2’-岩藻糖基乳糖的NMR核磁共振光谱。
具体实施方式
实施例
基因克隆
为了推定的α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL的细胞质表达，对表达载体pET22b(+)（Novagen,Darmstadt,Germany）进行改性。因此，使用限制性内切酶NdeI和BamHI切割诱导大肠杆菌中周质表达的pelB前导序列。猪葡萄球菌脂肪酶的前肽基因序列（SEQ ID No.3）（Sauerzapfe,B.,D.J.Namdjou,et al.(2008):″Characterization of recombinant fusion constructs ofhuman beta-1,4-galactosyltransferase 1 and the lipase pre-propeptide fromStaphylococcus hyicus.″Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic50(2-4):128-140）通过使用引物5`-CATATGCACCACCACCACCACCACAATGATTCGACAACACAAACAACGAC-3`（SEQ ID No.5）以及3′-GGATCCGTATGGTTTTTTGTCGCTCGCTTG-5`（SEQ ID No.6）从质粒pLGalTΔ38扩增，并且融合至产生载体pET22bHIS6Prop的改性pET22b载体。产生的载体被BamHI和XhoI消化。包括BamHI和XhoI限制位点的基因编码由Geneart（Geneart）合成，该基因编码用于推定的大肠杆菌O126中的α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL。将α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL连接到载体pET22bHIS6Prop上产生表达载体pETHIS6PropwbgL（参见图1A），用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导pETHIS6PropwbgL后，在大肠杆菌的细胞质中产生His6-前肽-WbgL（513个氨基酸）。可替换地，使用引物5’-GATCACCATGGGCAGCATTATTCGTCTGCAGGGTGGTC-3’（SEQ ID No.7）和5’-GATCAGGATCCTTAGCAGCTGCTATGTTTATCAACGTTGATCC-3’（SEQ ID No.8）扩增之后，基因wbgL通过NcoI/BamHI克隆到载体pACYCDuet-1（Novagen,Darmstadt,Germany）以产生载体pACYC-wbgL（见图1B）。使用用于大肠杆菌Nova Blue（Novagen,Darmstadt,Germany）或大肠杆菌TOP10（Invitrogen,Darmstadt,Germany）进行质粒增殖，以及使用大肠杆菌JM109(DE3)（
Madison,USA）进行His6-前肽-WbgL表达。
岩藻糖基转移酶的培养和表达
在包含20ml的LB培养基以及100μg/mL的氨苄青霉素的100ml爱伦美氏烧瓶中培养转化株，并且在37℃以及130rpm下温育过夜。在含有1000mL的TB培养基的5L爱伦美氏烧瓶中，在37℃以及80rpm下培养蛋白生产细胞。lacZ启动子的诱导通过向培养物中添加IPTG至0.1mM的最终浓度进行（OD600=0.6-0.8）。温育在25℃下持续20h，并且最终通过离心收获细胞。
酶纯化
在50mM pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，大肠杆菌细胞的40%（w/w）细胞悬液通过超声破碎（4x15s）。离心（15000rpm，30min）后，保留颗粒（pellet），通过SDS-PAGE分析内含体（inclusion）的产生。通过使用先前由100mL 50mM pH 7.6的Tris-HCl（缓冲液A）平衡的Ni2+-NTASepharose（
Hilden,Germany）将粗提物（15mL）上样到IMAC柱（0.8cm2×10cm,1.5mL/min）中。经包含0.3M NaCl和20mM咪唑的缓冲液B的洗涤步骤后，利用在缓冲液C（50mM Tris-HCl pH 7.6,0.3MNaCl以及300mM咪唑）中的浓度为300mM的咪唑洗脱蛋白质。所有部分进行蛋白浓度分析以及酶活性检测。将用缓冲液C洗脱的包含活性可溶WbgL的所有部分合并，并将得到的溶液称为IMAC池（参见图2）。
SDS-PAGE和免疫印迹检测
His6-前肽-WbgL的表达通过SDS-PAGE和免疫印迹监测。因此使用根据
（Paisley,UK）的凝胶灌注（gel casting）说明书灌注的10%丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。将蛋白样品（40μg）上样在每一个凝胶槽（slot）上。预染蛋白Ladder PageRulerTM（Vilnius,Lithuania）用于检测分子质量。用考马斯亮蓝对蛋白凝胶染色（参见图3）。
通过使用特定的抗-His6抗体进行免疫印迹，以检测His6PropWbgL。因此，大肠杆菌JM109(DE3)细胞碎片的样品、粗提物、以及His6-前肽-WbgL的IMAC部分在SDS-PAGE凝胶上分离，并通过NuPAGE印迹转移方案（BioRad,München,Germany）转移到PVDF膜上。用在TBS缓冲液（10mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.2）中的3%BSA封闭（block）膜。结合到辣根过氧化酶（HRP）（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）的单克隆抗-His6抗体用于特异性结合。经包含0.1%吐温20的TBS缓冲液的洗涤步骤后，用DAB底物（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）温育印迹，并且通过除去溶液以及添加蒸馏水使HRP反应停止（参见图4）。
活性测定
通过2’-岩藻糖基乳糖的分光光度测定以及HPAEC-PAD分析，测定粗提物和IMAC部分中His6-前肽-WbgL的酶活性。
分光光度测定通过使用用于检测释放的GDP（Barratt,D.H.,L.Barber,et al.(2001).″Multiple,distinct isoforms of sucrose synthase in pea.″PlantPhysiology 127(2):655-664.）的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶系统进行。用于微量滴定板检测的反应混合物包括50mM pH 7.6Tris-HCl、2mM GDP-β-L-岩藻糖、5mM乳糖、1mM磷酸烯醇丙酮酸、1mM DTT、0.25mM NADH、2mM MnCl2、5U丙酮酸激酶、以及5U乳酸脱氢酶，其总体积为250μl。通过添加100μl酶溶液开始反应，然后在30℃下置于340nm处。副活性（side activity）检测的对照试验在没有受体底物乳糖的情况下进行（参见图5）。
