ES2660698T3 - Síntesis de HMO - Google Patents
Síntesis de HMO Download PDFInfo
- Publication number
- ES2660698T3 ES2660698T3 ES09776698.4T ES09776698T ES2660698T3 ES 2660698 T3 ES2660698 T3 ES 2660698T3 ES 09776698 T ES09776698 T ES 09776698T ES 2660698 T3 ES2660698 T3 ES 2660698T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seta
- fucosyl
- lactose
- coli
- educt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 7
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract 2
- 101710161145 Sugar efflux transporter Proteins 0.000 abstract 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 2
- RTVRUWIBAVHRQX-PMEZUWKYSA-N Fucosyllactose Chemical compound C([C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H]1O)O)OC)O[C@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O RTVRUWIBAVHRQX-PMEZUWKYSA-N 0.000 abstract 1
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 abstract 1
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 abstract 1
- WJPIUUDKRHCAEL-UHFFFAOYSA-N 3FL Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)OC(O)C1O WJPIUUDKRHCAEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- AUNPEJDACLEKSC-ZAYDSPBTSA-N 3-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]1O AUNPEJDACLEKSC-ZAYDSPBTSA-N 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 101150073719 Sh3kbp1 gene Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 6
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 101150001899 lacY gene Proteins 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 3
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150111848 fucA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N GDP-L-fucose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N GDP-beta-L-fucose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N 0.000 description 2
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 description 2
- -1 and the second educt Chemical compound 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 108010012710 L-fuculose-phosphate aldolase Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 101150092956 fucP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Una célula bacteriana para ser cultivada de forma estable en un medio para la producción de oligosacáridos, siendo dichos oligosacáridos fucosil-lactosa, transformándose la célula para comprender al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una fucosil-transferasa, caracterizada por que la célula se transforma además para comprender al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la familia de Transportadores de Eflujo de Azúcar (SET), proteína la cual se sobreexpresa, conduciendo la sobreexpresión a una exportación de los oligosacáridos.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 1: Síntesis de oligosacáridos y transporte al interior de una célula bacteriana gramnegativa
La Fig. 1 muestra una sección de una célula bacteriana gramnegativa 10. Una célula bacteriana gramnegativa 10 según la invención comprende una membrana externa 11, una membrana plasmática 12, un espacio periplásmico 13, situado entre dicha membrana externa 11 y dicha membrana plasmática 12, y un citosol 14, encerrado en dicha membrana plasmática 12. La membrana externa comprende porinas a través de las cuales pueden pasar compuestos solubles en agua desde el medio 16 al espacio periplásmico 13, y viceversa.
Según una realización de la presente invención, la membrana plasmática comprende FucP, que sirve como un primer transportador 17 de educto, LacY, que sirve como un segundo transportador 18 de educto, y SetA, que sirve como un exportador de producto.
Además, en el citosol 14 están comprendidos Fkp, que sirve como una nucleotidiltransferasa 20, y FutAco, que sirve como una glucosiltransferasa 21.
Según esta realización, cuando se suministran al medio 16 fucosa, como un primer educto 22, y lactosa, como un segundo educto 23, entran en el espacio periplásmico 13 a través de la porina 15. Después, el primer educto 22 es transportado por el primer transportador 17 de educto al citosol 14. En el citosol, el primer educto 22 es modificado por la nucleotidiltransferasa 20, dando como resultado un primer educto 24 nucleotidilado, GDP-fucosa.
El segundo educto 23 es importado al citosol 14 por el segundo importador 15 de educto.
Después, la glucosiltransferasa 21 cataliza una reacción entre el primer educto nucleotidilado, la GDP-fucosa, y el segundo educto, lactosa, dando como resultado un oligosacárido 25, 3-fucosil-lactosa, y GDP (no mostrado).
Subsiguientemente, el oligosacárido 25 es exportado desde el citosol 14 por el exportador 19 de producto (SetA) al espacio periplásmico 13, y puede abandonar el espacio periplásmico 13 vía las porinas 15, entrando al medio 16.
