BRPI0924899A2

BRPI0924899A2 - síntese hmo

Info

Publication number: BRPI0924899A2
Application number: BRPI0924899-4A
Authority: BR
Inventors: Stefan Jennewein; Eric Hüfner; Julia Parkot
Original assignee: Jennewein Biotechnologie Gmbh
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2021-02-23
Also published as: EP2440661B1; MY182355A; EP2440661A1; JP5580408B2; AU2009347610B2; US20140120611A1; CN102459605A; AU2009347610A1; US20120135467A1; RU2517602C2; US9512433B2; BRPI0924899B8; US8652808B2; RU2011153792A; CN106978382A; SG176651A1; NZ597129A; PL2440661T3; WO2010142305A1; BRPI0924899B1

Abstract

SÍNTESE HMO. A presente invenção se refere a uma célula estavelmente cultivada em um meio, cuja célula é ajustada para a produção de oligossacarídeos, a célula sendo transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma enzima envolvida na síntese de oligossacarídeo. Além disto, a célula é transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína da família de transportador de efluxo de açúcar, um homólogo funcional ou um derivado deste. Adicionalmente, a invenção inclui um método para a produção de oligossacarídeos que envolvem a célula acima descrita.

Description

“SÍNTESE HMO” A presente invenção se refere a uma célula estavelmente cultivada em um meio, cuja célula é ajustada para a produção de oligossacarídeos, a célula sendo transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleico que 5 codifica uma enzima envolvida na síntese de oligossacarídeo.

Estas células são conhecidas, por exemplo, a partir de Dumon et al., 2001.

Há muito tempo se sabe que o leite materno humano, além de lactose, é composto por uma mistura complexa de oligossacarídeos chamada Oligossacarídeos de Leite Humano (HMO). A fração de oligossacarídeo do leite materno humano é única em 10 relação à composição e quantidade. Em contraste com outros mamíferos, o leite materno humano compreende uma concentração de oligossacarídeo que varia de 7 a 12 g/L, o que representa um fator de 10 a 100 a maior do que na maioria dos outros mamíferos (Boehm & Stahl, 2007, Kunz et al., 2000, Newburg & Neubauer, 1995).

15 Atualmente, mais de 80 compostos pertencentes aos HMOs já foram estruturalmente caracterizados. Geralmente, os HMOs são caracterizados, ao contrário dos outros oligossacarídeos encontrados no corpo humano, por uma molécula lactose na extremidade redutora, e a fucose e/ou ácido siálico na extremidade não redutora.

20 Dois tipos básicos são encontrados: os oligossacarídeos de estrutura tipo I, que apresentam fucose αl,4-ligado ao GlcNAc, enquanto os de estrutura tipo II apresentam αl,3-fucosilação de GlcNAc ou glicose. Ambos os tipos podem conter αl,2-fucose ligada à galactose. Os oligossacarídeos mais importantes são 2’- fucosilactose e 3-fucosilactose.

25 Estas estruturas estão intimamente relacionadas aos epítopos de glicoconjugados da superfície da célula epitelial, os antígenos do grupo sanguíneo Lewis, tais como Lewis x (Lex) (Gal(ß1-4)[Fuc-(α1-3)]GlcNAc(ß1)) (Newburg, 2001). A homologia estrutural de HMO para epítopos epiteliais explica as propriedades de proteção contra patógenos bacterianos.

5 Por exemplo, a virulência patogênica de Escherichia coli (Cravioto et al., 1991), Vibrio cholerae (Coppa et al., 2006), Streptococcus pneumoniae (Andersson et al., 1986) ou Campylobacter jejuni (Ruiz-Palacios et al., 2003) pode ser drasticamente reduzida pela ligação de patógenos ao HMO, ao invés de glicanos nas superfícies mucosas humana, e também a ligação às toxinas como a enterotoxina termo-estável 10 E. coli (Crane et al., 1994).

Além dos mencionados efeitos locais no trato intestinal, os HMOs também são capazes de produzir efeitos sistêmicos em lactentes pela entrada na circulação sistêmica (Gnoth et al., 2001). O impacto dos HMOs nas interações proteína- carboidrato, por exemplo, ligação selectina-leucócito, pode modular as respostas 15 imunes e reduzir as respostas inflamatórias (Bode, 2006, Kunz & Rudloff, 2006).

A fim de reduzir a frequência de infecções adquiridas por neonatos e, portanto, a mortalidade infantil, é altamente desejável fornecer às crianças alimentação com HMOs. Isto pode facilmente ser conseguido, uma vez que nas sociedades a amamentação é comum e largamente praticada. No entanto, geralmente, este não é 20 o caso.

Existe uma série de razões médicas, como a possível transmissão de doenças infecciosas de mãe para filho que, sob certas circunstâncias, argumentam contra o aleitamento materno. Em muitos países africanos, por exemplo, a amamentação pode ser a principal razão para as infecções de HIV durante a infância.

25 Circunstâncias culturais também podem levar à recusa do aleitamento materno,

como acontece na maioria dos países industrializados, como, por exemplo, os Estados Unidos.

Como os HMOs podem ser encontrados em fontes naturais, tais como o leite de outros mamíferos, apenas em baixas concentrações, a extração de oligossacarídeos 5 de fontes naturais não é adequada para satisfazer a demanda por HMOs.

A síntese química de oligossacarídeos é trabalhosa e exige proteção múltipla e etapas de desproteção (Kretzschmar & Stahl, 1998), portanto, geralmente, é relativamente cara e com baixas taxas de recuperação.

No entanto, a produção fermentativa de oligossacarídeos utilizando-se organismos 10 biotecnicamente projetados, é uma solução alternativa promissora para a síntese de HMO em larga escala.

Durante a década passada foram publicadas várias tentativas de sucesso da síntese de HMO usando-se ou fermentação com E. coli recombinante ou conversão enzimática in vitro. Estas tentativas estiveram, principalmente, concentradas na 15 síntese de compostos fucosilados pertencente aos HMOs ou muito semelhantes.

Por exemplo, muitas publicações descrevem a síntese das estruturas de Lewis lacto- N-neo-fucopentose, lacto-N-neo-difucohexose e lacto-N-neo-difucooctose, assim como 2’- e 3-fucosilactose ((Albermann et al., 2001, Dumon et al., 2006, Dumon et al., 2001, Dumon et al., 2004, Koizumi et al., 2000). Nestes casos, a fucosilação 20 enzimática de extratos como, por exemplo, a lactose, é realizada pela fucosiltransferase (FucTs).

A maioria das publicações a respeito da produção de compostos fucosilados, neste contexto, descrevem o uso de FucTs provenientes de Helicobacter pylori. De uma forma geral, os FucTs humanos podem ser utilizados para este propósito. No 25 entanto, quando super expressados em células bacterianas, os FucTs de fontes bacterianas são, geralmente, menos propensos a problemas, tais como enovelamento e insolubilidade.