酶活性还通过用于2′-岩藻糖基乳糖检测的HPAEC-PAD分析测定。检测溶液包括2mM GDP-β-L-岩藻糖、5mM乳糖、含2mM MnCl2的50mM pH 7.6Tris-HCl、1mM DTT、1U碱性磷酸酶，其总体积为175μl，然后加入175μl粗提物之后在30℃下温育，并纯化酶溶液。通过在95℃下加热5分钟停止反应，在不同的时间点转化率是线性的。使用软件ChromeleonTM 6.40，通过在CarboPac PA1柱上的Dionex HPAEC-PAD（Dionex Corporation,Sunnyvale,CA,USA）分析离心的样品。在30℃下用50mM NaOH进行洗脱（流速：1mL/min，注射量：50μL）。通过商用2`-岩藻糖基乳糖标准曲线测定产生的三糖2`-岩藻糖基乳糖的浓度，并且将浓度用于随后的酶活性的计算（参见图6）。
对于HPAEC-PAD和分光光度测定两者，1U的His6-前肽-WbgL是在标准检测条件下每分钟产生1μmol产物（GDP或2′-岩藻糖基乳糖）的酶量。
通过在配有UV检测器的来自Beckman Coulter（Krefeld,Germany）的P/ACE MDQ装置上进行毛细管电泳来分析GDP-β-L-岩藻糖及其消耗量。用于测定活化供体底物GDP-β-L-岩藻糖的样品通过加热（95℃）5分钟停止，并且在15000rpm（Rotina 35R,Hettich,Tuttlingen,Germany）下离心10分钟。检测通过使用50mM的Na2B4O7x10H2O/64mM的硼酸缓冲液（pH 8.9）在未经处理的弹性石英毛细管（I.D.75mm，总毛细管长度：57cm，距检测器50cm）上完成。迁移和检测条件分别是：25.8℃下25kV（23mA）以及UV检测波长为254nm。样品通过压力（在0.5psi条件下正向推进5.0秒）注射（参见图7）。GDP-β-L-岩藻糖和产生的鸟苷的识别由商用底物确定。
最适pH以及金属离子依赖性
为了研究重组His6-前肽-WbgL活性的最适pH值，检测在50mMTris-HCl缓冲液不同的pH值下进行，pH值范围为6.8至8.4。最适pH值为7.6（参见图8）。向标准检测中加入金属离子Mn2+以研究金属离子依赖性。所有样品通过上述HAPAEC-PAD进行分析。结果表明，酶不依赖于Mn2+离子。
动力学分析
用于受体底物乳糖和供体底物GDP-β-L-岩藻糖的His6-前肽-WbgL的动力学常数来自于使用上述分光光度测定在变化的底物浓度下的初始速率分析。GDP-β-L-岩藻糖在恒定浓度为10mM的乳糖中的变化范围为0.02mM至4mM，并且在恒定浓度为2mM GDP-β-L-岩藻糖中乳糖的变化范围为0.05mM至40mM。所有数据通过使用Sigma Plot 10软件（SPSSScience Software GmbH,Erkrath,Germany）根据Michaelis-Menten方程非线性回归分析测定。
表1.重组α-1,2-岩藻糖基转移酶His6-前肽-WbgL的动力学常数
| 底物 | Km值[mM] | Vmax[mU/mg] | Vmax/Km[mU*mg-1mM-1] | R2 |
| 乳糖 | 5.3 | 170 | 32 | 0.9935 |
| GDP-岩藻糖 | 0.27 | 167 | 618 | 0.9907 |
受体底物光谱研究
通过根据上述活性测定的HPAEC-PAD分析重组His6-前肽-WbgL的底物光谱。测试替代5mM乳糖的不同受体底物以测定相对于乳糖的相对活性。
表2.α-1,2-岩藻糖基转移酶His6-前肽-WbgL的受体光谱
| 底物 | 相对活性[%] |
| 乳糖 | 100 |
| 乳果糖 | 124 |
| LacNAc Typ Ⅰ | 28 |
| LacNAc Typ Ⅱ | 95 |
| D-半乳糖 | 71 |
| 3-岩藻糖基乳糖 | 0 |
| β-卞基乳糖 | 50 |
| D-GalNAc | 0 |
| D-GalNH2 | 0 |
| LacDiNAc | 0 |
岩藻糖基化化合物的产生
用载有合适的岩藻糖基转移酶基因的pACYCDuet-1转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)ΔlacZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP。菌落在含有合适的抗生素的2YT平板上生长。用5ml过夜培养物（含有抗生素的2YT）培养各菌株，并且将该培养物的各15ml矿物培养基接种至1%。细胞通过使用甘油作为碳源生长，然后使用0.1mM IPTG、40mM乳糖在OD600=0.5下诱导，再加入30mM乳糖。培养物在30℃以及120rpm下温育。HPLC分析监测2’-岩藻糖基乳糖的产生。通过来自幽门螺杆菌的FucT2表达产生的2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）量相对于来自大肠杆菌O126的WbgL表达产生的2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）量的比较显示于以下表1中：
表3.使用来自幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶FucT2以及来自大肠杆菌O126的WbgL产生的2’-岩藻糖基乳糖量的比较
| 岩藻糖基转移酶 | 2’-FL产量[mM] |
| 无（阴性对照） | 0.00 |
| FucT2（幽门螺杆菌） | 2.01 |
| WbgL（大肠杆菌O126） | 4.05 |
从表1中可以看出，当使用根据本发明的α-1,2-岩藻糖基转移酶，即来自大肠杆菌O126的WbgL时，岩藻糖基化产物2’-岩藻糖基乳糖的量明显高于现有技术中使用来自幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶FucT2。
岩藻糖基化产物的纯化
如上所述产生的2’-岩藻糖基乳糖以以下几个步骤进行纯化。第一步是通过活性炭吸附进行纯化。将来自生产步骤的培养上清液应用于活性炭床。收集和分析通流（flow-through），但没有检测到残余的2’-岩藻糖基乳糖。为了除去不确定地结合的培养基化合物，如，例如，盐类和氨基酸，用蒸馏水洗涤活性炭床（在通流中没有2’-FL）。然后，用96%的乙醇洗脱2’-FL、残留的乳糖、以及岩藻糖。随后在旋转蒸发器中蒸发乙醇，并且通过10kDa的横流模块（crossflow module）（Microdyn Nadir,Germany）过滤残余物。通过电渗析（electrodialysation）除去残留的盐类，其后通过使用横流模块（Pall,Germany）过滤除去内毒素。然后，通过利用在520mmx428mm的玻璃柱中堆积玻璃料的凝胶渗透色谱法材料Biogel P-2（BioRad,Germany），将2’-FL以克级规模从乳糖和岩藻糖中分离。通过薄层色谱法监测2’-FL的纯化。合并仅包含2’-岩藻糖基乳糖的部分，并将其冷冻干燥。
产物身份（identity）的确认
通过1H-NMR分析利用本发明给出的岩藻糖基转移酶产生的纯化2’-岩藻糖基乳糖（参见图11）。得到的谱图与2’-FL的标准谱图（Dextra,Reading,UK）一致。除此之外，应用不同的HPLC方法确认得到的2’-FL的身份。使用如上所述的HPAEC-PAD。其它方法是通过使用以水作为洗脱液的Phenomenex Rezex RCM Ca2+柱（在80℃下，以0.6ml/min洗脱30分钟；通过折光率检测器（Shimadzu,Germany）检测）分离（参见图10A），以及通过使用以乙腈/水（68:32）作为洗脱液的5μm 250x4.6mmReprosil碳水化合物（在35℃下，以1.4ml/min洗脱20分钟；通过折光率检测器（Shimadzu,Germany）检测）分离（参见图10B）。