Ejemplo 2: Material ymétodos
2.1. Construcción de plásmidos de expresión y desarrollo de cepas de E. coli
Para el desarrollo de la cepa de producción de E. coli, se usó como cepa hospedante inicial JM109(DE3) (Promega; www.promega.com). Todos los cebadores oligonucleotídicos usados para los procedimientos de clonación se dan en la Tabla 1. Los plásmidos pACYC-lacY y pACYC-lacY-setA se construyeron como sigue: los genes lacY (corresponde al número de acceso de GenBank ACB02461) (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.gov) y setA (corresponde al número de acceso de GenBank YP_025293) (GenBank) se amplificaron a partir de ADN genómico de E. coli TOP10 (Invitrogen; www.invitrogen.com) usando cebadores lacY NcoI directo/lacY EcoRI inverso y setA NdeI directo/setA XhoI inverso. Los productos de la PCR se sometieron a digestión de restricción con las enzimas indicadas, y se ligaron con el vector de expresión digerido correspondientemente pACYCDuet-1 (Novagen; www.merckbiosciences.co.uk).
Los plásmidos resultantes se comprobaron mediante digestión de restricción, electroforesis en gel de agarosa, así como secuenciación con los cebadores pACYCduetUP1, DuetDOWN-1-Primer, DuetUP2-Primer y T7-Terminator-Primer, para la inserción correcta de los genes (dato no mostrado). Los plásmidos pCOLA-fkp-fucP y pET-futAco se han construido previamente (Parkot et al., 2008). Para obtener las cepas JM00, JM01 y JM02, se introdujeron diferentes combinaciones de plásmidos en E. coli JM109(DE3) mediante electroporación (Dower et al., 1988). Todos los plásmidos y cepas bacterianas se dan en la Tabla 2.
2.2. Inactivación del catabolismo de fucosa en E. coli:
Para evitar la degradación de fucosa suministrada externamente, se suprimió del cromosoma de E. coli JM109(DE3) el gen fucA que codifica la enzima catabólica clave L-fuculosa-1-fosfato aldolasa. Todos los cebadores oligonucleotídicos usados para los procedimientos de mutagénesis se dan en la Tabla 1. Para la construcción del mutante de supresión de fucA, se aplicó la metodología de Datsenko y Wanner (Datsenko y Wanner, 2000), usando los cebadores fucA-knock-f y fucA-knock-r. La supresión correcta de fucA se confirmó mediante PCR usando los cebadores fucA-control-f y fucA-control-r que flanquean el sitio de inserción cromosómica, y el fenotipo negativo para fucosa se verificó colocando las bacterias en placas en agar mínimo M9 (Sambrook y Russell, 2001) con fucosa suplementada como la única fuente de carbono (dato no mostrado).
7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
obtener tiempos de retención constantes, y después se regeneró con NaOH 10 mM durante 20 min. Para todas las muestras analizadas, se usaron 20 l de disoluciones diluidas con dH2O 1:2 para el análisis de HPAEC. El análisis vía HPAEC-PAD mostró tiempos de retención en la columna de HPLC usada de aproximadamente 3,5 min. para el patrón de L-fucosa, aprox. 15 min. para el patrón de lactosa, y aprox. 11-12 min. para el patrón de 3-fucosil-lactosa (dato no mostrado). Los patrones de las sustancias glicerol y glucosa, que se añaden al medio de cultivo como fuente de carbono, se registraron con un tiempo de retención de aprox. 1,5 min. y 7-8 min., respectivamente.
Ejemplo 3: Producción de 3-fucosil-lactosa y secreción dependiente de SetA en el medio de cultivo por E. coli recombinante
El objetivo de este experimento fue investigar la exportación de 3-fucosil-lactosa intracelular mediada por SetA. Para los experimentos de fermentación se usaron las cepas JM01 y JM02 de E. coli (véase la Tabla 2). Las cepas JM01 y JM02, que expresan ambas las enzimas Fkp y FutAco (1,3-fucosiltransferasa), así como las proteínas transportadoras FucP y LacY, difieren solamente en la expresión del transportador de SetA. JM01 no sobreproduce SetA, y JM02 sobreproduce SetA.
