BR112021003502A2 - produção fermentativa de oligossacarídeos por fermentação total utilizando uma matéria-prima mista - Google Patents

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Abstract

PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE OLIGOSSACARÍDEOS POR FERMENTAÇÃO TOTAL UTILIZANDO UMA MATÉRIA-PRIMA MISTA. São reveladas células microbianas geneticamente modificadas para a produção de oligossacarídeos compreendendo uma subunidade galactose-ß1,4-glicose em sua extremidade redutora, em que as referidas células microbianas são capazes de produzir os referidos oligossacarídeos na ausência de lactose adicionada exogenamente, e um método de produção dos referidos oligossacarídeos usando as referidas células microbianas.

Description

PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE OLIGOSSACARÍDEOS POR FERMENTAÇÃO TOTAL UTILIZANDO UMA MATÉRIA-PRIMA MISTA
[001] A presente invenção está relacionada a células hospedeiras bacterianas sendo capazes de produzir lactose ou um oligossacarídeo de interesse que compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora, bem como a um método de produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse que compreende uma subunidade galactose-β1,4- glicose terminal.
ANTECEDENTES
[002] O leite humano compreende uma mistura complexa de carboidratos, gorduras, proteínas, vitaminas, minerais e oligoelementos. A fração mais predominante do leite humano consiste em carboidratos. A fração de carboidratos no leite humano pode ser dividida em (i) lactose e (ii) oligossacarídeos (oligossacarídeos do leite humano, HMOs). Enquanto a lactose (galactose-β1,4-glicose) é usada como fonte de energia, os oligossacarídeos não são metabolizados pela criança. A fração de oligossacarídeos é responsável por até 1/10 da fração total de carboidratos e consiste em provavelmente mais de 150 oligossacarídeos diferentes. A ocorrência e concentração desses oligossacarídeos complexos são específicas para humanos e, portanto, não podem ser encontradas em grandes quantidades no leite de outros mamíferos, incluindo animais de fazenda leiteira.
[003] Os oligossacarídeos mais proeminentes do leite humano são 2'- fucosil-lactose e 3'-fucosil-lactose que, juntos, podem contribuir com até 1/3 da fração total de HMO. Outros HMOs proeminentes presentes no leite humano são lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose e a lacto-N-fucopentaose I. Além desses oligossacarídeos neutros, também HMOs ácidos podem ser encontrados no leite humano, tal como 3'-sialil-lactose, 6'-sialil-lactose e 3-fucosil-3'-sialil-
lactose, sialil-lacto-N-tetraose, disialil-lacto-N-tetraose. Notavelmente, a grande maioria dos HMOs compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora. As estruturas dos HMOs estão intimamente relacionadas aos epítopos dos glicoconjugados da superfície das células epiteliais, os antígenos do grupo do histosangue de Lewis, como Lewis x (LeX). A semelhança estrutural dos HMOs com os epítopos epiteliais é responsável pelas propriedades protetoras dos HMOs contra patógenos bacterianos.
[004] A presença de oligossacarídeos no leite humano é conhecida há muito tempo e as funções fisiológicas desses oligossacarídeos foram objeto de pesquisas médicas por muitas décadas. Para alguns dos mais abundantes oligossacarídeos do leite humano, funções específicas já foram identificadas.
[005] Além dos efeitos locais no trato intestinal, conforme mencionado anteriormente na presente invenção, os HMOs também mostraram provocar efeitos sistêmicos em crianças ao entrar em sua circulação sistêmica. Além disso, o impacto dos HMOs nas interações proteína-carboidrato, por exemplo, ligação selectina-leucócito, pode modular as respostas imunológicas e reduzir as respostas inflamatórias. Além disso, é cada vez mais reconhecido que os HMOs representam um substrato chave para o desenvolvimento dos microbiomas em crianças.
[006] Devido às propriedades benéficas bem estudadas dos oligossacarídeos prebióticos, em particular dos HMOs, mas à sua disponibilidade limitada de fontes naturais, uma produção comercial eficiente, ou seja, em grande escala, de HMOs é altamente desejável.
[007] Na tentativa de produção em larga escala de oligossacarídeos individuais do leite humano, foram desenvolvidas rotas químicas para alguns desses oligossacarídeos. No entanto, tais métodos envolvem o uso de diversos produtos químicos nocivos, que apresentam o risco de contaminar o produto final. Pelo menos quantidades em grande escala, bem como qualidades suficientes para aplicações em alimentos, não podem ser fornecidas até hoje através da síntese química.
[008] Para contornar as desvantagens associadas com à síntese química de oligossacarídeos de leite humano, vários métodos enzimáticos e abordagens fermentativas para sua produção foram desenvolvidos. Os processos de produção fermentativa foram desenvolvidos para vários HMOs, como 2'-fucosil- lactose, 3-fucosil-lactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, 3'-sialil-lactose e 6'-sialil-lactose. Esses processos de produção tipicamente usam cepas bacterianas geneticamente modificadas, como Escherichia coli.
[009] Hoje, todos os processos de produção fermentativa, bem como reações biocatalíticas para produzir HMOs, são baseados exclusivamente na lactose adicionada exogenamente como substrato inicial. Um ou mais monossacarídeos são adicionados à lactose nos processos (US 7.521.212 B1; Albermann et al., (2001) Carbphydr. Res. 334 (2) p 97-103). A adição de monossacarídeos à lactose pode ser catalisada por glicosil transferase ou por glicosidases usando adequados substratos monossacarídeos ativados. Além disso, monossacarídeos adicionais podem ser adicionados à lactose por reações de transglucosidase.
[010] Em particular a produção fermentativa de HMOs provou ser eficiente, porque os monossacarídeos ativados por nucleotídeos que são necessários, mas de tamanho difícil de sintetizar, são fornecidos pelo metabolismo das células microbianas que são empregadas. No entanto, o uso de células inteiras para a síntese de HMOs também traz - em comparação com a abordagem biocatalítica - diversas desvantagens importantes, que se relacionam aos processos de transporte através da membrana celular, às reações colaterais metabólicas e à necessidade de que os oligossacarídeos sendo sintetizados pelas células microbianas devem ser purificadas a partir de uma mistura complexa contendo, inter alia, vários polióis (por exemplo, carboidratos), ácidos nucleicos, polipeptídeos, material inorgânico, etc.
[011] Um problema técnico referido ao uso de lactose em processos fermentativos que precisa ser superado, em particular quando o oligossacarídeo a ser produzido deve ser usado para consumo humano, é o rearranjo da lactose (beta-D-galactopiranosil-(1->4)-D-glicose) em lactulose (beta-D-galactopiranosil- (1->4)-D-fructofuranose) após tratamento térmico de lactose. Este rearranjo pode ocorrer extensivamente por esterilização por calor da lactose, levando ao rearranjo de diversos por cento da lactose para estar presente no meio de fermentação ou na alimentação da lactose para a lactulose. No entanto, a lactulose é um açúcar não digerível para humanos e é amplamente utilizada como laxante no tratamento da constipação crônica.
[012] A conversão de lactose em lactulose não só leva à geração de lactulose indesejada, mas também fornece um substrato indesejado para reações de glicosilação nas células microbianas. Desse modo, oligossacarídeos mais complexos (por exemplo, 2'-fucosil-lactulose) são gerados como subprodutos. Assim, a geração de lactulose a partir da lactose está levando à contaminação do produto desejado com oligossacarídeo intimamente relacionados, que são difíceis ou mesmo impossíveis de separar do produto desejado.
[013] Além disso, a lactose pode ser convertida em alolactose (beta-D- galactopiranosil-(1→6)-D-glucopiranose), outro contaminante indesejado (Huber et al., "Efflux of beta-galactosidase products from Escherichia coli” (1980) J. Bacteriol. 141, 528- 533), se fornecido a um beta-galactosidase positivo de cepa de E. coli.
[014] Além disso, a adição de lactose pode causar um efeito bem documentado conhecido como "morte celular induzida pela lactose". Este efeito é provavelmente causado pela absorção excessiva de lactose pela célula microbiana e o colapso associado do gradiente de prótons através da membrana bacteriana. Em particular, a superexpressão do gene da lactose permease (por exemplo lacY de E. coli) em combinação com a exposição da célula microbiana recombinante ao excesso de lactose pode causar um atraso considerável no crescimento da cepa recombinante e uma síntese aumentada de polissacarídeos celulares (Grube et al., "Hydrogen-producing Escherichia coli strains overexpressing lactose permease: FT-IR analysis of the lactose-induced stress"(2013) Biotechnol. Appl. Biochem. 5, 31).