Claims (18)
1.编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽并且包括选自由以下各项组成的组中的序列的多核苷酸：
a)随附序列表中的SEQ ID No.1；
b)与SEQ ID No.1互补的核酸序列；
c)在严格条件下与a)和b)中限定的所述核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，由编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的SEQ ID No.1组成。
3.载体，包含根据权利要求1或2所述的编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至由所述载体转化的宿主细胞识别的控制序列。
4.一种具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽，由选自以下组中的氨基酸序列组成，所述组由以下各项组成：
(a)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列；
(b)在SEQ ID No.2中所示的所述氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中，所述等位基因变体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQ ID No.1中所示的核酸分子的相反链；
(c)在SEQ ID No.2中所示的所述氨基酸序列的同源体的氨基酸序列，其中，所述同源体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQ ID No.1中所示的所述核酸分子的相反链；以及
(d)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的片段，其中，所述片段包括至少10个连续的氨基酸。
5.宿主细胞，包含根据权利要求3所述的载体、或者包含由根据权利要求1或2所述的多核苷酸组成的序列，其中，所述序列是所述宿主细胞的外源序列，以及其中，所述序列整合在所述宿主细胞的基因组中。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自由包括酵母菌的真菌、细菌、昆虫、动物细胞、和植物细胞所组成的组中。
7.根据权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽的所述核酸适合各细胞的密码子使用。
9.根据权利要求1或2所述的多核苷酸、或根据权利要求3所述的载体、或根据权利要求4所述的多肽在生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的生产通过编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的所述多核苷酸的异源或同源表达进行。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述岩藻糖基化寡糖是已知来自于母乳中的寡糖。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述岩藻糖基化寡糖是2’-岩藻糖基乳糖。
13.用于生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、和(糖)脂的方法，包括以下步骤：
a.提供根据权利要求4所述的具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽，
b.在所述多肽催化岩藻糖残基从供体底物转移至受体底物的条件下，使步骤a中的具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽与包括所述供体底物和所述受体底物的混合物接触，所述供体底物包括岩藻糖残基，所述受体底物包括单糖或寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂，由此生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂。
14.用于生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、和(糖)脂的方法，包括以下步骤：
a.在允许生产所述岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂的适宜营养条件、以及允许具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽表达的条件下，培养根据权利要求5至8中任一项所述的宿主细胞；
b.与步骤a同时或在步骤a之后，提供包括岩藻糖残基的供体底物以及包括单糖或寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂的受体底物，以使所述α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽催化岩藻糖残基从所述供体底物转移到所述受体底物，由此生产岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂；以及
c.从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述供体底物是GDP-岩藻糖。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述GDP-岩藻糖通过在所述宿主细胞中同时表达的酶或所述宿主细胞的代谢提供。
17.由权利要求9至11中任一项所述的应用或通过权利要求12至15中任一项所述的方法获得的岩藻糖基化寡糖、(糖)蛋白和/或(糖)脂。
18.根据权利要求1或2所述的多核苷酸或根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多核苷酸或所述多肽是分离的、重组的、或合成的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710788461.3A CN107604023A (zh) | 2011-01-20 | 2011-12-30 | 岩藻糖基转移酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP11151571.4A EP2479263B1 (en) | 2011-01-20 | 2011-01-20 | Novel Fucosyltransferases and their applications |
| EP11151571.4 | 2011-01-20 | ||