La Fig. 2 muestra las cantidades de 3-fucosil-lactosa en la masa celular húmeda y en el sobrenadante de los cultivos de JM01 y JM02 de E. coli, determinado mediante el análisis de HPAEC-PAD.
Para determinar el efecto de la sobreexpresión de SetA, se llevaron a cabo medidas a 7, 24 y 32 horas después de la inducción de la expresión de fkp, fucP, lacY, futAco y setA.
En la figura, las fracciones extracelulares de 3-fucosil-lactosa medida en E. coli JM01 (SetA no se sobreexpresó) se representan mediante las columnas I, representándose las fracciones intracelulares mediante las columnas II. En el caso de E. coli JM02 (sobreexpresión de SetA), las fracciones extracelulares de 3-fucosil-lactosa se representan mediante las columnas III, y las fracciones intracelulares se representan mediante las columnas IV. Todos los valores representan los valores medios de experimentos por duplicado, indicando las barras de error las desviaciones estándar respectivas.
Estas medidas muestran que la cepa JM01, que no sobreexpresa SetA, acumula 3-fucosil-lactosa en la fracción citosólica.
Por el contrario, la concentración intracelular de 3-fucosil-lactosa en el caso de la cepa JM002, que sobreexpresa setA, está por debajo del nivel de detección.
Además, los sobrenadantes procedentes de los cultivos de JM01 y JM02 exhiben un cierto contenido de 3-fucosillactosa. De ese modo, sin embargo, el contenido de 3-fucosil-lactosa encontrado en el sobrenadante del cultivo de JM02 está enormemente incrementado con respecto al contenido de 3-fucosil-lactosa encontrada en el sobrenadante del cultivo de JM01. Mientras que después de 32 h la concentración de 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante de JM01 es aproximadamente 21 mg l-1, la concentración de 3-fucosil-lactosa en el caso de JM02 está por encima de 51 mg l-1 .
La comparación de las cantidades totales de 3-fucosil-lactosa en cultivos de E. coli JM01 y JM02 se representa en la Fig. 3.
Aquí, la cantidad total de 3-fucosil-lactosa en cultivos de E. coli JM01 está representada por las columnas I, y la cantidad total de 3-fucosil-lactosa en cultivos de E. coli JM02 está representada por las columnas II. Nuevamente, se representan los valores medios de experimentos por duplicado.
Después de 32 h de incubación, la cepa JM02 produce con 51,68 mg l-1 aproximadamente 57% más de 3-fucosillactosa en total que la cepa JM01 (32,99 mg l-1).
Ejemplo 4: Discusión
Los resultados experimentales del análisis de HPAEC-PAD muestran que existen fuertes diferencias en la síntesis y transporte de 3-fucosil-lactosa entre las cepas JM01, sin expresión de SetA, y JM02, que sobreexpresa SetA.
Para empezar, 3-fucosil-lactosa no es detectable en la masa húmeda celular del cultivo de JM02, mientras que la concentración de 3-fucosil-lactosa se puede medir en el sobrenadante.
Esto indica claramente que la sobreexpresión de SetA en E. coli conduce a una exportación extremadamente eficiente de 3-fucosil-lactosa desde la célula.
Por tanto, los inventores han mostrado que SetA, contrariamente a lo que se habría de esperar de la técnica anterior, puede exportar eficientemente oligosacáridos más grandes, presentando, en el presente caso, tres subunidades y una masa molecular de 488 g/mol.
Por el contrario, en la masa celular húmeda de JM01, se detecta una cantidad considerable de 3-fucosil-lactosa, mientras que solamente está presente comparativamente poca 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante.
10
Claims (1)
-
imagen1
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2009/004112 WO2010142305A1 (en) | 2009-06-08 | 2009-06-08 | Hmo synthesis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2660698T3 true ES2660698T3 (es) | 2018-03-23 |
Family
ID=40941939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES09776698.4T Active ES2660698T3 (es) | 2009-06-08 | 2009-06-08 | Síntesis de HMO |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8652808B2 (es) |
| EP (1) | EP2440661B1 (es) |
| JP (1) | JP5580408B2 (es) |
| CN (2) | CN106978382A (es) |
| AU (1) | AU2009347610B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0924899B8 (es) |
| DK (1) | DK2440661T3 (es) |
| ES (1) | ES2660698T3 (es) |
| MX (1) | MX2011013231A (es) |
| MY (1) | MY182355A (es) |
| NZ (1) | NZ597129A (es) |
| PL (1) | PL2440661T3 (es) |
| RU (1) | RU2517602C2 (es) |
| SG (1) | SG176651A1 (es) |
| WO (1) | WO2010142305A1 (es) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010142305A1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-16 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Hmo synthesis |
| NZ708078A (en) | 2010-06-02 | 2017-01-27 | Evolva Nutrition Inc | Recombinant production of steviol glycosides |
| EP2455387A1 (en) * | 2010-11-23 | 2012-05-23 | Nestec S.A. | Oligosaccharide mixture and food product comprising this mixture, especially infant formula |
| BR112014003037B1 (pt) | 2011-08-08 | 2022-04-05 | Evolva Sa | Hospedeiro recombinante e método para produzir um glicosídeo de esteviol |
| CN102839157A (zh) * | 2012-07-12 | 2012-12-26 | 扬州大学 | 稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用 |
| WO2014086373A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Glycom A/S | Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo) |
| EP2954058B1 (en) | 2013-02-06 | 2021-03-31 | Evolva SA | Methods for improved production of rebaudioside d and rebaudioside m |
| BR112015019160A2 (pt) | 2013-02-11 | 2017-08-22 | Dalgaard Mikkelsen Michael | Produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes |
| WO2014135167A1 (en) * | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Glycom A/S | Purification of oligosaccaharides by reversible derivatization |
| WO2015032412A1 (en) | 2013-09-06 | 2015-03-12 | Glycom A/S | Fermentative production of oligosaccharides |
| DK2845905T3 (da) * | 2013-09-10 | 2021-06-14 | Chr Hansen Hmo Gmbh | Fremstilling af oligosaccharider |
| EP2857410A1 (en) * | 2013-10-04 | 2015-04-08 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography |
| ES2701163T3 (es) | 2014-01-20 | 2019-02-21 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Procedimiento para la purificación eficiente de oligosacáridos de la leche humana (HMO) neutros a partir de la fermentación microbiana |
| EP2905341B1 (en) * | 2014-02-07 | 2020-04-29 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Methods for producing GDP-fucose using nucleotide sugar transporters and recombinant microorganism host cells used therefor |
| DK2927316T3 (en) | 2014-03-31 | 2019-03-04 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Total fermentation of oligosaccharides |
| SG11201700651RA (en) | 2014-08-11 | 2017-02-27 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| CN107109358B (zh) | 2014-09-09 | 2022-08-02 | 埃沃尔瓦公司 | 在重组宿主中生产甜菊醇糖苷 |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| CA2975091A1 (en) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Cadena Bio, Inc. | Oligosaccharide compositions for use as food ingredients and methods of producing thereof |
| WO2016120486A1 (en) | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| WO2016146711A1 (en) | 2015-03-16 | 2016-09-22 | Dsm Ip Assets B.V. | Udp-glycosyltransferases |
| AU2016307066A1 (en) | 2015-08-07 | 2018-02-08 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| EP3141610A1 (en) | 2015-09-12 | 2017-03-15 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Production of human milk oligosaccharides in microbial hosts with engineered import / export |
| WO2017178632A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| EP3458599A1 (en) | 2016-05-16 | 2019-03-27 | Evolva SA | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| CN106190937B9 (zh) * | 2016-07-18 | 2020-12-01 | 南开大学 | 一种构建重组大肠杆菌生物合成2’-岩藻乳糖的方法 |
| PL3315610T3 (pl) * | 2016-10-29 | 2021-06-14 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Sposób wytwarzania fukozylowanych oligosacharydów |
| US11396669B2 (en) | 2016-11-07 | 2022-07-26 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| EP3604505A4 (en) * | 2017-03-31 | 2020-02-19 | Kaneka Corporation | NOVEL MONOOXYGENASE AND USE THEREOF |
| WO2019003133A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Glycom A/S | PURIFICATION OF OLIGOSACCHARIDES |
| EP3425052A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-09 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Fucosyltransferases and their use in producing fucosylated oligosaccharides |
| CN110914284A (zh) | 2017-07-12 | 2020-03-24 | 格礼卡姆股份公司 | 包含中性单糖或寡糖和酸性非碳水化合物组分的无定形混合物 |
| EP3438122A1 (en) | 2017-08-01 | 2019-02-06 | OligoScience Biotechnology GmbH | Microorganism for producing human milk oligosaccharide |
| EP3691658A4 (en) | 2017-10-04 | 2021-06-23 | The Regents of The University of California | IMMUNOMODULATOR OLIGOSACCHARIDES |
| CN107805622B (zh) * | 2017-11-08 | 2021-04-30 | 光明乳业股份有限公司 | 一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
| EP3486326A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-22 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth |
| WO2019209241A1 (en) * | 2018-04-23 | 2019-10-31 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Increasing export of 2' fucosyllactose from microbial cells through the expression of a heterologous nucleic acid |
| WO2019209245A1 (en) * | 2018-04-23 | 2019-10-31 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Increasing activity of 2' fucosyllactose transporters endogenous to microbial cells |
| EP3569713A1 (en) * | 2018-05-16 | 2019-11-20 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Use of glycosidases in the production of oligosaccharides |
| CN109735479B (zh) * | 2019-01-30 | 2022-04-01 | 光明乳业股份有限公司 | 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
| EP3702468A1 (en) * | 2019-03-01 | 2020-09-02 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Fermentative production of carbohydrates by microbial cells utilizing a mixed feedstock |
| KR102254548B1 (ko) * | 2019-04-26 | 2021-05-24 | 고려대학교 산학협력단 | 돌연변이 대장균을 이용한 콜라닉 산 생산 |
| EP3751003A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-16 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Production of fucosylated oligosaccharides in bacillus |
| EP3999635A1 (en) * | 2019-07-19 | 2022-05-25 | Inbiose N.V. | Production of fucosyllactose in host cells |
| BR112022002584A2 (pt) * | 2019-08-13 | 2022-08-09 | Amyris Inc | Célula de levedura, método para produzir um ou mais oligossacarídeos, composição de fermentação, método para recuperar um ou mais oligossacarídeos, método para modificar geneticamente uma célula de levedura |
| CN110396532A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-01 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种制备唾液酸乳糖的方法 |
| JP2022551195A (ja) * | 2019-10-14 | 2022-12-07 | インバイオス エン．フェー． | 宿主細胞におけるバイオプロダクトの産生 |
| KR20220114632A (ko) * | 2019-12-18 | 2022-08-17 | 인바이오스 엔.브이. | 숙주 세포에서 시알릴화 올리고당의 생산 |
| WO2021148618A1 (en) | 2020-01-23 | 2021-07-29 | Glycom A/S | New major facilitator superfamily (mfs) protein (bad) in hmo production |
| BR112022014367A2 (pt) | 2020-01-23 | 2022-09-13 | Glycom As | Produção de hmo |
| JP2023511524A (ja) | 2020-01-23 | 2023-03-20 | グリコム・アクティーゼルスカブ | Ｈｍｏ産生 |
| JP2023511527A (ja) * | 2020-01-23 | 2023-03-20 | グリコム・アクティーゼルスカブ | Ｈｍｏの産生 |
| EP3929300A1 (en) | 2020-06-26 | 2021-12-29 | Chr. Hansen HMO GmbH | Improved export of oligosaccharides from bacterial cells |
| DK180952B1 (en) | 2020-12-22 | 2022-08-10 | Glycom As | A dfl-producing strain |
| EP4281564A1 (en) | 2021-01-22 | 2023-11-29 | Glycom A/S | New major facilitator superfamily (mfs) protein (fred) in production of sialylated hmos |
| JPWO2022168991A1 (es) | 2021-02-08 | 2022-08-11 | ||
| WO2022243310A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-24 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel technology to enable sucrose utilization in strains for biosyntetic production |
| DK181497B1 (en) | 2021-05-17 | 2024-03-12 | Dsm Ip Assets Bv | ENHANCING FORMATION OF THE HMOS LNT AND/OR LNnT BY MODIFYING LACTOSE IMPORT IN THE CELL |
| DK181242B1 (en) | 2021-05-17 | 2023-05-30 | Dsm Ip Assets Bv | GENETICALLY ENGINEERED CELLS COMPRISING A RECOMBINANT NUCLEIC ACID SEQUNCE ENCODING AN α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE CAPABLE OF PRODUCING LNFP-I, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAME AND METHODS FOR USE OF SAME |
| WO2023120615A1 (ja) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | 協和発酵バイオ株式会社 | コア３糖としてラクト－ｎ－トリオースｉｉを含む糖質の製造方法および該糖質の結晶の製造方法 |
| CN115029371B (zh) * | 2022-06-14 | 2024-01-02 | 大连工业大学 | 一种微生物生产的天然活性产物的高效分离方法 |
| DK202200689A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-02-27 | Dsm Ip Assets Bv | New fucosyltransferases for in vivo synthesis of lnfp-iii |
| WO2024042235A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Dsm Ip Assets B.V. | Hybrid method for producing complex hmos |
| WO2024110667A1 (en) | 2022-11-25 | 2024-05-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Two-strain system for producing oligosaccharides |
| WO2024175777A1 (en) | 2023-02-24 | 2024-08-29 | Dsm Ip Assets B.V. | Product specific transporter for in vivo synthesis of human milk oligosaccharides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6204431B1 (en) * | 1994-03-09 | 2001-03-20 | Abbott Laboratories | Transgenic non-human mammals expressing heterologous glycosyltransferase DNA sequences produce oligosaccharides and glycoproteins in their milk |
| US20080145899A1 (en) | 2004-09-17 | 2008-06-19 | Neose Technologies Inc | Production of Oligosaccharides By Microorganisms |
| CN102257128A (zh) | 2008-12-19 | 2011-11-23 | 詹内怀恩生物技术股份有限公司 | 岩藻糖化化合物的合成 |
| WO2010142305A1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-16 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Hmo synthesis |
-
2009
- 2009-06-08 WO PCT/EP2009/004112 patent/WO2010142305A1/en active Application Filing
- 2009-06-08 CN CN201710200038.7A patent/CN106978382A/zh active Pending
- 2009-06-08 ES ES09776698.4T patent/ES2660698T3/es active Active
- 2009-06-08 NZ NZ597129A patent/NZ597129A/xx unknown
- 2009-06-08 SG SG2011089521A patent/SG176651A1/en unknown
- 2009-06-08 MX MX2011013231A patent/MX2011013231A/es active IP Right Grant
- 2009-06-08 EP EP09776698.4A patent/EP2440661B1/en not_active Revoked
- 2009-06-08 DK DK09776698.4T patent/DK2440661T3/en active
- 2009-06-08 PL PL09776698T patent/PL2440661T3/pl unknown
- 2009-06-08 RU RU2011153792/10A patent/RU2517602C2/ru active
- 2009-06-08 CN CN2009801597553A patent/CN102459605A/zh active Pending
- 2009-06-08 BR BRPI0924899A patent/BRPI0924899B8/pt active IP Right Grant
- 2009-06-08 MY MYPI2011005908A patent/MY182355A/en unknown
- 2009-06-08 AU AU2009347610A patent/AU2009347610B2/en active Active
- 2009-06-08 JP JP2012514353A patent/JP5580408B2/ja active Active
-
2011
- 2011-11-30 US US13/308,082 patent/US8652808B2/en active Active
-
2013
- 2013-12-09 US US14/100,825 patent/US9512433B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0924899A2 (pt) | 2021-02-23 |
| CN102459605A (zh) | 2012-05-16 |
| DK2440661T3 (en) | 2018-03-12 |
| US9512433B2 (en) | 2016-12-06 |
| US20140120611A1 (en) | 2014-05-01 |
| RU2517602C2 (ru) | 2014-05-27 |
| NZ597129A (en) | 2012-12-21 |
| EP2440661B1 (en) | 2017-12-06 |
| EP2440661A1 (en) | 2012-04-18 |
| WO2010142305A1 (en) | 2010-12-16 |
| US20120135467A1 (en) | 2012-05-31 |
| US8652808B2 (en) | 2014-02-18 |
| BRPI0924899B1 (pt) | 2022-03-22 |
| JP2012529274A (ja) | 2012-11-22 |
| CN106978382A (zh) | 2017-07-25 |
| SG176651A1 (en) | 2012-01-30 |
| MY182355A (en) | 2021-01-20 |
| PL2440661T3 (pl) | 2018-06-29 |
| AU2009347610A1 (en) | 2012-01-12 |
| RU2011153792A (ru) | 2013-07-20 |
| MX2011013231A (es) | 2012-01-20 |
| AU2009347610B2 (en) | 2013-02-21 |
| BRPI0924899B8 (pt) | 2023-01-31 |
| JP5580408B2 (ja) | 2014-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2660698T3 (es) | Síntesis de HMO | |
| Viehweger et al. | Direct RNA nanopore sequencing of full-length coronavirus genomes provides novel insights into structural variants and enables modification analysis | |
| Borrel et al. | Comparative genomics highlights the unique biology of Methanomassiliicoccales, a Thermoplasmatales-related seventh order of methanogenic archaea that encodes pyrrolysine | |
| Walton et al. | Novel gene functions required for melanization of the human pathogen Cryptococcus neoformans | |
| Beare et al. | Comparative genomics reveal extensive transposon-mediated genomic plasticity and diversity among potential effector proteins within the genus Coxiella | |
| Jonas et al. | The RNA binding protein CsrA controls cyclic di‐GMP metabolism by directly regulating the expression of GGDEF proteins | |
| Matilla et al. | Cyclic diguanylate turnover mediated by the sole GGDEF/EAL response regulator in Pseudomonas putida: its role in the rhizosphere and an analysis of its target processes | |
| Hug et al. | Helicobacter pylori lipopolysaccharide is synthesized via a novel pathway with an evolutionary connection to protein N-glycosylation | |
| Gonzalez et al. | DNA methylation by CcrM activates the transcription of two genes required for the division of C aulobacter crescentus | |
| US20170183665A1 (en) | Recombinant microorganisms capable of carbon fixation | |
| Youngblut et al. | Genomic and phenotypic differentiation among Methanosarcina mazei populations from Columbia River sediment | |
| EA201001436A1 (ru) | Клетка, сбраживающая пентозный сахар | |
| Zhou et al. | Helicobacter pylori Modulates Cisplatin Sensitivity in Gastric Cancer by Down‐Regulating miR‐141 Expression | |
| Huang et al. | Cultivation of the gut bacterium Prevotella copri DSM 18205T using glucose and xylose as carbon sources | |
| Renzi et al. | Glycan-foraging systems reveal the adaptation of Capnocytophaga canimorsus to the dog mouth | |
| Gu et al. | Effects of exogenous synthetic autoinducer-2 on physiological behaviors and proteome of lactic acid bacteria | |
| van der Stel et al. | Catabolite repression in Campylobacter jejuni correlates with intracellular succinate levels | |
| Rauch et al. | Novel proteins for homocysteine biosynthesis in anaerobic microorganisms | |
| Liu et al. | Suppression of the tonoplast sugar transporter, StTST3. 1, affects transitory starch turnover and plant growth in potato | |
| Stock et al. | Disruption and complementation of the selenocysteine biosynthesis pathway reveals a hierarchy of selenoprotein gene expression in the archaeon Methanococcus maripaludis | |
| CN113166710A (zh) | 真贝酵母的麦芽三糖代谢突变体 | |
| Liu et al. | Isolation and Genomics of Futiania mangrovii gen. nov., sp. nov., a Rare and Metabolically Versatile Member in the Class Alphaproteobacteria | |
| Fathy Mohamed et al. | T he LpxL acyltransferase is required for normal growth and penta‐acylation of lipid A in B urkholderia cenocepacia | |
| Costa et al. | Coiled-coils in the YopD translocator family: A predicted structure unique to the YopD N-terminus contributes to full virulence of Yersinia pseudotuberculosis | |
| Benoist et al. | Constitutive stringent response restores viability of Bacillus subtilis lacking structural maintenance of chromosome protein |