ES2715010T3

ES2715010T3 - Fermentación total de oligosacáridos

Info

Publication number: ES2715010T3
Application number: ES14162869T
Authority: ES
Inventors: Stefan Jennewein
Original assignee: Jennewein Biotechnologie GmbH
Current assignee: Chr Hansen HMO GmbH
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2034-03-31
Also published as: JP2017509346A; EP3461890A1; DK2927316T3; WO2015150328A1; KR20170003546A; PL2927316T3; EP2927316A1; EP2927316B1; KR102012070B1; JP6360908B2

Abstract

Un método para producir al menos un oligosacárido de interés por fermentación total mediante células hospedadoras modificadas genéticamente, comprendiendo el oligosacárido de interés un disacárido de la galactosa-(1->4)-glucosa terminal, y comprendiendo el método las etapas de: a) obtener (i) una célula hospedadora bacteriana que puede producir oligosacáridos que comprenden un disacárido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal, y que comprende - al menos una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que tiene una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y que puede galactosilar un monosacárido de glucosa libre para generar de forma intracelular lactosa, - al menos una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una glucosiltransferasa que se selecciona de al menos una de las siguientes: una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa, una galactosiltransferasa, y dicha célula hospedadora bacteriana puede generar el oligosacárido sin la adición exógena de lactosa, o (ii) una primera célula hospedadora bacteriana que comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que tiene una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y que puede galactosilar un monosacárido de glucosa libre para generar de forma intracelular lactosa, y una segunda célula hospedadora bacteriana que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una glucosiltransferasa que se selecciona de al menos una de las siguientes: una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa, una galactosiltransferasa; b) cultivar dichas células hospedadoras bacterianas (i) o (ii) de la etapa a), en el que dicho cultivo se realiza (I) a partir de una fuente de carbono que se selecciona de al menos una de las siguientes: glucosa, sacarosa, glicerol, melazas, jarabe de maíz, galactosa, gas de síntesis, monóxido de carbono, metanol, succinato, piruvato, rafinosa, en el que la célula hospedadora puede general glucosa libre dentro de la célula a partir de dicha fuente de carbono, y (II) sin suministrar de forma externa lactosa durante la ejecución del método, produciendo de este modo dicho oligosacárido de interés.

Description

DESCRIPCION

Fermentacion total de oligosacaridos

La presente invencion se refiere a un metodo para producir oligosacaridos que comprenden un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal.

La leche humana representa una mezcla compleja de carbohidratos, grasas, protemas, vitaminas, minerales y oligoelementos. La fraccion mas predominante por mucho esta representada por carbohidratos, que pueden dividirse ademas en lactosa y oligosacaridos mas complejos (oligosacaridos de la leche human HMO). Mientras que la lactosa se usa como fuente de energfa, los oligosacaridos complejos no se metabolizan por el bebe. La fraccion de oligosacaridos complejos representa hasta 1/10 de la fraccion de carbohidratos total y consiste en probablemente mas de 150 oligosacaridos diferentes. La existencia y concentracion de estos oligosacaridos complejos es espedfica para los seres humanos y, por tanto, no pueden encontrarse en grandes cantidades en la leche de otros mairnferos, como por ejemplo animales productores de leche domesticados.

Los oligosacaridos mas prominentes son 2'-fucosil-lactosa y 3'-fucosil-lactosa que juntos pueden contribuir hasta 1/3 de la fraccion de HMO total. HMO prominentes adicionales presentes en la leche humana son lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa y las lacto-W-fucopentaosas I. Ademas de estos oligosacaridos naturales, tambien pueden encontrarse HMO acidos en la leche humana, como por ejemplo 3'-sialil-lactosa, 6'-sialil-lactosa y 3-fucosil-3'-sialillactosa, disialil-lacto-W-tetraosa, etc. Estas estructuras estan muy relacionadas con epttopos de glucoconjugados de la superficie de celulas epiteliales, los antfgenos del grupo histosangumeo de Lewis tales como Lewis x (LeX) y la homologfa estructural de HMO con epttopos epiteliales representa propiedades protectoras contra patogenos bacterianos.

La existencia de estos oligosacaridos complejos en la leche humana ya se conoce desde hace tiempo y las funciones fisiologicas de estos oligosacaridos se sometieron a investigacion medicinal durante muchas decadas. Para algunos de los oligosacaridos de la leche humana mas abundantes, ya se ha identificado funciones espedficas.

Ademas de los efectos locales mencionados en el tubo intestinal, los HMO tambien han demostrado provocar efectos sistemicos en bebes entrando en la circulacion sistemica. Ademas, el impacto de los HMO sobre las interacciones de protema-carbohidrato, por ejemplo, union de lectina-leucocito, pueden modular las respuestas inmunitarias y reducir las respuestas inflamatorias.

Debido a las propiedades beneficiosas bien estudiadas de los oligosacaridos prebioticos, en particular de HMO, conectadas con su disponibilidad limitada, es muy deseable una produccion comercial eficaz, es decir, a gran escala.

Debido al suministro limitado y a las dificultades de obtener fracciones puras de oligosacaridos de leche humana individuales, se desarrollaron rutas qmmicas para algunas de estas moleculas complejas. Sin embargo, la produccion de oligosacaridos de la leche humana por smtesis qmmica, smtesis enzimatica o fermentacion demostro ser dificultosa. No se pueden proporcionar cantidades al menos a gran escala, asf como cantidades suficientes para aplicaciones alimentarias actualmente mediante smtesis qmmica. A este respecto, particularmente las rutas sinteticas qmmicas para oligosacaridos de la leche humana implican varios agentes qmmicos nocivos, que imponen el riesgo de contaminar el producto final.

Debido a los problemas implicados en la smtesis qmmica de oligosacaridos de la leche humana, se desarrollaron varios metodos enzimaticos y estrategias fermentativas. Actualmente, para varios HMO tales como 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, 3'-sialil-lactosa y 6'-sialil-lactosa, se han desarrollado estrategias fermentativas, usando principalmente cepas bacterianas genomanipuladas tales como Escherichia coli recombinante.

Actualmente, las estrategias biocatalfticas, asf como las fermentativas para HMO se basaban todas exclusivamente en lactosa como sustrato de partida, a la que se anaden monosacaridos adicionales, como se divulga en, por ejemplo, el documento US 7521212 B1 o Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) pag. 97-103. La adicion de monosacaridos a lactosa puede catalizarse por glucosiltransferasas o glucosidasas usando sustratos monosacaridos activados adecuados. Ademas, pueden anadirse monosacaridos adicionales a lactosa mediante reacciones de transglucosidasa.

En particular, la smtesis fermentativa de HMO demostro eficacia particular, porque se proporcionan monosacaridos activados por nucleotido necesarios y diffciles de sintetizar por el metabolismo del microbio usado. Sin embargo, el uso de celulas completas para la smtesis de HMO tambien alberga, en comparacion con la estrategia biocatalftica, varias des ventajas principales, que estan relacionadas con los procesos de transporte a traves de la membrana celular, reacciones secundarias metabolicas y el hecho de que los oligosacaridos sintetizados tienen que purificarse de una mezcla compleja que contiene, entre otras cosas, diversos polioles (por ejemplo, carbohidratos), acidos nucleicos, polipeptidos, material inorganico, etc.

El documento US 2009/0082307 A1 divulga la produccion de oligosacaridos mediante un proceso microbiologico, en el que un precursor exogeno, tal como lactosa, se anade al medio en el que se cultiva una celula hospedadora, y en el que el precursor se internaliza por dicha celula.

Un problema tecnico relacionado con el uso de lactosa en procesos fermentativos se presenta por el reordenamiento de lactosa (beta-D-galactopiranosil-(1->4)-D-glucosa) en lactulosa (beta-D-galactopiranosil-(1->4)-D-fructofuranosa) por tratamiento termico de lactosa. Este reordenamiento puede producirse extensivamente sometiendo a autoclave la lactosa, que da lugar al reordenamiento de varias cantidades porcentuales de la lactosa presente en un medio de fermentacion o el suministro de fermentacion de lactosa en lactulosa. Sin embargo, la lactulosa representa un azucar no digerible para seres humanos y se usa ampliamente en el tratamiento de estrenimiento cronico.

Ademas, la conversion de lactosa en lactulosa no solamente da lugar a la generacion de productos secundarios indeseados, sino que ademas tambien genera un sustrato potencial de glucosilacion y la generacion de oligosacaridos as complejos (por ejemplo, 2'-fucosil-lactulosa). Por tanto, la generacion de lactulosa a partir de lactosa esta dando lugar a la contaminacion del producto deseado con oligosacaridos muy relacionados, que son diffciles o incluso imposibles de separar del producto deseado.

Por encima de todo la adicion de lactosa en particular da lugar a un efecto bien documentado conocido como muerte celular inducida por lactosa. Este efecto esta muy probablemente causado por la captacion excesiva de lactosa y el colapso asociado del gradiente de protones a traves de la membrana bacteriana. En particular, la sobreexpresion del gen de lactosa permeasa (por ejemplo, lacY de E. Coli) en combinacion con la exposicion de la celula recombinante puede causar un retardo del crecimiento considerable de la cepa recombinante y la smtesis aumentada de polisacaridos celulares (Grube et al., "Hydrogen-producing Escherichia coli strains overexpressing lactose permease: FT-IR analysis of the lactose-induced stress" (2013) Biotechnol. Appl. Biochem. 5, 31.).

Ademas, actualmente, la lactosa en escala comercial se obtiene completamente de lactosuero, un producto residual de la industria lactea. El lactosuero se produce en cantidades enormes en la fabricacion de queso y casema. Por tanto, obteniendose de la industria lactea, aun hay preocupaciones relacionadas con la posible contaminacion de lactosa con protemas de priones, el agente causante de la encefalopatfa espongiforme bovina (BSE), tambien ampliamente conocida como enfermedad de las vacas locas. La BSE, una enfermedad neurodegenerativa mortal en el ganado bovino, que causa degeneracion esponjosa del cerebro y la medula espinal, puede transmitirse a los seres humanos y en esa ocasion se conoce como variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Ademas, la lactosa, si se suministra a una cepa de E. coli positiva a beta-galactosidasa, puede convertirse en alolactosa (beta-D-galactopiranosil-(1->6)-D-glucopiranosa), otro contaminante indeseado (Huber et al., "Efflux of beta-galactosidase products from Escherichia coli" (1980) J. Bacteriol. 141, 528-533).

Ademas, la lactosa aun es uno de los componentes mas caros del medio de fermentacion y su sustitucion por glucosa, glicerol, sacarosa, etc. dana lugar a una produccion mas rentable de HMO.

En vista de lo anterior, sena deseable desarrollar un medio mejorado y metodos para la produccion de HMO, que permitan superar los inconvenientes mencionados anteriormente del estado de la tecnica.