[015] Além disso, qualquer lactose comercialmente disponível hoje é derivada de soro de leite, um produto residual da indústria de laticínios. O soro de leite é produzido em enormes quantidades na fabricação de queijos e caseína. Assim, por ser derivado da indústria de laticínios, ainda existem preocupações relacionadas a uma contaminação potencial da lactose com proteínas príon, que são o agente causador da encefalopatia espongiforme bovina (BSE), também amplamente conhecida como doença da vaca louca. A BSE é uma doença neurodegenerativa fatal em bovinos, causando degeneração esponjosa do cérebro e da medula espinhal. A BSE pode ser transmitida a humanos e é conhecida como variante da doença de Creutzfeldt-Jakob.
[016] Acima de tudo, a lactose ainda é um dos componentes mais caros do meio de fermentação e sua substituição por glicose, glicerol, sacarose etc. levaria a uma produção mais econômica de HMOs.
[017] Para superar as desvantagens acima mencionadas, foram desenvolvidos meios e métodos aprimorados para a produção de HMOs. Por exemplo, WO 2015/150328 A1 divulga células hospedeiras bacterianas sendo capazes de produzir oligossacarídeos compreendendo um dissacarídeo de galactose-(1→4)-glicose terminal, em que a referida célula hospedeira bacteriana expressa pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando para uma β-1,4-galactosil transferase que é capaz de galactosilar um monossacarídeo de glicose livre para gerar lactose intracelularmente e que contém e expressa pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando uma fucosil transferase, uma sialiltrans-ferase, uma glucosamil transferase ou uma galactosil transferase. A referida célula hospedeira bacteriana é capaz de gerar o oligossacarídeo sem adição exógena de lactose de modo que a célula hospedeira bacteriana pode ser cultivada em um meio de cultura sem adição exógena de lactose para produzir o referido oligossacarídeo. Mais especificamente, o WO 2015/150328 A1 divulga um produto geneticamente manipulado de cepa de E. coli para a produção de 2'-fucosil- lactose que utiliza sacarose ou uma combinação de glicose e sacarose como fonte de carbono. Para utilização de sacarose, a referida cepa de E. coli foi geneticamente modificada para expressar os quatro genes do cluster genético csc de E. coli W, ou seja, os genes que codificam a sacarose permease (cscB), a frutocinase (cscK), a sacarose hidrolase (cscA), e um repressor transcricional (cscR).
[018] No entanto, a produção de 2'-FL pela referida cepa de E. coli geneticamente modificada usando sacarose como única fonte de carbono e energia tem suas desvantagens em que também é difícil esterilizar a sacarose por calor sem um grau considerável de hidrólise e formação de produtos colaterais indesejados. Como alternativa, a filtração estéril da solução de sacarose pode ser empregada, mas a filtração estéril apresenta um alto risco de contaminação por crescimento estranho da fermentação, em particular na fermentação em escala industrial.
[019] Além disso, o cultivo de uma célula microbiana para a produção de um HMO na presença de sacarose como fonte de carbono, em que a referida célula microbiana foi geneticamente modificada para possuir um metabolismo dividido de modo que os monômeros que constituem a sacarose sejam usados em percursos metabólicos distintos, leva a características de crescimento indesejáveis da cultura de células bacterianas, presumivelmente devido à estequiometria de monômeros gerados a partir da hidrólise de sacarose intracelular que não corresponde às necessidades quantitativas dos diferentes monômeros nos percursos distintos.
[020] Para superar as desvantagens acima mencionadas, é fornecida uma célula microbiana geneticamente modificada que é capaz de produzir um oligossacarídeo de interesse compreendendo uma subunidade galactose-β1,4- glicose em sua extremidade de redução quando cultivada em uma matéria- prima de monossacarídeo misto como principal fonte de carbono e energia, mas em a ausência de lactose adicionada exogenamente.
RESUMO
[021] Em um primeiro aspecto, é fornecido uma célula microbiana geneticamente modificada para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse compreendendo uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade de redução, em que a referida célula microbiana é capaz de produzir a referida lactose de novo ou o referido oligossacarídeo de interesse quando cultivado na ausência de lactose adicionada exogenamente.
[022] Em um segundo aspecto, é fornecido o uso da célula hospedeira microbiana geneticamente modificada para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse compreendendo uma subunidade galactose-β1,4- glicose em sua extremidade redutora.
[023] Em um terceiro aspecto, é fornecido um método para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse compreendendo uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora, cultivando a célula microbiana geneticamente modificada na presença de uma matéria-prima mista contendo glicose, e recuperar o oligossacarídeo de interesse.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[024] A Fig. 1 mostra um desenho esquemático de uma modalidade exemplar de uma célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a invenção para a produção de 2'-fucosil-lactose.
[025] A Fig. 2 mostra um desenho esquemático de outra modalidade exemplar de uma célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a invenção para a produção de 2'-fucosil-lactose.
[026] A Fig. 3 mostra um desenho esquemático de uma modalidade exemplar adicional de uma célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a invenção para a produção de 2'-fucosil-lactose.
[027] A Fig. 4 mostra as características de crescimento de cepas E. coli durante o cultivo em glicose (A) ou uma matéria-prima de monossacarídeo misto que consiste em glicose e frutose (B) como única fonte de carbono e energia.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[028] De acordo com o primeiro aspecto, é fornecida uma célula microbiana geneticamente modificada para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse compreendendo uma subunidade galactose-β1,4- glicose em sua extremidade redutora, em que a referida célula microbiana possui pelo menos um transportador de glicose para translocação glicose do meio de cultura para o citoplasma da célula microbiana, um percurso de biossíntese de UDP-galactose para a biossíntese intracelular de UDP-galactose e pelo menos uma galactosil transferase que é capaz de galactosilar glicose intracelular livre para produzir lactose intracelularmente.
[029] A célula microbiana geneticamente modificada é capaz de produzir lactose. Em certas modalidades, a célula microbiana pode utilizar a lactose sendo produzida por si mesma para a produção de um oligossacarídeo de interesse que carrega uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora. Para a produção do referido oligossacarídeo de interesse, não é necessário fornecer um suprimento exógeno de lactose à célula microbiana.
[030] A célula microbiana geneticamente modificada possui pelo menos um transportador de glicose para translocar glicose do meio de cultura em que a referida célula microbiana é cultivada no citoplasma da célula microbiana de modo que a glicose livre se torne disponível para a biossíntese intracelular de lactose.
[031] Tipicamente, a célula microbiana geneticamente modificada compreende pelo menos um gene funcional codificando o referido transportador de glicose, que é capaz de translocar glicose (Glu) do meio de cultura para o citoplasma da célula.
[032] O termo "gene funcional", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou polipeptídeo, e que também contém sequências regulatórias operacionalmente vinculadas à referida sequência de nucleotídeos de codificação de proteína de modo que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína ou polipeptídeo pode ser expresso na/pela célula microbiana portadora do referido gene funcional. Assim, quando cultivado em condições que são permissivas para a expressão do gene funcional, o referido gene funcional é expresso e a célula microbiana que expressa o referido gene funcional compreende tipicamente a proteína ou polipeptídeo que é codificado pela região de codificação da proteína do gene funcional. Tal como utilizado na presente invenção, os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a um desoxirribonucleotídeo ou polímero de ribonucleotídeo na forma de fita simples ou dupla e, a menos que de outra forma limitado, engloba análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que hibridizam com ácidos nucleicos de uma maneira semelhantes aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular inclui a sequência complementar da mesma.
[033] O termo "operacionalmente vinculadas", tal como utilizado na presente invenção, deve significar uma vinculação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, sequência de sinal ou matriz de sítios de ligação de fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que o controle de expressão sequência afeta a transcrição e /ou tradução do ácido nucleico correspondente à segunda sequência. Consequentemente, o termo "Promotor" designa sequências de DNA que geralmente "precedem" um gene em um polímero de DNA e fornecem um local para a iniciação da transcrição em mRNA. Sequências de DNA "reguladoras", também geralmente "a montante" de (ou seja, precedendo) um gene em um determinado polímero de DNA, ligam-se a proteínas que determinam a frequência (ou taxa) de iniciação da transcrição. Coletivamente referidas como "promotor/regulador" ou sequência de DNA de "controle", essas sequências que precedem um gene selecionado (ou série de genes) em um polímero de DNA funcional cooperam para determinar se a transcrição (e eventual expressão) de um gene ocorrerá. As sequências de DNA que "seguem" um gene em um polímero de DNA e fornecem um sinal para a terminação da transcrição em mRNA são referidas como sequências "terminadoras" da transcrição.