| PCT/EP2011/074291 WO2012097950A1 (en) | 2011-01-20 | 2011-12-30 | Novel fucosyltransferases and their applications |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710788461.3A Division CN107604023A (zh) | 2011-01-20 | 2011-12-30 | 岩藻糖基转移酶及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103328630A true CN103328630A (zh) | 2013-09-25 |
Family
ID=44072605
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710788461.3A Pending CN107604023A (zh) | 2011-01-20 | 2011-12-30 | 岩藻糖基转移酶及其应用 |
| CN2011800655811A Pending CN103328630A (zh) | 2011-01-20 | 2011-12-30 | 新型岩藻糖基转移酶及其应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710788461.3A Pending CN107604023A (zh) | 2011-01-20 | 2011-12-30 | 岩藻糖基转移酶及其应用 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9611285B2 (zh) |
| EP (1) | EP2479263B1 (zh) |
| JP (1) | JP6155196B2 (zh) |
| KR (1) | KR101891649B1 (zh) |
| CN (2) | CN107604023A (zh) |
| AU (1) | AU2011356210B8 (zh) |
| BR (1) | BR112013018539A8 (zh) |
| DK (1) | DK2479263T3 (zh) |
| ES (1) | ES2439507T3 (zh) |
| HK (1) | HK1167683A1 (zh) |
| MX (1) | MX344314B (zh) |
| RU (1) | RU2628307C2 (zh) |
| WO (1) | WO2012097950A1 (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695537A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-06-22 | 福建农林大学 | 一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法 |
| CN106062186A (zh) * | 2013-12-18 | 2016-10-26 | 哥本哈根大学 | 糖基化黄胭脂酮酸和/或胭脂酮酸的糖基转移酶 |
| CN106190937A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-12-07 | 南开大学 | 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’‑岩藻乳糖的方法 |
| CN106434590A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-02-22 | 福建农林大学 | 一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用 |
| CN106434591A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-02-22 | 福建农林大学 | 一种岩藻糖基转移酶及其应用 |
| CN106795484A (zh) * | 2014-05-15 | 2017-05-31 | 格里康辛有限责任公司 | 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种 |
| CN108103039A (zh) * | 2016-11-25 | 2018-06-01 | 上海交通大学 | 一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用 |
| CN108690856A (zh) * | 2017-04-03 | 2018-10-23 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的方法 |
| CN109312379A (zh) * | 2016-04-05 | 2019-02-05 | 科学与工业研究委员会 | 多功能重组核苷酸依赖性糖基转移酶蛋白及其糖基化的方法 |
| CN109337883A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-02-15 | 福建农林大学 | 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用 |
| CN110662842A (zh) * | 2017-04-21 | 2020-01-07 | 首尔大学校产学协力团 | 利用谷氨酸棒状杆菌的3’-岩藻糖基乳糖的生产方法 |
| CN111629732A (zh) * | 2017-11-20 | 2020-09-04 | 高丽大学校产学协力团 | 各种新颖岩藻糖基低聚糖的制备方法和其用途 |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2675899T1 (da) | 2011-02-16 | 2016-08-22 | Glycosyn LLC | Biosyntese af humane mælkeoligosaccharider i manipulerede bakterier |
| US9029136B2 (en) | 2012-07-25 | 2015-05-12 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
| ES2640978T3 (es) * | 2012-10-31 | 2017-11-07 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Proceso de producción de monosacáridos |
| DK3041946T3 (da) | 2013-09-06 | 2021-08-23 | Glycom As | Fermentative production of oligosaccharides |
| EP3572521A1 (en) * | 2013-09-10 | 2019-11-27 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Production of oligosaccharides |