De acuerdo con la invencion, este y otros objetivos se resuelven mediante un metodo para producir al menos un oligosacarido de interes, comprendiendo el oligosacarido de interes un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal, como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, en el que el metodo, en una alternativa, comprende las etapas de:

a) obtener una celula hospedadora bacteriana, que es una celula capaz de producir oligosacaridos que comprenden un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal y que comprende

(i) al menos una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una protema que tiene una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y que puede galactosilar un monosacarido de glucosa libre en lactosa generada de forma intracelular,

(ii) al menos una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una glucosiltransferasa que se selecciona de al menos una de las siguientes: una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa, una galactosiltransferasa,

y que es una celula hospedadora bacteriana que puede generar el oligosacarido sin la adicion exogena de lactosa, y

b) cultivar dicha celula hospedadora bacteriana, en la que dicho cultivo se realiza (i) a partir de una fuente carbono que se selecciona de al menos una de las siguientes: glucosa, sacarosa, glicerol, melazas, jarabe de mafz, galactosa, gas de smtesis, monoxido de carbono, metanol, succinato, piruvato, rafinosa, en el que la celula hospedadora puede generar glucosa libre dentro de la celula a partir de dicha fuente de carbono, y (ii) sin el suministro externo de lactosa durante la ejecucion del metodo, produciendo de este modo dicho oligosacarido de interes.

El objetivo subyacente de la invencion se resuelve completamente de esta manera.

Con el metodo de acuerdo con la invencion y la celula bacteriana usada en el metodo es posible fermentar totalmente un oligosacarido deseado que comprende un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal, en particular uno que porta un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa en su extremo reductor, tal como, por ejemplo, 2'-fucosil-lactosa y otros HMO a partir de una fuente de carbono simple tal como glucosa, sacarosa, glicerol y otras fuentes de carbono como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, sin la necesidad del suministro externo de lactosa como sustrato al metodo de fermentacion de dichos oligosacaridos.

Las fuentes de carbono simples pueden usarse para obtener una combinacion de glucosa libre dentro de la celula productora, de modo que la celula pueda sintetizar lactosa. Despues, la lactosa obtenida puede exportarse desde la celula sintetizadora y usarse por otras celulas en la fermentacion para la smtesis de oligosacaridos mas complejos, o mas ventajosamente por la propia celula sintetizadora para la smtesis de oligosacaridos mas complejos. Los productos oligosacaridos sintetizados entonces se exportan de la celula productora al medio de fermentacion por exportadores o permeasas.

Actualmente, la expresion "acido nucleico" se refiere a un polfmero de desoxirribonucleotido o ribonucleotido en forma monocatenaria o bicatenaria, y salvo que se limite de otro modo, abarca analogos conocidos de nucleotidos naturales que hibridan con acidos nucleicos de una manera similar a los nucleotidos de origen natural. Salvo que se indique de otro modo, una secuencia de acido nucleico particular incluye la secuencia complementaria del mismo. Actualmente, la expresion "unido de forma funcional", como se usa en este documento, significara un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresion de acidos nucleico (tal como un promotor, secuencia senal o serie de sitios de union de factor de transcripcion) y una segunda secuencia de acido nucleico, en la que la secuencia de control de la expresion afecta a la transcripcion y/o traduccion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Por consiguiente, el termino "promotor" indica secuencias de ADN que habitualmente "preceden" a un gen en un polfmero de ADN y proporcionan un sitio para el inicio de la transcripcion en ARNm. Secuencias de ADN "reguladoras", tambien habitualmente "en direccion 5'" de (es decir precediendo) un gen en un polfmero de ADN dado, se unen a protemas que determinan la frecuencia (o tasa) de inicio de la transcripcion. Colectivamente mencionadas como secuencia de ADN "promotora/reguladora" o "de control", estas secuencias que preceden a un gen seleccionado (o serie de genes) en un polfmero de ADN funcional cooperan para determinar si se producira la transcripcion (y finalmente la expresion) de un gen. Las secuencias de ADN que "siguen" a un gen en un polfmero de ADN y proporciona una senal para la terminacion de la transcripcion en ARNm se mencionan como secuencias "terminadoras" de la transcripcion.

El termino "recombinante", como se usa en este documento con referencia a una celula hospedadora bacteriana indica que la celula bacteriana replica un acido nucleico heterologo, o expresa un peptido o protema codificada por un acido nucleico heterologo (es decir, una secuencia "exogena a dicha celula"). Las celulas recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la celula. Las celulas recombinantes tambien contienen genes encontrados en la forma nativa de la celula, en la que los genes se modifican y reintroducen en la celula por medios artificiales. El termino tambien abarca celulas que contienen un acido nucleico endogeno para la celula que se ha modificado sin retirar el acido nucleico de la celula; dichas modificaciones incluyen aquellas obtenidas por remplazo genico, mutacion espedfica de sitio y tecnicas relacionada. Por consiguiente, un "polipeptido recombinante" es uno que se ha producido por una celula recombinante. Una "secuencia heterologa" o un "acido nucleico heterologo", como se usan en este documento, es uno que se origina de una fuente exogena a la celula hospedadora particular (por ejemplo, de una especie diferente) o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. Por tanto, un acido nucleico heterologo unido de forma funcional a un promotor es de una fuente diferente a la de la que se obtuvo el promotor o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. La secuencia heterologa puede introducirse de forma estable, por ejemplo, por transfeccion, transformacion, conjugacion o transduccion, en el genoma de la celula del microorganismo hospedador, en la que pueden aplicarse tecnicas que dependeran de la celula hospedadora en que se tiene que introducir la secuencia. Los expertos en la materia conocen diversas tecnicas y se divulgan, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Por consiguiente, una "celula hospedadora bacteriana" se entiende actualmente como una celula bacteriana que se ha transformado o transfectado, o tiene capacidad de transformacion o transfeccion por una secuencia polinucleotfdica exogena.

Por tanto, las secuencias de acido nucleico como se usan en la presente invencion, pueden estar comprendidas, por ejemplo, en un vector que tiene que transformarse/transfectarse de forma estable o introducirse de otro modo en las celulas del microorganismo hospedador.

Puede usarse una gran diversidad de sistemas de expresion para producir los polipeptidos de la invencion. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosomicos, episomicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriofagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de insercion, de elementos cromosomicos de levadura, de virus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos geneticos plasmfdicos y de bacteriofago, tales como cosmidos y fagomidos. Las construcciones del sistema de expresion pueden contener regiones de control que regulan la expresion, y tambien provocan la expresion. En general, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleotidos y para sintetizar un polipeptido en un hospedador, para la expresion a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresion por cualquiera de una diversidad de tecnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., supra. La tecnica es abundante en publicaciones de patente y bibliograffa que se refieren a metodologfas de "ADN recombinante" para el aislamiento, smtesis, purificacion y amplificacion de materiales geneticos para su uso en la transformacion de organismos hospedadores seleccionados. Por tanto, es conocimiento comun la transformacion de organismos hospedadores con ADN "hnbrido" vmco o plasirndico circular que incluye secuencias de ADN exogenas (es decir foraneas o "heterologas") seleccionadas. Los procedimientos conocidos en la tecnica implican en primer lugar la generacion de un vector de transformacion por escision enzimatica del ADN circular vmco o plasmfdico para formar hebras de ADN lineales. Las hebras de ADN exogeno seleccionadas que habitualmente incluyen secuencias que codifican un producto protemico deseado se preparan en forma lineal mediante el uso de enzimas iguales/similares. El ADN lineal vmco o plasmfdico se incuba con el ADN exogeno en presencia de enzimas de ligamiento que pueden lograr un proceso de restauracion y se forman vectores "hnbridos" que incluyen el segmento de ADN exogeno seleccionado "sometido a corte y empalme" en el plasmido de ADN vmco o circular.

La expresion "secuencia de acido nucleico que codifica..." en general se refiere a cualquier polirribonucleotido o polidesoxirribonucleotido, que puede ser ARN o ADN no modifica o ARN o ADN modificado, y en general representa un gen que codifica un determinado polipeptido o protema. La expresion incluye, sin limitacion, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias o regiones monocatenarias, bicatenarias y tricatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que es mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moleculas hnbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, mas tfpicamente, regiones bicatenarias o tricatenarias, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. La expresion tambien abarca polinucleotidos que incluyen una unica region continua o regiones discontinuas que codifican el polipeptido (por ejemplo, interrumpido por un fago integrado o una secuencia de insercion o edicion) junto con regiones adicionales que tambien pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

Como se usa en este documento, el termino "cultivar" significa hacer crecer una celula bacteriana en un medio y en condiciones permisivas y adecuadas para la produccion del oligosacarido u oligosacaridos deseados. Una combinacion de celulas hospedadoras bacterianas adecuadas, asf como medios y condiciones para su cultivo, estaran facilmente disponibles para un experto en la materia tras la lectura de la divulgacion de esta invencion en relacion con los antecedentes tecnicos y la experiencia del experto en la materia.

Debe entenderse que con la invencion como se divulga en este documento, es posible la produccion de uno o mas, es decir, dos, tres, cuatro, etc., oligosacaridos como se define en este documento, siempre que los acidos nucleicos respectivos que codifican las protemas/enzimas relevantes como se divulga en este documento esten comprendidos en la celula o celulas.

De acuerdo con una realizacion preferida, el metodo de acuerdo con la invencion comprende la etapa c) recuperar el oligosacarido del medio y/o las celulas bacterianas. Debe entenderse que la etapa c) sigue a la etapa b), es decir la etapa de cultivo, y la recuperacion pueden conseguirse siempre que el oligosacarido deseado como se define en este documento, o una cantidad deseada del mismo, se haya alcanzado por la etapa de cultivo.

Como se usa en este documento, el termino "recuperacion" significa aislar, recoger, purificar, colectar o separar de otro modo del- cultivo del microorganismo hospedador el oligosacarido producido por el microorganismo hospedador de acuerdo con la invencion.

Ademas, como se usa en este documento, se entiende que la expresion "actividades enzimaticas" comprende cualquier molecula que presente actividad enzimatica, en particular una protema, y que actue como catalizador para conseguir una reaccion bioqmmica espedfica mientras permanece inalterada por la reaccion. En particular, se entiende que las protemas con actividad enzimatica englobadas por esta expresion, son capaces de convertir un sustrato en un producto.

En reacciones enzimaticas, las moleculas al inicio del proceso, llamadas sustratos, se convierten en moleculas diferentes, llamadas productos. Casi todas las reacciones qmmicas en una celula biologica necesitan enzimas para que se produzcan a tasas suficientes para la vida. Como las enzimas son selectivas para sus sustratos y aceleran unicamente unas pocas reacciones entre muchas posibilidades, el conjunto de enzimas generado en una celula determina las rutas metabolicas que se producen en esa celula.

Con la celula bacteriana, su uso y los metodos como se describe en este documento, se descubrio sorprendentemente puede conseguirse la fermentacion total de un oligosacarido deseado como se define en este documento. La presente invencion utiliza un microorganismo bacteriano que tiene basicamente dos actividades enzimaticas espedficas, es decir, una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y al menos una actividad glucosiltransferasa, en un metodo, donde el microorganismo hospedador bacteriano, que crece en una fuente de carbono simple, produce de forma eficaz el oligosacarido deseado sin anadir lactosa.