[034] O termo "recombinante", tal como utilizado na presente invenção com referência a uma célula hospedeira bacteriana indica que a célula bacteriana replica um ácido nucleico heterólogo ou expressa um peptídeo ou proteína codificada por um ácido nucleico heterólogo (ou seja, uma sequência "estranha à referida célula") As células recombinantes podem conter genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula. As células recombinantes também podem conter genes encontrados na forma nativa da célula, em que os genes são modificados e reintroduzidos na célula por meios artificiais. O termo também abrange células que contêm um ácido nucleico endógeno à célula que foi modificado sem remover o ácido nucleico da célula; tais modificações incluem aquelas obtidas por substituição de genes, mutação específica do local e técnicas relacionadas. Consequentemente, um "polipéptido recombinante" é aquele que foi produzido por uma célula recombinante. Uma "sequência heteróloga" ou um "ácido nucleico heterólogo", tal como utilizado na presente invenção, é aquele que se origina de uma fonte estranha à célula hospedeira particular (por exemplo, de uma espécie diferente), ou, se for da mesma fonte, é modificado a partir de sua forma original. Assim, um ácido nucleico heterólogo operacionalmente vinculado a um promotor é de uma fonte diferente daquela a partir da qual o promotor foi derivado, ou, se for da mesma fonte, é modificado de sua forma original. A sequência heteróloga pode ser introduzida de forma estável, por exemplo, por transfecção, transformação, conjugação ou transdução, no genoma da célula do microrganismo hospedeiro, em que podem ser aplicadas técnicas que dependerão da célula hospedeira em que a sequência deve ser introduzida. Várias técnicas são conhecidas por um técnico no assunto e são, por exemplo, reveladas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).
[035] Consequentemente, uma "célula microbiana geneticamente modificada" é entendida como uma célula bacteriana que foi transformada ou transfectada, ou é capaz de transformação ou transfecção por uma sequência polinucleotídica exógena.
[036] Assim, as sequências de ácido nucleico conforme utilizadas na presente invenção, podem, por exemplo, estar compreendidas num vector que deve ser transformado/transfectado de forma estável ou de outro modo introduzido em células de microrganismo hospedeiro.
[037] Uma grande variedade de sistemas de expressão pode ser usada para produzir os polipeptídeos da invenção. Tais vetores incluem, entre outros, vetores cromossômicos, episômicos e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, de bacteriófagos, de transposons, de epissomas de levedura, de elementos de inserção, de elementos cromossômicos de levedura, de vírus e vetores derivados de combinações dos mesmos, tais como aqueles derivados de plasmídeos e elementos genéticos de bacteriófagos, tais como cosmídeos e fagemídeos. Os constructos do sistema de expressão podem conter regiões de controle que regulam, bem como geram expressão. Geralmente, qualquer sistema ou vetor adequado para manter, propagar ou expressar polinucleotídeos e para sintetizar um polipeptídeo em um hospedeiro pode ser usado para expressão a este respeito. A sequência de DNA apropriada pode ser inserida no sistema de expressão por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas e de rotina, tais como, por exemplo, aquelas estabelecidas em Sambrook et al., supra.
[038] A técnica é rica em publicações de patentes e literatura relacionadas a metodologias de "DNA recombinante" para o isolamento, síntese, purificação e amplificação de materiais genéticos para uso na transformação de organismos hospedeiros selecionados. Assim, é de o conhecimento comum transformar organismos hospedeiros com DNA viral "híbrido" ou plasmídeo circular que inclui sequências de DNA exógeno (ou seja, estranho ou "heterólogo") selecionadas. Os procedimentos conhecidos na técnica envolvem primeiro a geração de um vetor de transformação por clivagem enzimática de DNA viral circular ou plasmídeo para formar fitas de DNA lineares. Fitas de DNA estranhas selecionadas geralmente incluindo sequências que codificam para o produto de proteína desejado são preparadas de forma linear através das mesmas/semelhantes enzimas. O DNA viral ou plasmídeo linear é incubado com o DNA estranho na presença de enzimas de vinculação capazes de efetuar um processo de restauração e vetores "híbridos" são formados, os quais incluem o segmento de DNA exógeno selecionado "dividido" no plasmídeo de DNA viral ou circular.
[039] O termo "codificação de sequência de nucleotídeos ... "geralmente refere-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado, e geralmente representa a porção de um gene que codifica um determinado polipeptídeo ou proteína. O termo inclui, sem limitação, DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla ou regiões de fita simples, dupla e tripla, RNA de fita simples e dupla e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou de fita tripla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. O termo também abrange polinucleotídeos que incluem uma única região contínua ou regiões descontínuas codificando o polipeptídeo (por exemplo, interrompido por fago integrado ou uma sequência de inserção ou edição) juntamente com regiões adicionais que também podem conter sequências codificantes e/ou não codificantes.
[040] Em uma modalidade, um transportador de glicose adequado é uma proteína para difusão facilitada de glicose. Uma proteína para fusão facilitada de glicose adequada é codificada pelo gene glf de Zymomonas mobilis subsp.
mobilis (cepa ATCC 31821 / ZM4 / CP4).
[041] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, outro transportador de glicose adequado é uma permease de translocação de glicose. Uma permease de translocação de glicose adequada é codificada pelo gene galP de E. coli K-12. A permease de translocação de glicose também é conhecida como simportador de próton de galactose ou premease de galactose, mas também importa glicose através da membrana celular.
[042] Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende e expressa pelo menos um gene que compreende a região de codificação da proteína do gene glf de Zymomonas mobilis subsp. mobilis (cepa ATCC 31821 / ZM4 / CP4), o gene galP K-12 de E. coli ou variantes funcionais do mesmo.
[043] O termo "variante(s)", conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que difere de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente, mas retém as propriedades essenciais (enzimáticas) do polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência. Uma variante típica de um polinucleotídeo difere na sequência de nucleotídeos de outro polinucleotídeo de referência. Mudanças na sequência de nucleotídeos da variante podem ou não alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. As alterações de nucleotídeos podem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncagens de aminoácidos no polipeptídeo codificado pela sequência de referência, como discutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere na sequência de aminoácidos de outro polipeptídeo de referência. Geralmente, as diferenças são limitadas de modo que as sequências do polipeptídeo de referência e da variante sejam muito semelhantes em geral e, em muitas regiões, idênticas. Uma variante e um polipeptídeo de referência podem diferir na sequência de aminoácidos por uma ou mais substituições, adições, deleções em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substituído ou inserido pode ou não ser um codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser de ocorrência natural, como uma variante alélica, ou pode ser uma variante que não se sabe que ocorre naturalmente. Variantes de polinucleotídeos e polipeptídeos de ocorrência não natural podem ser feitas por técnicas de mutagênese, por síntese direta e por outros métodos recombinantes conhecidos pelos técnicos no assunto.
[044] No escopo da presente invenção, também as variantes polimórficas de ácido nucleico/polinucleotídeo e polipeptídeo, alelos, mutantes e homólogos interespécies são compreendidos por esses termos, que têm uma sequência de aminoácidos que tem mais do que cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, de preferência 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou maior identidade de sequência de aminoácidos , de preferência sobre uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais aminoácidos, para um polipeptídeo codificado por uma proteína de tipo selvagem.
[045] Consequentemente, uma "variante funcional" de qualquer um dos genes/proteínas revelados na presente invenção, destina-se a designar variantes de sequência dos genes/proteínas que ainda retêm a mesma ou algo da atividade do gene ou proteína de onde o respectivo fragmento é derivado.
[046] A célula microbiana geneticamente modificada possui um percurso de biossíntese de UDP-galactose para a formação intracelular de GDP-galactose (GDP-Gal), porque um suprimento eficiente de UDP-galactose é necessário para a biossíntese intracelular de lactose.
[047] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, UDP-galactose pode ser obtida a partir do próprio metabolismo das células microbianas, ou seja, a atividade de uma fosfoglucomutase, uma UTP-glicose-1-fosfato-uridil transferase e uma UDP-glicose-4-epimerase.