| EP2896628B1 (en) | 2014-01-20 | 2018-09-19 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation |
| ES2715010T3 (es) | 2014-03-31 | 2019-05-31 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Fermentación total de oligosacáridos |
| ES2968677T3 (es) | 2014-06-11 | 2024-05-13 | Glycom As | Separación de 2-O-fucosil-lactosa de caldo de fermentación |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US10676770B2 (en) | 2014-12-16 | 2020-06-09 | Glycom A/S | Separation of 2′-FL from a fermentation broth |
| EP3050973A1 (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-03 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars |
| ES2856749T3 (es) | 2016-10-29 | 2021-09-28 | Chr Hansen Hmo Gmbh | Proceso para la producción de oligosacáridos fucosilados |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| EP3425052A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-09 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Fucosyltransferases and their use in producing fucosylated oligosaccharides |
| EP3450443A1 (en) | 2017-08-29 | 2019-03-06 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for purifying sialylated oligosaccharides |
| EP3486326A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-22 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth |
| EP3494807A1 (en) | 2017-12-11 | 2019-06-12 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Spray-dried sialyllactose |
| CN111447844A (zh) | 2017-12-08 | 2020-07-24 | 詹尼温生物技术有限责任公司 | 喷雾干燥的四糖 |
| EP3494804A1 (en) | 2017-12-08 | 2019-06-12 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Spray-dried 3-fucosyllactose |
| EP3494805A1 (en) | 2017-12-08 | 2019-06-12 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Spray-dried tetrasaccharides |
| EP3494806A1 (en) | 2017-12-08 | 2019-06-12 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Spray-dried lacto-n-fucopentaose |
| EP3524067A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-14 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Spray-dried mixture of human milk oligosaccharides |
| WO2019209245A1 (en) | 2018-04-23 | 2019-10-31 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Increasing activity of 2' fucosyllactose transporters endogenous to microbial cells |
| EP3784791A1 (en) | 2018-04-23 | 2021-03-03 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Increasing export of 2' fucosyllactose from microbial cells through the expression of a heterologous nucleic acid |
| EP3746456A1 (en) | 2018-10-18 | 2020-12-09 | Basf Se | Crystalline form ii of 2'-o-fucosyllactose, process for its preparation, nutritional, cosmetic or pharmaceutical formulation containing the same |
| CN109337882A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-02-15 | 福建农林大学 | 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及制备人乳寡糖中的应用 |
| CN109735479B (zh) * | 2019-01-30 | 2022-04-01 | 光明乳业股份有限公司 | 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
| EP3751003A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-16 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Production of fucosylated oligosaccharides in bacillus |
| BR112022005578A2 (pt) | 2019-09-24 | 2022-09-20 | Prolacta Bioscience Inc | Composições e métodos para tratamento de doenças inflamatórias e imunes |