Dentro del contexto de la presente invencion, se entiende que la expresion "sin la adicion exogena de lactosa" indica que no se anade lactosa al medio de cultivo en que se cultiva la celula hospedadora bacteriana de acuerdo con la invencion. "Exogeno" indicara lo contrario a "producido de forma endogena" por dicha celula, e indicara que la celula hospedadora bacteriana no se alimenta con lactosa durante ningun momento del metodo.

Aunque pueden emplearse microorganismos no modificados que tienen las caractensticas enzimaticas descritas anteriormente con el presente metodo, de acuerdo con un aspecto de la invencion, el microorganismo bacteriano es un microorganismo o celula bacteriana recombinante, en el que la celula bacteriana recombinante se ha transformado para que comprenda al menos las actividades enzimaticas mencionadas anteriormente.

La celula hospedadora bacteriana usada en el metodo de acuerdo con la invencion usa la fuente carbono, por ejemplo, glucosa, de la siguiente manera: en primer lugar, la fuente de carbono, es decir, glucosa, se internaliza por la celula bacteriana, es decir, se transporta a traves de la membrana citoplasmatica al citosol. En el citosol, la glucosa se galactosila, es decir se transfiere un resto de galactosa desde una galactosa activada con nucleotido presente (o generada en la celula) a la glucosa, mediante la enzima que presenta actividad beta-1,4-galactosiltransferasa para producir lactosa. Posteriormente, la lactosa se usa como aceptador para la actividad glucosiltransferasa que transfiere, por ejemplo, un resto fucosilo desde una fucosa activada con nucleotido hasta la lactosa, generando de este fucosil-lactosa. Este proceso puede conseguirse en la misma celula bacteriana que comprende la actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y al menos una actividad glucosiltransferasa, o la lactosa se exporte desde la celula que transporte una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y se usa por otra celula (bacteriana), que es una celula presente o anadida el medio, en cuyo caso la lactosa se capta/internaliza por dicha otra celula, que comprende la actividad glucosiltransferasa usando la lactosa como aceptador.

La fucosil-lactosa, o cualquier otro oligosacarido producido como se define en este documento, se transporta entonces desde la celula al medio en que se cultiva la celula bacteriana y puede recuperarse, por ejemplo, aislarse del mismo y, por tanto, proporcionarse para uso posterior.

En general, y durante toda la presente invencion, la expresion "actividad glucosiltransferasa" o "glucosiltransferasa" indica y abarca enzimas que son responsables de la biosmtesis de disacaridos, oligosacaridos y polisacaridos, y catalizan la transferencia de restos de monosacarido desde un monosacarido/azucar activado con nucleotido (el "donador de glucosilo") a una molecula aceptadora de glucosilo.

De acuerdo con la invencion, la glucosiltransferasa se selecciona de una galactosiltransferasa, una sialiltransferasa, una W-acetilglucosaminiltransferasa y una fucosiltransferasa.

De acuerdo con una realizacion preferida, en el metodo de la invencion y en la celula hospedadora bacteriana usada en el mismo, la glucosiltransferasa se selecciona de al menos una de las siguientes: alfa-1,2-fucosiltransferasa, alfa-1,3-fucosiltransferasa, beta-1,3-W-acetilglucosamiltransferasa, beta-1,3-galactosiltransferasa, alfa-2,3-sialiltransferasa, alfa-2,6-sialiltransferasa, beta-1,4-galactosiltransferasa o beta-1,6-galactosiltransferasa.

De acuerdo con realizaciones preferidas, para la smtesis de 2'-fucosil-lactosa, se expresa una 2-fucosiltransferasa adecuada ademas de la actividad beta-1,4-galactosiltransferasa. Para la smtesis de 3-fucosil-lactosa se expresa una 3-fucosiltransferasa adecuada ademas de la beta-1,4-galactosiltransferasa. Para la smtesis de 2',3-difucosil-lactosa, se expresa tanto una alfa-1,2-fucosiltransferasa como una alfa-1,3-fucosiltransferasa adecuadas ademas de la beta-1.4- galactosiltransferasa. Para la smtesis de lacto-W-tetraosa, se expresa una beta-1,3-W-acetilglucosamiltransferasa y una beta-1,3-galactosiltransferasa adecuadas en la celula hospedadora bacteriana productora ademas de la beta-1.4- galactosiltransferasa. Para la smtesis de polisacaridos incluso mas complejos tales como lacto-W-fucopentaosa I, la celula recombinante se prepara introduciendo acidos nucleicos para que tenga capacidad de expresion funcional de una beta-1,3-W-acetil-glucosamiltransferasa, beta-1,3-galactosiltransferasa y alfa-1,2-fucosiltransferasa adecuadas ademas de la beta-1,4-galactosiltransferasa.

Ejemplos no limitantes de glucosiltransferasas que pueden usarse de acuerdo con la invencion son, por ejemplo, fucosiltransferasas bacterianas y preferiblemente una alfa-1,2-fucosiltransferasa, y mas preferiblemente la alfa-1,2-fucosiltransferasa codificada por el gen wbgL de E. col/:O126 (n.° de acceso a GenBank ADN43847) o una alfa-1,3-fucosiltransferasa, y mas preferiblemente una alfa-1,3-fucosiltransferasa de Akkermans/a muc/n/ph/la, Bactero/des frag/l/s, Helicobacter pylori, Escherichia col/, Salmonella enter/ca, mammals, Caenorhabd/t/s elegans y Schistosoma mansoni. Preferiblemente, se usa una glucosiltransferasa o variantes de la misma que se divulga en el documento EP 2479263 A1 o en el documento EP 2439264 o en el documento WO 2010/142305.

"Variante o variantes", como se usa la expresion en este documento, es un polinucleotido o polipeptido que difiere de un polinucleotido o polipeptido de referencia, respectivamente, pero retiene las propiedades esenciales (enzimaticas) del polinucleotido o polipeptido de referencia. Una variante tfpica de un polinucleotido difiere en la secuencia de nucleotidos de otro polinucleotido de referencia. Cambios en la secuencia de nucleotidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoacidos de un polipeptido codificado por el polinucleotido de referencia. Cambios de nucleotidos pueden producir sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoacidos en el polipeptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza a continuacion. Una variante tfpica de un polipeptido difiere en la secuencia de aminoacidos de otro polipeptido de referencia. En general, las diferencias se limitan de modo que las secuencias del polipeptido de referencia y la variante son muy similares globalmente y, en muchas regiones, identicas. Un polipeptido variante y de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoacidos en una o mas sustituciones, adiciones, eliminaciones en cualquier combinacion. Un resto de aminoacidos sustituido o insertado puede ser uno codificado o no por el codigo genetico. Una variante de un polinucleotido o polipeptido puede ser de origen natural, tal como una variante alelica, o puede ser una variante que no se sabe que se produzca de forma natural. Las variantes que no son de origen natural de polinucleotidos y polipeptidos pueden prepararse por tecnicas de mutagenesis, por smtesis directa y por otros metodos recombinantes conocidos para los expertos en la materia.

Ademas, las variantes polimorficas, alelos, mutantes y homologos entre especies del acido nucleico/polinucleotido y polipeptido estan comprendidos por estas expresiones, que tienen una secuencia de aminoacidos que tiene mas de aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia de aminoacidos, un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, preferiblemente un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor identidad de secuencia de aminoacidos, preferiblemente sobre una region de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000, o mas aminoacidos, con un polipeptido codificado por una protema que presenta actividad glucosiltransferasa/beta-1,4-galactosiltransferasa de tipo silvestre.

Por consiguiente, un "fragmento funcional" de cualquiera de los genes/protemas divulgados en este documento, se entiende que indica variantes de secuencia de los genes/protemas que aun retienen la misma actividad o algo menor del gen o protema del que se obtiene el fragmento respectivo.

Por consiguiente, las expresiones "alfa-1,2-fucosiltransferasa" o "fucosiltransferasa" o un acido nucleico/polinucleotido que codifica una "alfa-1,2-fucosiltransferasa" o "fucosiltransferasa" se refieren a una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de fucosa desde un sustrato donador, por ejemplo, GDP-fucosa, hasta una molecula aceptadora en un enlace alfa-1,2. Las expresiones "alfa-1,3-fucosiltransferasa o fucosiltransferasa" o un acido nucleico/polinucleotido que codifica una "alfa-1,3-fucosiltransferasa o fucosiltransferasa" se refiere a una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de fucosa desde un sustrato donador, por ejemplo, GDP-fucosa, hasta una molecula aceptadora en un enlace alfa-1,3. La molecula aceptadora puede ser, por ejemplo, lactosa, lacto-W-triosa II, lacto-A/-tetraosa, lacto-W-neotetraosa o cualquier derivado de las mismas.

De acuerdo con una realizacion preferida, en el metodo de acuerdo con la invencion y en la celula hospedadora bacteriana usada en el mismo, esta comprendida ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una de las siguientes protemas adicionales: una protema exportadora de oligosacarido o una permeasa que exporte el oligosacarido sintetizado desde la celula hospedadora, una invertasa, una fructocinasa, protemas implicadas en la biosmtesis de GDP-fucosa, GDP-glucosa, GDP-manosa, UDP-W-acetilglucosamina, UDP-galactosa, UDP-W-acetilgalactosamina, acido y/o CMP-acido sialico.

Preferiblemente, la protema exportadora de oligosacarido o la permeasa es una protema que puede exportar un producto de oligosacarido soluble de la celula productora. Una realizacion ejemplar, que puede usarse como acido nucleico que expresa una protema exportadora, de acuerdo con un aspecto de la invencion, es el gen yberc0001_9420 de Yersinia bercovieri ATCC 43970 o variantes u homologos o fragmentos funcionales del mismo. Por consiguiente, una "protema exportadora" o "protema exportadora de oligosacarido" es cualquier protema que pueda exportar un oligosacarido desde una celula bacteriana. A este respecto, tambien se hace referencia a la divulgacion y particularmente a los ejemplos del documento WO 2010/142305, que describe y divulga exportadores de oligosacaridos y su uso.

Realizaciones ejemplares para las protemas exportadoras o permeasa mencionadas anteriormente son, por ejemplo, las protemas codificadas por el grupo genico csc, que comprende cuatro genes de sacarosa permeasa, fructocinasa, sacarosa hidrolasa y un represor transcripcional (cscB, cscK, csc.4 y cscR, respectivamente), la glucosa permeasa de Bacillus subtiilis, la glucosa permeasa de Streptomyces coelicolor o Streptomyces clavuligerus. Por consiguiente, en una realizacion preferida, la celula hospedadora bacteriana comprende ademas el grupo genico csc.