[048] O suprimento intracelular de GDP-galactose pode ser melhorado por modificações genéticas, tal como uma expressão ou superexpressão de um ou mais dos genes que codificam polipeptídeos exibindo atividade de fosfoglucomutase, atividade de UDP-glicose-1-fosfato uridil transferase e atividade de UDP-glicose-4-epimerase, respectivamente.
[049] O termo "superexpressão" ou "superexpressado", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um nível de expressão de enzima ou polipeptídeo que é maior do que o que é medido em uma célula de tipo selvagem da mesma espécie que a célula hospedeira que não foi alterada geneticamente.
[050] A fosfoglucomutase é uma enzima que facilita a interconversão de glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato em que está em um monômero de α-D- glicose da posição 1' para a posição 6' ou da posição 6' para a 1'. Um exemplo de gene que codifica uma fosfoglucomutase adequada é o gene pgm K-12 de E. coli (GenBank: U08369.1). Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende e expressa/superexpressa um gene que codifica uma fosfoglucomutase, o gene preferencialmente compreendendo a região codificadora da proteína do gene pgm de E. coli ou uma variante do mesmo.
[051] UTP-glicose-1-fosfato-uridil transferase tal como GalU ou uma variante funcional da mesma catalisa a conversão de α-D-glicose-1-fosfato em UDP-glicose utilizando UTP. Um exemplo de gene que codifica uma UTP-glicose- 1-fosfato-uridil transferase adequada é o gene galU K-12 de E. coli (GenBank: M98830.1). Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende e expressa/superexpressa um gene que codifica uma UTP-glicose-1-fosfato-uridil transferase, o gene preferencialmente compreendendo a região codificadora da proteína do gene galU de E. coli ou uma variante do mesmo.
[052] UDP-glicose-4-epimerase, tal como gale ou uma variante funcional da mesma, catalisa a epimerização de UDP-glicose em UDP-galactose. Um exemplo de gene que codifica uma UDP-glicose-4-epimerase é o gene galE K-12 de E. coli. Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende e expressa/superexpressa um gene que codifica uma UDP-glicose-4-epimerase, o gene preferencialmente compreendendo a região codificadora da proteína do gene galE de E. coli ou uma variante do mesmo.
[053] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o percuros de biossíntese de UDP-galactose compreende adicionalmente a atividade enzimética de uma isomerase de glicose-6-fosfato que converte frutose-6- fosfato em glicose-6-fosfato e vice-versa. Um exemplo de gene codificando uma glicose-6-fosfato isomerase é o gene pgi K-12 de E. coli. Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende e expressa/superexpressa um gene codificando uma glicose-6-fosfato isomerase, o gene preferencialmente compreendendo a região codificadora da proteína do gene pgi de E. coli ou uma variante da mesma.
[054] Alternativamente, UDP-galactose pode ser obtida alimentando galactose às células microbianas via o meio de cultura. A galactose é captada pela célula e fosforilada em galactose-1-fosfato que é então convertida em UDP galactose. Os genes codificando enzimas que possuem as atividades enzimáticas necessárias são conhecidos na literatura (Groissoird et al., "Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway (2003) J. Bacteriol. 185(3) 870-878).
[055] A célula microbiana geneticamente modificada compreende uma β- 1,4-galactosil transferase que é capaz de galactosilar o monossacarídeo de glicose livre. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, uma β-1,4- galactosil transferase adequada é derivada de Neisseria menningitidis, de Aggregatibacter aphrophilus de Pasteurella multocida, de preferência uma β- 1,4-galactosil transferase codificada pelo gene lgtB de Neisseria menningitidis, pelo gene lex-1 de Aggregatibacter aphrophilus ou pelo gene Tpm1141 de Pasteurella multocida β-1,4-galactosil transferase (GenBank: AEC04686). Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende e expressa/superexpressa um gene que codifica uma β-1,4-galactosil transferase, o gene preferencialmente compreendendo a região de codificação da proteína do gene lgtB de Neisseria menningitidis, o gene lex-1 de Aggregatibacter aphrophilus, o gene galTpm1141 de Pasteurella multocida ou uma variante do mesmo.
[056] A β-1,4-galactosil transferase usa UDP-galactose como substrato para a transferência da subunidade de galactose para o monossacarídeo de glicose livre, sintetizando assim um dissacarídeo de galactose-β1,4-glicose, ou seja, lactose.
[057] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende pelo menos uma glicosil transferase adicional, isto é, além da referida β-1,4-galactosil transferase.
[058] Geralmente, e ao longo da presente invenção, o termo "atividade de glicosil transferase" ou "glicosil transferase" designa e abrange enzimas que são responsáveis pela biossíntese de dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos e catalisam a transferência de meações de monossacarídeos de um monossacarídeo/açúcar de nucleotídeo ativado (o "doador de glicosil") para uma molécula aceitadora de glicosil.
[059] Em uma modalidade preferida, a pelo menos uma glicosil transferase adicional é uma fucosil transferase, uma sialil transferase, uma glucosaminil transferase ou uma galactosil transferase, mais preferencialmente, a pelo menos uma glicosil transferase adicional é selecionada a partir de pelo menos um dos seguintes: alfa-1,2-fucosil transferase, alfa-1,3-fucosil transferase, beta-1,3-N- acetilglucosamil transferase, beta-1,3-galactosil transferase, alfa-2,3-sialil transferase, alfa-2,6-sialil transferase, beta-1,4-galactosil transferase ou beta- 1,6-galactosil transferase.
[060] A atividade enzimática de pelo menos uma glicosil transferase adicional permite a produção de oligossacarídeos de interesse que compreendem uma subunidade de galactose-13-1,4-glicose em sua extremidade redutora usando lactose como um aceitador para a atividade da glicosil transferase adicional. A Tabela 1 identifica os HMOs mais abundantes que podem ser produzidos pelas células microbianas e métodos revelados na presente invenção como oligossacarídeo de interesse. Nome Abrev. estrutura 2’-Fucosil-lactose 2'-FL Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glu 3-Fucosil-lactose 3-FL Gal(β1-4) Glu
I Fuc (α1-3) 2’, 3-Difucosil-lactose DF-L Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glu
I Fuc (α1-3) Lacto-N-triose II LNT II GlcNAc (β1-3) Gal (β1-4) Glu lacto-N-tetraose LNT Gal(β1-3) GlcNAc (β1-3)Gal(β1-4) Glu Lacto-N-neotetraose LNnT Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu Lacto-N- LNFP I Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4) Glu fucopentaose I Lacto-N- LNnFP I Fuc(α1-2)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu
Nome Abrev. estrutura neofucopentaose I Lacto-N- LNFP II Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu fucopentaose II I Fuc(α1-4) Lacto-N-fucopentaose LNFP III Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu
III I Fuc (α1-3) Lacto-N-fucopentaose LNFPV Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu
V I Fuc(α1-3) Lacto-N-neofucopentaose V LNnFP V Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu
I Fuc (α1-3) Lacto-N- LNDH I Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu difucohexaose I I I Fuc(α1-2) Fuc(α1-4) Lacto-N- LND Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1- difucohexaose II 4)Glu
I I Fuc(α1-4) Fuc(α1-3) 6'-Galactosil-lactose 6'-GL Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glu 3'-Galactosil-lactose 3'-GL Gal(β1-3)Gal(β1-4)Glu Lacto-N-hexaose LNH Gal(β1-4)GlcNAc(β1-6)Gal(β1-4)Glu
I Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3) Lacto-N-neohexaose LNnH Gal(β1-4)GlcNAc(β1-6)Gal(β1-4)Glu
I Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3) para-Lacto-N- paraLNT Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu hexaose para-Lacto-N- paraLNnH Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu neohexaose
Nome Abrev. estrutura Difucosil-lacto-N- DF-LNnH Fuc(α1-3) neohexaose I Gal(β1-4)GlcNAc(β1-6)Gal(β1-4)Glu
I Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)
I Fuc(α1-3) 3'-Sialil-lactose 3'-SL Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glu 6'-Sialil-lactose 6'-SL Neu5Ac(α2-6)Gal(β1-4)Glu Lacto-N-sialilpentaose LST-a Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu a Lacto-N-sialilpentaose LST-b Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu b I Neu5Ac(α2-6) Lacto-N-sialilpentaose LST-c Neu5Ac(α2-6)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu c Fucosil-lacto-N- F-LST-a Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glu sialilpentaose a I Fuc(α1-4) Fucosil-lacto-N- F-LST-b Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4) Glu sialilpentaose b I Neu5Ac(α2-6) Fucosil-lacto-N- F-LST-c Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1- sialilpentaose c 4)Glu
I Fuc(α1-3) Disialyl-lacto-N- tetraose DS-LNT Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1- 4)Glu
I Neu5Ac(α2-6) Disialyl-lacto-N- DS-LNFP Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1- fucopentaose V 4)Glu
Nome Abrev. estrutura
I I Neu5Ac(α2-6) Fuc (α1-3) 3-fucosil-3'-sialil-lactose 3F-3'-SL Neu5Ac (α2-3) Gal (β1-4) Glu
I Fuc (α1-3) 3-fucosil-6'-sialil-lactose 3F-6'-SL Neu5Ac (α2-6) Gal(β 1-4) Glu
I Fuc(α1-3) Lacto-N- LNnDFH I Gal (1-4) GalNAc (1-3) Gal (1-4) Glu neodifucohexaose I I I Fuc(α1-3) Fuc(α1-3) Tabela 1: Lista de oligossacarídeos de interesse que podem ser produzidos usando uma célula microbiana geneticamente modificada e/ou um método como descrito na presente invenção.
[061] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana compreende um sistema de fosfotransferase de translocação de glicose (PtsG). O sistema de fosfotransferase de translocação de glicose catalisa a fosforilação da glicose de entrada concomitantemente com sua translocação através da membrana celular.
[062] O mecanismo geral do sistema Pts é o seguinte: um grupo fosforil de fosfoenolpiruvato (PEP) é transferido via um percurso de transdução de sinal para a enzima I (El) que, por sua vez, o transfere para um transportador de fosforil, a proteína histidina (HPr). Phospho-HPr então transfere o grupo fosforil para uma permease específica de açúcar, um complexo ligado à membrana conhecido como enzima 2 (EII), que transporta o açúcar para a célula. EII consiste em pelo menos três domínios estruturalmente distintos IIA, IIB e IIC. Estes podem ser fundidos em uma única cadeia polipeptídica ou existir como duas ou três cadeias interativas, anteriormente chamadas de enzimas II (EII) e III (EIII).
[063] O primeiro domínio (IIA ou EIIA) carrega o primeiro local de fosforilação específico da permease, uma histidina que é fosforilada por fosfo- HPr. O segundo domínio (IIB ou EIIB) é fosforilado por fosfo-llA em um resíduo de cisteinila ou histidila, dependendo do açúcar transportado. Finalmente, o grupo fosforil é transferido do domínio IIB para o substrato de açúcar concomitantemente com a absorção de açúcar processada pelo domínio IIC. Este terceiro domínio (IIC ou EIIC) forma o canal de translocação e o local de ligação ao substrato específico.
[064] Assim, o sistema PtsG adquire glicose exógena e fornece glicose-6- fosfato na célula microbiana. A glicose-6-fosfato pode ser utilizada no percurso de biossíntese de UDP-galactose e/ou convertida em frutose-6-fosfato que, por sua vez, pode ser usada para gerar trifosfatos ricos em energia no metabolismo central e/ou, por exemplo, em a biossíntese de sacarídeos ativados por nucleotídeos, como a GDP-fucose.
[065] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o(s) gene(s) de glucoquinase(s) da célula microbiana foram deletados ou funcionalmente inativados de modo que a célula microbiana não possua qualquer polipeptídeo com atividade de glucoquinase. A glucoquinase (Glk) b fosforila a glicose livre em seu átomo de carbono 6 para gerar glicose-6-fosfato. Na ausência de atividade da glucoquinase, a glicose livre que é translocada para o citoplasma da célula microbiana torna-se disponível como substrato para a β-1,4-galactosil transferase para produzir lactose, enquanto a glicose-6-fosfato obtida da atividade PtsG pode ser utilizada para UDP-galactose formação ou outros percursos metabólicos.
[066] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende um transportador de frutose para translocar a frutose (Fru) do meio de cultura para o citoplasma da célula microbiana. Um transportador de frutose adequado para a absorção de frutose livre é uma isoforma (PtsG-F), conforme descrito por Kornberg et al. PNAS 97: 1808-1812 (2000)).
[067] A frutose internalizada pode então ser fosforilada por uma frutocinase (FrK) para fornecer frutose-6-fosfato (Fru-6-P). A frutose-6-fosfato pode ser utilizada no percurso de biossíntese de UDP-galactose e/ou em outros percursos metabólicos, tal como a geração de trifosfatos ricos em energia no metabolismo central e/ou, por exemplo, na biossíntese de sacarídeos ativados por nucleotídeos, como o GDP-fucose.
[068] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende polipeptídeos exibindo atividade de frutose-6 e polipeptídeos exibindo atividade de 6-fosfofrutoquinase-1 (FruK ou fosfofrutoquinase) para fornecer um percurso metabólico de frutose internalizado via frutose-6-fosfato para frutose-1,6-bisfosfato.
[069] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende um sistema de fosfotransferase de translocação de frutose (PtsF). O sistema de fosfotransferase de translocação de frutose catalisa a fosforilação da frutose de entrada concomitantemente com sua translocação através da membrana celular.
[070] Assim, o sistema PtsF adquire frutose exógena e fornece frutose-1- fosfato na célula microbiana. O sistema PtsF compreende uma proteína que atravessa a membrana FruA, uma 1-fosfofrutose quinase (FruK) e uma proteína de transferência difosforil FruB. A frutose é translocada por meio de FruA e FruB para fornecer frutose-1-fosfato no citoplasma. A frutose-1-fosfato pode ser ainda fosforilada por uma fosfofrutoquinase (FruK) para render frutose-1,6- bifosfato que, por sua vez, pode ser usada pela célula microbiana para gerar trifosfatos ricos em energia no metabolismo central.
[071] Outro sistema PtsF adequado compreende LevD, LevE, LevF e LevG. LevD é o componente específico da enzima fosfotransferase IIA da frutose. LevE é o componente específico da enzima fosfotransferase IIB da frutose. LevF é o componente IIC da frutose permease, LevG é o componente IID da frutose permease. Genes correspondentes levD, levE, levF e levG são - por exemplo, forma conhecida do Bacillus subtilis (cepa 168). O referido sistema PtsF fornece frutose-1-fosfato na célula.
[072] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende pelo menos uma 1-fosfofrutoquinase (FruK).
[073] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende uma frutose-1,6-bisfosfatase (GlpX). A referida frutose-1,6-bisfosfatase desfosforila a frutose-1,6-bifosfato para fornecer frutose-6-fosfato. A frutose-6-fosfato pode ser usada pela célula microbiana no percurso de biossíntese de GDP galactose ou em outro percurso metabólico, por exemplo, na biossíntese de sacarídeos ativados por nucleotídeos, como a GDP-fucose.
[074] Preferencialmente, a célula microbiana também compreende uma deleção ou inativação funcional do(s) seu(s) gene(s) de fosfofrutoquinase. A deleção ou inativação funcional do(s) gene(s) da fosfofrutoquinase leva a uma célula microbiana sem atividade de fosfofrutoquinase, de modo que a conversão de Fru-6-P em Fru-1,6-bisP é prevenida. No E. coli, duas isoformas de fosfofrutoquinase estão presentes, designadas PfkA e PfkB. Os genes correspondentes são pfkA e pfkB.
[075] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada possui um percurso de biossíntese de GDP-L-fucose.
Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o percurso de biossíntese de GPD-fucose compreende uma manose-6-fosfato isomerase (ManA), uma fosfomanomutase (ManB), uma manose-1-fosfato-guanilil transferase (ManC), um GDP-manose-4,6-desidratase (Gmd), uma GDP-L-fucose sintase (WcaG). Preferencialmente, a célula microbiana possuindo um percurso de biossíntese de GDP-L-fucose também possui uma fucosil transferase.
[076] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana compreende uma proteína exportadora ou uma permease que exporta o oligossacarídeo de interesse da célula, de preferência um transportador de efluxo de açúcar.
[077] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada compreende uma deleção de inativação funcional de seu gene de isomerase de glicose-6-fosfato de modo que a célula microbiana não tem atividade de isomerase de glicose-6-fosfato. Glicose-6-fosfato isomerase, em E. coli designado Pgi, converte glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato. Ao deletar o (s) gene (s) de glicose-6-fosfato ou inativando sua expressão, qualquer glicose-6-fosfato presente no citoplasma da célula microbiana pode ser direcionado para a produção de lactose.