| JP2023506287A (ja) | 2019-12-17 | 2023-02-15 | インバイオス エン．フェー． | ラクトースを変換するアルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素 |
| WO2022036225A1 (en) | 2020-08-14 | 2022-02-17 | Prolacta Bioscience, Inc. | Human milk oligosaccharide compositions for use with bacteriotherapies |
| WO2022155201A1 (en) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | Prolacta Bioscience, Inc. | Synbiotic treatment regimens |
| WO2022263426A1 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Dsm Ip Assets B.V. | Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth |
| EP4355463A1 (en) | 2021-06-15 | 2024-04-24 | DSM IP Assets B.V. | Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth |
| EP4355464A1 (en) | 2021-06-15 | 2024-04-24 | DSM IP Assets B.V. | Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth |
| BE1029436B1 (nl) | 2021-06-15 | 2023-07-31 | Dsm Ip Assets Bv | Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon |
| CN113667656B (zh) * | 2021-08-23 | 2023-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 |
| WO2023242184A1 (en) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth |
| KR20240002283A (ko) * | 2022-06-28 | 2024-01-05 | 주식회사 삼양사 | 2’-푸코실락토오스 제조방법 |
| WO2024046993A1 (en) | 2022-08-29 | 2024-03-07 | Chr. Hansen A/S | Process for the production of a purified human milk oligosaccharide derived from a microbial fermentation process |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023398A1 (en) * | 1999-09-28 | 2001-04-05 | Carbion Oy | Novel fucosylated oligosaccharides and process for their preparation |
| CN1360633A (zh) * | 1999-02-18 | 2002-07-24 | 弗里德里希·阿尔特曼 | 岩藻糖基转移酶基因 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125092C1 (ru) * | 1991-10-15 | 1999-01-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Способ получения фукозилированного углевода, способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы, реакционная система in vitro |
| US5807732A (en) * | 1995-02-28 | 1998-09-15 | Lowe; John B. | GDP-L-fucose: β-D-galactoside 2-α-L-fucosyltransferases, DNA sequences encoding the same, method for producing the same and a method of genotyping a person |
| US6238894B1 (en) * | 1998-11-04 | 2001-05-29 | Diane Taylor | α1,2 fucosyltransferase |
| US6329170B1 (en) * | 1999-04-23 | 2001-12-11 | Northwest Hospital | Nucleic acids and proteins of a rat ganglioside GM1-specific α1→2fucosyltransferase and uses thereof |
| JP2001546898A (en) | 1999-12-21 | 2003-06-10 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | MODIFIED alpha -1,2-FUCOSYLTRANSFERASE GENE AND PROCESS FOR PRODUCING alpha -1,2-FUCOSYLTRANSFERASE AND FUCOSE-CONTAINING SUGAR CHAIN |
| WO2001077313A1 (fr) * | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | α1,2-FUCOSYLTRANSFERASE ET PROCEDE SERVANT A PREPARER UN GLUCIDE COMPLEXE CONTENANT FUCOSE |
| ATE468391T1 (de) * | 2001-08-24 | 2010-06-15 | Kyowa Hakko Bio Co Ltd | Alpha-1,2-fucosyl-transferase und diese codierende dna |
| US7326770B2 (en) | 2004-01-22 | 2008-02-05 | Neose Technologies, Inc. | H. pylori fucosyltransferases |
| CN102257128A (zh) * | 2008-12-19 | 2011-11-23 | 詹内怀恩生物技术股份有限公司 | 岩藻糖化化合物的合成 |
| US9029136B2 (en) * | 2012-07-25 | 2015-05-12 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