Realizaciones ejemplares para protemas implicadas en la biosmtesis de azucares de difosfato de nucleosido son, por ejemplo, una pirofosforilasa de azucar de difosfato de nucleosido, una azucar cinasa y, preferiblemente, fucosacinasa, GDP-fucosa-pirofosforilasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD), GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5 epimerasa, 4-reductasa, glucosacinasa, glucosa-6-fosfato 1-epimerasa, fosfoglucomutasa, glucosa-1-fosfato guaniltransferasa, CMP-sialato sintasa.

El acido nucleico puede ser un acido nucleico endogeno o recombinante.

Como se define anteriormente, el termino "endogeno" en este documento y en general dentro del campo, significa que le acido nucleico que codifica una enzima de interes se origina de la celula hospedadora bacteriana y no se ha introducido en dicha celula hospedadora, mientras que un acido nucleico "recombinante" se ha introducido en dicha celula hospedadora y no se origina en dicha hospedadora.

El acido nucleico puede ser homologo o heterologo. Actualmente, y como se entiende en general en el campo relevante, la expresion "homologo" se refiere a una secuencia de acido nucleico que codifica un producto o productos espedficos y se obtiene de la misma especie, en que dicha secuencia de acido nucleico se inserta. Por consiguiente, el termino "heterologo" se refiere a una secuencia de acido nucleico que codifica un producto o productos espedficos y que se obtiene de una especie diferente de aquella en que se inserta dicha secuencia de acido nucleico.

De acuerdo con otra realizacion, la celula hospedadora bacteriana usada en el metodo de la invencion comprende ademas secuencias de control que posibilitan la sobreexpresion controlada de secuencias de acido nucleico endogenas o recombinantes. Como se define anteriormente, la expresion "secuencia de control" que en este documento se usa como sinonimo de la expresion "secuencia de control de la expresion de acido nucleico", comprende secuencias promotoras, secuencia de senal o serie de sitios de union a factor de transcripcion, que son secuencias que afectan a la transcripcion y/o traduccion de una secuencia de acido nucleico unida de forma funcional a las secuencias de control.

Como ya se ha resumido anteriormente tambien, la secuencia de acido nucleico que se usa de acuerdo con la invencion puede estar comprendida, por ejemplo, en un vector que tiene que transformarse/transfectarse de forma estable en celula hospedadoras bacterianas. Las definiciones y descripcion detallada para la produccion recombinante que se resumen anteriormente tendran aplicacion para este parrafo.

En algunas realizaciones, la secuencia acido nucleico se coloca bajo el control de un promotor inducible, que es un promotor que dirige la expresion de un gen donde el nivel de expresion se puede alterar mediante factores ambientales o del desarrollo tales como, por ejemplo, temperatura, pH, condiciones anaerobicas o aerobicas, luz, factores de transcripcion y agentes qmmicos. Dichos promotores se mencionan en este documento como promotores "inducibles", que permiten controlar la cronologfa de la expresion de las protemas usadas en la presente invencion. Para E. coli y otras celulas hospedadoras bacterianas, los promotores inducibles son conocidos para los expertos en la materia.

De acuerdo con un aspecto de la invencion, la beta-1,4-galactosiltransferasa es una beta-1,4-galactosiltransferasa derivada de Neisseria meningitidis, y esta codificada preferiblemente por un gen seleccionado del grupo que consiste en LgtB de Neisseria meningitidis, o lex-1 de Aggregatibacter aphrophilus, o fragmentos funcionales de los mismos. Debe entenderse que un experto en la materia, tras leer esta invencion, sera capaz de identificar cualquier otra enzima que tenga beta-1,4-galactosiltransferasa y que acepte el monosacarido glucosa como sustrato y que finalmente se obtenga de cualquier otro organismo, cuya beta-1,4-galactosiltransferasa funcionara de la manera actualmente descrita y reivindicada.

Con la beta-1,4-galactosiltransferasa que se ha introducido en la celula hospedadora bacteriana de acuerdo con la invencion, la glucosa libre intracelular, que sirve como sustrato aceptador para la reaccion de p-1,4-galactosiltransferasa, se convierte en una estructura de disacarido de lactosa para la smtesis de HMO.

La combinacion de glucosa libre para la smtesis de lactosa puede proporcionarse suministrando glucosa mediante el medio de cultivo.

Como alternativa, la glucosa libre puede proporcionarse de forma intracelular usando un disacarido u oligosacarido que contiene glucosa como fuente de carbono para la celula hospedadora bacteriana recombinante. El disacarido u oligosacarido asf suministrado se escinde en monosacaridos, proporcionando de este modo glucosa libre y otros monosacaridos para la smtesis intracelular de HMO. Ademas de proporcionar glucosa libre o sacaridos que contienen glucosa, la glucosa para la smtesis de oligosacaridos tambien puede proporcionarse mediante el metabolismo (gluconeogenesis) de la celula recombinante.

Ademas de una combinacion de glucosa libre que actua como sustrato aceptador dentro de la celula hospedadora bacteriana, tambien se necesita un suministro eficaz de, por ejemplo, UDP-galactosa. Este suministro de UDP-galactosa puede obtenerse, por ejemplo, del metabolismo de las propias celulas, y el metabolismo puede mejorarse por modificacion genetica adicional, tal como la sobreexpresion de la UDP-galactosa-4'-epimerasa o la UDP-galactosa-4'-epimerasa en combinacion con la glucosa-1-fosfato-1-uridiniltransferasa.

Como alternativa, la UDP-galactosa puede obtenerse suministrando galactosa a la celula hospedadora bacteriana productora de HMO mediante el medio de fermentacion. La galactosa entonces se capta por la celula, se fosforila en galactosa-1-fosfato y despues se convierte en UDP-galactosa. Los genes que codifican estas actividades enzimaticas son bien conocidos en la bibliograffa (Grossiord et al., "Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway" (2003) J. Bacteriol 185(3) 870-878).

Para la smtesis de, por ejemplo, lacto-W-tetraosa, ademas de UDP-galactosa tambien se requiere UDP-W-acetilglucosamina. La UDP-W-acetilglucosamina tambien puede obtenerse del metabolismo de UDP-W-acetilglucosamina de la propia celula hospedadora bacteriana. La provision de UDP-W-acetilglucosamina para la smtesis de oligosacaridos que contienen W-acetilglucosamina puede mejorarse mediante la inactivacion del catabolismo de W-acetilglucosamina dentro de la celula productora.

Para la smtesis de HMO que contienen fucosa, tal como 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa y 2',3-fucosil-lactosa, aunque sin limitacion, se necesita GDP-L-fucosa. La GDP-fucosa para la smtesis de 2'-fucosil-lactosa puede proporcionarse, por ejemplo, mediante la accion de una enzima L-fucocinasa/GDP-pirofosforilasa bifuncional, codificada por el gen fkp de Bacteroidis fragilis, y suministrando L-fucosa a la celula sintetizadora de HMO. Asimismo, puede suministrarse acido sialico a la celula que despues se capta por la celula y se activa mediante una CMP-sialato sintasa en CMP-acido sialico. El CMP-acido sialico (tambien conocido como CMP-acido neurammico) entonces puede usarse para la smtesis de oligosacaridos que contienen acido sialico (tales como 3'-sialil-lactosa, 6'-sialil-lactosa, 3-fucosil-3'-sialil-lactosa).

Como alternativa para la provision de GDP-L-fucosa, pueden sobreexpresarse genes de la ruta de GDP-L-fucosa para aumentar el suministro de GDP-L-fucosa para la smtesis de HMO fucosilados tales como 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 2',3-difucosil-lactosa, lacto-W-fucopentaosa I y otros HMO fucosilados.

De acuerdo con una realizacion preferida del metodo de acuerdo con la invencion y la celula hospedadora bacteriana usada en el mismo, la celula hospedadora bacteriana es una cepa de Escherichia coli una especie de Lactobacillus, una cepa de Corynebacterium, una cepa de Bacillus, una cepa de Lactobacillus, una cepa de Streptococcus, una cepa de Enterococcus, una cepa de Lactococcus o una cepa de Clostridium. Preferiblemente, la celula hospedadora es una celula hospedadora bacteriana seleccionada de una celula de Corynebacterium glutamicum, Clotridium cellulolyticum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactococcus lactis. Un experto en la materia sera consciente de cepas bacterianas adicionales al leer la presente divulgacion.

De acuerdo con una realizacion preferida, el hospedador bacteriano usado en el metodo de acuerdo con la invencion se modifica adicionalmente (i) para que no exprese protemas de forma intracelular que degradan precursores de dicho oligosacarido, o (ii) para que tengan bloqueada la expresion de protemas de forma intracelular que degradan precursores de dicho oligosacarido, o (iii) se regulen de tal manera que no interfieran con la sintasa de los oligosacaridos deseados. En una realizacion preferida, dicha protema es una beta-galactosidasa y preferiblemente lacZ.

Ademas, con la expresion compuestos "precursores" se engloban los que estan implicados en la ruta biosintetica del oligosacarido de acuerdo con la invencion, en particular precursores endogenos, es decir, precursores que se producen y estan presentes de forma natural en la celula hospedadora.

La invencion, en una alternativa, tambien se refiere a un metodo para producir al menos un oligosacarido de interes por fermentacion total mediante celulas hospedadoras modificadas geneticamente, comprendiendo el oligosacarido de interes un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal, y comprendiendo el metodo las etapas de:

a) obtener una primera celula hospedadora bacteriana que comprende una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una protema que tiene una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y que puede galactosilar un monosacarido de glucosa libre para generar de forma intracelular lactosa, y obtener una segunda celula hospedadora bacteriana que comprende al menos una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una glucosiltransferasa que se selecciona de al menos una de las siguientes: una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa, una galactosiltransferasa;

b) cultivar dichas celulas hospedadoras bacterianas de la etapa a), en el que dicho cultivo se realiza (I) a partir de una fuente de carbono que se selecciona de al menos una de las siguientes: glucosa, sacarosa, glicerol, melazas, jarabe de mafz, galactosa, gas de smtesis, monoxido de carbono, metanol, succinato, piruvato, rafinosa, en el que la celula hospedadora puede generar glucosa libre dentro de la celula a partir de dicha fuente de carbono y (II) sin suministrar de forma externa lactosa durante la ejecucion del metodo, produciendo de este modo dicho oligosacarido de interes.

Como ya se ha explicado anteriormente para la celula hospedadora bacteriana, con el metodo de acuerdo con la invencion es posible fermentar completa o totalmente un oligosacarido de interes, sin la necesidad de anadir precursores a dicho oligosacarido, ya que, con el metodo presentado en este documento, el oligosacarido puede producirse de forma microbiana por las celulas hospedadoras que crecen en fuentes de carbono simples. De acuerdo con el metodo de la invencion, se proporciona una celula hospedadora bacteriana como se resume anteriormente, y se cultiva en una fuente de carbono simple, por ejemplo, en glucosa, que se internaliza por la celula bacteriana, es decir, se transporta a traves de la membrana citoplasmatica al citosol. En el citosol, la fuente de carbono, por ejemplo, la glucosa, se galactosila, es decir, se transfiere un resto de galactosa desde una galactosa activada con nucleotido presente (o generada en la celula) en la glucosa, que es una etapa catalizada por la actividad beta-1,4-galactosiltransferasa para producir lactosa. Posteriormente, la lactosa se usa como aceptador para una actividad glucosiltransferasa que transfiere, por ejemplo, un resto fucosilo de una fucosa activada con nucleotido a la lactosa, generando de ese modo, por ejemplo, fucosil-lactosa.

De acuerdo con el metodo de la invencion, este proceso puede conseguirse en la misma celula hospedadora bacteriana que comprende la actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y al menos una actividad glucosiltransferasa, o unicamente la primera etapa, es decir, la etapa (i), la galactosilacion se realiza en una primera celula bacteriana, la lactosa asf generada se exporta desde la primera celula bacteriana que porta una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa en el medio en que se cultiva la primera celula, y posteriormente se usa por otra, una segunda celula hospedadora bacteriana, que es una segunda celula hospedadora bacteriana presente o anadida al medio, y la lactosa se capta/internaliza por dicha segunda celula hospedadora bacteriana, que comprende la actividad glucosiltransferasa usando la lactosa como aceptador.

De acuerdo con una realizacion preferida del metodo de acuerdo con la invencion, el oligosacarido de interes es un oligosacarido de leche humana, preferiblemente un oligosacarido de leche humana seleccionado de al menos uno de los enumerados en la tabla 1 adjunta, preferiblemente seleccionado de 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 2'3-difucosil-lactosa, 3-sialil-lactosa, 6-sialil-lactosa, 3-fucosil-3'-sialil-lactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-A/-fucopentaosa I, lacto-W-fucopentaosa II, lacto-W-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-difucosilhexosa I, lacto-W-difucosilhexaosa II, lacto-W-sialilpentaosa LSTa, LSTb, LSTc.

Tabla 1: lista de oligosacaridos que pueden producirse de acuerdo con la invencion (figura 4)

De acuerdo con una realizacion preferida del metodo de la invencion en la etapa b), se usa un azucar activado con nucleotido producido de forma intracelular por la celula durante la ejecucion del metodo, siendo el azucar activado con nucleotido preferiblemente al menos uno de los siguientes: GDP-fucosa, UDP-W-acetilglucosamina, UDP-galactosa, UDP-W-acetilgalactosamina, CMP-acido sialico.

De acuerdo con otra realizacion preferida del metodo de la invencion, durante la ejecucion del metodo se anade externamente un azucar (no activado con nucleotido), en el que el azucar se selecciona de fucosa, glucosa, manosa, W-acetilglucosamina, galactosa, W-acetilgalactosamina, acido sialico y en el que el azucar se activa con nucleotido en dicha celula hospedadora bacteriana.

De acuerdo con un aspecto de la invencion, el metodo es un metodo de fermentacion total discontinuo o continuo. Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la invencion, es decir, en un metodo continuo, se anade constantemente una fuente de carbono al medio durante la etapa de cultivo de la celula hospedadora. Anadiendo constantemente la fuente de carbono durante la etapa de cultivo, se consigue una produccion constante y eficaz del oligosacarido. De acuerdo con otro aspecto, el metodo de acuerdo con la invencion es o incluye un metodo de fermentacion semicontinuo, con un cultivo semicontinuo de volumen constante, donde el sustrato se suministra sin diluir el cultivo, o cultivo semicontinuo de volumen variable, donde el volumen de fermentacion cambia con el tiempo de fermentacion debido al suministro de sustrato.

Se prefiere ademas en una realizacion de la presente invencion, que la celula hospedadora bacteriana se transforme ademas para que carezca de un gen que codifique beta-galactosidasa, o que comprenda un gen codificante de beta-galactosidasa no regulado, y L-fucosa isomerasa, L-fuculosa cinasa y UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa.

Esta realizacion tiene la ventaja de que se evita la degradacion intracelular de monosacaridos y la produccion de acido colonico y en el caso de la beta-galactosidasa no se degrada la molecula aceptadora.

De acuerdo con otra realizacion preferida, se aplica una glucosidasa en el metodo para producir un oligosacarido, en el que la glucosidasa se usa para degradar los productos secundarios obstaculizantes y/o indeseados, sustratos de partida sin usar y productos intermedios generados durante la produccion del oligosacarido deseado. Mediante la glucosidasa, puede conseguirse que, por ejemplo, se produzcan otros (oligo) sacaridos, ademas del oligosacarido deseado, con otros (oligo) sacaridos en el microorganismo durante la srntesis del oligosacarido deseado, y dichos otros oligosacaridos que impiden la etapa de purificacion del oligosacarido deseado pueden metabolizarse.

Pueden anadirse de forma externa una o mas glucosidasas al cultivo al final del proceso de produccion de acuerdo con la invencion, lo que es particularmente preferido cuando se han activado o eliminado genes endogenos del microorganismo hospedador que codifican glucosidasas. Como alternativa, la glucosidasa se produce de forma endogena por dicho microorganismo hospedador, en el que las secuencias de acido nucleico que codifican la glucosidasa producida de forma endogena no existen de forma natural en dicha celula hospedadora, y en el que dicha celula hospedadora se ha transformado de forma estable para que exprese la glucosidasa de origen natural, y en el que la expresion de la glucosidasa en el microorganismo hospedador es inducible.

De acuerdo con esta realizacion, el microorganismo productor de oligosacarido expresa de forma endogena, es decir, contenido en su genoma, la glucosidasa, por ejemplo, beta-galactosidasa, tras la induccion externa, por ejemplo, mediante temperatura o expresion inducida por sustrato, que de lo contrario no esta regulada. Esto significa que, durante la smtesis del oligosacarido deseado, la glucosidasa no esta regulada y puede inducirse, por ejemplo, por la temperatura o anadiendo un inductor, por ejemplo, tetraciclina, al final del proceso de fermentacion. La expresion de la glucosidasa se inducira despues haber producido una cantidad suficiente y/o esencialmente maxima de oligosacarido durante el cultivo del microorganismo hospedador. Posteriormente, la glucosidasa expresada degradara los intermedios de sacarido indeseados, sustratos, etc., haciendo que el medio este esencialmente libre de los intermedios de sacarido o sustratos que de lo contrario impedinan o complicanan la purificacion del oligosacarido deseado. Se conoce una combinacion de herramientas de expresion inducibles adecuadas en la tecnica anterior (vease, por ejemplo, Sambrook et. al, 1989, supra), y un experto sera capaz de aplicar una adecuada respectivamente para el oligosacarido deseado.

"Regulado" dentro del presente contexto con referencia a un gen se entiende en general como un gen cuya expresion puede regularse de una manera controlada, por ejemplo, regularse por disminucion o aumento, es decir, la cantidad de la protema sintetizada codificada por el gen regulado es diferente, por ejemplo, esta no regulado/regulado por disminucion o regulado por aumento, del gen de lo contrario no regulado.

De acuerdo con otro aspecto de la invencion, la glucosidasa se produce por un segundo microorganismo anadido adicionalmente al medio y que expresa la glucosidasa.

En esta realizacion, la glucosidasa expresada por el microorganismo es una glucosidasa de origen natural o una glucosidasa que esta codificada por una secuencia de acido nucleico que se ha integrado de forma estable en el genoma del segundo microorganismo. Esta realizacion es particularmente adecuada en un proceso de fermentacion continuo para la produccion del oligosacarido, donde, por ejemplo, se proporcionan dos vasos o recipientes de fermentacion diferentes, mientras que se usa un vaso/recipiente para la reaccion de smtesis de oligosacarido y el segundo vaso/recipiente se emplea esencialmente para la degradacion de sacaridos indeseados.

En la presente invencion, se usan celulas hospedadoras bacterianas como se divulga en este documento para producir oligosacaridos que comprenden un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal por fermentacion total mediante dichas celulas.

Salvo que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento en general tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invencion. En general, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genetica molecular, qmmica organica y qmmica de acidos nucleicos e hibridacion descritos anteriormente y a continuacion son los bien conocidos y habitualmente empleados en la tecnica.

Se deducen ventajas adicionales de la descripcion de las realizaciones y los dibujos adjuntos.

No hace falta decir que las caractensticas mencionadas anteriormente y las caractensticas que aun tienen que explicarse a continuacion pueden usarse no solamente en las combinaciones especificadas respectivamente, sino tambien en otras combinaciones o por sf mismas, sin alejarse del alcance de la presente invencion.

Se ilustran varias realizaciones de la invencion en las figuras y se explican en mayor detalle en la siguiente descripcion. En las figuras:

La fig. 1 muestra un dibujo esquematico para realizacion del metodo de acuerdo con la invencion: produccion de 2'-fucosil-lactosa (A); 3'-sialil-lactosa (B); y lacto-W-neotetraosa (C);

La fig. 2 muestra analisis de HPLC de sobrenadantes de cultivos de cepas de E. coli productoras de 2'-fucosillactosa: celulas cultivas en presencia de sacarosa y lactosa sin adicion de IPTG (A); celulas cultivadas en sacarosa (B), celulas cultivadas en sacarosa mas glucosa (C); celulas en reposo: cultivas en medio de sales minerales que contiene sacarosa (D) y glucosa (E);

La fig. 3 muestra los resultados de analisis de TLC de extractos de cultivo de la cepa BL21(DE3) de E. coli productora de lacto-W-neotetraosa: (A) extracto de cultivo de E. coli BL21 (DE3) 1046 (4) cultivada en presencia de glucosa; (B) extractos de cultivo de E. coli BL21 (DE3) 724 pCDF-galE pINT-malE-lex1 y E. coli b L21 (DE3) 724 pCDF-ga/E pINT-malE-IgtB, cultivadas en glucosa. LNnT;

La fig. 4 muestra una lista (tabla 1) de oligosacaridos que pueden producirse de acuerdo con la invencion; y La fig. 5 muestra mapas esquematicos de secuencias/plasmidos usados como realizaciones ejemplares en la celula hospedadora bacteriana de acuerdo con la invencion: P^tet-lacY-FRT-add1-FRT (SEQ ID NO: 1 de la lista de secuencias adjunta) (A); P^{t e r}wbgL-FRT-neo-FRT SEQ ID NO: 2 de la lista de secuencias adjunta) (B); P^tet-yberc0001_9420-FRT-cat-FRT (SEQ ID NO: 3 de la lista de secuencias adjunta) (C); P^tet-manCB,P^{j 5}-gmd-wcaG-FRT-dhfr-FRT (SEQ ID NO: 4 de la lista de secuencias adjunta) (D); cscBKAR (SEQ ID NO: 5 de la lista de secuencias adjunta) (E); galMKTE (SEQ ID NO: 6 de la lista de secuencias adjunta) (F); pCDF-galE (SEQ ID NO: 7 de la lista de secuencias adjunta) (G); pDEST-/gtB (SEQ ID NO: 8 de la lista de secuencias adjunta) (H); P^tet-/gM-P^{i 5}-galT-FRT-^anR-FRT (SEQ ID NO: 9 de la lista de secuencias adjunta) (I); P^tet-glmUM-P^{j 5}-glmS-FRT-dhfr-FRT (SEQ ID NO: 10 de la lista de secuencias adjunta) (J); P^{j 5}-/gtB-FRT-tetR-FRT (SEQ ID NO: 11 de la lista de secuencias adjunta) (K); P^t5-galE-FRT-cat-FRT FRT (SEQ ID NO: 12 de la lista de secuencias adjunta) (L); pINT-malE-/gtB (SeQ ID No : 13 de la lista de secuencias adjunta) (M).

Descripcion detallada de realizaciones preferidas

La fig. 1 muestra rutas ejemplares para la fermentacion total de oligosacaridos ejemplares usando realizaciones ejemplares de las celulas hospedadoras bacterianas y usando los metodos de la invencion. En las figuras 1A, 1B y 1C, el numero de referencia 100 indica una celula hospedadora bacteriana ejemplar que se ha modificado geneticamente de acuerdo con la invencion, con respecto a diferentes oligosacaridos de interes.

Como puede observase de la fig. 1A, que muestra la produccion ejemplar esquematica, es decir, la fermentacion total, de 2'-fucosil-lactosa, se usa de forma ejemplar sacarosa como fuente de carbono. Mediante una sacarosa permeasa (1), la sacarosa se capta o internaliza en la celula hospedadora. Dentro de la celula hospedadora bacteriana, la sacarosa se degrada por la invertasa (2) en fructosa y glucosa. La fructosa se fosforila por la fructocinasa (4) en fructosa-6-fosfato, que puede convertirse mediante una fosfohexosa isomerasa (5) en glucosa-6-fosfato, sigue mediante una conversion por fosfoglucomutasa (6) en glucosa-1-fosfato, que a su vez se convierte mediante la glucosa-1-fosfato uridiltransferasa (7) en UDP-glucosa. La UDP-glucosa se hace reaccionar con UDP-galactosa, catalizada por la enzima UDP-galactosa-4-epimerasa (8). La beta-1,4-galactosiltransferasa (3) entonces cataliza la reaccion uDP-galactosa glucosa => UDP lactosa.

Por tanto, la lactosa producida de forma intracelular posteriormente puede convertirse y usarse como base para la produccion de oligosacaridos (veanse los ejemplos anteriores). En la realizacion mostrada en la fig. 1, la lactosa se convierte mediante la enzima alfa-1,2-fucosiltransferasa (14), usando GDP-fucosa como sustrato donador, en el producto final, es decir, 2'-fucosil-lactosa.

La UDP-fucosa puede producirse de forma intracelular (o anadirse): la enzima manosa fosfato isomerasa (9) cataliza la conversion de fructosa-6-fosfato en manosa-6-fosfato, que se convierte mediante la enzima fosfomanomutasa (10) en manosa-1-fosfato. La enzima manosa-1-fosfato guanililtransferasa (11) cataliza la conversion de manosa-1-fosfato en GDP-manosa, que se convierte en GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa mediante la GDP-D-manosa-4,6-deshidratasa (12). Entonces, la GDP-L-fucosa sintasa (13) cataliza la reaccion de GDP-fucosa, que se usa como sustrato donador por la enzima alfa-1,2-fucosiltransferasa (14) como se describe anteriormente. La 2'-fucosil-lactosa asf producida de forma intracelular posteriormente se exporte por un exportador o permeasa (15).

La fig. 1B muestra la produccion ejemplar esquematica, es decir, la fermentacion total de 3'-sialil-lactosa usando una realizacion ejemplar de la celula hospedadora bacteriana y usando el metodo de acuerdo con la invencion, usando las siguientes enzimas: (1) sacarosa permeasa, (2) invertasa, (3) p-1,4-galactosiltransferasa, (4) fructocinasa, (5) glucosa-6-fosfato isomerasa, (6) fosfoglucomutasa, (7) glucosa-1-fosfato uridiltransferasa, (8) UDP-galactosa-4-epimerasa, (9) L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa, (10) fosfoglucosamina mutasa, (11) N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferasa/glucosamina-1-fosfato acetiltransferasa, (12) UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa, (13) acido sialico sintasa, (14) CMP-acido sialico sintetasa, (15) alfa-2,3-sialiltransferasa, (16) transportador de flujo de azucar, (17) glucosamina-6-fosfato-acetiltransferasa, (18) fosfatasa, (19) N-acetilglucosamina-2-epimerasa.

La fig. 1C muestra la produccion ejemplar esquematica, es decir, la fermentacion total de lacto-N-neotetraosa, usando una realizacion ejemplar de la celula hospedadora bacteriana y usando el metodo de acuerdo con la invencion, usando las siguientes enzimas: (1) sacarosa permeasa, (2) sacarosa-6-fosfato hidrolasa, (3) beta-1,4-galactosiltransferasa, (4) fructocinasa, (5) glucosafosfato isomerasa, (6) fosfoglucomutasa, (7) glucosa-1-fosfato uridiltransferasa, (8) UDP-galactosa-4-epimerasa, (9) L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa, (10) fosfoglucosamina mutasa, (11) N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferasa/glucosamina-1-fosfato acetiltransferasa, (12) beta-1,3-N-acetilglucosamina transferasa.

Como ya se ha resumido anteriormente tambien, la celula hospedadora bacteriana de acuerdo con la invencion puede transformarse para que comprende, ademas de la beta-1,4-galactosiltransferasa y una glucosiltransferasa como se define anteriormente, al menos una, es decir, una o mas de las enzimas mostradas en la fig. 1A a 1C, y resumidas en la descripcion.

Ejemplo 1

Desarrollo de la cepa de produccion de 2'-fucosil-lactosa de E. coli

Se uso Escherichia coli BL21 (DE3) para construir una cepa productora de 2'-fucosil-latosa. La ingeniena metabolica incluyo mutagenesis y eliminaciones de genes espedficos, respectivamente, e integraciones genomicas de genes heterologos.

Los genes lacZ y araA se inactivaron por mutagenesis usando oligonucleotidos con emparejamiento incorrecto como se describe por Ellis et al., "High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single stranded oligonucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6742-6746 (2001).

Se realizaron eliminaciones genomicas de acuerdo con el metodo de Datsenko y Warner ("One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 97:6640-6645 (2000)). Para evitar la degradacion intracelular de L-fucosa, se han eliminado genes que codifican L-fucosa isomerasa (fucl) y L-fuculosa cinasa (fucK) del genoma de la cepa de E. coli BL21 (DE3). Ademas, se eliminaron los genes wzxC-wcaJ. WcaJ probablemente codifica una UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa que cataliza la primera etapa la smtesis de acido colanico (Stevenson et al., "Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid", J. Bacteriol. 178:4885-4893; (1996)); la produccion de acido colanico competiria por GDP-fucosa con la reaccion de fucosiltransferasa. Ademas, se eliminaron los genes nagA y nagB, que codifican la A/-acetil-glucosamina-6-fosfato desacetilasa y la glucosamina-6-fosfato desaminasa, respectivamente.

Se realizo integracion genomica de genes heterologos por transposicion. Se uso la transposasa EZ-Tn5™ (Epicentre, EE. UU.) para integrar fragmentos de ADN lineales o se uso el mutante C9 hiperactivo de la transposasa de mariner Himarl (Lampe et al., "Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433 (1999)) para la transposicion. Para producir transposomas EZ-Tn5, se amplifico el gen de interes junto con un casete de resistencia a antibiotico flanqueado por sitios FRT con los cebadores 1119 y 1120 (todos los cebadores usados se enumeran en la tabla 3); el producto de PCR resultante portaba en ambos sitios los sitos de reconocimiento Mosaic End de 19 pb para la transposasa EZ-Tn5. Para la integracion usando la transposasa Himar1, se clonaron operones de interes junto con casetes de resistencia a antibiotico flanqueados por sitios FRT en el vector pEcomar. La transposasa esta codificada en pEcomar bajo el control de P^araB. Los transposones de EZ-Tn5 <P^tet-lacY-FRT-aadA-FRT> (SEQ ID NO: 1 de la lista de secuencias), <P^tet-wbgLco-FRT-neo-FRT> (SEQ ID NO: 2 de la lista de secuencias) y <P^tet-yberc0001_9420-FRT-cat-FRT> (S^eQ ID NO: 3 de la lista de secuencias) se integraron por mediacion de la transposasa EZ-Tn5.

Despues de la integracion satisfactoria del gen del importador de lactosa LacY de E. coli K12 TG1 (n.° de acceso ABN72583), se elimino el gen de resistencia de los clones resistentes a estreptomicina por la FLP recombinasa codificada en el plasmido pCP20 (Datsenko y Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)).

El gen de la alfa-1,2-fucosiltransferasa wbgL de E. coli:O126 (n.° de acceso ADN43847) se optimizo en los codones para su expresion en E. coli y se preparo sinteticamente por GenScript Cooperation (EE. UU.). El gen yberc0001_9420 que codifica un transportador de flujo de azucar de la superfamilia de facilitadores principales de Yersinia bercovieri ATCC 43970 (n.° de acceso EEQ08298) se sintetizo por GenScript Cooperation (EE. UU.) y se inserto como el transposon de EZ-Tn5 <P^tet-yberc0001_9420-FRT-cat-FRT>.

Para potenciar la smtesis de novo de GDP-fucosa, se sobreexpresaron los gene que codifican la fosfomanomutasa (manB), manosa-1-fosfato guanosiltransferasa (manC), GDP-manosa-4,6-deshidratasa (gmd) y GDP-L-fucosa sintasa (wcaG) de E. coli K12 DH5a en la cepa de E. coli BL21(DE3); el operon manCB esta bajo el control de P^tet, el operon gmd, wcaG se transcribe a partir del promotor P^t5. El casete de transposon <P^tet-manCB-P^{j 5}-gmd, wcaG-FRT-dhfr-FRT>>SEQ ID NO: 4, flanqueado por las repeticiones terminales invertidas reconocido espedficamente por la transposasa Himar1 del elemento de tipo mariner se inserto a partir de pEcomar C9-manCB-gmd, wcaG-dhfr. El grupo genico csc (SEQ ID NO: 5 de la lista de secuencias) de E. coli W (n.° de acceso CP002185.1) comprende cuatro genes para sacarosa permeasa, fructocinasa, sacarosa hidrolasa y un represor transcripcional (genes cscB, cscK, cscA y cscR, respectivamente), que posibilitan que la cepa crezca en sacarosa como unica fuente de carbono. El grupo csc se integro en el genoma de la cepa de E. coli BL21 (DE3) por transposicion usando el plasmido pEcomar-cscABKR.

El operon gal (galETKM) (SEQ ID NO: 6 de la lista de secuencias) se amplifico a partir de E. coli K12 TG1 usando los cebadores 605 y 606 y se inserto en el locus galM ybhJ de la cepa de E. coli BL21 (DE3) por recombinacion homologa facilitada mediante el uso del plasmido pKD46 auxiliar de recombinasa red (Datsenko y Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)).

Construccion de plasmido

pCDF-ga/E (SEQ ID NO: 7 de la lista de secuencias): Usando el ADN genomico de E. coli K12 como molde, se amplifico galE usando los cebadores 1163 y 1162. El producto de PCR se purifico, se restringio con las endonucleasas de restriccion Ndel y XhoI y se ligo en el segundo sitio de clonacion multiple del vector pCDF (Novagen), que se corto con las mismas enzimas.

pDest-lgtB (SEQ ID NO: 8 de la lista de secuencias): El gen para la b-1,4-galactosiltransferasa IgtB de Neisseria meningitis se clono mediante una reaccion de acceso (Invitrogen) en el vector pDEST14.

Tabla 2: Cepas y plasmidos

Tabla 3: Oligonucleotidos usados para PCR

Produccion de 2'-fucosil-lactosa por celulas en reposo

Se cultivo E. coli BL21 (DE3) 878 que alberga los plasmidos pCDF-galE y pDEST-/gtB en caldo 2YT que contema ampicilina 100 |jg ml-1 y estreptomicina 50 |jg ml-1 a 30 °C. Se inocularon 300 ml de caldo 2YT fresco que contema los mismos antibioticos con un 0,3 % (vol/vol) del cultivo que ha crecido durante la noche. Las celulas se cultivaron a 30 °C hasta una DO 660 nm de 0,3, y se indujo la expresion genica de galE y /gtB mediante la adicion de IPTG 0,35 mM. Las celulas se recogieron en esterilidad por centrifugacion despues de 5 h de crecimiento a 30 °C, y se resuspendieron en 50 ml de medio de sales minerales esteril (Samain et al., "Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes", J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)) que contema los antibioticos mencionados anteriormente y un 2 % (p/vol) de sacarosa y glucosa, respectivamente, como fuente de carbono. Las celulas se cultivaron a 25 °C durante cuatro dfas.

La 2'-fucosil-lactosa secretada en el sobrenadante se detecto por HPLC.

Fermentacion de 2'-fucosil-lactosa por sobreexpresion de galE y /gtB

Se cultivo E. coli BL21 (DE3) 878 que alberga los plasmidos pCDF-galE y pDEST-/gtB a 30 °C en medio de sales minerales (Samain et al., "Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes", J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)) que contema ampicilina 100 |jg ml-1 y estreptomicina 50 jg ml-1 y como fuente de carbono un 2 % (p/vol) de sacarosa, y un 1,6 % (p/vol) de sacarosa y un 0,4 % (p/vol) de glucosa, respectivamente. Cuando los cultivos alcanzaron una DO 660 nm de 0,3, se indujo la expresion genica de galE y /gtB mediante la adicion de IPTG 0,35 mM. Despues de la induccion, las celulas se cultivaron durante cuatro dfas a 25 °C.

Como control, se cultivo E. coli BL21 (DE3) 878 en medio de sales minerales que contema un 2 % (p/vol) de sacarosa como fuente de carbono. Cuando se hubo alcanzado una DO 660 nm de 0,5 se anadio lactosa 10 mM. Las celulas se cultivaron durante dos dfas a 30 °C.

La 2'-fucosil-lactosa secretada en el sobrenadante se detecto por HPLC.

Analisis de sobrenadante de cultivo y deteccion de 2'-fucosil-lactosa por HPLC

Se realizo analisis por cromatograffa de Kquidos de alto rendimiento (HPLC) usando un detector de mdice de refraccion (RID-10A) (Shimadzu, Alemania) y un carbohidrato ReproSil, 5 pm (250 mm x 4,6 mm) (Dr. Maisch GmbH, Alemania) conectado a un sistema de HPLC (Shimadzu, Alemania). Se realizo elucion de forma isocratica con acetonitrilo:H²O (v/v) como eluyente a 35 °C y un caudal de 1,4 ml/min. Se aplicaron 40 pl de la muestra a la columna. Las muestras se filtraron (tamano de poro de 0,22 pm) y se aclararon por extraccion en fase solida en una matriz de intercambio ionico (Strata ABW, Phenomenex).

Los resultados de los analisis de HPLC se muestran en la fig. 2, que muestran los analisis de HPLC de sobrenadantes de cultivo de E. coli BL21 (DE3) 878 pCDF-galE pDEST-IgtB productora de 2'-fucosil-lactosa. La fig.

2A muestra E. coli BL21 (DE3) 878 pCDF-galE pDEST-IgtB cultivada en presencia de sacarosa y lactosa sin adicion de IPTG; la fig. 2B muestra celulas cultivadas en sacarosa, la fig. 2C muestra celulas cultivadas en sacarosa mas glucosa; la expresion de galE y IgtB se indujo con IPTG 0,35 mM a una DO 660 nm de 0,3.

Las fig. 2D y 2E muestran los resultados de HPLC de celulas en reposo: Se precultivaron celulas de E. coli BL21 (DE3) 878 pCDF-galE pDEST-IgtB en caldo 2YT y se indujeron con IPTG 0,35 mM; despues de la recoleccion, las celulas se cultivaron en medio de sales minerales que contema sacarosa (fig. 2D) y glucosa (fig. 2E), respectivamente.

Como puede observarse a partir de los analisis de HPLC de la fig. 2, el producto final de las realizaciones ejemplares resumidas anteriormente, es decir, 2'-fucosil-lactosa, se produjo de forma eficaz tras la fermentacion de las celulas hospedadoras bacterianas de acuerdo con la invencion en sacarosa, sacarosa mas glucosa, celulas en reposo en sacarosa y celulas en reposo en glucosa.

Ejemplo 2

Produccion de LNnT por una cepa de E. coli recombinante mediante sobreexpresion de galE y una beta-1,4-galactosiltransferasa sin la adicion de lactosa extracelular

Desarrollo de la cepa de produccion de lacto-W-neotetraosa de E. coli

Se uso Escherichia coli BL21 (DE3) para construir una cepa productora de lacto-W-neotetraosa (LNnT). La ingenieria metabolica incluyo mutagenesis y eliminaciones de genes espedficos, respectivamente, e integraciones genomicas de genes heterologos.

Se inactivaron los genes lacZ y araA por mutagenesis usando oligonucleotidos con emparejamiento incorrecto como se describe por Ellis et al., "High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single stranded oligonucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6742-6746 (2001).

Se realizaron eliminaciones genomicas de acuerdo con el metodo de Datsenko y Warner ("One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. ^uS^a97:6640-6645 (2000)). Para evitar la degradacion intracelular de W-acetilglucosamina, se eliminaron los genes que codifican W-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilasa (nagA) y glucosamina-6-fosfato desaminasa (nagB) del genoma de la cepa de E. coli BL21 (DE3). Tambien se eliminaron los genes wzxC-wcaJ. wcaJ codifica una UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa que cataliza la primera etapa en la smtesis de acido colanico (Stevenson et al., "Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid", J. Bacteriol. 178:4885-4893; (1996)). Ademas, se eliminaron los genes fucl y fucJ, que codifican la L-fucosa isomerasa y la L-fuculosa cinasa, respectivamente.

Se realizo integracion genomica de genes heterologos por transposicion. Se uso la transposasa EZ-Tn5™ (Epicentre, EE. UU.) para integrar fragmentos de ADN lineales o se empleo el mutante C9 hiperactivo de la transposasa de mariner Himar1 (Lampe et al., "Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433 (1999)) para la transposicion. Para producir transposomas EZ-Tn5, se amplifico el gen de interes junto con un marcador de resistencia a antibiotico flanqueado por sitios FRT con los cebadores 1119 y 1120 (todos los cebadores usados se enumeran en la tabla 5); el producto de PCR resultante portaba en ambos sitios los sitos de reconocimiento Mosaic End de 19 pb para la transposasa EZ-Tn5. Para la integracion usando la transposasa Himar1, las construcciones de expresion (operones) de interes se clonaron asimismo junto con un marcador de resistencia a antibiotico flanqueado por sitios FRT en el vector pEcomar. El vector pEcomar codifica el mutante C9 hiperactivo de la transposasa Himar1 de mariner bajo el control del promotor P^araBinducible por arabinosa.

Los fragmentos de expresion <P^tet-lacY-FRT-aadA-FRT> y < P^t5-galE-FRT-cat-FRT> (SEQ ID NO: 12 de la lista de secuencias) se integraron usando la transposasa EZ-Tn5. Despues de la integracion satisfactoria del gen para el importador de lactosa LacY de E. coli K12 TG1 (n.° de acceso ABN72583), se elimino el gen de resistencia de los clones resistentes a estreptomicina mediante la FLP recombinasa codificada en el plasmido pCP20 (Datsenko y Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). El gen de la N-acetilglucosamina glucosiltransferasa y IgtA de Neisseria meningitidis MC58 (n.° de acceso NP_274923) se optimizo en los codones para su expresion en E. coliy se preparo sinteticamente por smtesis genica. Juntos con el gen galT, que codifica una galactosa-1-fosfato uridiltransferasa de E. coli K-12 subcepa MG1655 (n.° de acceso NP_415279) que se obtuvo asimismo por smtesis genica, se inserto IgtA por transposicion (SEQ ID NO: 9 de la lista de secuencias) usando el plasmido pEcomar-IgtA-galT. Para potenciar la smtesis de novo de UDP-N-acetilglucosamina, se optimizaron los codones de los genes que codifican L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa (glmS), fosfoglucosamina mutasa de E. coli K-12 subcepa MG1655 (glmM) y N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferasa/glucosamina-1-fosfato acetiltransferasa (glmU) de E. coli K-12 subcepa. MG1655 (n.° de acceso NP_418185, NP_417643, NP_418186, respectivamente) y se obtuvieron por smtesis genica. El operon glmUM se clono bajo el control del promotor P^tetde tetraciclina constitutivo mientras que glmS se clono bajo el promotor Pt⁵constitutivo. El casete de transposon <P^tet-glmUM-P^T5-glmS-FRT-dhfr-FRT> (SEQ ID NO: 10 de la lista de secuencias), flanqueado por las repeticiones terminales invertidas reconocidas espedficamente por la transposasa Himar1 de elemento tipo mariner se inserto desde pEcomar-glmUM-glmS. El gen de la beta-1,4-galactosiltransferasa IgtB de N. meningitidis MC58 (n.° de acceso NP_274922) se optimizo en los codones para su expresion en E. coli y se preparo sinteticamente. La incorporacion en el genoma de E. coli BL21(De3) se produjo por transposicion del casete <P^t5-IgtB-FRT-tetR-FRT> (SEQ ID NO: 11 de la lista de secuencias) a partir del plasmido pEcomar-IgtB. Ademas, para mejorar la smtesis de UDP-galactosa, se sobreexpreso el gen de la UDP-galactosa-4-epimerasa galE de E. coli K12 DH5a en la cepa de E. coli BL21(DE3). El operon gal (galETKM) se amplifico a partir de E. coli K12 TG1 usando los cebadores 605 y 606 y se inserto en el locus galM ybhJ de la cepa de E. coli b L21(DE3) por recombinacion homologa facilitada usando el plasmido pKD46 auxiliar de recombinasa red (Datsenko y Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Las secuencias de los genes heterologos y los grupos genicos estan depositadas en el apendice 1.