[078] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana é uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo que consiste em bactérias dos gêneros Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus e Clostidium, preferencialmente uma célula bacteriana que é selecionada a partir do grupo de espécies bacterianas que consiste em Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clotridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii e Lactococcus lactis. Em outra modalidade, a célula microbiana é uma Escherichia coli. Um técnico no assunto estará ciente de outras cepas bacterianas ao ler a presente divulgação.
[079] De acordo com o segundo aspecto, é fornecido o uso de uma célula microbiana geneticamente modificada como descrito na presente invenção para a produção de lactose ou um oligossacarídeo que compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana geneticamente modificada é usada em um método para a produção de lactose ou um oligossacarídeo que compreende uma subunidade de galactose-β-1,4-glicose em sua extremidade redutora, em que a célula microbiana é cultivada na presença de uma matéria- prima mista compreendendo glicose e pelo menos uma fonte de carbono adicional. A referida fonte de carbono adicional pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em frutose, galactose, manose, xilose, ramnose, glicerol, succinato, piruvato e malato. Preferencialmente, a matéria-prima mista é uma mistura de glicose e frutose, mais preferencialmente uma mistura equimolar de glicose e frutose, mais preferencialmente compreendendo ou consistindo em sacarose hidrolisada.
[080] De acordo com o terceiro aspecto, é fornecido um método para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse que compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora, o método compreendendo as etapas de: a) fornecer uma célula microbiana geneticamente modificada como descrito na presente invenção; b) cultivar a célula microbiana em um meio de cultura e sob condições que são permissivas para a produção da referida lactose ou oligossacarídeo de interesse, em que o meio de cultura contém uma mistura de glicose e pelo menos um composto adicional selecionado a partir do grupo que consiste em frutose, galactose, manose, xilose, ramnose, glicerol, succinato, piruvato e malato como principal fonte de carbono; e c) recuperar a lactose ou oligossacarídeo de interesse do meio de cultura e/ou da célula microbiana.
[081] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o oligossacarídeo de interesse é um oligossacarídeo de leite humano selecionado a partir do grupo que consiste em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, 2',3-difucosil-lactose, 3'- sialil-lactose, 6'-sialil-lactose, 3-fucosil-3'sialil-lactose, lacto-N-tetraose, lacto-N- neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N- fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-difucosilhexose I, lacto-N- difucosilhexaose II, lacto-N-sialilpentaose LSTa, LSTb, LSTc.
[082] Preferencialmente, a mistura de glicose e pelo menos um monossacarídeo adicional é uma matéria-prima mista de glicose e frutose, preferencialmente obtida por hidrólise de sacarose.
[083] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula microbiana é cultivada sem suprimento exógeno de lactose, em particular quando cultivada para a produção do oligossacarídeo de interesse.
[084] A presente invenção será descrita no que diz respeito às modalidades particulares e com referência aos desenhos, mas a invenção não é limitada aos mesmos, mas somente às reivindicações. Além disso, os termos primeiro, segundo e afins na descrição e nas reivindicações são usados para distinguir entre elementos semelhantes e não necessariamente para descrever uma sequência, seja temporal, espacial, em classificação ou em qualquer outra maneira. Deve-se entender que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção descrita na presente invenção são capazes de operar em outras sequências do que descrito ou ilustrado na presente invenção.
[085] Deve-se notar que o termo “compreendendo”, conforme usado nas reivindicações, não deve ser interpretado como sendo restrito aos meios listados depois disso; este não exclui outros elementos ou etapas. Deve, portanto, ser interpretado como especificando a presença das características, números inteiros, etapas ou componentes declarados, como referido, mas não impede a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos do mesmo. Assim, o escopo da expressão "um dispositivo que compreende os meios A e B" não deve ser limitado a dispositivos que consistem apenas nos componentes A e B. Isso significa que, em relação à presente invenção, os únicos componentes relevantes do dispositivo são A e B.
[086] A referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade" ou "alguma modalidade" significa que uma característica, estrutura ou traço específicos descritos em conexão com a modalidade aspecto estão incluídos em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, ocorrências das frases “em uma modalidade” ou “em alguma modalidade” em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não se referem, necessariamente, todas à mesma modalidade. Além disso, as características, estruturas ou traços específicos podem ser combinados de qualquer forma adequada, como seria evidente para uma pessoa com habilidade comum no assunto a partir desta divulgação, em uma ou mais modalidades.
[087] Da mesma forma, deve ser apreciado que na descrição de modalidades exemplares da invenção, várias características da invenção são, por vezes, agrupadas em uma única modalidade, figura ou descrição das mesmas com o propósito de simplificar a divulgação e auxiliar na compreensão de um ou mais dos vários aspectos inventivos. Este método de invenção não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada requer mais características do que são expressamente listadas em cada reivindicação. Em vez disso, como as seguintes reivindicações refletem, os aspectos inventivos podem exigir menos do que todas as características de qualquer uma das modalidades reveladas. Assim, as reivindicações que seguem a descrição detalhada são por meio desta incorporadas expressamente nesta descrição detalhada, com cada reivindicação por conta própria como uma modalidade separada desta invenção.
[088] Além disso, enquanto algumas modalidades descritas na presente invenção incluem algumas, mas não outras características incluídas em outras modalidades, combinações de características de diferentes modalidades devem estar dentro do escopo da invenção e formar diferentes modalidades, como seria compreendido por aqueles técnicos no assunto. Por exemplo, nas seguintes reivindicações, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.
[089] Além disso, algumas das modalidades são descritas na presente invenção como um método ou combinação de elementos de um método que pode ser implementado por um processador de um sistema de computador ou por outros meios de realizar a função. Assim, um processador com as instruções necessárias para a realização de tal método ou elemento de um método forma um meio para realizar o método ou elemento de um método. Além disso, um elemento descrito na presente invenção de uma modalidade do aparelho é um exemplo de um meio para a realização da função realizada pelo elemento com a finalidade de realizar a invenção.
[090] Na descrição e desenhos providos na presente invenção, numerosos detalhes específicos são estabelecidos. Entretanto, deve-se entender que as modalidades da invenção podem ser praticadas sem esses detalhes específicos.
Em outros casos, métodos, estruturas e técnicas bem conhecidos não foram mostrados em detalhes para não obscurecer a compreensão deste relatório descritivo.
[091] A invenção será descrita agora por uma descrição detalhada de diversas modalidades da invenção. É claro que outras modalidades da invenção podem ser configuradas de acordo com o conhecimento de técnicos no assunto sem se afastar do verdadeiro espírito ou mérito técnico da invenção, a invenção sendo limitada apenas pelos termos das reivindicações anexas.
[092] Em uma modalidade, uma cepa E. coli possuindo o genótipo lacY, lacZ-, fuclK, wcaJ é metabolicamente manipulado para produzir 2'-fucosil-lactose de maneira eficiente por meio de fermentação total, usando uma matéria-prima de monossacarídeo misto (por exemplo, sacarose hidrolisada) como principal fonte de carbono e energia. Portanto, a expressão do gene glk da glucoquinase e/ou o gene gcd da glicose desidrogenase e/ou o gene ptsG da glicose PTS permease é diminuído e/ou abolido. Além disso, um gene de glicose permease é expresso ou superexpresso na referida cepa de E. coli.
[093] Além disso, pelo menos um dos genes manA, manC, manB, gmd, wcaG, pgm, galU e galE de E. coli bem como a expressão de uma β-1,4-galactosil transferase heteróloga, capaz de transferir galactose de UDP-galactose na glicose, gerando lactose, e uma α-1,2-fucosil transferase, capaz de transferir fucose de GDP-fucose para lactose, gerando assim 2'-fucosil-lactose, são expressas/superexpressas.
[094] Em uma modalidade preferida, esta cepa de produção é ainda manipulada reduzindo e/ou diminuindo a expressão dos genes pfkA e/ou pfkB da fosfofrutoquinase e/ou o gene zwf da glicose-6-fosfato desidrogenase e/ou o gene pgi da glicose-6-fosfato isomerase. Esta modificação genética adicional permite cultivar a cepa de produção assim manipulada em uma matéria-prima de monossacarídeo misto (por exemplo, sacarose hidrolisada) como principal fonte de carbono e energia, enquanto previne dificultar o metabolismo da cepa, mas aumenta o suprimento precursor (glicose e frutose-6-fosfato e glicose-6- fosfato) para a produção de 2'-fucosil-lactose por fermentação total.
[095] Com referência à Fig. 1, um exemplo de célula microbiana da invenção é mostrado esquematicamente. A referida célula microbiana é capaz de produzir 2'-FL quando cultivada em uma matéria-prima mista que consiste em glicose (Glu) e frutose (Fru), mas cuja matéria-prima mista não contém lactose (Lac). A célula microbiana expressa polinucleotídeos codificando um transportador de glicose (Glf) e um transportador de frutose para importação de glicose e frutose para a célula, respectivamente. Como a expressão da glicosequinase Glk foi abolida por deleção ou inativação funcional do(s) gene(s) glk, qualquer glicose que é importada pela célula torna-se disponível como substrato para a β-1,4-galactosil transferase GaITpm1141 pelo percurso de biossíntese de UDP-galactose para gerar lactose intracelularmente (Lac).
[096] A frutose importada é fosforilada pela frutose-6-quinase celular para gerar um pool Fru-6-P intracelular. Uma porção do pool Fru-6-P é usada no "percurso de biossíntese de UDP-Gal" para sintetizar intracelularmente UDP-Gal que serve como doador de Gal para a galactosil transferase GaITpm1141 para gerar Lac. Outra porção do pool fru-6-P é usada na "percurso de biossíntese do GDP-L-Fuc" para a produção do GDP-L-fucose. A referida GDP-L-fucose serve como doador de fucose para a 2'-fucosil transferase WbgL. Ainda uma terceira porção do pool Fru-6-P intracelular é usada para produção de energia e biomassa em que seu fru-6-P é convertido em Fru-1,6-bisP pelas células fosfofrucocinases PfkA e/ou PfkB.
[097] A Fig. 2 exibe esquematicamente outra célula microbiana exemplar da invenção sendo capaz de produzir 2'-FL quando cultivada em uma matéria-
prima mista consistindo em glicose (Glu) e frutose (Fru), mas cuja matéria-prima mista não contém lactose (Lac). Além da célula microbiana exemplar mostrada na Fig. 1, a célula microbiana compreende ainda um Sistema Pts específico para glicose (PtsG). O referido sistema PtsG importa e fosforila Glu para fornecer Glu- 6-P no citosol da célula. O referido Glu-6-P pode ser utilizado pela célula microbiana para gerar UDP-Gal ou Fru-6-P. Em uma variante da célula microbiana (não mostrada), os genes da célula pgi codificando uma isomerase de glicose-6-fosfato (Pgi) é deletada. Junto com a deleção do gene glk, o microbiano foi geneticamente manipulado de modo que o monômero de glicose livre adquirido por Glf se torne disponível como substrato para a β1,4-galactosil transferase, enquanto qualquer Glu-6-P adquirido por meio de PtsG torna-se disponível para a biossíntese de UDP-Gal.
[098] A Fig. 3 exibe esquematicamente outra célula microbiana exemplar da invenção capaz de produzir 2'-FL quando cultivada em uma matéria-prima mista que consiste em glicose (Glu) e frutose (Fru), mas cuja matéria-prima mista não contém lactose (Lac). Além da célula microbiana exemplar mostrada na Fig. 2, a célula microbiana compreende ainda um sistema Pts específico para frutose (PtsF). O referido sistema PtsF importa e fosforilata Fru para fornecer Fru-1-P. Fru-1-P é fosforilado por FruK para fornecer Fru-1,6-bisP. A célula microbiana possui atividade de frutose-1,6-bisfosfatase (GlpX). Desse modo, a célula microbiana geneticamente modificada é metabolicamente manipulada de modo que a frutose e/ou a frutose-1-P possam ser utilizadas pela célula para a biossíntese de UDP-Gal.
[099] Além disso, o(s) gene(s) da fosfofrutoquinase são deletados ou funcionalmente inativados de modo que a célula não possui atividade de fosfofrutoquinase (PfkNPfkB). A deleção ou inativação funcional dos genes de fosfofrutoquinase prejudica a conversão de Fru-6P em Fru-1,6-P de modo que a utilização de Fru-6-P para gerar trifosfatos ricos em energia é evitada e a produção de 2'-FL é aumentada.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Preparação de uma matéria-prima de monossacarídeo misto.
[0100] Uma solução de sacarose a 50% (p/v) foi preparada dissolvendo 500 g de sacarose em água. O volume final da solução foi 1 litro. A uma temperatura de 30°C a 35°C, o pH foi ajustado ao usar ácido sulfúrico a 96% (v/v). Em seguida, a solução foi esterilizada em autoclave vertical (Systec VX-65, Linden, Alemanha) a 121°C por 45 minutos. As amostras foram retiradas antes e após a esterilização por calor e mantidas congeladas antes da análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A CLAE foi desenvolvida usando um detector de índice de refração RID-10A (Shimadzu, Alemanha) e uma Coluna Waters XBridge de Amida 3,5 µm (250 x 4,6 mm) (Eschborn, Alemanha) conectado a um sistema de HPLC Shimadzu. A eluição isocrática foi desenvolvida com 30% de solvente A (50% (v / v) acetonitrila em água bidestilada, 0,1% (v / v) NH4OH) e 70% de solvente B (80% (v / v) acetonitrila em água bidestilada, 0,1% (v / v) NH4OH) a 35°C e a uma taxa de fluxo de 1,4 ml min-1. As amostras foram depuradas por extração em fase sólida em uma matriz de troca iônica (Strata ABW, Phenomenex). Dez microlitros da amostra (diluição de 1:5) foram aplicados à coluna. Finalmente, a quantidade relativa de açúcares detectados foi determinada. Conforme representado na Tabela 1, a conversão de sacarose nos monossacarídeos glicose e frutose aumentou com a diminuição dos valores de pH das soluções antes do tratamento térmico. A clivagem total da sacarose pode ser observada em valores de pH ≤ 3,50 quando a acidificação foi desenvolvida com ácido sulfúrico. Composição relativa [%] pH Sacarose Glicose Frutose antes da esterilização por calor
3,50 - 7,10 100 - - após esterilização por calor 7,10 100 - - (não acidificado) pH 5,50 87,55 6,30 6,15 pH 5,05 68,25 16,62 15,13 pH 3,87 13,90 45,05 41,06 pH 3,50 - 51,68 48,32 Tabela 1: Quantidade relativa de açúcares detectados em solução de sacarose com pH ajustado a 50% (p/v) antes e depois da esterilização por calor. O ajuste do pH foi desenvolvido com ácido sulfúrico a 96% (v/v). É representada a quantidade percentual de açúcares (área sob a curva; AUC) detectada por HPLC. Exemplo 2 - Crescimento dependente de matéria-prima de várias cepas de deleção de genes.
[0101] O comportamento de crescimento de uma cepa Bl21 de E. coli (DE3) (tipo selvagem), bem como as cepas mutadas pfkA- de E. coli (ΔpfkA), pfkB- de E. coli (ΔpfkB), pfkA- pfkB- de E. coli (ΔpfkA ΔpfkA) foi comparado. As deleções genômicas foram realizadas de acordo com o método de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645 (2000)). Todas as cepas foram cultivadas a 30°C em frascos de agitação de 100 ml com meio de sais minerais de 20 ml, contendo 7 g∙L-1 de NH4H2PO4, 7 g∙L-1 de K2HPO4, 2 g∙L-1 de KOH, 0,3 g∙L- 1 de ácido cítrico, 2 g∙L-1 de MgSO4 x 7·H2O e 0,015 g∙L-1 de CaCl2 x 6·H2O, suplementado com 1 mL∙L-1 solução de oligoelemento (54,4 g∙L-1 de citrato férrico de amônio, 9,8 g∙L-1 de MnCl2 x 4·H2O, 1,6 g∙L-1 de CoCl2 x 6·H2O, 1 g∙L-1 de CuCl2 x 2·H2O, 1,9 g∙L-1 de H3BO3, 9 g∙L-1 de ZnSO4 x 7·H2O, 1,1 g∙L-1 de Na2MoO4 x 2·H2O, 1,5 g∙L-1 de Na2SeO3, 1,5 g∙L-1 de NiSO4 x 6·H2O) e contendo 2% (m/v) de glicose (A) ou 1% (p/v) de glicose/1% (p/v) frutose (B) como fonte de carbono. As culturas foram inoculadas com OD 0,1 e o desenvolvimento do crescimento foi monitorado ao longo de 26 horas por medição OD600. Conforme mostrado na Fig.2, pfkA- pfkB- de E. coli dificilmente mostraram crescimento quando a glicose foi fornecida como única fonte de carbono e energia, enquanto seu crescimento foi indistinguível da cepa de tipo selvagem, bem como dos mutantes de deleção única quando a matéria-prima de monossacarídeo misto estava disponível. Exemplo 3 - Fermentação total de 2'-fucosil-lactose por uma cepa de E. coli manipulada durante o crescimento em uma matéria-prima de monossacarídeo misto
[0102] A cepa E. coli BL21 (DE3) exibindo o genótipo pfkA-, lacZ-, fuclK-, wcaJ-, glk-, gcd-, ptsG- foi ainda geneticamente modificada pela superexpressão de enzimas para a nova síntese de GDP-Fucose (ManB, Mane, Gmd, WcaG), o gene wbgL da 2'-fucosil transferase de E. coli: O126, o gene transportador de efluxo de açúcar yberc0001_9420 de Yersinia bercovieri ATCC 43970, o gene facilitador de glicose g/f de Zymomonas mobilis, o gene galTpm1141 de Pasteurella multocida β-1,4-galactosil transferase (GenBank: AEC04686), bem como o gene pgm de E. coli gale, codificando uma UDP-glicose 4-epimerase e uma fosfoglucomutase, respectivamente. As deleções genômicas foram realizadas de acordo com o método de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645 (2000)). A integração genômica de genes heterólogos foi realizada por transposição. A transposase EZ Tn5TM (Epicentre, EUA) foi usada para integrar fragmentos de DNA lineares ou o mutante C9 hiperativo da transposase mariner Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96: 11428-11433) foi empregue para a transposição. Os genes foram otimizados por códons para expressão em E. coli e preparado sinteticamente pela cooperação GenScript.
[0103] O resultado da cepa E. coli foi cultivado a 30°C em um fermentador de 3 L (New Brunswick, Edison, EUA) começando com 1000 ml de meio de sais minerais contendo 7 g·L-1 de NH4H2PO4, 7 g·L-1 de K2HPO4, 2 g·L-1 de KOH, 0,3 g·L- 1 de ácido cítrico, 2 g·L-1 de MgSO4 x 7·H2O e 0,015 g·L-1 de CaCl2 x 6·H2O, suplementado com 1 mL·L-1 solução de oligoelemento (54,4 g·L-1 de citrato férrico de amônio, 9,8 g·L-1 de MnCl2 x 4·H2O, 1,6 g·L-1 de CoCl2 x 6·H2O, 1 g·L-1 de CuCl2 x 2·H2O, 1,9 g·L-1 de H3BO3, 9 g·L-1 de ZnSO4 x 7·H2O, 1,1 g·L-1 de Na2MoO4 x 2·H2O, 1,5 g·L-1 de Na2SeO3, 1,5 g·L-1 de NiSO4 x 6·H2O) e contendo 2% (m/v) de sacarose hidrolisada como fonte de carbono. O cultivo foi iniciado com a adição de um inóculo de 2,5% (v/v) de uma pré-cultura cultivada no mesmo meio. O final da fase batelada foi caracterizado por um aumento no nível de oxigênio dissolvido. Uma alimentação de carbono que consiste em sacarose totalmente hidrolisada, suplementada com 2 g·L-1 de MgSO4 x 7·H2O, 0,015 g·L-1 de CaCl2 x 6·H2O e 1 mL·L-1 solução de oligoelementos, foi aplicada instantaneamente após deixar a fase batelada. Uma taxa de alimentação de 12,0 - 15,0 mL·L-1 h-1 foi aplicado, referindo-se ao volume inicial. A aeração foi mantida a 3 L·min-1.
[0104] O oxigênio dissolvido foi mantido em 20-30% de saturação, controlando a taxa de agitação. O pH foi mantido em 6,7 pela adição de solução de amônia a 25%. O cultivo durou 86 horas e rendeu quantidades substanciais de 2'-FL no sobrenadante da cultura.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Uma célula microbiana geneticamente modificada para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse que compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora, em que a referida célula microbiana possui: − pelo menos um transportador de glicose para translocar glicose do meio de cultura para o citoplasma da célula microbiana; − uma via de biossíntese de UDP-galactose; e − pelo menos uma β-1,4-galactosil transferase capaz de galactosilar glicose livre para produzir lactose intracelularmente.
2. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um transportador de glicose é selecionado a partir do grupo que consiste em proteínas para difusão facilitada de glicose e permeases de translocação de glicose.
3. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida célula microbiana expressa ou superexpressa pelo menos um gene que codifica o transportador de glicose, preferencialmente pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste em glf, galP e variantes funcionais dos mesmos.
4. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a referida célula microbiana possui uma fosfoglicomutase, uma UTP-glicose-1-fosfato-uridil transferase, e uma UDP- glicose 4-epimerase.
5. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a β-1,4-gaIactosil transferase é codificada por um gene selecionado a partir do grupo que consiste em lgtB de Neisseria meningitidis, lex-1 de Aggregatibacter aphrophilus, galTpm1141 de Pasteurella multocida e variantes funcionais dos mesmos.
6. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida célula microbiana possui pelo menos uma glicosil transferase adicional, preferencialmente uma glicosil transferase selecionada a partir do grupo que consiste em fucosil transferases, sialil transferases, glicosaminil transferases e galactosil transferases.
7. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a célula microbiana compreende um sistema de fosfotransferase de translocação de glicose.
8. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida célula microbiana possui um transportador de frutose.
9. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a célula microbiana possui um sistema de fosfotransferase específico para frutose e em que a célula compreende ainda 1- fosfofrutoquinase.
10. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 8, em que a referida célula microbiana compreende atividade de frutoquinase-6 e atividade de 6-fosfofrutoquinase-1.
11. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 9, em que a célula microbiana compreende uma frutose-1,6- bisfosfatase.
12. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 9 ou 11, em que a referida célula microbiana compreende uma deleção ou inativação funcional de sua glicose-6-fosfato isomerase.
13. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que a glicosil transferase adicional é uma fucosil transferase e em que a referida célula microbiana possui uma manose-6- fosfato isomerase, uma fosfomanomutase, uma manose-1-fosfato-guanilil transferase, uma GDP-manose-4,6-desidratase, uma GDP-L-fucose sintase.
14. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a referida célula microbiana compreende uma proteína exportadora ou uma permease que exporta o oligossacarídeo de interesse da célula, preferencialmente um transportador de efluxo de açúcar.
15. A célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a referida célula microbiana é uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo que consiste em bactérias dos gêneros Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus e Clostridium preferencialmente uma célula bacteriana que é selecionada a partir do grupo de espécies bacterianas que consiste em Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii e Lactococcus lactis.
16. Uso de uma célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 para a produção de lactose ou um oligossacarídeo que compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora.
17. Um método para a produção de lactose ou um oligossacarídeo de interesse, que compreende uma subunidade galactose-β1,4-glicose em sua extremidade redutora, o método compreende as etapas de: a) fornecer uma célula microbiana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15;
b) cultivar a célula microbiana em um meio de cultura e sob condições que são permissivas para a produção da referida lactose ou oligossacarídeo de interesse, em que o meio de cultura contém uma mistura de glicose e pelo menos um composto adicional selecionado a partir do grupo que consiste em frutose, galactose, manose, xilose, ramnose, glicerol, succinato, piruvato e malato como principal fonte de carbono; e c) recuperar a lactose ou oligossacarídeo de interesse do meio de cultura e/ou da célula microbiana.
18. O método de acordo com a reivindicação 17, em que o oligossacarídeo de interesse é um oligossacarídeo de leite humano selecionado a partir do grupo que consiste em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, 2’,3-difucosil-lactose, 3’- sialil-lactose, 6’-sialil-lactose, 3-fucosil-3’-sialil-lactose, lacto-N-tetraose, lacto- N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose l, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N- fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-difucosil-hexose I, lacto-N- difucosil-hexaose II, lacto-N-sialil-pentaose LSTa, LSTb, LSTc.
19. O método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que a mistura de glicose e pelo menos um monossacarídeo adicional é uma matéria-prima mista de glicose e frutose, preferencialmente obtida por hidrólise de sacarose.
20. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, em que a célula microbiana é cultivada sem suprimento exógeno de lactose.
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