-
2011
- 2011-01-20 ES ES11151571.4T patent/ES2439507T3/es active Active
- 2011-01-20 DK DK11151571.4T patent/DK2479263T3/da active
- 2011-01-20 EP EP11151571.4A patent/EP2479263B1/en active Active
- 2011-12-30 WO PCT/EP2011/074291 patent/WO2012097950A1/en active Application Filing
- 2011-12-30 JP JP2013549748A patent/JP6155196B2/ja active Active
- 2011-12-30 RU RU2013138474A patent/RU2628307C2/ru active
- 2011-12-30 CN CN201710788461.3A patent/CN107604023A/zh active Pending
- 2011-12-30 BR BR112013018539A patent/BR112013018539A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-12-30 MX MX2013008423A patent/MX344314B/es active IP Right Grant
- 2011-12-30 CN CN2011800655811A patent/CN103328630A/zh active Pending
- 2011-12-30 AU AU2011356210A patent/AU2011356210B8/en active Active
- 2011-12-30 KR KR1020137019052A patent/KR101891649B1/ko active IP Right Grant
-
2012
- 2012-08-29 HK HK12108431.6A patent/HK1167683A1/xx unknown
-
2013
- 2013-07-19 US US13/946,845 patent/US9611285B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1360633A (zh) * | 1999-02-18 | 2002-07-24 | 弗里德里希·阿尔特曼 | 岩藻糖基转移酶基因 |
| WO2001023398A1 (en) * | 1999-09-28 | 2001-04-05 | Carbion Oy | Novel fucosylated oligosaccharides and process for their preparation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIU Y.ET AL.: "A6M9C2", 《EMBL》 * |
| 王克夷: "糖基转移酶的研究进展", 《生物化学与生物物理进展》 * |
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106062186A (zh) * | 2013-12-18 | 2016-10-26 | 哥本哈根大学 | 糖基化黄胭脂酮酸和/或胭脂酮酸的糖基转移酶 |
| US10724012B2 (en) | 2013-12-18 | 2020-07-28 | Københavns Universitet | Glycosyltransferase glycosylating flavokermesic acid and/or kermesic acid |
| US11643675B2 (en) | 2014-05-15 | 2023-05-09 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferase syngenes for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
| CN106795484B (zh) * | 2014-05-15 | 2022-09-09 | 格里康辛有限责任公司 | 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种 |
| CN106795484A (zh) * | 2014-05-15 | 2017-05-31 | 格里康辛有限责任公司 | 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种 |
| US11046984B2 (en) | 2014-05-15 | 2021-06-29 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferase syngenes for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
| CN105695537A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-06-22 | 福建农林大学 | 一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法 |
| CN105695537B (zh) * | 2016-02-29 | 2019-11-19 | 福建农林大学 | 一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法 |
| CN109312379B (zh) * | 2016-04-05 | 2022-04-12 | 科学与工业研究委员会 | 多功能重组核苷酸依赖性糖基转移酶蛋白及其糖基化的方法 |
| CN109312379A (zh) * | 2016-04-05 | 2019-02-05 | 科学与工业研究委员会 | 多功能重组核苷酸依赖性糖基转移酶蛋白及其糖基化的方法 |
| CN106190937B (zh) * | 2016-07-18 | 2019-05-14 | 南开大学 | 一种构建重组大肠杆菌生物合成2"-岩藻乳糖的方法 |
| CN106190937B9 (zh) * | 2016-07-18 | 2020-12-01 | 南开大学 | 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’-岩藻乳糖的方法 |
| CN106190937A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-12-07 | 南开大学 | 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’‑岩藻乳糖的方法 |
| CN108103039A (zh) * | 2016-11-25 | 2018-06-01 | 上海交通大学 | 一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用 |