Além disto, a maioria dos sistemas publicados para a síntese de compostos fucosilados apóia-se na associação endógena GDP-fucose de E. coli, que é 5 normalmente utilizada para a síntese da fucose contendo exopolissacarídeo - ácido colânico (Grant et al., 1970). Nestes casos, a disponibilidade da fucose-GDP é, naturalmente, um gargalo, restringindo a eficiência da síntese.

Recentemente, os inventores da presente invenção descreveram um novo processo de produção de célula utilizando a enzima Fkp (Parkot et al., 2008); todo o conteúdo 10 desta solicitação de patente é aqui incorporado por referência.

A Fkp (Coyne et al, 2005), que se origina da Bacteroides fragilis, é uma enzima bifuncional que possui tanto a atividade da fucoquinase quanto da L-fucose-1-P- guanililtransferase. Assim, a fucose exogenamente fornecida é primeiramente fosforilada e, depois, o nucleotídeo é ativado para formar a importante molécula 15 precursora fucose-GPD. A Fkp, com base na via de salvamento da fucose, foi utilizada com sucesso para sintetizar oligossacarídeos fucosilados (Parkot et al., 2008).

Ainda assim, ao nível de síntese bioquímica, importantes estratégias foram desenvolvidas. Todos os métodos conhecidos para síntese de oligossacarídeo in 20 vivo trazem certas desvantagens, inibindo, ao máximo, a produção em massa de oligossacarídeos.

A verdadeira dificuldade de produção de oligossacarídeos, em células, em altas taxas é, por um lado, o grande enriquecimento intracelular dos oligossacarídeos produzidos e subprodutos nucleotídeos e, por outro lado, a extração dos 25 oligossacarídeos produzidos.

Devido ao enriquecimento intracelular, os produtos da reação de síntese podem, gradualmente, desenvolver um produto de efeito inibitório sobre as enzimas sintéticas. Em certo ponto, a síntese torna-se, então, ineficientemente lenta. Além disto, os produtos podem atingir concentrações citotóxicas que direcionem as 5 células para uma lise ou, pelo menos, uma interrupção metabólica. Em qualquer caso, não é mais possível a produção intracelular contínua de oligossacarídeos.

Além disto, pode-se esperar que a acumulação de quantidades excessivas de oligossacarídeos, eventualmente, conduzirá à lise ou morte celular. Tal lise celular, ou a última lise celular realizada para a extração dos oligossacarídeos sintetizados 10 da célula, conduzirá a uma complexa mistura de oligossacarídeos alvos e componentes celulares (metabólitos, fragmentos). A purificação do oligossacarídeo alvo desta mistura complexa é cara e, portanto, para a maioria dos oligossacarídeos, não economicamente viável.

Sob estas circunstâncias, a produção biotécnica de oligossacarídeo é muito 15 ineficiente e de difícil controle, principalmente porque a produção biotécnica de oligossacarídeo conhecida é realizada usando-se cultura em batelada, tal cultura em batelada sendo, do ponto de vista econômico, altamente insatisfatória.

Em face ao acima exposto, é um objetivo da invenção melhorar os métodos de produção biotécnica de oligossacarídeos, de forma com que a produção seja 20 facilitada, e mais facilmente controlada, e o rendimento de oligossacarídeos seja aumentado.

De acordo com a invenção, este e outros objetivos são atingidos fornecendo uma célula do tipo já mencionado, além disto, a célula sendo transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma 25 proteína da família de transportador de efluxo de açúcar, um homólogo funcional ou um derivado deste. O objetivo da invenção é, desta forma, completamente atingido.

De acordo com a invenção, os oligossacarídeos são entendidos como pequenos polímeros de monossacarídeos, compreendendo pelo menos 2 subunidades de açúcar. Os oligossacarídeos podem ou ser ramificados ou formar uma cadeia linear 5 de subunidades. Além disto, as subunidades de açúcar de oligossacarídeos podem apresentar uma série de modificações químicas. Desta forma, os oligossacarídeos, de acordo com a presente invenção, podem compreender uma ou mais moléculas não-açucar.

A sequência de ácido nucleico, de acordo com a invenção, descreve um código 10 genético, representado por um polímero ácido nucleico, como, por exemplo, um polímero ácido desoxirribonucléico ou um polímero ácido ribonucléico. O código genético pode então incluir sequências de codificação, incluindo informação para a formação de uma proteína, ou regiões não codificantes compreendendo, por exemplo, regiões promotoras, regiões para a fixação de compostos reguladores ou 15 auxiliares, espaçadores ou sequências estruturais que influenciam a estrutura secundária ou terciária do próprio polímero ácido nucleico e/ou na participação do seu processamento.

“Transformado para incluir”, de acordo com a presente invenção, se refere a qualquer método de inserção de, pelo menos, uma sequência adicional de ácido 20 nucleico para o interior das células, a sequência de ácido nucleico, daí em diante, estando presente dentro da célula, seja como um plasmídeo ou sendo integrada dentro das células de cromossomo/cromossomos. Os métodos conhecidos de transformação compreendem, por exemplo, transformação química ou eletroporação. As transgêneses estáveis, mesmo na ausência de agentes seletivos, 25 podem, geralmente, ser obtidas pela integração cromossomal de pelo menos uma sequência adicional de ácido nucleico. Para este objetivo, a célula deve ser infectada com um vírus ou fago. Alternativamente, outros meios de recombinação homóloga e não homóloga usando, por exemplo, vírus ou sistemas baseados em transposon, podem ser aplicados.

5 Para aplicações biotecnológicas, a exportação de grandes oligossacarídeos das células é um problema complexo. Este é essencialmente o caso, porque apenas poucos mecanismos celulares relacionados com tal transporte foram identificados. A razão para a rara ocorrência de exportação de oligossacarídeo das células é que a síntese de oligossacarídeo consome uma grande quantidade de recursos celulares.

10 A perda destes compostos é, portanto, geralmente, desfavorável para a célula.

Além disto, a maioria dos mecanismos conhecidos para a exportação de oligossacarídeo envolve a modificação química dos oligossacarídeos, por exemplo, ligando-os às moléculas de lipídio (Alaimo et al. 2006). Consequentemente, os oligossacarídeos não são apenas membranas suportadas, que inibem sua liberação 15 no meio, mas, como quimicamente ligados às moléculas de lipídio, reduzem sua solubilidade em meio aquoso. Desta forma, tais mecanismos dificilmente são adequados para serem empregados em grande escala de produção de oligossacarídeos.

A família Transportador de Efluxo de Açúcar (SET), primeiramente descrita por Liu e 20 colaboradores (Liu et al., 1999a) para E. coli, compreende às proteínas SetA, SetB e SetC. Os homólogos (identidades de aminoácidos > 50%) das proteínas transportadoras são encontrados, principalmente, nos Enterobacteriaceae (Liu et al.

1999ª).

Além da glicose e lactose, as proteínas exportadoras SET mostram especificidade 25 de substrato para certos monos e dissacarídeos, assim como, por exemplo, a molécula indutora isopropil- ß-D-tiogalactosídeo (IPTG) e o análogo tóxico de açúcar o-nitrofenil-- ß-D-tiogalactosídeo (ONPG) (Liu et al., 1999b). Estudos bioquímicos mostraram, entretanto, que, por exemplo, as SetA exibem uma atividade de transporte de muito baixa a zero para moléculas maiores ou mais volumosas, tais 5 como as heptoses ou trissacarídeos.

Pelas razões acima, não se poderia esperar que as proteínas exportadoras da família SET fossem adequadas para o transporte de oligossacarídeos.

Entretanto, os inventores encontraram, surpreendentemente, que a super expressão das proteínas exportadoras SET conduzia a uma exportação de oligossacarídeos 10 muito eficiente.

Além disto, as proteínas SET mostraram exportar lactose, um dos extratos da reação de síntese. Era, portanto, de se esperar que a síntese de oligossacarídeos obtida nas células modificadas procederia de forma muito ineficiente e lenta, devido a uma drenagem constante do extrato das células.

15 Pelo contrário, os inventores foram capazes de mostrar pela primeira vez que, apesar da super expressão das proteínas exportadoras SET, a síntese de oligossacarídeos obtidos em células modificadas é altamente produtiva.

Geralmente, é preferível se a célula for selecionada de um grupo que consista de bactéria, fungo, células animais ou vegetais. É ainda particularmente preferível se a 20 célula for uma célula Escherichia coli.

A vantagem é que as células de E. coli oferecem alta atividade metabólica e uma alta taxa de reprodução. Além disto, a E. coli é um dos organismos mais bem caracterizados para propósitos moleculares biológicos e biotécnicos. Muitas técnicas conhecidas para a transformação e cultivo de bactéria, na arte, foram especialmente 25 adaptadas para o E. coli. Além disto, cepas de E. coli, com uma variedade de background genético, estão comercialmente disponíveis.

É ainda preferível se a enzima for selecionada de um grupo que compreenda a glicosiltransferase, glicosiltransferase tipo Leloir, glicosiltransferase não Leloir, sialiltransferase, galactosiltransferase, fucosiltransferase, manosiltransferase, N- 5 acetilglucosaminiltransferase, N-acetilgalactosaminiltransferase.

De acordo com uma personalização, a enzima é uma fucosiltransferase.

Além disto, é preferível, se o transportador de efluxo de açúcar for SetA ou um derivado deste.

A vantagem neste caso é que a SetA, entre os membros bioquimicamente 10 caracterizados da família SET de proteínas exportadoras, apresenta a mais ampla especificidade de substrato. Desta forma, a mais ampla variedade de oligossacarídeos pode, pelo menos, potencialmente ser exportada e, assim, produzida, usando-se a SetA.

É também preferível, se a célula for adicionalmente transformada para compreender 15 pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que facilita ou promove a importação de extratos necessários para a síntese de oligossacarídeos.

Neste sentido, é vantajoso que a concentração de extrato dentro da célula seja aumentada. Sob circunstâncias normais, a importação de extratos, tais como fucose 20 ou lactose, é limitada pela disponibilidade das correspondentes proteínas importadoras. No caso de uma célula ajustada para síntese de oligossacarídeos em larga escala, entretanto, a importação de extratos, dependendo dos níveis endógenos de proteínas importadoras, pode ser insuficiente para constantemente abastecer a reação de síntese com extratos. Este problema pode ser resolvido super 25 expressando as respectivas proteínas importadoras.

Proteínas importadoras, de relevância no presente caso, são, primeiramente, importadoras para mono ou dissacarídeos, tais como, importadoras de lactose, por exemplo, E. coli ß-galactosídeo permease (LacY), ou importadoras de fucose, por exemplo, E. coli fucose permease (FucP), mas pode ainda compreender 5 importadoras para nucleotídeos e outros extratos.

É especialmente preferível, se a célula for transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína selecionada de um grupo que consiste de transportador de lactose, transportador de fucose, transportador de ácido siálico, transportador de galactose, transportador de manose, 10 transportador de N-acetilglucosamina, transportador de N-acetilgalactosamina, transportador ABC, transportador para um nucleotídeo-açúcar ativado e transportador para uma nucleobase, nucleosídeo ou nucleotídeo.

Neste contexto, um nucleotídeo-açúcar ativado pode ser, mas não está limitado a, GDP-fucose, CMP-ácido siálico, UDP-galactose, UDP-glicose, GDP-manose, UDP- 15 glucosamina ou UDP-galactosamina.

Além disto, o termo nucleobase corresponde a Guanina, Citosina, Adenina, Timina e Uracila. Nucleosídeo corresponde a Guanosina, Citidina, Adenosina. Timidina e Uridina, enquanto um nucleotídeo pode ser um mono, di ou trifosfato de Guanosina, Citidina, Adenosina, Timidina ou Uridina.

20 Além disto, é preferível se a célula for adicionalmente transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína selecionada de um grupo que consiste de nucleotidil transferase, guanilil transferase, uridilil transferase, Fkp, L-fucose quinase, fucose-1-fosfato guanililtransferase, sintase – CMP-ácido siálico, galactose quinase, galactose-1- 25 fosfato uridilil transferase, glicose quinase, glucose—fosfato uridilil transferase,

manose quinase, manose-1-fosfato guanilil transferase, redutase GDP-4-keto-6- deoxi-D-manose, glucosamina quinase, glucosamina-fosfato acetil transferase, N- acetil-glucosamina-fosfato uridilil transferase, UDP-N-acetilglucosamina 4- epimerase, UDP-N-acetil-glucosamina-2-epimerase.

5 Neste contexto, o termo nucleotidil transferase, geralmente, se refere às enzimas que podem transferir nucleotídeos em fosfo-açucares, sejam açúcares de ocorrência natural ou não.

A vantagem aqui é que, como também descrito em Parkol et Al., 2008, aqui incluído por referência, as associações intracelulares de nucleotídeo-açúcares ativados, 10 como a GDP-fucose, podem ser suplementadas. Assim, a síntese de oligossacarídeo torna-se mais eficiente.

Além disto, é geralmente preferível que a via catabólica da célula para os monos, di ou oligossacarídeos envolvidos, e/ou necessários, para a síntese de oligossacarídeos, seja, pelo menos, parcialmente inativada.

15 Aqui, a vantagem está no fato de que a eficiência global da síntese pode ser aumentada. Isto acontece porque menos extratos destinados para a síntese de oligossacarídeo são consumidos pelo metabolismo endógeno da célula.

Na personalização abaixo descrita, por exemplo, são empregadas células, as quais são deficientes em degradação de lactose. Isto pode ser feito inativando-se a 20 enzima ß-galactosidase, que é codificada pelo gene LacZ. Esta modificação genética impede a ruptura intracelular da lactose em monossacarídeos glicose e galactose que são rapidamente metabolizáveis. Desta forma, a lactose está presente em alta concentração como molécula receptora em posteriores reações de glicosilação/fucosilação.

25 Em uma personalização alternativa, as células usadas para a síntese de oligossacarídeos são, isoladamente ou em adição à deficiência de lacZ acima descrita, deficiente para a degradação da L-fucose. Isto pode ser conseguido pela inativação do gene fucA que codifica a enzima catabólica chave fuculose-1-fosfato aldolase (FucA) da via de degradação da fucose.

5 Naturalmente, existem outras técnicas disponíveis, que variam de inibidores enzimáticos a construções de RNAi estavelmente transfectadas, que podem ser empregadas a fim de, pelo menos, parcialmente, inativar vias catabólicas.

Dentro do escopo da presente invenção, é geralmente preferível se os oligossacarídeos compreenderem, pelo menos, três subunidades e/ou estrutura de 10 peso molecular de, pelo menos, 480 g/mol.

Todos os HMOs de maior importância têm um peso molecular superior a este limite.

A presente invenção ainda compreende um método para a produção de oligossacarídeos, compreendendo as etapas de: a) Fornecer uma célula de acordo com a invenção, 15 b) cultivar a célula em um meio sob condições permissivas para a produção de tais oligossacarídeos, c) extrair tais oligossacarídeos do meio de cultura.

No escopo da presente invenção, condições permissivas são entendidas com condições relacionadas aos parâmetros físicos e químicos incluindo, mas não 20 limitado a, temperatura, pH, pressão, pressão osmótica e concentração de produto/extrato.

Em uma personalização particular, as condições permissivas devem incluir uma temperatura na faixa de 30 +/- 20°C e pH na faixa de 7 +/- 3.

O método acima descrito confere a vantagem de que os oligossacarídeos possam 25 se extraídos diretamente do meio de cultura, enquanto que os métodos conhecidos requerem a lise das células e uma posterior extração de oligossacarídeos do lisado resultante.

Neste sentido, é preferível que a etapa b) seja executada usando-se um biorreator de fluxo contínuo.

5 A vantagem reside no fato de que, usando-se um biorreator de fluxo contínuo, a quantidade de oligossacarídeos produzidos pode ser facilmente aumentada. Isto acontece porque a síntese ocorre continuamente em um nível relativamente alto.

É também preferível que o meio na etapa b) compreenda uma ou mais substâncias selecionadas de um grupo que consiste de suplementos básicos para apoiar o 10 crescimento e propagação celular, agentes seletivos, efetores de atividade genética e extratos necessários para a síntese de oligossacarídeos.

Típicos suplementos para apoiar o crescimento e propagação celular são muito conhecidos do estado da arte e são descritos, por exemplo, em Sambrook e Russel,

2001. Estes suplementos básicos respondem pela demanda nutricional das células 15 cultivadas, contendo, por exemplo, proteínas, carboidratos, lipídios e minerais.

Os agentes seletivos, como os antibióticos, também são bastante conhecidos do estado da arte, por exemplo, Sambrook e Russel, 2001. Estes agentes podem ser usados para proteger as culturas, de células geneticamente modificadas, de contaminação com organismos competidores, como, por exemplo, fungo e bactéria.

20 Além disto, por exemplo em populações bacterianas, os agentes seletivos podem ser usados para estabilizar a informação genética formada no plasmídeo.

Os efetores de atividade genética podem ser usados para, seletivamente, induzir ou reprimir a atividade de certos genes ou conjuntos de genes dentro da célula. Estes efetores variam de compostos químicos simples, tais como, isopropil-l-tio- ß-D- 25 galactopiranosídeo (IPTG), a compostos mais complexos como os hormônios. Os efetores de atividade genética são muito conhecidos do estado da arte, por exemplo, a partir de Sambrook e Russel, 2001.

Além disto, é preferível que os extratos sejam selecionados de um grupo que consista de arabinose, treose, eritrose, ribose, ribulose, xilose, glucose, D-2-deoxi-- 5 amino-glucose, N-Acetilglucosamina, glucosamina, frutose, manose, galactose, N- acetilgalactosamina, galactosamina, sorbose, fucose, ácidoN-acetilneuramínico, glicosídeo, açúcar não natural, nucleobase, nucleosídeo, nucleotídeo e qualquer possível di ou polímero destes.

É geralmente preferível que os oligossacarídeos compreendam, pelo menos, três 10 subunidades e/ou estrutura de peso molecular de, pelo menos, 480 g/mol.

De acordo com uma personalização da presente invenção, o oligossacarídeo produzido pelo método acima descrito é uma fucosilactose, a vantagem, neste caso, sendo que a fucosilactose é um dos compostos mais importantes presente nos HMOs.

15 Outras vantagens encontram-se nas descrições das personalizações e nos desenhos anexos.

Não é preciso dizer que as características acima mencionadas, e aquelas que ainda serão explicadas, podem ser usadas não só nas combinações respectivamente especificadas, mas também em outras combinações, ou por conta própria, sem que 20 se afaste do escopo da presente invenção.

Muitas personalizações da invenção estão ilustradas nas figuras e são explicadas em maiores detalhes na descrição que segue. Nas figuras: Fig. 1 mostra uma visão esquemática da síntese e transporte de oligossacarídeo dentro de uma célula bacteriana gram negativa, modificada de acordo com a 25 invenção.

Fig. 2 mostra os resultados de medições de 3-fucosilactose na massa celular úmida e sobrenadantes de culturas de bactérias, comparando diferentes genótipos; e Fig. 3 mostra uma comparação entre quantidades de 3-fucosilactose sintetizada em culturas de bactérias com diferentes genótipos.

5 Exemplo 1: Síntese e transporte de oligossacarídeo dentro de uma célula bacteriana gram negativa A Fig.1 mostra uma seção de uma célula bacteriana gram negativa 10. Uma célula bacteriana gram negativa 10, de acordo com a invenção, é composta por uma membrana externa 11, uma membrana plasmática 12, um espaço periplasmático 13, 10 localizado entre a membrana externa 11 e a membrana plasmática 12, e um citosol 14, envolto dentro da membrana plasmática 12. A membrana externa é composta por porinas pelas quais compostos solúveis em água podem passar do meio 16 para dentro do espaço periplasmático 13 e vice-versa.

De acordo com uma personalização da presente invenção, a membrana plasmática 15 compreende a FucP, servindo como um primeiro transportador de extratos 17, a LacY, servindo como um segundo transportador de extratos 18 e a SetA servindo como um exportador de produto.

Além disto, Fkp servindo como um nucleotidil transferase 20, FutAco servindo como uma glicosil transferase 21, estão compreendidos no citosol 14.

20 Quando, de acordo com esta personalização, fucose, como um primeiro extrato 22, e lactose, como um segundo extrato 23, são fornecidos para um meio 16, eles adentram o espaço periplasmático 13 através das porinas 15. Então, o primeiro extrato 22 é transportado pelo primeiro transportador de extrato 17 para dentro do citosol 14. No citosol, o primeiro extrato 22 é modificado pela nucleotidil transferase 25 20 resultando em um primeiro extrato nucleotidilado 24, GDP-fucose.

O segundo extrato 23, é importado para dentro do citosol 14 por um segundo importador de extrato.

Desta forma, a glicosil transferase 21 catalisa uma reação entre o primeiro extrato nucleotidilado, GDP-fucose, e o segundo extrato, lactose, resultando em um 5 oligossacarídeo 25, 3-fucosilactose, e GDP (não mostrado).

Posteriormente, o oligossacarídeo 25 é exportado do citosol 14 por um exportador de produto 19 (SetA) para dentro do espaço periplasmático 13 e pode deixar o espaço periplasmático 13 por meio das porinas 15, adentrando o meio 16.

Exemplo 2: Material e métodos 10 2.1 Construção dos plasmídeos de expressão e desenvolvimento das cepas de E.

coli E. coli JM109(DE3) (Promega; www.promega.com) foi usado como cepa hospedeira inicial para o desenvolvimento da produção de cepa de E. coli. Todos os primers de oligonucleotídeo usados para os procedimentos de clonagem estão listados na 15 Tabela 1. Os plasmídeos pACYC-lacY e pACYC-lacY-setA foram construídos conforme segue: Os genes lacY (correspondente ao acesso do GenBank no.

ACB02461) (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.gov) e setA (corresponde ao acesso GenBank no. YO_025293) (GenBank) foram amplificados do DNA genômico de E.

coli TOPIO (Invitrogen; )www.invitrogen.com usando os primers lacY Ncol dianteiro / 20 lacY EcoRI reverso e setA Ndel dianteiro / setA Xhol reverso. Os produtos PCR foram submetidos à digestão com enzimas de restrição indicadas, e ligados com o vetor de expressão correspondentemente digerido pACYCuet-1 (Novagen; www.merckbiosciences.co.uk).

Os plasmídeos resultantes foram conferidos por digestão de restrição, eletroforese 25 em gel de agarose, assim como o seqüenciamento com os primers pACYCduetUPI,

DuetDOWN-1-Primer, DuetUP2-Primer e T7-Terminator-Primer para a correta inserção dos genes (dados não mostrados). Os plasmídeos utilizados pCOLA-fkp- fucP e pET-futAco foram previamente construídos (Parkot Et Al., 2008). Para obter as cepas JMOO, JM01 e JM02, diferentes combinações de plasmídeos foram 5 introduzidas dentro do E. coli JM109(DE3) por eletroporação (Dower Et Al, 1988).

Todos os plasmídeos e cepas bacterianas estão listados na Tabela 2.

2.2. Inativação do catabolismo da fucose em E. coli: Para prevenir a degradação da fucose que é fornecida externamente, o gene fucA que codifica a enzima catabólica chave L-fuculose-1-fosfato aldolase foi excluído do 10 cromossomo do E. coli JM109(DE3). Todos os oligonucleotídeos primers utilizados para os procedimentos de mutagênese estão listados na Tabela 1. Para a construção da exclusão do fucA mutante, a metodologia de Datsenko e Wanner foi aplicada (Datsenko e Wanner, 2000), utilizando-se os primers fucA-knock-f e fucA- knock-r. A correta exclusão do fucA foi confirmada por PCR usando-se os primers 15 fucA-control-f e fucA-control-r que flanqueiam o sítio de inserção cromossomal, e o fenótipo fucose-negativo foi verificado por plaqueamento da bactéria em meio mínimo M9 agar (Sambrook e Russel, 2001) com fucose suplementada como única fonte de carbono (dados não mostrados).

Tabela 1. Primers utilizados neste estudo.

Nome Sequência (5’ 3’) Sítio de restrição adicionado fucA-knock-f AATTACTCTTCAATTCGTAACCCATAGGTTT

TGAATTTCTCCAGCACTACGGCAATCTCTTC ATCGCTCAGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTT

CGAAGTTC fucA-knock-r GGTGGGTAATTAAACGGCTAATTCAATAGT

GTGAAAGGAACAACATTATTGCCCTGTTTT GAATCAGAGAGAGGGCTGACATGGGAATT

AGCCATGGTCC fucA-control-f CATTCTGTTAGCCATCATCCTTCTCC fucA-control-r GAAGAAGATGGTGGGTAATTAAACGGC seta Ndel AAGGGAAAAACATATGATCTGGATAATGAC Ndel dianteiro GATGGCTCGCCGTATGAACGGTG seta Xhol AAGGGAAAAACTCGAGCCACGTCATCAAAC Xhol reverso GTCTTTAACCTTTGCGG lacy Ncol AAGGAAATATACCATGGGCTACTATTTAAAA Ncol dianteiro AACACAAACTTTTGGATGTTCGG lacy Eco-RI AAGGAAAACCGAATTCGATTGCTTAAGCGA EcoRI reverso CTTCATTCACCTGACGACGCAGCAGGG pACYCduetUP1 GGTCTCGACGCTCTCCCT DuetDOWN-1- GATTATGCGGCCGTGTACAA Primer DuetUP2-Primer TTGTACACGGCCGCATAATC T7Terminator- TATGCTAGTTATTGCTCAG Primer * Os sitos de reconhecimento de endonucleases de restrição estão sublinhados.

Tabela 2. Cepas de bactérias e plasmídeos usados neste estudo.

Nome Característica(s) relevantes* Referências Cepas de E. Invitrogen coli TOP10 F- mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80LacZ∆M15, ∆lacX74, recA1, araD139, ∆ (araleu), 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG JM109(DE3) endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (r k- , mk+), relA1,Promega supE44, λ-, ∆(lac-proAB), [F´, traD36, proAB, lacIqZ∆M15], IDE3 JM109(DE3) Exclusão fucA JM109(DE3) mutante Este estudo fucA JM00 Cepa de controle negativo, JM109 (DE3) abrigando Este estudo os vetores vazios pCOLADuet-1, pETDuet-1 e pACYCDuet-1 JM01 JM109(DE3) abrigando pCOLA-fkp-fucP, pET-futAco Este estudo e pACYC-lacY JM02 JM109(DE3) abrigando pCOLA-fkp-fucP, pET-futAco Este estudo e pACYC-lacY-setA JM03 JM109(DE3) abrigando pCOLA-fkp-fucP e pA-CYC- Este estudo lacY-setA JM∆00 Cepa de controle negativo, JM109 (DE3) ∆fucAEste estudo abrigando os vetores vazios pCOLADuet-1, pETDuet-

1 e pACYCDuet-1 JM∆01 JM109(DE3) ∆fucA abrigando pCOLA-fkp-fucP, pET- Este estudo futAco e pACYC-lacY JM∆02 JM109(DE3) ∆fucA abrigando pCOLA-fkp-fucP, pET-Este estudo futAco e pACYC-lacY-setA JM∆03 JM109(DE3) ∆fucA abrigando pCOLA-fkp-fucP e Este estudo pACYC-lacY-setA Plasmídeos pCOLADuet Vetor de expressão kmR Novagen

-1 pETDuet-1 Vetor de expressão, ApR Novagen pACYCDuet Vetor de expressão, CmR Novagen

-1 pCOLA-fkp- Abrigando os genes fkp e fucP, KmR Parkot et al.,

fucP 2008 pET-futAco Abrigando gene fucosil transferase futAco de H.

Parkot et al.,

pylor com códon otimizado i, ApR 2008 pACYC- Abrigando gene lacy, CmR Este estudo lacY pACYC- Abrigando genes lacy e seta, CmR Este estudo lacY-setA ApR, ampicilina resistente; KmR, kanamicina resistente; CmR, cloranfenicol resistente.

2.3. Condições de cultivo e preparação dos extratos celulares As cepas de E. coli foram inoculadas 1:100 em culturas, durante a noite, em 100mL de meio mineral (Samain Et Al., 1999)., contendo 7.0 g L -1 de NH4H2PO4, 7.0 g L-1 de K2HPO4, 1.0 g L-1 de MgSO4x7H2O, 0.5 g L-1 de ácido cítrico, 2.0 g L -1 de KOH, 5 0.0045 g L-1 de tiamina-HCl e 7.5 mL L -1 de solução traço mineral. A solução estoque traço mineral continha 70mM de nitrilotriacetato (pH 6.5), 7.5 gL -1 de citrato férrico,

1.3 gL-1 de MnCl2x4H2O, 0.21 gL-1 CoCl2x6H2O, 0.13 gL-1 de CuCl2x2H2O, 0.25 g L-1 de H3BO3, 1.2 g L-1 de ZnSO4x7H2O e 0.15 g L-1 de Na2MoO4x2H2O. O meio foi suplementado com 0.1% de glicose e 1% de glicerol como fonte de carbono, e com 10 100 µg mL-1 de ampicilina, 50 µg mL -1 de kanamicina e/ou 20 µmL-1 de cloranfenicol antes da incubação em um agitador rotatório a 37°C fornecendo boa aeração.

Quando as culturas atingiram uma densidade óptica (OD 600 nm) de, aproximadamente,

1.0, o indutor isopropil-1-tio- β-D-galactopiranosídeo (IPTG) foi adicionado em uma concentração de 0.5mM e as culturas foram incubadas durante a noite a 28°C sob 15 constante agitação. Após aproximadamente 16 horas, 40 mM de fucose e 20 mM de lactose foram adicionados. As culturas então foram continuamente incubadas a 28°C sob agitação constante.

Em diversos momentos, foram retiradas amostras de 20 mL das culturas e as células foram coletadas por centrifugação. Os sobrenadantes das culturas foram 20 separados e imediatamente analisados por cromatografia de troca iônica de alto desempenho (HPAEC) ou estocados a 20°C. Os aglomerados de célula foram lavados com PBS (Sambrook e Russel, 2001), ressuspendidos em 5 vezes o peso do aglomerado de água destilada e lisado por ebulição por 10 minutos. Para obter as frações intracelulares, os fragmentos celulares foram separados por centrifugação e 25 o lisado celular limpo foi estocado a 20°C ou imediatamente analisado por HPAEC.

2.4. SDS-PAGE A expressão de proteínas heterólogas foi verificada por SDS-PAGE (Sambrook e Russel, 2001) (dados não mostrados). Os extratos de proteína foram preparados em 1 x tampão de gel-carga de SDS e géis de poliacrilamida foram corados com Azul 5 Brilhante de Coomassie.

2.5 Detecção de oligossacarídeos por cromatografia de troca iônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) As amostras foram analisadas por cromatografia de troca iônica de alto desempenho (HPAEC) usando-se um detector amperométrico pulsado Decade II (PAD) (Antec 10 Leyden; www.antec-leyden.nl) e uma coluna CarboPac PA20 (Dionex; www.dionex.com) conectada ao sistema HPLC (Shimadzu; www.shimadzu.eu). A sensibilidade do detector foi fixada em 50 µA com um potencial de pulso aplicado de

0.05V.

Mono, di e oligossacarídeos foram eluídos com 10mM de hidróxido de sódio a uma 15 vazão de 0.4 mL min-1. Após 30 minutos de eluição isocrática com 10mM de NaOH a coluna foi lavada por 20 minutos com 200 mM de NaOH para se obter tempos de retenção constantes e, posteriormente, foi regenerada com 10mM de NaOH por 20 minutos. Para todas as amostras analisadas, 20 µL de soluções diluídas 1:2 dH 2O foram usadas para a análise de HPAEC. A análise via HPAEC-PAD mostrou tempos 20 de retenção na coluna usada de HPLC de, aproximadamente, 3,5 minutos para o padrão de L-fucose, aproximadamente 15 minutos para o padrão de lactose, e aproximadamente 11-12 minutos para o padrão de 3-fucosilactose (dados não mostrados).

Padrões das substâncias glicerol e glicose, que são adicionados ao meio de cultura 25 como fonte de carbono, foram registrados com um tempo de retenção de aproximadamente 1,5 minutos e 7-8 minutos, respectivamente.

Exemplo 3: Produção de 3-fucosilactose e secreção dependente de SetA no meio de cultura por E. coli recombinante O objetivo deste experimento foi a investigação da exportação mediada por SetA da 5 3-fucosilactose intracelular. Cepas de E. coli JM01 e JM02 (veja Tabela 2) foram usadas para os experimentos de fermentação. As cepas JM01 e JM02, as quais ambas expressam as enzimas Fkp e FutAco (1,3-fucosil transferase), assim como as proteínas transportadoras FucP e LacY, apenas diferem na expressão do transportador SetA. JM01 não é um super produtor de SetA e JM02 é um super 10 produtor de SetA.

A Fig. 2 mostra as quantidades de 3-fucosilactose na massa celular úmida e sobrenadantes de culturas de E. coli JM01 e JM02 determinado por análise em HPAEC-PAD.

Para determinar o efeito da super expressão, foram execudas medidas 7, 24 e 32 15 horas pós-indução de fkp, fucP, lacY, futAco e expressão da setA.

Na figura, as frações extracelulares de 3-fucosilactose medidas no E. coli JM01 (SetA não super expressado) estão representadas pela coluna I, as frações intracelulares estando representadas pela coluna II. No caso do E. coli JM02 (SetA super expressado), as frações extracelulares de 3-fucosilactose estão representadas 20 pela coluna III e as frações intracelulares estão representadas pela coluna IV. Todos os valores representam os valores médios de experimentos em duplicata, as barras de erro indicam os respectivos desvios padrão.

Estas medições mostram que a cepa JM01, que não super expressa SetA, acumula 3-fucosilactose na fração citosólica. Ao contrário, a concentração intracelular de 3- 25 fucosilactose, no caso da cepa JM002, que super expressa setA, se encontra abaixo do nível de detecção.

Além disto, os sobrenadantes das culturas de JM01 e JM02 exibem certo teor de 3- fucosilactose. Desta forma, entretanto, o teor de 3-fucosilactose encontrado no sobrenadante da cultura do JM02 é muito maior em relação ao teor de 3- 5 fucosilactose encontrado no sobrenadante da cultura do JM01. Enquanto após 32 horas a concentração de 3-fucosilactose no sobrenadante de JM01 é aproximadamente 21 mg L-1, a concentração de 3-fucosilactose no caso de JM02 é maior do que 51 mg L-1.

A comparação das quantidades totais de 3-fucosilactose nas culturas de E. coli 10 JM01 e JM02 está descrita na Figura 3.

Aqui a quantidade total de 3-fucosilactose nas culturas de E. coli JM01 está representada pela coluna I e a quantidade total de 3-fucosilactose nas culturas de E.

coli JM02 está representada pela coluna II. Mais uma vez, os valores médios dos experimentos em duplicata são apresentados.

15 Após 32 horas de incubação, a cepa JM02 produz 51.68 mg L -1, aproximadamente 57% mais 3-fucosilactose do que a cepa JM01 (32.99 mg L-1).

Exemplo 4: Discussão Os resultados experimentais das análises de HPAEC-PAD mostram que existem fortes diferenças na síntese e transporte de 3-fucosilactose, entre as cepas JM01, 20 sem super expressão de SetA, e JM02, com super expressão de SetA.

Para começar, a 3-fucosilatose não é detectável na massa celular úmida da cultura JM02, enquanto que uma alta concentração de 3-fucosilactose pode ser medida no sobrenadante.

Isto indica claramente que a super expressão de SetA em E. coli conduz a uma 25 exportação extremamente eficiente de 3-fucosilactose da célula.

Assim, os inventores mostraram que a SetA, contrariamente ao que era esperado do estado da arte, pode exportar eficientemente oligossacarídeos maiores, que apresentem, no presente caso, três subunidade e uma massa molecular de 488 g/mol.

5 Ao contrário, na massa celular úmida do JM01 uma considerável quantidade de 3- fucosilactose foi detectada, enquanto apenas, comparativamente, pouco 3- fucosilactose estava presente no sobrenadante.

Este resultado mostra que, na ausência de SetA super expressado, 3-fucosilactose se acumula fortemente no citosol das células bacterianas. O fato da 3-fucosilactose, 10 nestas circunstâncias, também ser detectada no sobrenadante pode, de acordo com o atual estado de conhecimento, ser atribuído ao aumento da lise das células bacterianas, resultante das altas concentrações intracelulares de 3-fucosilactose.

Quando se compara as quantidades globais de 3-fucosilactose nas culturas JM01 e JM02, fica evidente que a super expressão de SetA não apenas conduz a um 15 aumento de concentração de 3-fucosilactose no sobrenadante, mas também eleva a quantidade total de 3-fucosilactose sintetizada (veja Figura 3).

Este aumento na eficiência global da síntese pode ser atribuído a uma maior viabilidade celular das células que super expressam SetA, cuja viabilidade seria devido à ausência de produto com citotoxicidade. Alternativamente, ou 20 adicionalmente, o aumento na eficiência global da síntese pode ser atribuído à ausência de efeitos de produto inibidor sobre as enzimas sintéticas, devido à exportação de produto mediada pela SetA super expressada.

Assim, os inventores demonstraram que a super expressão do transportador SetA é uma via eficiente para aumentar o rendimento da síntese de oligossacarídeo, 25 realizada por métodos biotécnicos que empregam células cultiváveis. Além disto,

como o produto de inibição das enzimas sintéticas mais importantes e a citotoxicidade do produto da síntese pode ser, na maioria das vezes, evitado, a produção é facilitada e torna-se mais controlável.

Lista de Referências 5 Alaimo, C., Catrein, I., Morf, L., Marolda, C. L., Callewaert, N., Valvano, M. A., Feldman, M. F. & M. Aebi, (2006) Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO j 25(5): 967-976.

Albermann, C., W. Piepersberg & U. F. Wehmeier, (2001) Synthesis of the milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose using recombinant bacterial enzymes. Carbohydr 10 Res 334: 97-103.

Andersson, B., O. Porras, L. A. Hanson, T. Lagergard & C. Svanborg-Eden, (1986) Inhibition of attachment of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae by human milk and receptor oligosaccharides. J Infect Dis 153: 232-237.

Bode, L., (2006) Recent advances on structure, metabolism, and function of human 15 milk oligosaccharides. j Nutr 136: 2127-2130.

Boehm, G. & B. Stahl, (2007) Oligosaccharides from milk. J Nutr 137: 847S-849S.

Coppa, G. V., L. Zampini, T. Galeazzi, B. Facinelli, L. Ferrante, R. Capretti & G.

Orazio, (2006) Human milk oligosaccharides inhibit the adhesion to Caco-2 cells of diarrea pathogens: Escherichia coli, Vibrio cholerae, and Salmonella fyris. Pediatr 20 Res 59: 377-382.

Coyne, M. J., B. Reinap, M. M. Lee & L. E. Comstock, (2005) Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation. Science 307: 1778-1781.

Crane, J. K., S. S. Azar, A. Stam & D. S. Newburg, (1994) Oligosaccharides from human milk block binding and activity of the Escherichia coli heat-stable enterotoxin 25 (STa) in T84 intestinal cells. J Nutr 124: 2358-2364.

Cravioto, A., A. Tello, H. Villafan, J. Ruiz, S. del Vedovo & J. R. Neeser, (1991) Inhibition of localized adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to HEp-2 cells by immunoglobulin and oligosaccharide fractions of human colostrum and breast milk. J Infect Dis 163: 1247-1255.

5 Datsenko, K. A., and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640-5.

Dower, W. J., J. F. Miller, and C. W. Ragsdale. 1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 16:6127-45.

10 Dumon, C, C. Bosso, J. P. Utille, A. Heyraud & E. Samain, (2006) Production of Lewis x tetrasaccharides by metabolically engineered Escherichia coli.

Chembiochem 7: 359- 365.

Dumon, C, B. Priem, S. L. Martin, A. Heyraud, C. Bosso & E. Samain, (2001) In vivo fucosylation of lacto-N-neotetraose and lacto-N-neohexaose by heterologous 15 expression of Helicobacter pylori alpha-1,3 fucosyltransferase in engineered Escherichia coli. Glycoconj J18: 465-474.

Dumon, C, E. Samain & B. Priem, (2004) Assessment of the two Helicobacter pylori alpha-1,3-fucosyltransferase ortholog genes for the large-scale synthesis of LewisX human milk oligosaccharides by metabolically engineered Escherichia coli.

20 Biotechnol Prog 20:412-419.

Gnoth, M. J., S. Rudi off, C. Kunz & R. K. Kinne, (2001) Investigations of the in vitro transport of human milk oligosaccharides by a Caco-2 monolayer using a novel high performance liquid chromatography-mass spectrometry technique. J Biol Chem 276: 34363-34370.

25 Grant, W. D., I. W. Sutherland & J. F. Wilkimson, (1970) Control of colanic acid synthesis. J Bacteriol 103: 89-96.

Koizumi, S., T. Endo, K. Tabata, H. Nagano, J. Ohnishi & A. Ozaki, (2000) Large- scale production of GDP-fucose and Lewis X by bacterial coupling. J Ind Microbiol Biotechnol 25: 213-217.

5 Kretzschmar, G. & W. Stahl, (1998) Large scale synthesis of linker-modified sialyl- Lewis(X), Lewis(X) and N-acetyllactosamine. Tetrahedron 54: 6341-6358.

Kunz, C. & S. Rudloff, (2006) Health promoting aspects of milk oligosaccharides. Int Dairy J 16: 1341-1346.

Kunz, C., S. Rudloff, W. Baier, N. Klein & S. Strobel, (2000) Oligosaccharides in 10 human milk: structural, functional, and metabolic aspects. Annu Rev Nutr 20: 699-

722.

Liu, J. Y., P. F. Miller, M. Gosink & E. R. Olson, (1999a) The identification of a new family of sugar efflux pumps in Escherichia coli. Mol Microbiol 31:1845-1851.

Liu, J. Y., P. F. Miller, J. Willard & E. R. Olson, (1999b) Functional and biochemical 15 characterization of Escherichia coli sugar efflux transporters. Journal of Biological Chemistry 214: 22977-22984.

Newburg, D. S., (2001) Bioactive components of human milk: evolution, efficiency, and protection. Adv Exp Med Biol 501: 3-10.

Newburg, D. S. & S. H. Neubauer, (1995) Carbohydrates in milk. In: Handbook of 20 Milk Composition. R. G. Jensen (ed). San Diego, CA: Academic Press, pp. 273-349.

Parkot, J., E. Hüfner & S. Jennewein, (2008) Synthesis of fucosylated compounds.

European patent application EP08172267.

Ruiz-Palacios, G. M., L. E. Cervantes, P. Ramos, B. Chavez-Munguia & D. S.

Newburg, (2003) Campylobacter jejuni binds intestinal H(O) antigen (Fuc alpha 1, 2 25 Gal beta 1, 4 GlcNAc), and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit its binding and infection. j Biol Chem 278: 14112-14120.

Samain, E., V. Chazalet & R. A. Geremia, (1999) Production of O-acetylated and sulfated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harboring different combinations of nod genes. J Biotechnol 72: 33-47.

5 Sambrook, J. & D. W. Russell, (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, no qual a célula é ajustada para a produção de oligossacarídeos, a célula sendo transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma enzima 5 envolvida na síntese de oligossacarídeo, caracterizada pela célula, além disto, ser transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína da família de transportador de efluxo de açúcar, um homólogo funcional ou derivado deste.

2. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com a 10 reivindicação 1, caracterizada pela célula ser selecionada de um grupo que consiste de bactéria, fungo, células animais ou vegetais.

3. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela célula ser uma célula Escherichia coli.

4. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com 15 qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pela enzima ser selecionada de um grupo que consiste de glicosiltransferase, glicosiltransferase tipo Leloir, glicosiltransferase do tipo não Leloir, fucosiltransferase, sialiltransferase, galactosiltransferase, manosiltransferase, N-Acetilglucosaminiltransferase, N- Acetilgalactosaminiltransferase.

20 5. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela enzima ser uma fucosiltransferase.

6. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo transportador de efluxo de açúcar ser um SetA ou um derivado deste.

25 7. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada por ser adicionalmente transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que facilita ou promove a importação de extratos necessários para a síntese de oligossacarídeos.

5 8. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína selecionada de um grupo que consiste de transportador de lactose, transportador de fucose, transportador de ácido siálico, transportador de galactose, transportador de manose, 10 transportador de N-acetilglucosamina, transportador de N-acetilgalactosamina, transportador ABC, transportador para um nucleotídeo-açúcar ativado e transportador para uma nucleobase, nucleosídeo ou nucleotídeo.

9. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada por ser adicionalmente 15 transformada para compreender pelo menos uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína selecionada de um grupo que consiste de nucleotidil transferase, guanilil transferase, uridilil transferase, Fkp, L-fucose quinase, fucose-1- fosfato guanililtransferase, sintase – CMP-ácido siálico, galactose quinase, galactose-1-fosfato uridilil transferase, glicose quinase, glucose—fosfato uridilil 20 transferase, manose quinase, manose-1-fosfato guanilil transferase, redutase GDP- 4-keto-6-deoxi-D-manose, glucosamina quinase, glucosamina-fosfato acetil transferase, N-acetil-glucosamina-fosfato uridilil transferase, UDP-N- acetilglucosamina 4-epimerase, UDP-N-acetil-glucosamina-2-epimerase.

10. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com 25 qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada por compreender uma via catabólica para mono, di ou oligossacarídeos selecionados, que é pelo menos parcialmente inativada, os mono, di ou oligossacarídeos sendo envolvidos e/ou necessários para a síntese do oligossacarídeos.

11. CÉLULA ESTAVELMENTE CULTIVADA EM UM MEIO, de acordo com 5 qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelos oligossacarídeos compreenderem pelo menos três subunidades e/ou estrutura com um peso molecular de pelo menos cerca de 480 g/mol.

12. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS, caracterizado por compreender as etapas de: 10 a) Fornecer uma célula de acordo com qualquer uma das exigências de 1 a 11, b) Cultivar a célula em um meio sob condições permissivas para a produção de tais oligossacarídeos, c) Extrair tais oligossacarídeos do meio de cultura.

15 13. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela etapa b) ser realizada usando um biorreator de fluxo contínuo.

14. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS, de acordo com as reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo meio na etapa b) compreender uma 20 ou mais substâncias selecionadas de um grupo que consiste de suplementos básicos para apoiar o crescimento e propagação, agentes seletivos, extratos necessários para a síntese de oligossacarídeos, efetores de atividade genética.

15. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelos extratos serem selecionados de um grupo 25 que consiste de arabinose, treose, eritrose, ribose, ribulose, xilose, glucose, D-2-

deoxi-2-amino-glucose, N-Acetilglucosamina, glucosamina, frutose, manose, galactose, N-acetilgalactosamina, galactosamina, sorbose, fucose, ácidoN- acetilneuramínico, glicosídeo, açúcar não natural, nucleobase, nucleosídeo, nucleotídeo e qualquer possível di ou polímero destes.

5

16. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 15, caracterizado pelos oligossacarídeos compreenderem pelo menos três sub-unidades e/ou estrutura com um peso molecular de pelo menos cerca de 480 g/mol.

17. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS, de acordo com 10 a reivindicação 16, caracterizado pelo oligossacarídeo ser fucosilactose.