Construccion de plasmido

Usando ADN genomico de E. coli K12 DH5a como molde, se amplifico galE usando los cebadores 1163 y 1162. El producto de PCR se purifico, se restringio con las endonucleasas de restriccion Ndel y XhoI y se ligo en el segundo sitio de clonacion multiple del vector pCDF (Novagen), que se corto con las mismas enzimas. galE se expresa a partir del promotor T7 inducible por IPTG. Los genes para las p-1,4-galactosiltransferasas IgtB de Neisseria meningitis (n.° de acceso NP_274922) y lex1 de Aggregatibacter aphrophilus NJ8700 (n.° de acceso YP_003008647) se optimizaron en los codones y se sintetizaron sinteticamente por GenScript Cooperation (EE. UU.). La clonacion de ambos genes se produjo por clonacion independiente de secuencia y ligamiento (Li y Elledge, "Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.", Nat. Methods. marzo de 2007;4(3):251-6. Epub 11 de febrero de 2007). Por lo tanto, se uso el plasmido pINT, que alberga el gen malE bajo el control de un promotor inducible por anhidrotetraciclina, que posibilita la generacion de una fusion en el extremo N de malE con el gen de la beta-1,4-galactosiltransferasa codificada por el gen IgtB o el gen lex1.

Tabla 4: Cepas y plasmidos

Tabla 5: Oligonucleotidos usados para PCR

Fermentacion discontinua de E. coli BL21 (DE3) 1046

Se cultivo E. coli BL21 (DE3) 1046 durante 48 horas a 30 °C en medio de sales minerales (Samain et al., "Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes", J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)) que contema glucosa al 2 % (p/vol) como unica fuente de carbono y energfa. Las celulas se recogieron y alteraron mecanicamente. La produccion de LNnT se detecto por cromatograffa en capa fina.

Fermentacion discontinua de E. coli BL21 (DE3) 724 pCDF-galE pINT-malE-IgtB/pINT-malE-lex1

Se cultivo E. coli BL21 (DE3) 724 que alberga los plasmidos pCDF-ga/E y pINT-malE-IgtB o pINT-malE-lex1 a 30 °C en medio de sales minerales (Samain et al., "Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes", J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)) complementado con glucosa al 2% (p/vol), ampicilina a 100 |jg ml-1 y zeocina a 40 |jg ml-1. Cuando los cultivos alcanzaron una DO 660 nm de 0,1, se indujo la expresion genica del gen galE y la p-1,4-galactosiltransferasa por adicion de IPTG 0,3 mM y 200 ng/ml de anhidrotetraciclina. Despues de incubacion durante 48 horas a 30 °C en matraces de agitacion, las celulas se recogieron y alteraron mecanicamente. LNnT se detecto por cromatograffa in capa fina.

Deteccion de lacto-W-neotetraosa (LnNT) por cromatograffa en capa fina (TLC)

Las celulas se alteraron mecanicamente usando microesferas de vidrio. Posteriormente, las muestras se aplicaron a gel de silice de TLC 60 F²⁵⁴(Merck, Alemania). La fase movil estaba compuesta de acetona:butanol:acido acetico:agua (35:35:7:23).

Analisis de TLC de extracto de cultivo de cepa de E. coli BL21 (DE3) productora de lacto-W-neotetraosa

La fig. 3 muestra los analisis de TLC (cromatograffa en capa fina) de extractos de cultivo de celulas de E. coli BL21 (DE3) productoras de lacto-W-neotetraosa. la fig. 2A muestra los resultados de un extracto de cultivo de E. coli BL21 (DE3) 1046 (4) cultivada en presencia de glucosa, con los siguientes patrones: lactosa (carril 1), lacto-W-triosa II (carril 2) y lacto-W-neotetraosa (carril 3). La fig. 3B muestra los resultados de extractos de cultivo de E. coli BL21 (DE3) 724 pCDF-galE pINT-malE-lex1 (carril 5) y E. coli BL21 (DE3) 724 pCDF-galE pINT-malE-IgtB (carril 6) cultivadas en glucosa. La formacion del producto LNnT en las muestras esta marcada con asteriscos.

Por tanto, los resultados presentados en la fig. 3 muestran la produccion eficaz de lacto-W-neotetraosa que se logro con los metodos de acuerdo con la invencion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para producir al menos un oligosacarido de interes por fermentacion total mediante celulas hospedadoras modificadas geneticamente, comprendiendo el oligosacarido de interes un disacarido de la galactosa-(1->4)-glucosa terminal, y comprendiendo el metodo las etapas de:

a) obtener

(i) una celula hospedadora bacteriana que puede producir oligosacaridos que comprenden un disacarido de galactosa-(1->4)-glucosa terminal, y que comprende

- al menos una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una protema que tiene una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y que puede galactosilar un monosacarido de glucosa libre para generar de forma intracelular lactosa,

- al menos una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una glucosiltransferasa que se selecciona de al menos una de las siguientes: una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa, una galactosiltransferasa,

y dicha celula hospedadora bacteriana puede generar el oligosacarido sin la adicion exogena de lactosa, o (ii) una primera celula hospedadora bacteriana que comprende una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una protema que tiene una actividad beta-1,4-galactosiltransferasa y que puede galactosilar un monosacarido de glucosa libre para generar de forma intracelular lactosa, y una segunda celula hospedadora bacteriana que comprende al menos una secuencia de acido nucleico recombinante que codifica una glucosiltransferasa que se selecciona de al menos una de las siguientes: una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa, una galactosiltransferasa;

b) cultivar dichas celulas hospedadoras bacterianas (i) o (ii) de la etapa a), en el que dicho cultivo se realiza (I) a partir de una fuente de carbono que se selecciona de al menos una de las siguientes: glucosa, sacarosa, glicerol, melazas, jarabe de mafz, galactosa, gas de smtesis, monoxido de carbono, metanol, succinato, piruvato, rafinosa, en el que la celula hospedadora puede general glucosa libre dentro de la celula a partir de dicha fuente de carbono, y (II) sin suministrar de forma externa lactosa durante la ejecucion del metodo, produciendo de este modo dicho oligosacarido de interes.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el oligosacarido de interes es un oligosacarido de leche humana, preferiblemente un oligosacarido de leche humana seleccionado de al menos uno de los enumerados en la tabla 1 adjunta, preferiblemente seleccionado de 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 2',3-difucosil-lactosa, 3'-sialil-lactosa, 6'-sialil-lactosa, 3-fucosil-3'-sialil-lactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-W-fucopentaosa I, laco-W-fucopentaosa II, lacto-W-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-difucosilhexaosa I, lacto-W-difucosilhexaosa II, lacto-W-sialilpentaosa LSTa, LSTb, LSTc.

3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que, en la etapa b), se usa un azucar activado con nucleotido producido de forma intracelular por la celula durante la ejecucion del metodo, siendo el azucar activado con nucleotido preferiblemente al menos uno de los siguientes: GDP-fucosa, GDP-manosa, UDP-glucosa, UDP-W-acetilglucosamina, UDP-galactosa, UDP-W-acetilgalactosamina, CMP-acido sialico.

4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones de metodo precedentes, en el que, durante la ejecucion del metodo, se anade de forma externa azucar no activado con nucleotido, en el que el azucar no activado con nucleotido se selecciona de fucosa, glucosa, manosa, W-acetilglucosamina, galactosa, W-acetilgalactosamina, acido sialico y en el que el azucar no activado con nucleotido se activa con nucleotido en dicha celula hospedadora bacteriana.

5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones de metodo precedentes, que incluye ademas la etapa c) despues de la etapa b), en el que la etapa c) se realiza despues de que se haya producido una cantidad deseada de dicho oligosacarido, y en el que la etapa c) comprende (i) inducir la expresion de al menos una glucosidasa contenida en dicha celula hospedadora bacteriana, o (ii) anadir un segundo hospedador bacteriano que expresa al menos una glucosidasa al medio en que se cultiva la celula hospedadora bacteriana, degradando de este modo los oligosacaridos indeseados.

6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glucosiltransferasa se selecciona de al menos una de las siguientes: alfa-1,2-fucosiltransferasa, alfa-1,3-fucosiltransferasa, beta-1,3-W-acetilglucosamiltransferasa, beta-1,3-galactosiltransferasa, beta-1,4-galactosiltransferasa, alfa-2,6-sialiltransferasa, alfa-2,3-sialiltransferasa, beta-1,6-galactosiltransferasa o un fragmento funcional de las mismas.

7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la celula hospedadora bacteriana comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una de las siguientes protemas adicionales: una protema exportadora o una permeasa que exporta el oligosacarido sintetizado desde la celula hospedadora.

8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la protema exportadora es el transportador de flujo de azucar codificado por el gen yberc0001_9420 de Yersinia bercovieri ATCC 43970 o un fragmento funcional del mismo.

9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la celula hospedadora bacteriana comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una las siguientes protemas adicionales: una invertasa, una fructocinasa, protemas implicadas en la biosmtesis de GDP-fucosa, GDP-manosa, UDP-glucosa, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-galactosa, uDP-A/-acetilgalactosamina, UDP-acido glucuronico, CMP-acido sialico.

10. El metodo de la reivindicacion 8 o 9, en el que el acido nucleico es un acido nucleico endogeno o recombinante.

11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el acido nucleico es homologo o heterologo.

12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la celula hospedadora bacteriana comprende ademas secuencias de control que posibilitan la sobreexpresion controlada de secuencias de acido nucleico endogenas o recombinantes.

13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la beta-1,4-galactosiltransferasa esta codificada por un gen seleccionado del grupo que consiste en IgtB de Neisseria meningitidis y lex-1 de Aggregatibacter aphrophilus NJ8700, o fragmentos funcionales de los mismos.

14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que celula hospedadora bacteriana es una cepa de Escherichia coli, una especie de Lactobacillus, una cepa de Corynebacterium glutamicum o una cepa de Clostridium.

15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la celula hospedadora bacteriana comprende ademas al menos uno de los genes del grupo genico csc de E. coli W.

16. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la celula hospedadora bacteriana se modifica para que no expresa protemas que degradan de forma intracelular los precursores de dicho oligosacarido.

17. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la celula hospedadora bacteriana se modifica geneticamente ademas para que contenga una secuencia de acido nucleico que codifica una glucosidasa para la degradacion espedfica de oligosacaridos interferentes, tales como intermedios, productos secundarios u oligosacaridos endogenos generados por la celula hospedadora bacteriana, en el que la expresion de dicha glucosidasa esta bajo el control de secuencias reguladoras.