| CN108103039B (zh) * | 2016-11-25 | 2021-10-22 | 上海交通大学 | 一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用 |
| CN106434591A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-02-22 | 福建农林大学 | 一种岩藻糖基转移酶及其应用 |
| CN106434590A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-02-22 | 福建农林大学 | 一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用 |
| CN108690856A (zh) * | 2017-04-03 | 2018-10-23 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的方法 |
| CN108690856B (zh) * | 2017-04-03 | 2022-12-23 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的方法 |
| CN110662842A (zh) * | 2017-04-21 | 2020-01-07 | 首尔大学校产学协力团 | 利用谷氨酸棒状杆菌的3’-岩藻糖基乳糖的生产方法 |
| CN110662842B (zh) * | 2017-04-21 | 2023-03-21 | 首尔大学校产学协力团 | 利用谷氨酸棒状杆菌的3-岩藻糖基乳糖的生产方法 |
| CN111629732A (zh) * | 2017-11-20 | 2020-09-04 | 高丽大学校产学协力团 | 各种新颖岩藻糖基低聚糖的制备方法和其用途 |
| CN109337883A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-02-15 | 福建农林大学 | 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20140024820A1 (en) | 2014-01-23 |
| AU2011356210B8 (en) | 2015-09-03 |
| CN107604023A (zh) | 2018-01-19 |
| EP2479263A1 (en) | 2012-07-25 |
| DK2479263T3 (da) | 2014-02-03 |
| MX344314B (es) | 2016-12-13 |
| KR101891649B1 (ko) | 2018-08-27 |
| RU2628307C2 (ru) | 2017-08-15 |
| JP6155196B2 (ja) | 2017-06-28 |
| AU2011356210A1 (en) | 2013-07-11 |
| MX2013008423A (es) | 2013-10-17 |
| AU2011356210B2 (en) | 2015-08-13 |
| KR20140032983A (ko) | 2014-03-17 |
| US9611285B2 (en) | 2017-04-04 |
| BR112013018539A2 (pt) | 2017-09-05 |
| HK1167683A1 (en) | 2012-12-07 |
| AU2011356210A8 (en) | 2015-09-03 |
| BR112013018539A8 (pt) | 2023-01-31 |
| WO2012097950A1 (en) | 2012-07-26 |
| EP2479263B1 (en) | 2013-11-27 |
| RU2013138474A (ru) | 2015-02-27 |
| ES2439507T3 (es) | 2014-01-23 |
| JP2014504874A (ja) | 2014-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103328630A (zh) | 新型岩藻糖基转移酶及其应用 | |
| RU2642307C2 (ru) | Новые фукозилтрансферазы и их применение | |
| Ju et al. | Purification, characterization, and subunit structure of rat core 1 β1, 3-galactosyltransferase | |
| US20220002773A1 (en) | Production of 3-fucosyllactose and lactose converting alpha-1,3-fucosyltransferase enzymes | |
| JP2009195255A (ja) | スクロースホスホリラーゼ（ｓｐ）の耐熱化方法 | |
| JP2002524080A (ja) | アミロスクラーゼをコードする核酸分子 | |
| JP2010504082A (ja) | ２−Ｏ−グリセリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの生産方法 | |
| JP2015532832A (ja) | 単糖類の製造方法 | |
| Bastida et al. | Heterologous Over‐expression of α‐1, 6‐Fucosyltransferase from Rhizobium sp.: Application to the Synthesis of the Trisaccharide β‐d‐GlcNAc (1→ 4)‐[α‐l‐Fuc‐(1→ 6)]‐d‐GlcNAc, Study of the Acceptor Specificity and Evaluation of Polyhydroxylated Indolizidines as Inhibitors | |
| CN114763518B (zh) | 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用 | |
| KR20120122098A (ko) | 박테로이드 프라질리스 균주 유래 푸코실전이효소 | |
| JP4540067B2 (ja) | α−グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）の耐熱化方法 | |
| WO2003102193A1 (fr) | Chondroitine synthetase et acide nucleique codant pour cette enzyme | |
| JP2019129716A (ja) | 新規酵素剤、その製造方法およびその用途 | |
| Moracci | Identification of an Archaeal-L-Fucosidase Encoded by an Interrupted Gene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130925 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |