BR112020000164A2 - fucosiltransferases e seu uso na produção de oligossacarídeos fucosilados - Google Patents

Abstract

São divulgadas novas fucosiltransferases sendo capazes de transferir um resíduo de fucose a partir de um substrato doador para uma lactotetraose, métodos para a produção de oligossacarídeos fucosilados utilizando as referidas fucosiltransferases e o uso dos assim produzidos oligossacarídeos fucosilados para a fabricação de composições nutricionais.

Description

FUCOSILTRANSFERASES E SEU USO NA PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS FUCOSILADOS

[001] A presente invenção refere-se a novas fucosiltransferases e seu uso na produção de oligossacarídeos fucosilados.

ANTECEDENTES

[002] Aproximadamente 200 oligossacarídeos de leite humano estruturalmente distintos (HMOs) foram identificados até a data. Os referidos HMOs são baseados no dissacarídeo lactose e carregam os resíduos de monossacarídeo adicionais que são baseados em N-acetil-glucosamina, fucose, ácido siálico e galactose. A concentração e composição dos HMOs no leite humano varia entre os indivíduos e durante o período de lactação de até 20 g/L no colostro para 5-10 g/L no leite maduro.

[003] O leite de mulheres pertencentes ao chamado "fenótipo secretor" contém um alto teor de HMOs α-1,2-fucosilado. Essas mulheres expressam o gene FUT2 que codifica a chamada "fucosiltransferase 2". Os HMOs mais abundantes em seu leite são 2'-fucosil-lactose (2'-FL; Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc) e Lacto-N-fucopentaose-I (LNPF-I; Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc (β1-3)Gal(β1-4)Glc).

[004] Oligossacarídeos de leite humano não são digeridos durante o seu trânsito através do intestino de bebês. Devido à sua persistência no intestino do bebê, eles exibem efeitos benéficos para as crianças. Mais especificamente, os HMOs têm se mostrado prebióticos, pois servem como fonte de carbono para microrganismos comensais dos gêneros Bifidobacterium, Bacteroides e Lactobacillus. Portanto, os HMOs apoiam a proliferação desses microrganismos nos intestinos dos bebês.

[005] Oligossacarídeos de leite humano também reduzem diretamente a colonização do intestino do bebê por patógenos na medida em que previnem a aderência dos referidos patógenos às estruturas de glicanos na superfície mucosa do intestino. Os HMOs funcionam como um chamariz devido à sua semelhança estrutural com glicanos da superfície epitelial e inibem a invasão dos patógenos, reduzindo assim o risco de infecções.

[006] HMOs alfa-1,2-fucosilados têm se mostrado protetores contra infecções com Campylobacter jejuni, o agente causal das diarreias bacterianas mais comuns. Os HMOs α-1,2-fucosilados são também associados à proteção contra à diarreia causada pela toxina estável ao calor de Escherichia coli. Além disso, o risco de infecções com calicivírus mediadores de diarreia é reduzido por um alto teor de HMOs de α-1,2-fucosilado no leite materno. HMOs, especialmente o HMO fucosilado Lacto-N-fucopentaose V (LNFP-V; Gal (β1- 3)GlcNAc (β1-3)Gal(β1-4)[Fucα1-3]Glc), liga-se ao sítio de ligação de carboidratos da toxina A de Clostridium difficile, a causa mais comum de diarreia nosocomial. Assim, os HMOs parecem prevenir a interação da toxina A de C. difficile com receptores celulares. Além disso, a aderência de Pseudomonas aeruginosa às células epiteliais foi significativamente inibida por 2'-FL e 3-fucosilactose (3-FL; Gal (β1-4)[Fucα1-3]Glc). A ligação de norovírus (vírus tipo Norwalk, NLV), a principal causa de gastroenterite aguda, a antígenos de grupos histo-sanguíneos é prevenida por HMOs α-1,2-fucosilados, bem como por HMOs α-1,3-fucosilados. Isso indica o potencial desses HMOs para inibir o norovírus de ligação ao capsídeo para hospedar glicanos receptores.

[007] Devido aos benefícios conhecidos dos HMOs e especialmente de HMOs fucosilados, é desejado um processo economicamente viável para sua síntese. Foram descritos processos biotecnológicos para a produção de HMOs utilizando bactérias que foram metabolicamente modificadas. Várias fuctosiltransferases foram descritas para a produção de oligossacarídeos fucosilados por bactérias geneticamente modificadas.

[008] Para produzir 2'-fucosilactose (2'-FL), as α-1,2-fucosiltransferases WbgL de E. coli O126 e FucT2 de Helicobacter pylori (EP 2 479 263 B1), as α-1,2- fucosiltransferases WblA de Vibrio cholera O22, FutD de H. bilis ATCC 437879, FutE de H. cinaede CCUG 18818, FutN de Bacteroides vulgatus ATCC 8482, FutO de Bacteroides ovatus ATCC 8483, WbgN de E. coli O55:H7, Bft1 e Bft3 de Bacteroides fragilis NCTC 9343 (WO 2014/018596 A2), e as α-1,2- fucosiltransferases FucT2 de H. pylori para a síntese de Lewis Y e Lewis B (US 6,670,160 B2) foram descritos.

[009] Para produzir 3-fucosil-lactose, a α-1,3-fucosiltransferase Amuc de Akkermansia muciniphila e FucT6 e FucT7 de Bacteroides fragilis (EP 2 439 264 A1), a α-1,3-fucosiltransferase FutA de H. pylori (US 2014/0120611 A1) são descritos. Além disso, WO 2016/040531 A1 revela a α-1,3-fucosiltransferase CafC de B. nordii CL02T12C05 para a síntese de 3-fucosil-lactose e lactodifucotetraose, e CafD de H. hepaticus ATCC51449 para a produção de LNnFP-III.

[010] No entanto, sabe-se na técnica que glicosiltransferases incluindo fucosiltransferases podem variar muito em termos de cinética, especificidade do substrato, afinidade por substratos doadores e moléculas aceptoras, estabilidade e solubilidade. Além disso, a escolha de uma fucosiltransferase para mediar uma reação de fucosilação desejada afeta significativamente o rendimento final do oligossacarídeo fucosilado. Por exemplo, WO 2014/018596 A1 ensina que E. coli produzindo WbgL sintetizou 2'-FL e também foi capaz de sintetizar lactodifucotetraose (LDFT), enquanto E. coli produzindo WbsJ de E. coli ou WblA de V. cholerae foram capazes de promover a síntese de 2'-FL, mas não de sintetizar LDFT.

[011] Além disso, a produção de oligossacarídeos fucosilados mais complexos, tais como tetrassacarídeos fucosilados, pentassacarídeos fucosilados, hexassacarídeos fucosilados ou mesmo heptassacarídeos fucosilados é conhecida somente em pequena escala.

[012] Tendo em vista essas desvantagens, há a necessidade de fucosiltransferases adicionais com cinética mais rápida, maior afinidade por açúcares doadores de nucleotídeos e/ou especificidades diferentes para molécula aceptoras. Há uma necessidade particular de fucosiltransferases que podem ser empregadas na produção comercial de oligossacarídeos de leite humano fucosilados complexos, isto é, das fucosiltransferases que são capazes de fucosilar tri-, tetra-, penta- ou mesmo hexassacarídeos e/ou possuem atividade suficiente para obter quantidades de valor comercial do oligossacarídeo fucosilado desejado.

[013] Na tentativa de resolver este problema, os inventores procuraram bases de dados da proteína e bases de dados da sequência de nucleotídeos para as entradas que representam fucosiltransferases ainda desconhecidas. As fucosiltransferases putativas fornecidas pelas batidas que foram recuperadas das buscas da base de dados foram analisadas no que diz respeito à atividade de fucosiltransferase dos polipeptídeos correspondentes. Com base nessa abordagem, foram identificadas fucosiltransferases ainda desconhecidas que utilizam uma lactotetraose como molécula aceptora para ser fucosilada.

SUMÁRIO

[014] São fornecidas novas fructosiltransferases provenientes de células bacterianas. As referidas fucosiltransferases utilizam uma lactotetraose como molécula aceptora para sua atividade de fucosiltransferase. As referidas novas fucosiltransferases podem ser usadas para sintetizar oligossacarídeos fucosilados com base em LNT e/ou LNnT.

[015] De acordo com um primeiro aspecto, é fornecido um método para produzir oligossacarídeos fucosilados, em que uma célula geneticamente modificada é usada para produzir os referidos oligossacarídeos fucosilados. A referida célula geneticamente modificada foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga que é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose.

[016] De acordo com um segundo aspecto, é fornecida uma célula geneticamente modificada para uso em um método para produzir oligossacarídeos fucosilados. A referida célula geneticamente modificada foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga que é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose.

[017] De acordo com um terceiro aspecto, é fornecida uma molécula de ácido nucleico recombinante para expressar uma fucosiltransferase heteróloga quando propagada em uma célula, em que referida fucosiltransferase é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a molécula aceptora é uma lactotetraose.

[018] De acordo com um quarto aspecto, são fornecidos fucosiltransferases sendo capazes de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose.

[019] De acordo com um quinto aspecto, é fornecido o uso de uma fucosiltransferase sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose, para a produção de oligossacarídeos fucosilados.

[020] De acordo com um sexto aspecto, é fornecido um método para produzir oligossacarídeos fucosilados por biocatálise in vitro, em que uma fucosiltransferase é usada, referida fucosiltransferase sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora.

[021] De acordo com um sétimo aspecto, são fornecidos oligossacarídeos fucosilados sendo produzidos por um método de acordo com o primeiro aspecto ou por um método de acordo com o sexto aspecto.

[022] De acordo com um oitavo aspecto, é fornecido o uso de oligossacarídeos fucosilados de acordo com o sétimo aspecto para a fabricação de uma composição nutriticional.

[023] De acordo com um nono aspecto, é fornecida uma composição nutricional contendo pelo menos um oligossacarídeo fucosilado de acordo com o sétimo aspecto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[024] A Fig. 1 é uma representação esquemática mostrando o mapa de plasmídeo do vetor de expressão plNT-malE-fucT-zeo que foi usado para expressão heteróloga das sequências de nucleotídeos que codificam fucosiltransferases putativas em E. coli.

[025] A Fig. 2 mostra cromatogramas de análises LC/MS de produtos fucosilados tipo 1 (estrutura central: Gal(β1,3)GlcNAc) e tipo 2 (estrutura central: Gal (β1,4)GlcNAc).

[026] A Fig. 2a mostra cromatogramas de derivados fucosilados de LNT e LNnT.

[027] A Fig. 2b mostra cromatogramas de uma mistura de LNFP-III e LNnFP-V como sintetizados em reações in vitro usando extratos celulares contendo uma fucosiltransferase expressa heterologicamente de B. fragilis, ou seja, FucT109 (painel superior) em comparação com cromatogramas de padrões de açúcar.

[028] A Fig. 3 é uma representação esquemática de vias metabólicas para a produção de oligossacarídeos fucosilados com base em Lacto-N-tetraose e Lacto-N-neotetraose em E. coli.

[029] A Fig. 4 retrata uma análise TLC de sobrenadantes de cultura de lacto-N-fucopentaose produzindo cepas de E. coli contendo plNT-malE- fucT109-zeo.

[030] A Fig. 5 mostra um gráfico de barras que demonstra a produção de LNFP-I extracelular por E. coli (cepa nº 993) após a integração cromossômica de diferentes genes fucT.

[031] A Fig. 6 mostra um gráfico de barras que demonstra a produção de LNFP-I por E. coli (cepa nº 1772) em uma fermentação 1L usando glicose como fonte de carbono.

[032] A Fig. 7 mostra um gráfico ilustrando a degradação de LNT-2 e lactose por hidrolases expressas na cepa de E. coli nº 1886.

[033] A Fig. 8 mostra uma imagem de cromatografia em camada delgada ilustrando a degradação de LNT dependente do tempo, pela β-1,3- galactosidase Bga42A.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[034] De acordo com o primeiro aspecto, é fornecido um método para produzir oligossacarídeos fucosilados, o método compreendendo as etapas de: a) prover pelo menos uma célula geneticamente modificada que foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga, em que a referida fucosiltransferase heteróloga é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, referida molécula aceptora sendo uma lactotetraose; b) cultivar a pelo menos uma célula geneticamente modificada na presença de pelo menos uma fonte de carbono e sob condições adequadas para a pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador para a molécula aceptora; e c) opcionalmente, recuperar o oligossacarídeo fucosilado.

[035] No método de acordo com o primeiro aspecto, uma célula geneticamente modificada é fornecida. O termo "geneticamente modificado", como usado na presente invenção, refere-se à modificação da composição genética da célula usando métodos biológicos moleculares. A modificação da composição genética da célula pode incluir a transferência de genes dentro e (ou através dos limites das espécies, inserindo, excluindo, substituindo e/ou modificando nucleotídeos, trincas, genes, quadros de leitura aberta, promotores, reforçadores, terminadores e outras sequências de nucleotídeos mediando e/ou controlando a expressão gênica. A modificação da composição genética da célula visa gerar um organismo geneticamente modificado que possui propriedades particulares e desejadas. Células geneticamente modificadas podem conter um ou mais genes que não estão presentes na forma nativa (não geneticamente modificada) da célula. Técnicas para introduzir moléculas de ácido nucleico exógenas e/ou inserir moléculas de ácido nucleico exógenas (recombinantes, heterólogas) nas informações hereditárias de uma célula para inserir, excluir ou alterar a sequência de nucleotídeos da informação genética de uma célula são conhecidas pelo técnico no assunto. Células geneticamente modificadas podem conter um ou mais genes que estão presentes na forma nativa da célula, em que os referidos genes são modificados e reintroduzidos na célula por meios artificiais. O termo "geneticamente modificado" também abrange células que contêm uma molécula de ácido nucleico sendo endógena para a célula e que foi modificada sem remover a molécula de ácido nucleico da célula. Tais modificações incluem aquelas obtidas pela recolocação do gene, mutações em sítio específico e técnicas relacionadas.

[036] A célula geneticamente modificada é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. As células apropriadas incluem células de levedura, bactérias, arquebactérias, células fúngicas, células de insetos, células vegetais e células animais, incluindo células de mamíferos (como células humanas e linhagens celulares).

[037] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula procariótica é uma célula bacteriana, preferencialmente selecionada a partir do gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, Sporolactobacillus spp., Micromonospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp. e Pseudomonas. Espécies de bactéria adequadas são Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Enterococcus thermophiles, Escherichia coli, Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii, Lactococcus lactis, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus thermophiles e Xanthomonas campestris.

[038] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula eucariótica é uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula vegetal ou uma célula de mamíferos. A célula de levedura é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces sp., particularmente Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis sp., Pichia sp., particularmente Pichia pastoris, Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Yarrowia sp., Rhodotorula sp. e Schizosaccharomyces sp.

[039] A célula geneticamente modificada foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga. O termo "heterólogo" como usado na presente invenção refere-se a uma sequência de nucleotídeos, molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo que é externo a uma célula ou organismo, ou seja, a uma sequência de nucleotídeos, molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente na referida célula ou organismo. Uma "sequência heteróloga" ou um "ácido nucleico heterólogo" ou "polipeptídeo heterólogo", como usado na presente invenção, é aquela que se origina de uma fonte externa à célula hospedeira em particular (por exemplo, de uma espécie diferente), ou, se da mesma fonte, é modificada a partir de sua forma original. Assim, um ácido nucleico heterólogo ligado operacionalmente a um promotor é de uma fonte diferente daquela de que o promotor foi derivado, ou, se da mesma fonte, é modificado de sua forma original. A sequência heteróloga pode ser introduzida de forma estável, por exemplo, por transfecção, transformação, conjugação ou transdução, no genoma da célula hospedeira microbiana hospedeira, representando assim uma célula hospedeira geneticamente modificada. Técnicas podem ser aplicadas, o que dependerá da célula hospedeira que a sequência deve ser introduzida. Várias técnicas são conhecidas por um técnico no assunto e são, por exemplo, reveladas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Assim, um "polipeptídeo heterólogo" é um polipeptídeo que não ocorre naturalmente na célula, e uma "fucosiltransferase heteróloga" é uma fucosiltransferase que não ocorre naturalmente na célula.

[040] O termo "fucosiltransferase", como usado na presente invenção, refere-se a polipeptídeos que são capazes de catalisar a transferência de um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora. O substrato doador para a transferência de um resíduo de fucose para uma molécula aceptora é tipicamente L-fucose de guanosina-difosfato (GDP-L- fucose). Molécula aceptora adequada para resíduos de fucose inclui oligossacarídeos, glicopeptídeos, glicoproteínas e glicolipídios. Normalmente, o resíduo de fucose é transferido para, por exemplo, um resíduo de N- acetilglucosamina, resíduo de N-acetilgalactosamina, resíduos de galactose, resíduos de fucose, resíduos de ácido siálico ou resíduo de glicose do oligossacarídeo ou uma fração de sacarídeo da glicoproteína ou glicolipídeo. O termo "fucosiltransferase", como usado na presente invenção é também entendido para abranger variantes funcionais da referida nova fucosiltransferase, fragmentos funcionais da referida fucosiltransferases e fragmentos funcionais das referidas variantes funcionais. O termo "funcional" indica que as referidas variantes e fragmentos são também capazes de catalisar a transferência de um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, ou seja, eles podem possuir atividade de fucosiltransferase.

[041] O termo "fragmento funcional" como usado na presente invenção refere-se a um polipeptídeo truncado em comparação com a fucosiltransferase que ocorre naturalmente e cujo fragmento é capaz de possuir a mesma atividade de fucosiltransferase que o polipeptídeo de ocorrência natural do qual o referido fragmento se origina.

[042] O termo "variante funcional", como usado na presente invenção refere-se a um polipeptídeo que é capaz de possuir a mesma atividade de fucosiltransferase que o polipeptídeo de ocorrência natural do qual referido derivado se origina, mas que tem uma sequência de aminoácidos alterada como comparado com o polipeptídeo de ocorrência natural.

[043] A fucosiltransferase heteróloga é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora. O termo "capaz de" no que diz respeito à fucosiltransferase heteróloga refere-se à atividade de fucosiltransferase da fucosiltransferase heteróloga e à disposição de que são necessárias condições de reação adequadas para fucosiltransferase heteróloga para possuir sua atividade enzimática. Na ausência de condições de reação adequadas, a fucosiltransferase heteróloga não possui sua atividade enzimática, mas mantém sua atividade enzimática e possui sua atividade enzimática quando as condições de reação adequadas são restauradas. As condições de reação adequadas incluem a presença de um substrato doador adequado, a presença de moléculas aceptoras adequadas, a presença de cofatores essenciais, como - por exemplo - íons monovalentes ou divalentes, um valor de pH em uma faixa apropriada, temperatura adequada e afins. Não é necessário que os valores ideais para cada fator que efetuar a reação enzimática da fucosiltransferase heteróloga sejam cumpridos, mas as condições de reação têm que ser tais que a fucosiltransferase heteróloga realize sua atividade enzimática. Assim, o termo "capaz de" exclui quaisquer condições sobre as quais a atividade enzimática da fucosiltransferase heteróloga tenha sido irreversivelmente reduzida, e também excluiu a exposição da fucosiltransferase heteróloga a qualquer condição. Em vez disso, "capaz de" significa que a fucosiltransferase é enzimaticamente ativa, ou seja, possui sua atividade de fucosiltransferase, se as condições de reações adequadas (em que todos os requisitos são necessários para a fucosiltransferase realizar sua atividade enzimática) são fornecidas.

[044] Fucosiltransferases podem formar ligações α-1,2-, α-1,3-, α-1,4-, ou α-1,6-glicosídicas entre fucose e a fração de sacarídeo da molécula aceptora. Assim, o termo "alfa-1,2-fucosiltransferase" refere-se a uma glicosiltransferase que catalisa a transferência de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora formando uma ligação alfa-1,2 do resíduo de fucose e um resíduo de sacarídeos da molécula aceptora. O termo alfa-1,3-fucosiltranferase refere-se a uma glicosiltransferase que catalisa a transferência de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora em uma ligação alfa-1,3 do resíduo de fucose e um resíduo de sacarídeo da molécula aceptora. O termo alfa-1,4-fucosiltranferase refere-se a uma glicosiltransferase que catalisa a transferência de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora em uma ligação alfa-1,4 do resíduo de fucose e um resíduo de sacarídeo da molécula aceptora; e o termo alfa-1,6-fucosiltranferase refere-se a uma glicosiltransferase que catalisa a transferência de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora em uma ligação alfa-1,6 do resíduo de fucose e um resíduo de sacarídeo da molécula aceptora.

[045] O termo "substrato doador" no que diz respeito à transferência de um resíduo de fucose do substrato doador para uma molécula aceptora refere- se a uma molécula que compreende um resíduo de fucose, referida molécula sendo utilizada pela fucosiltransferase heteróloga uma fonte de fucose que deve ser transferida para uma molécula aceptora específica. Normalmente, o substrato de doadores é GDP-fucose.

[046] O termo "molécula aceptora", como usado na presente invenção, refere-se a uma molécula que recebe o resíduo de fucose do substrato doador pela atividade enzimática da fucosiltransferase heteróloga. Como usado na presente invenção, o termo "molécula aceptora" refere-se mais especificamente a uma molécula que consiste ou compreende uma fração de sacarídeo. A menos que indicado o contrário, o termo "molécula aceptora", como usado na presente invenção, refere-se a uma lactotetraose.

[047] A fucosiltransferase heteróloga é capaz de transferir um resíduo de fucose para uma lactotetraose como uma molécula aceptora. O termo "lactotetraose", como usado na presente invenção, refere-se a um tetrassacarídeo, ou seja, um oligossacarídeo consistindo em 4 resíduos de monossacarídeos, em que o tetrassacarídeo compreende um motivo lactose (Gal(β1, 4)Glc) em sua extremidade de redução.

[048] Em uma modalidade, a lactotetraose é selecionada a partir do grupo que consiste em Lacto-N-tetraose (LNT; Gal(β1,3)GlcNAc(β1,3)Gal(β1,4)Glc) e Lacto-N-neotetraose (LNnT; Gal(β1,3)GlcNAc(β1,4)Gal(β1,4)Glc). A atividade enzimática da fucosiltransferase heteróloga leva a um oligossacarídeo fucosilado, mais especificamente a uma lactotetraose fucosilada, ou seja, uma lactofucopentaose. A referida lactofucopentaose é um pentassacarídeo preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em lacto-N- fucopentaose I (LNFP-I), lacto-N-neofucopentaose I (LNnFP-I), lacto-N- fucopentaose II (LNFP II), lacto-N-neofucopentaose III (LNnFP-III), lacto-N- fucopentaose V (LNFP-V) e lacto-N-neofucopentaose V (LNnFP-V).

[049] Polipeptídeos que foram identificados no genoma de várias espécies bacterianas e que são capazes de possuir atividade de fucosiltransferase para a transferência de um resíduo de fucose de um substrato doador para uma lactotetraose são mostrados na Tabela 1. Espécies / fonte Número de SEQ ID NOs: acesso ao Genbank ácido amino nucleico ácido Helicobacter hepaticus ATCC 51449 (HH_0072) AAP76669 1 16 Brachyspira pilosicoli WesB (WESB_1374) CCG56842 2 17 Yersinia sp. A125 KOH2 (tipo WbcH) CAl39173 3 18

Gramella forsetii KT0803 WP_011708479 4 19 Francisella philomiragia ssp. philomiragia ATCC EET21243 5 20 25015 (FTPG_00102) Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002 EEG10438 6 21 (FuraDRAFT_0420) Sideroxydans lithotrophicus ES-11 (Slit_2889) ADE13114 7 22 Providencia alcalifaciens (WdcS) AFH02807 8 23 Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 EGl74693 9 24 (PH505_ae00940) Roseovarius nubinhibens ISM (ISM_09170) EAP78457 10 25 Thalassospira profundimaris WP0211 EKF09232.1 11 26 (TH2_05058) Desulfovibrio alaskensis G20 (Dde_2877) ABB39672 12 27 Thermosynechococcus elongates BP-1 (t110994) BAC08546 13 28 Bacteroides fragilis cepa ATCC 25285 CAH09151 14 29 (BF9343_3370) Escherichia coli O126 (WbgL) ABE98421 15 30 Tabela 1: Fucosiltransferases sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma lactotetraose. As sequências de aminoácidos (aa) das fucosiltransferases usadas nos exemplos e nas sequências de nucleotídeos (nt) codificando as referidas sequências de aminoácidos e sendo usadas para expressar as fucosiltransferases de acordo com os exemplos que são indicados nas duas últimas colunas da tabela, identificando suas SEQ ID NOs.

[050] Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a fucosiltransferase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, variantes funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30. Assim, a fucosiltransferase heteróloga é selecionada a partir do grupo de polipeptídeos como representado por qualquer uma das SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, variantes funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.

[051] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a fucosiltransferase heteróloga é codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo i) uma sequência de nucleotídeos como representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15; ii) uma sequência de nucleotídeos que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% com uma das sequências de nucleotídeos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15, preferencialmente em toda a extensão da sequência; iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30;

iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; v) uma sequência de nucleotídeos codificando um fragmento funcional de qualquer um dos polipeptídeos de acordo com iii) e iv); ou vi) em que a molécula de ácido nucleico hibridiza a uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com i), ii), iii), iv) ou v) sob condições de estringência.

[052] A expressão "SEQ ID NOs: 1 a 15" refere-se ao grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15.

[053] "Hibridização sob condições de estringência" refere-se - por exemplo - a: hibridização em 4 x SSC a 65°C e lavagem múltipla subsequente em 0,1 x SSC a 65° C para - no total - cerca de 1 hora. Condições de hibridização menos de estringência são, por exemplo: hibridização em 4 x SSC a 37 °C e lavagem múltipla subsequente em 1 x SSC à temperatura ambiente. "Condições de estringência de hibridização" também podem significar: hibridização a 68 °C em fosfato de sódio a 0,25 M, pH 7,2, SDS a 7% (p/v), EDTA a 1 mM e BSA a 1% (p/v) por 16 horas e lavagem subsequente, duas vezes com 2 x SSC e SDS a 0,1% (p/v) a 68 °C.

[054] A sequência de nucleotídeos que codifica a fucosiltransferase heteróloga pode estar presente em uma molécula de ácido nucleico linear ou em uma molécula de ácido nucleico circular. Adicionalmente e/ou alternativamente, a sequência de nucleotídeos que codifica a fucosiltransferase heteróloga pode estar presente em uma molécula de ácido nucleico extracromossômico ou ser integrada à(s), ou em pelo menos uma das, molécula(s) de ácido nucleico cromossômico da célula, em que a referida molécula de ácido nucleico cromossômico pode ser uma molécula de ácido nucleico linear ou circular (cromossomo bacteriano).

[055] A pelo menos uma célula geneticamente modificada é cultivada na presença de pelo menos uma fonte de carbono.

[056] Como usado na presente invenção, o termo "cultivar" significa crescer uma célula em um caldo de fermentação e condições permissivas e adequadas para a produção do(s) oligossacarídeo(s) fucosilado(s) desejado(s) . Alguns caldos de fermentação adequados e condições para o cultivo de células estarão prontamente disponíveis para um técnico no assunto ao ler a divulgação desta invenção em conjunto com o fundamento técnico e especialista do técnico no assunto.

[057] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, pelo menos uma fonte de carbono é selecionada a partir do grupo que consiste em glicerol, sacarose, glicose, galactose, frutose, melaço, lactose, xilose, celulose, piruvato, succinato, monóxido de carbono de gás de síntese e qualquer outra fonte de carbono e energia que possam ser metabolizadas para a célula geneticamente modificada produzir o oligossacarídeo fucosilado desejado. Neste contexto, deve-se entender que qualquer outro - preferencialmente de baixo custo - substrato de fermentação pode ser empregado como fonte de carbono, e o técnico no assunto será facilmente capaz de empregar uma fonte de carbono adequada na presente invenção, a fim de crescer o microrganismo para produzir o monossacarídeo desejado em grande escala. Em uma modalidade preferida da produção de oligossacarídeos fucosilados, a lactose é fornecida ao caldo de fermentação, em particular se a célula geneticamente modificada não é capaz de sintetizar a lactose sozinha. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa da produção de oligossacarídeos fucosilados, a fucose é fornecido ao caldo de fermentação, particularmente se a célula geneticamente modificada não é capaz de sintetizar a fucose sozinha. Suplementar o caldo de fermentação com fucose pode melhorar a síntese intracelular de GDP-fucose usando um percurso de resgate de fucose ou sistema de resgate de fucose.

[058] Pelo menos uma célula geneticamente modificada é cultivada sob condições que são adequadas para pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador da fucosiltransferase heteróloga para a molécula aceptora. Para produzir o oligossacarídeo fucosilado, pelo menos uma célula geneticamente modificada é cultivada em um caldo de fermentação que fornece quantidades suficientes de nutrientes para que pelo menos uma célula seja metabolicamente ativa de tal forma que a fucosiltransferase heteróloga é expressa e tal que a célula fornece quantidades suficientes de substrato doador e moléculas aceptoras para que a fucosiltransferase heteróloga seja enzimaticamente ativa. Para que as condições sejam adequadas para pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador para a molécula aceptora por meio da atividade de sua fucosiltransferase heteróloga, o caldo de fermentação tem - dentre outros - uma temperatura adequada, um valor pH adequado, uma quantidade adequada de oxigênio dissolvido no caldo de fermentação, bem como uma osmolaridade adequada. Os valores adequados podem variar e dependem do tipo de célula cultivada. Valores adequados podem ser facilmente determinados pelo técnico no assunto.

[059] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o cultivo de pelo menos uma célula geneticamente modificada sob condições adequadas para pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador da fucosiltransferase heteróloga para a molécula aceptora compreende a etapa de fornecer lactose exógena para o caldo de fermentação enquanto cultiva pelo menos uma célula geneticamente modificada. Isso permite que pelo menos uma célula geneticamente modificada use a referida lactose fornecida exogenamente para síntese endógena de uma lactotetraose. A referida lactotetraose sintetizada endogenamente pode então servir como substrato aceptor para a fucosiltransferase heteróloga.

[060] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o cultivo de pelo menos uma célula geneticamente modificada sob condições adequadas para pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador da fucosiltransferase heteróloga para a molécula aceptora compreende uma síntese endógena de lactose por pelo menos uma célula geneticamente modificada. Em uma modalidade, a síntese endógena da lactose pode ocorrer devido à competência natural da célula geneticamente modificada para sintetizar a lactose. Adicionalmente e/ou alternativamente, a síntese endógena da lactose ocorre pela superexpressão de uma β-1,4 galactosiltransferase heteróloga na célula geneticamente modificada. Assim, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para superexpressar, em comparação com a célula progenitora geneticamente não modificada, o referido gene de β-1,4-galactosilatransferase heteróloga. O referido gene de β-1,4-galactosilatransferase heteróloga codifica uma β-1,4- galactosilatransferase que catalisa a formação de lactose a partir de galactose e glicose. Exemplos de β-1,4-galactosilatransferases adequadas são selecionados a partir do grupo que consiste em Pm1141 de Pasteurella multocida (nº de acesso AECO4686) e Lex1 de Aggregatibacter aphrophilus NJ8700 (nº de acesso AK965832).

[061] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o cultivo de pelo menos uma célula geneticamente modificada sob condições adequadas para pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador da fucosiltransferase heteróloga para a molécula aceptora compreende a etapa de fornecer lacto-N-triose-2 (LNT-2) para o caldo de fermentação enquanto cultiva pelo menos uma célula geneticamente modificada, em que a referida pelo menos uma célula geneticamente modificada compreende (i) uma β-1,3-galactosiltransferase ou uma β-1,4- galactosiltransferase e (ii) uma α-1,2- e/ou α-1,3-fucosiltransferase como glicosiltransferase. LNT-2 é um trisacarídeo bastante eficiente que pode ser produzido. Suplementar o caldo de fermentação com LNT-2 permite que pelo menos uma célula geneticamente modificada use a referida LNT-2 fornecida exogenamente como precursor para a síntese endógena de LNT ou LNnT, que por sua vez podem servir como moléculas aceptoras para a fucosiltransferase heteróloga.

[062] De acordo com uma modalidade adicional e/ou alternativa do método para produzir um oligossacarídeo fucosilado, o método que compreende a etapa de cultivar pelo menos uma célula geneticamente modificada é um processo de fermentação contínuo ou um processo de fermentação em batelada, preferencialmente um processo de fermentação em batelada alimentada.

[063] Assim, de acordo com a modalidade em que o cultivo é um processo de fermentação contínuo, ou seja, um processo em que pelo menos uma fonte de carbono é constantemente adicionada ao caldo de fermentação durante a etapa de cultivo da célula geneticamente modificada, e em que o caldo de fermentação é continuamente recuperado do processo de fermentação. Ao adicionar constantemente a fonte de carbono durante a etapa de cultivo, uma produção constante e eficaz do oligossacarídeo é alcançada.

[064] De acordo com a modalidade em que o cultivo é um processo de fermentação em batelada, um sistema de cultura fechado é usado com uma composição de nutrientes específicos no início da fermentação e temperatura, pressão, aeração e outras condições ambientais específicas para otimizar o crescimento. Nem os nutrientes são adicionados, nem os produtos residuais são removidos do processo de fermentação durante o cultivo das células.

[065] A fermentação em batelada alimentada é entendida como uma técnica operacional em que um ou mais nutrientes (substratos) são alimentados (fornecidos) ao biorreator durante o cultivo e em que o(s) produto(s) permanece(m) no biorreator até o final da batelada ou em que pelo menos uma porção do caldo de fermentação, incluindo células e produto(s) é removida do biorreator durante o processo de fermentação. Porções do caldo de fermentação podem ser removidas do biorreator várias vezes e/ou em intervalos diferentes durante o processo de fermentação.

[066] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o método para produzir um oligossacarídeo fucosilado compreende uma recuperação do desejado oligossacarídeo fucosilado da cultura da célula produtora. Como usado na presente invenção, o termo "recuperação" significa isolar, colher, purificar, coletar ou, de outra forma, separar a cultura do microrganismo hospedeiro o oligossacarídeo produzido pelo microrganismo hospedeiro de acordo com a invenção. O termo "purificar", como usado na presente invenção, refere-se à remoção de pelo menos uma quantidade significativa de impurezas e compostos indesejados. As referidas impurezas e compostos indesejados (subprodutos indesejados) compreendem células, íons e sais, outros sacarídeos que não a lactofucopentaose desejada, por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, tetrassacarídeos, especialmente lactotetraoses e outros pentassacarídeos que não a lactofucopentaose desejada.

[067] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a recuperação e/ou purificação do oligossacarídeo fucosilado compreende uma etapa selecionada a partir do grupo que consiste em (i) cristalizar o oligossacarídeo fucosilado a partir de uma solução do referido oligossacarídeo fucosilado e (ii) secar por pulverização o oligossacarídeo fucosilado. Estas etapas proveem um oligossacarídeo fucosilado em cristalizado de forma amorfa.

[068] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa da recuperação ou purificação dos oligossacarídeos fucosilados desejados, pelo menos uma glicosidase é aplicado, em que pelo menos uma glicosidase é usada para degradar impurezas inibidoras e/ou indesejadas ou subprodutos, substratos de partida não utilizados e produtos intermediários gerados durante a produção do oligossacarídeo desejado. Por meio do uso de pelo menos uma glicosidase é alcançado que, por exemplo, outros (oligo-)sacarídeos que não o oligossacarídeo fucosilado desejado – em que outros (oligo-)sacarídeos são produzidos em ou por pelo menos uma célula geneticamente modificada durante o síntese do oligossacarídeo fucosilado desejado e que outros oligossacarídeos interferem com a etapa de purificação do oligossacarídeo desejado, podem ser metabolizados.

[069] Pelo menos uma glicosidase pode ser adicionada externamente ao caldo de fermentação no final do processo de fermentação ou endogenamente sintetizado por pelo menos uma célula geneticamente modificada.

[070] Adicionar pelo menos uma glicosidase ao caldo de fermentação é vantajoso, se a célula geneticamente modificada não sintetizar uma ou mais glicosidases, por exemplo, porque os genes endógenos da célula geneticamente modificada que codifica as referidas uma ou mais glicosidases foram excluídos ou a expressão dos genes endógenos que codificam as referidas uma ou mais glicosidases foram reduzidas.

[071] Em uma modalidade, em que pelo menos uma glicosidase é adicionada ao caldo de fermentação, pelo menos uma glicosidase é produzida por pelo menos uma outra célula além da célula geneticamente modificada para produzir o oligossacarídeo fucosilado, e a referida pelo menos outra célula é adicionalmente adicionadas ao caldo de fermentação para expressar o(s) gene(s) que codificam pelo menos uma glicosidase.

[072] Nesta modalidade, pelo menos uma glicosidase que é expressa por pelo menos uma outra célula é ou uma glicosidase de ocorrência natural da referida outra célula ou uma glicosidase heteróloga, em que a referida outra célula foi transformada de forma estável para expressar a glicosidase heteróloga e em que a expressão da glicosidase heteróloga na outra célula é indutível. Preferencialmente, a glicosidase heteróloga é codificada por uma sequência de nucleotídeos que foi estavelmente integrada ao genoma da pelo menos uma outra célula.

[073] Esta modalidade é particularmente adequada em um processo de fermentação contínua para a produção do oligossacarídeo fucosilado, em que, por exemplo, dois vasos ou recipientes de fermentação separados são fornecidos, enquanto um vaso/recipiente é usado para a reação de síntese do oligossacarídeo e o segundo vaso/recipiente é essencialmente empregado para cultivar as células que expressam a glicosidase heteróloga.

[074] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, pelo menos uma glicosidase que é expressa por pelo menos uma outra célula é uma glicosidase intracelular. Assim, pelo menos uma glicosidase que é expressa por pelo menos uma célula reside na referida pelo menos uma célula. A referida pelo menos uma outra célula, portanto, ingere as impurezas indesejadas, subprodutos, os substratos iniciais não utilizados e/ou produtos intermediários gerados durante a produção do oligossacarídeo desejado de tal forma que os compostos internalizados são degradados pela pelo menos uma glicosidase intracelular.

[075] Em uma modalidade alternativa, pelo menos uma glicosidase que é expressa por pelo menos uma outra célula é secretada por menos uma outra célula no caldo de fermentação. Em seguida, as impurezas indesejadas, os subprodutos, os substratos iniciais não utilizados e/ou produtos intermediários gerados durante a produção do oligossacarídeo desejado são degradados no caldo de fermentação. Esta modalidade é vantajosa na medida em que pelo menos uma outra célula não precisa ser capaz de internalizar as impurezas indesejadas, os subprodutos, os substratos iniciais não utilizados e/ou produtos intermediários gerados durante a produção do oligossacarídeo desejado.

[076] Em uma modalidade preferida, a glicosidase degrada a lactose. Uma glicosidase adequada para degradar a lactose é a β1,4-galactosidase LacZ de E. coli. Uma glicosidase adequada para hidrolisar LNT-2, um produto intermediário, é a β-N-acetilhexosaminidase Bbhl de Bifidobacterium bifidum JCM1254. Uma glicosidase adequada para hidrolisar o produto intermediário LNT, é a β-1,3-galactosidases Bga42A de Bifidobacterium longum subsp. infantis.

[077] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada, que também produz pelo menos uma glicosidase ou pelo menos uma outra célula que produz pelo menos uma glicosidase expressa pelo menos uma glicosidase após indução externa, por exemplo, via expressão induzida por temperatura ou via expressão induzida por substrato. Isso significa que a expressão de pelo menos uma glicosidase é infrarregulada durante a síntese do oligossacarídeo fucosilado desejado e pode ser induzida, por exemplo, pela temperatura ou adição de um indutor como o IPTG, no final do processo de fermentação. A expressão da glicosidase será induzida após a quantidade suficiente e/ou essencialmente máxima de oligossacarídeo ter sido produzida durante o cultivo da célula geneticamente modificada. Subsequentemente, as glicosidases expressas degradarão intermediários de sacarídeos indesejados, substratos, etc., tornando o meio essencialmente livre dos intermediários de sacarídeos ou substratos que, de outra forma, dificultariam ou complicariam a purificação do oligossacarídeo desejado. Algumas ferramentas de expressão indutíveis adequadas são conhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, Sambrook et. al, 1989, supra), e um técnico no assunto será capaz de aplicar um respectivamente adequado para o oligossacarídeo desejado.

[078] "Regulado" no presente contexto com referência a um gene é geralmente entendido como um gene, cuja transcrição pode ser regulada de forma controlada, por exemplo, infrarregulada ou suprarregulada, ou seja, a quantidade da proteína sintetizada codificada pelo gene regulado é diferente, por exemplo, des-/infrarregulado ou suprarregulado, a partir do gene de outra forma não regulado.

[079] Em uma modalidade adicional, os monossacarídeos resultantes da degradação dos intermediários de sacarídeo indesejados, dos substratos, etc. podem ser metabolizados pela célula geneticamente modificada.

[080] De acordo com o segundo aspecto, é fornecida uma célula geneticamente modificada para produção ou para uso em um método para produzir um oligossacarídeo fucosilado. A referida célula geneticamente modificada foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga que é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose.

[081] O termo "geneticamente modificado", como usado na presente invenção com referência a uma célula hospedeira indica que a célula hospedeira replica uma molécula de ácido nucleico heteróloga ou recombinante e/ou expressa um peptídeo ou proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo heteróloga (ou seja, uma sequência de nucleotídeos "externa à referida célula"). Células geneticamente modificadas podem conter genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula. Células geneticamente modificadas podem também conter genes encontrados na forma nativa da célula em que os genes são modificados e reintroduzidos na célula por meios artificiais. O termo também abrange células que contêm uma molécula de ácido nucleico endógena para a célula que foi modificada sem remover o ácido nucleico da célula; tais modificações incluem aquelas obtidas pela recolocação do gene, pela mutação sítio-específico, e por técnicas relacionadas. Assim, um "polipeptídeo recombinante" é aquele que foi produzido por uma célula geneticamente modificada.

[082] Assim, uma "célula geneticamente modificada" é entendida como uma célula que foi transformada ou transfectada.

[083] Assim, as sequências de nucleotídeos como usadas na presente invenção, podem, por exemplo, ser compreendidas em um vetor que deve ser transformado/transfectado de forma estável ou introduzida de outra forma em células de microrganismos hospedeiros.

[084] Métodos para gerar "DNA recombinante", incluindo isolamento, síntese, purificação e amplificação de material genético, para uso na transformação ou transfecção de células hospedeiras selecionadas são conhecidas pelo técnico no assunto. Assim, é de conhecimento comum transformar células com DNA plasmidial "híbrido" viral ou circular, que incluem sequências de nucleotídeos exógenos selecionadas (ou seja, externas ou "heterólogas"). Esses procedimentos conhecidos no estado da técnica envolvem a geração de um vetor de transformação por clivagem enzimática circular viral ou DNA plasmidial para formar fitas de DNA lineares. Fitas de DNA externas selecionadas geralmente incluindo sequências de codificação para o produto de proteína desejado são preparados em forma linear através do uso das mesmas enzimas/enzimas semelhantes. O DNA viral linear ou plasmidial é incubado com o DNA externo na presença de enzimas ligantes capazes de efetuar um processo de restauração e formar vetores "híbridos" que incluem o segmento de DNA exógeno selecionado "emendado" no DNA viral ou circular plasmidial.

[085] A célula geneticamente modificada é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. As células apropriadas incluem células de levedura, bactérias, arquebactérias, fungos, insetos, células vegetais e células animais, incluindo células de mamíferos (como células humanas e linhagens celulares).

[086] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula procariótica é uma célula bacteriana, preferencialmente selecionada a partir do gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, Sporolactobacillus spp., Micromonospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp., e Pseudomonas.Espécies bacterianas adequadas são Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Enterococcus thermophiles, Escherichia coli, Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii,

Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii, Lactococcus lactis, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus thermophiles e Xanthomonas campestris.

[087] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula eucariótica é uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula vegetal ou uma célula de mamíferos. A célula de levedura é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces sp., particularmente Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis sp., Pichia sp., particularmente Pichia pastoris, Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Yarrowia sp., Rhodotorula sp., e Schizosaccharomyces sp.

[088] A célula geneticamente modificada foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora sendo uma lactotetraose. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a fucosiltransferase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em polipeptídeos representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, variantes funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30.

[089] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a fucosiltransferase heteróloga é codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo i) uma sequência de nucleotídeos como representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15;

ii) uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% com uma das sequências de nucleotídeos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15, preferencialmente em toda a extensão da sequência; iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; v) uma sequência de nucleotídeos codificando um fragmento funcional de qualquer um dos polipeptídeos de acordo com iii) e iv); ou vi) em que a molécula de ácido nucleico hibridiza a uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com i), ii), iii), iv) ou v) sob condições de estringência.

[090] A sequência de nucleotídeos codificando a fucosiltransferase heteróloga pode estar presente em uma molécula de ácido nucleico extracromossômico linear ou circular da célula geneticamente modificada ou ser integrada à molécula de ácido nucleico cromossômico da célula, em que a referida molécula de ácido nucleico cromossômico pode ser uma molécula de ácido nucleico (cromossomo bacteriano) linear ou circular.

[091] A célula geneticamente modificada é capaz de sintetizar a GDP- fucose, que é necessária para que a reação seja catalisada pelo polipeptídeo heterólogo capaz de possuir atividade de fucosiltransferase para a transferência de um resíduo de fucose de um substrato doador para uma lactotetraose para produzir o oligossacarídeo fucosilado desejado, porque a

GDP-fucose serve como substrato doador para que o resíduo de fucose seja transferido a uma lactotetraose pela fucosiltransferase heteróloga. Assim, em uma modalidade, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para compreender uma maior capacidade intracelular de produção de GDP-fucose em comparação com a célula antes de ser geneticamente modificada.

[092] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, prover um conjunto (pool) intracelular de GDPfucose para a produção de oligossacarídeos fucosilados é alcançado que a célula geneticamente modificada também tenha sido geneticamente modificada de tal forma que um gene que codifica um fucosequinase/L-fucose-1-fosfato-guaniltransferase (Fkp) bifuncional, preferencialmente um gene que codifica a fucosequinase/L-fucose-1-fosfato- guaniltransferase (Fkp) bifuncional de Bacteroides fragilis (nº de acesso AY8498O6), que é capaz de converter L-fucose em GDP-fucose, é expressa ou superexpressa pela referida célula. Preferencialmente, a L-fucose é alimentada à célula geneticamente modificada durante a fermentação das células para produzir o oligossacarídeo fucosilado desejado.

[093] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a GDP-fucose para a síntese do oligossacarídeo fucosilado desejado pode ser usada do próprio metabolismo da GDP-fucose da célula usando o "percurso de novo". Para aumentar o conjunto de GDP-fucose intracelular através do "percurso de novo", a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para expressar ou superexpressar - em comparação com a célula antes de ser geneticamente modificada - pelo menos um dos genes codificando fosfomano mutase, manose-1-fosfato guanosiltransferase, GDP-manose-4, 6- dehidratase e sintese GDP-L-fucose. Em uma modalidade preferida, a célula é geneticamente modificada para superexpressar todos os quatro referidos genes.

[094] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para possuir uma maior importação de L-fucose exógeno através de sua membrana celular. Preferencialmente, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para expressar ou superexpressar - em comparação com a célula progenitora antes de ser geneticamente modificada - uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de nucleotídeos que codificam o principal transportador facilitador FucP de E. coli. MG1655 (nº de acesso AIZ9O162), sequências de nucleotídeos que codificam variantes funcionais do principal transportador facilitador FucP de E. coli, sequências de nucleotídeos que codificam fragmentos funcionais do principal transportador facilitador FucP de E. coli e sequências de nucleotídeos que codificam variantes funcionais dos fragmentos funcionais do principal transportador facilitador FucP de E. coli. Expressão ou superexpressão do principal transportador facilitador FucP, são variantes funcionais e/ou fragmentos funcionais do mesmo na célula geneticamente modificada, aumenta a absorção da célula de L-fucose exógeno em toda a sua membrana celular.

[095] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para prevenir a depleção do conjunto GDP-fucose intracelular da célula. Em uma modalidade, a célula é geneticamente modificada nessa expressão do gene que codifica WcaJ, que catalisa a primeira etapa na síntese de ácido colônico, é reduzida ou inativada, preferencialmente na medida em que o gene WcaJ foi pelo menos parcialmente excluído das informações genéticas da célula, ou em que a sequência de nucleotídeos do gene WcaJ foi alterada de modo que a transcrição do gene que codifica WcaJ é impossível. Em uma abordagem adicional e/ou alternativa, a sequência de nucleotídeos que codifica o gene WcaJ foi alterada de tal forma que um polipeptídeo enzimaticamente inativo é codificado pelo gene WcaJ alterado, por exemplo, em que um códon de terminação é introduzido no quadro de leitura aberta levando a uma variante truncada do WcaJ, que representa um fragmento não funcional, é expressa, ou em que a sequência de nucleotídeos do gene WcaJ é alterada de tal forma que o polipeptídeo codificado pelo gene WcaJ alterado difere do tipo selvagem WcaJ em um ou mais resíduos de aminoácidos tornando o polipeptídeo resultante enzimaticamente inativo.

[096] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada em que os genes fucl e/ou fucK, que codificam a isomerase L-fucose e a quinase L-fuculose respectivamente, são excluídos, a sequência de nucleotídeos de fucl e/ou fucK é alterada para inativar irreversivelmente a atividade enzimática do(s) polipeptídeo(s) correspondente(s) ou em que a expressão de fucl e/ou fucK é reduzida. Abolir a síntese intracelular de Fucl e/ou FucK abole o catabolismo fucose na célula correspondente, aumentando assim a quantidade de fucose que está disponível para geração de GDP-fucose.

[097] Em uma modalidade adicional, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada de tal forma que a célula (i) não expressa um ou mais polipeptídeos que intracelularmente degradam um ou mais precursores do desejado oligossacarídeo fucosilado a ser produzido, ou (ii) expressa um ou mais polipeptídeos que tem uma sequência e/ou comprimento de aminoácidos alterados - em comparação com o seu homólogo de ocorrência natural - para reduzir a atividade de tal enzima intracelularmente degradando um ou mais precursores do oligossacarídeo fucosilado desejado a ser produzido.

[098] O termo "precursor" usado na presente invenção no que diz respeito aos oligossacarídeos fucosilados desejados refere-se aos compostos que são intermediários no percurso biosintético do oligossacarídeo fucosilado desejado a ser produzido. Estes intermediários incluem compostos endógenos, ou seja, compostos que são produzidos e podem estar presentes naturalmente na célula hospedeira, mesmo quando sua síntese na célula hospedeira bacteriana é melhorada pela modificação genética do hospedeiro.

[099] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para não incluir uma β-galactosidase enzimaticamente ativa.

[0100] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada para não ter um LacZ funcional ou para compor um gene LacZ funcional cuja expressão é rigorosamente regulada e que não é expressa durante o processo de fermentação para a produção do oligossacarídeo fucosilado.

[0101] Além disso, e/ou alternativamente, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada de modo que a célula não compreende ou expressa polipeptídeos possuindo uma atividade enzimática que hidrolisa outro precursor do oligossacarídeo fucosilado desejado do que lactose, por exemplo, LNT-2, LNT ou LNnT, ou derivados maiores de LNT e LNnT. Para este fim, a célula geneticamente modificada também foi geneticamente modificada de tal forma que o genoma da célula não contém uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sendo capaz de hidrolizar referido outro precursor do oligossacarídeo fucosilado desejado ou tal que expressão dos genes que codificam tais proteínas são regulados dessa forma que não são expressos durante o processo de fermentação para a produção do oligossacarídeo fucosilado.

[0102] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase. A célula geneticamente modificada dessa modalidade é capaz de expressar o polipeptídeo capaz de exibir atividade de β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase. Preferencialmente, a célula geneticamente modificada expressa referido polipeptídeo ser capaz de exibir atividade de β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase. Mais preferencialmente, a referida célula geneticamente modificada compreende o polipeptídeo ser capaz de exibir atividade de β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase. Preferencialmente, a referida pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3-N- acetilglucosaminiltransferase é uma sequência de ácido nucleico heterológa, ou seja, é uma sequência de nucleotídeos não ocorre naturalmente em um ancestral não geneticamente modificado da célula geneticamente modificada. Ao expressar um polipeptídeo que é capaz de exibir atividade β-1,3-N- acetilglucosaminil transferase, a célula hospedeira é capaz de ligar N- acetilglucosamina para o substrato aceptor de lactose quando o referido polipeptídeo possui sua atividade de β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase, gerando assim LNT-2 intracelularmente.

[0103] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase para uma transferência de N-acetilglucosamina para lactose é um β-1,3-N- acetilglucosaminiltransferase que pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em LgtA de Neisseria meningitidis MC58 (nº de acesso NP_274923) e o β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase de Pasteurella multocida subsp.

multocida str. HN06 (nº de acesso PMCN06_0022).

[0104] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3-galactosiltransferase ou atividade de β-1,4-galactosiltransferase. A célula geneticamente modificada dessa modalidade é capaz de expressar o polipeptídeo capaz de exibir atividade de β-1,3-galactosiltransferase ou atividade de β-1,4-galactosiltransferase. Preferencialmente, a célula geneticamente modificada expressa o referido polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3-galactosiltransferase ou atividade de β-1,4- galactosiltransferase. Mais preferencialmente, a referida célula geneticamente modificada compreende o polepeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β- 1,3-galactosiltransferase ou atividade de β-1,4-galactosiltransferase. Preferencialmente, a referida pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3- galactosiltransferase ou atividade de β-1,4-galactosiltransferase é uma sequência de ácido nucleico heteróloga, ou seja, é uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente em um ancestral não geneticamente modificado da célula geneticamente modificada. Ao expressar um polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,3-galactosiltransferase ou atividade de β-1,4-galactosiltransferase, a célula geneticamente modificada é capaz de galactosilar LNT-2 para gerar intracelularmente LNT ou LNnT, respectivamente.

[0105] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o polipeptídeo sendo capaz de exibir a atividade de β-1,3-galactosiltransferase para a galactosilação do LNT-2 para produzir LNT é uma β-1,3-galactosiltransferase selecionado a partir do grupo composto pela β-1,3-galactosiltransferase WbdO derivado de Salmonella enterica (nº de acesso AY730594) e o β-1,3- galactosiltransferase sendo codificados por um gene selecionado a partir do grupo que consiste em wbgO de E. coli O55:H7 (nº de acesso BAG11838), furA de Lutiella nitroferrum (FuraDRAFT_0419), e fragmentos funcionais das referidas β-1,3-galactosiltransferases.

[0106] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o polipeptídeo sendo capaz de exibir atividade de β-1,4-galactosiltransferase para a galactosilação de LNT-2 para produzir LNnT é uma β-1,4-galactosiltransferase selecionado a partir do grupo que consiste em LgtB de Neisseria meningitides (nº de acesso AAF42257), Lex1 de Aggregatibacter aphrophilus NJ8700 (nº de acesso YP_003008647), GalT de Kingella denitrificans ATCC 33394 (nº de acesso HMPREF9O 98_24O 7), GatD de Pasteurella multocida M14O 4 (nº de acesso GQ444331), GalT de Bacterioidis fragilis NCTC9343 (nº de acesso BF9343_O 585), lsgD de Haemophilus influenza (nº de acesso AAA24981), GaIT de Helicobacter pylori (nº de acesso ABO 35971), e fragmentos funcionais das referidas β-1,4-galactosiltransferases.

[0107] UDP-galactose e UDP-N-acetilglucosamina são necessárias para síntese intracelular de LNT ou LNnT, ou derivados maiores do mesmo, na célula geneticamente modificada.

[0108] UDP-galactose intracelular na célula geneticamente modificada pode ser fornecido alimentando galactose para a célula geneticamente modificada em que as células são cultivadas em um caldo de fermentação que contém galactose. A galactose é absorvida pela célula, fosforilada para galactose-1-fosfato e, em seguida, convertida em UDP-galactose. Genes que codificam polipeptídeos contendo as atividades enzimáticas que são necessárias para essas reações são bem conhecidos.

[0109] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o fornecimento intracelular de UDP-galactose também pode ser obtido a partir do próprio metabolismo da célula, e o próprio metabolismo da célula pode ser melhorado pela modificação genética da célula de tal forma que, por exemplo, a célula superexpressa UDP-galactose-4'-epimerase, ou superexpressa a UDP galactose- 4'-epimerase em combinação com a glicose-1-fosfato-1-uridinil-transferase.

[0110] UDP-N-acetilglucosamina intracelular na célula geneticamente modificada também pode ser obtida a partir do próprio metabolismo de UDP- N-acetilglucosamina da célula. Para aumentar o conjunto de UDP-N- acetilglucosamina intracelular na célula geneticamente modificada, a célula pode ser geneticamente modificada de tal forma que um ou mais dos genes codificando L-glutamina: D-fuctose-6-fosfato aminotransferase, fosfoglucomutase, fosforoglucomutase e N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferase/ glucosamina-1-fosfato acetiltransferase são superexpressos.

[0111] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula é geneticamente modificada de tal forma que o catabolismo de N- acetilglucosamina na célula geneticamente modificada foi inativado. A inativação do catabolismo de N-acetilglucosamina da célula melhora o nível intracelular da UDP-N-acetilglucosamina estando disponível para a síntese intracelular de N-acetilglucosamina.

[0112] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada para uso na síntese de HMOs fucosilados complexos é capaz de incorporar a lactose através de sua membrana celular para acumular lactose como material de partida para a produção do oligossacarídeo fucosilado desejado. Portanto, a célula pode expressar seu gene endógeno codificando uma lactose permease. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula é geneticamente modificada para conter e expressar um gene heterólogo lactose permease, particularmente se a célula não compreende naturalmente e expressa um gene codificando uma lactose permease.

[0113] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a lactose para produzir o oligossacarídeo fucosilado desejado é fornecida por meio da síntese intracelular da lactose pela célula. Preferencialmente, isso é alcançado na medida em que a célula expressa um gene endógeno ou recombinante codificando uma β1-4-galactosiltransefrase, a referida β1-4- galactosiltransferase sendo capaz de transferir a fração de galactose da UDP- galactose para uma molécula de glicose. Esta β1-4-galactosiltransefrase pode ser selecionado a partir de Pm1141 de Pasteurella multocida (nº de acesso: AEC04686) ou Lex1 de Aggregatibacter aphrophilus NJ8700 (acc no. YP_003008647).

[0114] Assim, em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula geneticamente modificada compreende (i) uma β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase, (ii) uma β-1,3-galactosiltransferase ou uma β-1,4-galactosiltransferase; e (iii) uma α-1, 2- e/ou α-1,3-fucosiltransferase.

[0115] Em outra modalidade, em que a célula geneticamente modificada é cultivada para produzir um oligossacarídeo fucosilado em que LNT-2 é adicionado ao caldo de fermentação como um precursor da molécula aceptora, a célula geneticamente modificada compreende (i) uma β-1,3-galactosiltransferase ou uma β-1,4-galactosiltransferase; e (ii) uma α-1, 2- e/ou α-1,3-fucosiltransferase como glicosiltransferase.

[0116] De acordo com o terceiro aspecto, são fornecidas moléculas de ácido nucleico recombinantes para expressar uma fucosiltransferase heteróloga em uma célula geneticamente modificada. O termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma macromolécula de desoxiribonucleotídeo de fita única ou fita dupla e compreende uma macromolécula de desoxiribonucleotídeos em fita ou macromolécula de ribonucleotídeo compreendendo um ou mais nucleotídeos análogos conhecidos ou produzidos naturalmente ou sinteticamente.

[0117] A molécula de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de nucleotídeos codificando para uma fucosiltransferase que é selecionada a partir do grupo que consiste em polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, variantes funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos como representado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a

30.

[0118] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a sequência de nucleotídeos codificando a fucosiltransferase é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) uma sequência de nucleotídeos como representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15; ii) uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% com uma das sequências de nucleotídeos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15, preferencialmente em toda a extensão da sequência; iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; v) uma sequência de nucleotídeos codificando um fragmento funcional de qualquer um dos polipeptídeos de acordo com iii) e iv); e vi) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza a uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com i), ii), iii), iv) ou v) sob condições de estringência.

[0119] No escopo da presente invenção, ácido nucleico/polinucleotídeo e variantes de polipeptídeo polimórficas, alelos, mutantes e interespécies homólogas também são compreendidos por esses termos, que têm uma sequência de aminoácidos que tem mais do que cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente em uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, ou mais aminoácidos, com um polipeptídeo que se assemelha a uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs. 16 a 30.

[0120] "Variante(s)", como o termo é usado na presente invenção, é um polinucleotídeo ou polipeptídeo que difere de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente, mas mantém as propriedades essenciais (enzimáticas) do polinucleotídeo de referência ou polipeptídeo. Uma variante típica de um polinucleotídeo difere na sequência de nucleotídeos de outro polinucleotídeo de referência. Alterações na sequência do nucleotídeo da variante podem ou não alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. As mudanças de nucleotídeo podem resultar em substituições de aminoácidos, adições, deleções, fusões e truncamentos no polipeptídeo codificado pela sequência de referência, como discutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere na sequência de aminoácidos de outro polipeptídeo de referência. Geralmente, as diferenças são limitadas de modo que as sequências de polipeptídeo de referência e da variante sejam muito semelhantes em geral e, em muitas regiões, idênticas. Uma variante e polipeptídeo de referência pode diferir na sequência de aminoácidos por uma ou mais substituições, adições, deleções em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácidos substituído ou inserido pode ou não ser codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser uma de ocorrência natural, como uma variante alélica, ou pode ser uma variante que não é conhecida por ocorrer naturalmente. Variantes não naturais de polinucleotídeos e polipeptídeos podem ser produzidas por técnicas de mutagênese, por síntese direta e por outros métodos recombinantes conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0121] Na molécula de ácido nucleico recombinante, a sequência de nucleotídeos codificando a fucosiltransferase, a variante funcional da mesma, o fragmento funcional da fucosiltransferase ou a variante funcional do fragmento funcional está operavelmente ligada a pelo menos uma sequência de nucleotídeos que media e/ou controla a expressão da fucosiltransferase, variante ou fragmentação da mesma, desde que a molécula de ácido nucleico recombinante esteja presente na célula.

[0122] O termo "operavelmente ligado" como usado na presente invenção, refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (como promotor, operador, reforçador, regulador, arranjo de sítios de ligação do fator de transcrição, terminador transcricional, sítio de ligação de ribossomo) e uma segunda sequência de nucleotídeo, em que a sequência de controle de expressão afeta transcrição e/ou tradução do ácido nucleico correspondente à segunda sequência de nucletídeo. Assim, o termo "promotor" designa sequências de DNA que geralmente "precedem" um gene em um polímero de DNA e provêm um local para a iniciação da transcrição em mRNA. Sequências de DNA "Reguladoras", também geralmente "a montante" de (ou seja, precedendo) um gene em um determinado polímero de DNA, ligam proteínas que determinam a frequência (ou taxa) de iniciação transcricional. Coletivamente referido como "promotor / regulador" ou "controle" de sequência de DNA, essas sequências que precedem um gene selecionado (ou série de genes) em um polímero de DNA funcional cooperam para determinar se a transcrição (e eventual expressão) de um gene irá ocorrer. Sequências de DNA que "seguem" um gene em um polímero de DNA e provêm um sinal para o término da transcrição em mRNA são referidas como sequências "terminadoras" de transcrição.

[0123] Uma grande variedade de sistemas de expressão pode ser usada para produzir os polipeptídeos da invenção. Tais sistemas incluem, entre outros, vetores derivados de vírus, episomais e cromossomais, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, de bacteriófagos, de transposons, de epissomos de levedura, de elementos de inserção, de elementos cromossômicos de levedura, de vírus, e vetores derivados de combinações do mesmo, tais como os derivados de elementos genéticos plasmídeos e bacteriófagos, tais como cosmídeos e fagomóides. As construções do sistema de expressão podem conter regiões de controle que regulam, bem como engendram expressão. Geralmente, qualquer sistema ou vetor adequado para manter, propagar ou expressar polinucleotídeos e sintetizar um polipeptídeo em um hospedeiro pode ser usado para expressão a este respeito. A sequência apropriada de DNA pode ser inserida no sistema de expressão por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas e rotineiras, como, por exemplo, aquelas estabelecidas em Sambrook et al., supra. Assim, a molécula de ácido nucleico para expressar uma fucosiltransferase heteróloga em uma célula geneticamente modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em plasmídeos, fagomóides, cosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos (BACs) e leveduras artificiais cromossomos (YACs).

[0124] De acordo com o quarto aspecto, são fornecidos fucosiltransferases sendo capazes de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose.

[0125] As fucosiltransferases são de origem bacteriana. As fucosiltransferases podem ser usadas para sintetizar oligossacarídeos fucosilados, preferencialmente HMOs fucosilados complexos baseados em lactose, LNT e/ou LNnT ou outros oligossacarídeos. O oligossacarídeo fucosilado é um lactofucopentaose.

[0126] A fucosiltransferases são capazes de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador, preferencialmente GDP-fucose, para uma molécula aceptora. Em uma modalidade preferencial, a molécula aceptora é uma lactotetraose, preferencialmente LNT e/ou LNnT.

[0127] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a fucosiltransferase é selecionada a partir do grupo que consiste em polipeptídeos representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, variantes funcionais dos polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a

30.

[0128] As fucosiltransferases como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30 não foram descritos como fucosiltransferases que são capazes de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma lactotetraose como substrato aceptor. As novas fucosiltransferases como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 27 nem sequer foram descritos anteriormente como fucosiltransferases como tal, ou seja, independentemente da sua molécula aceptora.

[0129] As fucosiltransferases descritas na presente invenção anteriormente podem ser usadas para produzir oligossacarídeos fucosilados complexos, seja por um processo de fermentação com célula inteira, por exemplo, como descrito na presente invenção anteriormente, ou por meio de biocatálise in vitro. Consequentemente, de acordo com o quinto aspecto, é fornecido o uso de pelo menos uma das fucosiltransferases sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, em que a referida molécula aceptora é uma lactotetraose, para a produção de oligossacarídeos fucosilados.

[0130] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, as fucosiltransferases descritas na presente invenção anteriomente são usadas para sintetizar HMOs fucosilados complexos por biocatálise in vitro.

[0131] O uso de pelo menos uma das novas fucosiltransferases em um processo de biocatálise in vitro compreende a adição de um substrato doador adequado contendo um resíduo de fucose, preferencialmente GDP-fucose, e uma molécula aceptora adequada para pelo menos um dos novos fucosiltransferases em um solvente e sob condições adequadas para a fucosiltransferase para transferir o resíduo de fucose do substrato doador para a molécula aceptora, sintetizando assim um oligossacarídeo fucosilado. Preferencialmente, a molécula aceptora adequada é uma lactotetraose, mais preferencialmente LNT e/ou LNnT. Usando uma lactotetraose como molécula aceptora, o produto de reação da fucosiltransferase na reação biocatalítica in vitro é uma lactofucopentaose. A referida lactofucopentaose é preferencialmente um pentassacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste em lacto-N-fucopentaose I, lacto-Nneofucopentaose I, lacto-N- neofucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V e lacto-N-neofucopentaose V.

[0132] De acordo com o sexto aspecto, é fornecido um método para produzir oligossacarídeos fucosilados, preferencialmente oligossacarídeos fucosilados do leite humano, mais preferencialmente oligossacarídeos de leite humano complexos, mais preferencialmente uma lactofucopentaose, por biocatálise in vitro, em que uma fucosiltransferase é usada, referida fucosiltransferase sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora.

[0133] Em uma modalidade da biocatálise in vitro, o método compreende as etapas de a) fornecer a fucosiltransferase sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora em uma mistura de reação; b) colocar em contato a referida fucosiltransferase com um substrato doador compreendendo um resíduo de fucose e uma molécula aceptora, em que a molécula aceptora é uma lactotetraose, para sintetizar o oligossacarídeo fucosilado.

[0134] Esta modalidade compreende fornecer em uma mistura de reação uma fucosiltransferase. O termo "fucosiltransferase", como usado na presente invenção também compreende variantes funcionais, fragmentos funcionais da referida fucosiltransferase e variante funcional de fragmentos da fucosiltransferase, em que "funcional" denota que referidas variantes e fragmentos são capazes de possuir uma atividade de fucosiltransferase como descrito na presente invenção anteriormente.

[0135] O método de acordo com esta modalidade compreende adicionalmente reagir a mistura sob condições adequadas para ter o resíduo de fucose transferido do substrato doador, preferencialmente GDP-fucose, para uma fração aceptora da molécula aceptora, referida molécula aceptora preferencialmente sendo uma lactotetraose.

[0136] Em uma modalidade adicional, o método de biocatálise in vitro compreende adicionalmente purificar e/ou isolar subsequentemente a molécula aceptora fucosilidada da mistura de reação.

[0137] De acordo com o sétimo aspecto, são fornecidos oligossacarídeos fucosilados que estão sendo produzidos por uma abordagem de fermentação com célula inteira ou por uma biocatálise in vitro como descrito na presente invenção anteriormente.

[0138] Em uma modalidade, o oligossacarídeo fucosilado é um oligossacarídeo de leite humano. Oligossacarídeos de leite humano selecionados são 2'-fucosilactose, 3-fucosilactose, 2',3- difucosilactose, 3- fucosil-3'-sialillactose, 3-fucosil-6'-sialillactose, lacto-Nfucopentaose I, lacto-N- neofucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-neofucopentaose I, lacto- N-neofucopentaose V, lacto-N-difucosilhexaose I, lacto-Ndifucosilhexaose II, fucosil-lacto-N-sialilpentaose b, fucosil-lacto-N-sialilpentaose c, lacto-N- neodifucohexaose I, Disialil-lacto-N-fucopentaose V e fucosil-para-lacto-N hexaose IV. As estruturas dos oligossacarídeos de leite humano selecionados são exibidas na Tabela 2.

[0139] Em uma modalidade, o oligossacarídeo fucosilado que pode ser produzido utilizando uma fucosiltransferase como descrito na presente invenção anteriormente é selecionado do grupo que consiste em pentassacarídeos, preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em lacto-Nfucopentaose I, lacto-N-neofucopentaose I, lacto-N- neofucopentaose III, lacto-Nfucopentaose V, lacto-N-neofucopentaose V.

[0140] Não obstante as lactofucopentaoses nomeadas no parágrafo anterior constituem produtos de reação direta das atividades enzimáticas da fucosiltransferase descrita na presente invenção anteriormente, as referidas lactofucopentaoses podem ser processadas adicionalmente.

Por exemplo, as referidas lactofucopentaoses podem ser fornecidas como moléculas aceptoras para glicosiltransferases adicionais tal que os hexaoses resultantes, por exemplo, aqueles na Tabela 2, e heptaoses também podem ser considerados como oligossacarídeos fucosilados que podem ser produzidos utilizando as fucosiltransferases como divulgado na presente invenção.

Além disso, prevê-se que as fucosiltransferases também possam ser empregadas na produção de trissacarídeos e/ou tetrassacarídeos, tais como os identificados na Tabela 2. Nome Abreviação Estrutura 2'-Fucosilactose 2'-FL Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Gluc 3-Fucosilactose 3-FL Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Gluc 2',3-Difucosilactose DF-L Fuc(α1 -2)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Gluc Lacto-N-fucopentaose I LNFP I Fuc (α1-2)Gal (β1-3)GlcNAc (β1-3)Gal(β1-4)Gluc Lacto-N-neofucopentaose I LNnFP I Fuc(α1-2)Gal (β1-4)GlcNAc (β1-3)Gal(β1-4)Gluc Lacto-N-neofucopentaose III LNFP III Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc Lacto-N-fucopentaose V LNFP V Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Gluc Lacto-N-neofucopentaose V LNnFP V Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Gluc Lacto-N-difucohexaose I LNDH I Fuc(α1-2)Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNAc(β1- 3)Gal(β1-4)Gluc Lacto-N-difucohexaose II LND Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1- 4)[Fuc(α1-3)]Gluc para-Lacto-N-fucohexaose paraLNT Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1- 4)[Fuc(α1-3)]GlcNAc(β1- 3)Gal(β1-4)Gluc Fucosil-lacto-N- F-LST-b Fuc(α1-2)Gal(β1-3) [Neu5Ac(α2-6)]GlcNAc(β1- sialilpentaose b 3)Gal(β1-4)Gluc

Fucosil-lacto-N- F-LST-c Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1- sialilpentaose c 4)[Fuc(α1-3)]Gluc Disialil-lacto-N-fucopentaose DS-LNFP V Neu5Ac(α2-3)Gal(β1- 4)[Neu5Ac(α2-6)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1- 4)[Fuc(α1-3)]Gluc 3-Fucosil-3'-sialillactose 3F-3'-SL Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Gluc 3-Fucosil-6'-sialillactose 3F-6'-SL Neu5Ac(α2-6)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Gluc Lacto-N-neodifucohexaose I LNnDFH I Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]GalNAc(β1-3)Gal(β1- 4)[Fuc(α1-3)]Gluc Tabela 2: Estruturas de HMOs exemplares.

[0141] De acordo com o oitavo aspecto, é fornecido o uso de um oligossacarídeo fucosilado sendo produzido por uma abordagem de fermentação da célula inteira ou por uma biocatálise in vitro como descrito na presente invenção anteriormente para fabricar uma composição nutricional. A referida composição nutricional contém pelo menos um oligossacarídeo fucosilado que foi produzido por um método como revelado anteriormente na presente invenção.

[0142] Assim, de acordo com o nono aspecto, é fornecida uma composição nutricional contendo pelo menos um oligossacarídeo fucosilado que foi produzido por um método como revelado anteriormente na presente invenção. O pelo menos um oligossacarídeo fucosilado é uma lactofucopentaose. A pelo menos uma lactofucopentaose na composição nutricional é selecionada a partir do grupo que consiste em lacto-N- fucopentaose I, lacto-N-neofucopentaose I, lactoN-neofucopentaose Ill, lacto- N-fucopentaose V e lacto-N-neofucopentaose V.

[0143] Em uma modalidade adicional, a composição nutricional é selecionada a partir do grupo que consiste em formulações medicinais, formulações infantis e suplementos dietéticos.

[0144] A composição nutricional pode estar presente em forma líquida ou em forma sólida, incluindo, mas não limitado a pós, grânulos, flocos e pellets.

[0145] A presente invenção será descrita no que diz respeito às modalidades particulares e com referência aos desenhos, mas a invenção não é limitada aos mesmos, mas somente às reivindicações. Além disso, os termos primeiro, segundo e similares no relatório descritivo e nas reivindicações são utilizados para distinguir entre elementos semelhantes e não necessariamente para descrever uma sequência, seja temporal, espacial, em classificação ou em qualquer outra maneira. Deve-se entender que os termos assim utilizados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção descrita na presente invenção são capazes de operar em outras sequências além do descrito ou ilustrado na presente invenção.

[0146] Deve-se notar que o termo "compreendendo", usado nas reivindicações, não deve ser interpretado como sendo restrito aos meios listados depois disso; este não exclui outros elementos ou etapas. Deve-se, portanto, ser interpretado como especificando a presença das características, números inteiros, etapas ou componentes declarados, como referido, mas não impede a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos do mesmo. Assim, o escopo da expressão "um dispositivo compreendendo meios A e B" não deve ser limitado a dispositivos que compreendem apenas componentes A e B. Isso significa que, com relação à presente invenção, os únicos componentes relevantes do dispositivo são A e B.

[0147] A referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade" ou "alguma modalidade" significa que uma característica, estrutura ou traço particulares descritos em conexão com a modalidade estão incluídos em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, as aparências das frases "em uma modalidade" ou "em alguma modalidade" em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não se referem, necessariamente, todas à mesma modalidade, mas podem. Além disso, as características, estruturas ou traços particulares podem ser combinados de qualquer forma adequada, como seria evidente para um técnico no assunto a partir desta divulgação em uma ou mais modalidades.

[0148] Da mesma forma, deve-se apreciar que, na descrição de modalidades exemplares da invenção, várias características da invenção às vezes são agrupadas em uma única modalidade, figura ou descrição da mesma com a finalidade de racionalizar a divulgação e ajudar na compreensão de um ou mais dos vários aspectos inventivos. Este método de divulgação, no entanto, não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada requer mais características do que são expressamente recitadas em cada reivindicação. Pelo contrário, como as seguintes reivindicações refletem, aspectos inventivos estão em menos do que todas as características de uma única modalidade divulgada mencionada acima. Assim, as reivindicações que seguem a descrição detalhada são por meio desta incorporadas expressamente nesta descrição detalhada, com cada reivindicação por conta própria como uma modalidade separada desta invenção.

[0149] Além disso, enquanto algumas modalidades descritas na presente invenção incluem algumas, mas não outras características incluídas em outras modalidades, combinações de características de diferentes modalidades devem estar dentro do escopo da invenção e formar diferentes modalidades, como seria compreendido por técnicos no assunto. Por exemplo, nas seguintes reivindicações, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[0150] Além disso, algumas das modalidades são descritas na presente invenção como um método ou combinação de elementos de um método que pode ser implementado por um processador de um sistema de computador ou por outros meios de realizar a função. Assim, um processador com as instruções necessárias para a realização de tal método ou elemento de um método forma um meio para a realização do método ou elemento de um método. Além disso, um elemento descrito na presente invenção de uma modalidade do aparelho é um exemplo de um meio para a realização da função desempenhada pelo elemento com a finalidade de realizar a invenção.

[0151] No relatório descritivo e desenhos fornecidos na presente invenção, vários detalhes específicos são estabelecidos. No entanto, deve-se entender que as modalidades da invenção podem ser aplicadas sem esses detalhes específicos. Em outros casos, métodos, estruturas e técnicas bem conhecidas não foram mostradas em detalhes a fim de não obscurecer um entendimento dessa descrição.

[0152] A invenção será descrita agora por uma descrição detalhada de diversas modalidades da invenção. É claro que outras modalidades da invenção podem ser configuradas de acordo com o conhecimento de técnicos no assunto sem se afastar do verdadeiro espírito ou ensinamento técnico da invenção, a invenção sendo limitada apenas pelos termos das reivindicações em anexo. Exemplo 1: Identificação de fucosiltransferases que fucosilam lacto-N- tetraose e lacto-N-neotetraose

[0153] O banco de dados Genbank foi revisto para fucosiltransferases putativas codificadas no genoma de várias espécies bacterianas. Cento e vinte e cinco fucosiltransferases putativas que não foram anotadas como fucosiltransferase antes foram reveladas por esta abordagem.

[0154] Os genes que codificam as fucosiltransferases putativas (fucTs)

foram códon-otimizados para expressão em E. coli e comprados da GenScript Cooperation (Piscataway, EUA). Os genes de fucosiltransferase foram subclonados por sequência e clonagem independente de ligação (SLIC) em vector plNT-malE-zeo a jusante do gene malE que codifica a proteína de ligação à maltose (MBP) e permite a síntese de uma proteína de fusão de MBP - (Fig. 1), usando iniciadores 2700 e 2702 para amplificação dos genes fucT e iniciadores 2701 e 2703 para amplificação de plNT-malE-zeo (iniciadores oligonucleotídeos usados estão listados na Tabela 3).

[0155] Os genes fucT foram expressos em E. coli ER 2508 (New England Biolabs, Ipswich, EUA). Os genes que codificam as alfa-1,2-fucosiltransferases wbgL de E. coli 0126 e fucT2Hp de Helicobacter pylori também foram códon- otimizados para expressão em E. coli, também comprada da GenScript Cooperation e clonados nos sítios Ncol e BamHI do vetor pACYC (Novagen, Merck, Darmstadt, Alemanha) sob controle transcricional do promotor T7. WbgL e fucT2Hp foram amplificados com oligonucleotídeos 141 e 142, e 143 e 144, respectivamente. O vetor, bem como os produtos de amplificação PCR foram digeridos com endonucleases de restrição Ncol e BamHI e ligados. E. coli transformantes foram selecionados em cloranfenicol. WbgL e fucT2HP foram expressos em E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ (cepas bacterianas usadas neste trabalho estão listadas na Tabela 4). iniciador Sequência (5' - 3') SEQ ID NO: 2700 AACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCG 44 2702 TAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGC 45 2701 GCGGCCGCGTCGACACGCAAAAAGG 46 2703 AGTCTGCGCGTCTTTCAGGGCTTCATCG 47 141 GATCCCATGGAAGTTAAAATCATTGGTGGTC 48 142 GCGCGGATCCTTACAGTTTCACCCAAGATTCCG 49 143 TATACCATGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTGCGG 50 144 AATTCGGATCCTTAAGCGTTATACTTTTGGGATTTCA 51

CC

1119 CTGTCTCTTATACACATCTCCTGAAATTGGCCAGATG 52

ATTAATTCCTAATTTTTGTTG 1120 CTGTCTCTTATACACATCTCAGCATTACACGTCTTGA 53

GCGATTGTGTAGG 2194 CTGTCTCTTATACACATCTGGGAATTGATTCTGGTAC 54

CAAATGAGTC 2235 CTGTCTCTTATACACATCTCCCCAGGCTTTACACTTT 55

ATGCTTCC 6473 CTGTCTCTTATACACATCTTTACTCAGCAATAAACTG 56

ATATTCCGTCAGGCTGGATATTCCGTCAGGCTGG 6474 CTGTCTCTTATACACATCTTTCCGTTAACGTCGGTAG 57

TGCTGACCTTGCCGGAGG Tabela 3. Oligonucleotideos usados para reações em cadeia de polimerase Cepa Genótipo Referência E. coli BL21 (DE3) F- ompT hsdSB (rB-, mB-) gal dcm Merck KGaA, (DE3) Darmstadt, Alemanha E. coli ER 2508 F- ara-14 leuB6 fhuA2 Δ(argF- New England lac)U169 lacY1 Biolabs, lon::miniTn10(TetR)glnV44 galK2 Ipswich, EUA rpsL20(StrR)xyl-5 mtl-5 Δ(malB) zjc::Tn5( KanR) Δ(mcrC-mrr)HB101 E. coli BL21 (DE3) E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ Este estudo ΔlacZ E. coli BL21 (DE3) E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo 534 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: qalETKM, lac Y E. coli BL21 (DE3) E. coli BL21 (DE3)ΔlacZ Δara ΔwcaJ Patente #724 ΔfuclK ΔnagAB abrigando WO integrações genômicas de:galETKM, 2015/15032811 lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS- dhfr E. coli BL21 (DE3) E. coli BL21 (DE3)ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #753 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-qlmS- dhfr, wbdO-qalE-cat E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo

#993 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS- dhfr, wbdO-galE-cat, fkp-aacC1 E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #1046 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS- dhfr, lgtB-tetA, galE-cat E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #1076 ΔfuclK ΔnagAB habrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS- dhfr, lgtB-tetA, galE-cat, fkp-aacC 1 E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #1197 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS-dhfr, wbdO-galE-cat, fkp-aacC 1, malE-fucT61-zeoR E. coli BL21(DE3) E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ EP 2 845 905 #1369 ΔfuclK ΔnagAB abrigando (A1) integrações genômicas de: galETKM, lacYHis-aad1, bbhl-zeoR, lacZ-aacC1 E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ #1445 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS- dhfr, wbdO-galE-cat, manC-manB- gmd-wcaG E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3)ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #1772 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, lgtA-galT-kanR, glmUM-glmS- dhfr, wbdO-galE-cat, fkp-aacC 1, malE-fucT61-zeoR, fucP-aad1 E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #1796 ΔfuclK ΔnagAB abrigando integrações genômicas de: galETKM, lacY, fkp, setA-tetA, malE-fucT109-

zeoR E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3) ΔlacZ Δara ΔwcaJ Este estudo #1886 ΔfuclK ΔnagAB habrigando integrações genômicas de: galETKM, lacYHis-aad1, bbhl-zeoR, lacZ-aacC1, bga42A-cat Tabela 4: Cepas bacterianas usadas

[0156] E. coli ER 2508 contendo plasmídeos plNT-malE-fucT-zeo foram cultivados em caldo 2YT (Sambrook et. al, 1989, supra) contendo ampicilina 100 μg/ml e zeocina 40 μg/ml para um OD600nm de 0,3 antes que a expressão dos genes malE-fucT fosse induzida pela adição de 200 μg/ml de anidrotetraciclina. E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ abrigando pACYC-wbgL ou pACYC- fucT2Hp foi cultivada em caldo 2YT contendo 34 μg/ml de cloretonicol. Quando um OD600nm de 0,3 foi alcançado, a expressão foi induzida com 0,3 mM IPTG. Após 16 h de incubação a 30° C, as células foram coletadas por centrifugação.

[0157] As células foram rompidas mecanicamente usando esferas de vidro. Extratos livres de células dos clones de expressão contendo concentrações de proteína iguais foram incubados em 100 μI de amostras de atividade de fucosiltransferase por 22 h a 37° C. As amostras continham GDP L- fucose a 5 mM, LNT ou LNnT a 5 mM e ATP a 1 mM em Tris/HCI a 20 mM, pH 7,4 com NaCl a 200 mM.

[0158] A formação de LNT ou LNnT fucosilados foi determinada por cromografia em camada delgada (TLC) usando placas TCL de sílica gel (Sílica Gel 60 F254 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha)). Uma mistura de butanol: acetona: ácido acético:H2O (35/35/7/23 (v/v/v/v)) foi usada como fase móvel. Para detecção das substâncias separadas, o TCL foi embebido com reagente Thymol (0,5 g de Thymol dissolvido em 95 ml de etanol, 5 ml de ácido sulfúrico adicionado) e aquecido.

[0159] A formação e a identificação do produto foram determinadas adicionalmente por espectrometria de massa. A análise da espectrometria de massa foi realizada por MRM (monitoramento de reação múltipla) usando um sistema de detecção de MS LC Triplo-Quadrupolo (Shimadzu LC-MS 8050) (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). Os íons precursores são selecionados e analisados no quadrupolo 1, a fragmentação ocorre na célula de colisão usando argônio como gás CID, a seleção de íons fragmento é realizada no quadrupolo

3. Transições selecionadas e energias de colisão (CE) para intermediários e metabólitos de produto final estão listadas na Tabela 5. A separação cromatográfica de variantes de lactose, LNT-II, LNT e LNFP após diluição da cultura sobrenadante, o extrato de reação de biocatálise livre de partículas ou bruto, respectivamente, 1:50 ou 1:100 com H2O (Grau LC/MS), foi realizada em uma coluna XBridge Amide HPLC (3,5 μm, 2,1 x 50 mm (Waters, EUA). Antes de aplicar para as análises LC/MS amostras foram preparadas por filtração (tamanho de poros de 0,22 μm) e limpeza por extração de fase sólida em uma matriz de troca iônica (Strata ABW, Phenomenex). O sistema HPLC consiste em um Shimadzu Nexera X2 SIL-30ACMP Autosampler executado a 8° C, uma bomba Shimadzu LC-20AD e um forno de coluna Shimadzu CTO-20AC que foi executado a 35° C (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). A fase móvel era composta de acetonitrila: H2O com 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio. Uma amostra de 1 μI foi injetada no instrumento; a corrida foi realizada por 5,00 min com uma vazão de 300 μI/min. Todos os metabólitos foram analisados por MRM no modo de ionização negativa de ESI. O espectrômetro de massa foi operado na resolução da unidade. A energia da colisão, Q1 e Q3 Pre Bias foram otimizadas para cada análise individualmente. Métodos de quantificação foram estabelecidos usando padrões comercialmente disponíveis (Carbosynth, Compton, UK e Elicityl, Crolles, França).

[0160] Variantes de LNFP com base na fucosilação do intermediário Lacto- N-tetraose (LNT) podem ser identificadas por separação cromatográfica (LNFP-I - 2,4 min; e LNFP-V - 2,5 min). Os tempos de retenção ligeiramente diferentes são causados pela diferença no tipo de fucosilação de LNT (fucosilação alfa-1,2 na galactose para LNFP-I; fucosilação alfa-1,4 na N-acetil-glucosamina para LNFP-II e fucosilação alfa-1,3 na glicose para LNFP-V). Além disso, eles podem ser identificados por seu padrão de transição (ver Tabela 5) devido a padrões específicos de fragmentação relacionados à posição da fucosilação.

[0161] Variantes de LNnFP com base na diferença na posição da fucosilação (fucosilação alfa-1,2 na galactose para LNnFP-I e fucosilação alfa-1,3 na N-acetilglucosamina para LNnFPIII e na glicose para LNnFP-V) do intermediário Lacto-N-neotetraose (LNnT) podem ser identificadas por separação cromatográfica (Fig. 2a). Além disso, eles podem ser identificados por seu padrão de transição (ver Tabela 5) devido a padrões específicos de fragmentação relacionados à posição da fucosilação.

[0162] LNnFP-III e LNnFP-V têm apenas uma ligeira diferença no tempo de retenção de 0,1 min. A análise das reações enzimáticas in vitro usando a α-1,3- fucosiltransferase FucT109 mostrou uma mistura de LNnFP-III e LNnFP-V (vide Fig. 2b).

[0163] A tabela 6 resume as fucosiltransferases testadas para produção de fucopentaose e os produtos detectados das reações biocatalíticas ao usar LNT e LNnT como substrato glicano, respectivamente. Transição 1 Transição 2 Transição 3 Metabólito CE CE CE [m/z QI>Q3] [m/z QI>Q3] [m/z QI>Q3] Lactose [M-H] 341,00>161,15 9 341,00>101,05 15 341,00>179,15 7 LNT-II [M-H] 544,20> 161,00 16 544,20>382,10 11 544,20>112,90 28 LNT [M-H] 706,20>202, 10 22 706,20>142,00 31 706,20>382,10 17

LNnT [M-H] 706,10>179,20 29 706,10>263,25 21 706,10>382,30 17 LNFP-I [M-H] 852,10>690,20 16 852,10>325,10 23 852,10>205,20 40 LNnFP-I [M-H] 852,30>409,20 29 852,30>427,20 22 852,30>205,15 49 LNFP-II [M-H] 852,30>348,20 23 852,30>163,05 40 852,30>288,20 29 LNnFP-III [M-H] 852,30>364, 10 21 852,30>179,10 35 852,30>161,15 30 LNFP-V [M-H] 852,30>544,20 15 852,30>202,15 29 852,30>142,15 44 LNnFP-V [M-H] 852,30>544,20 13 852,30>179,15 38 852,30>281,15 24 Tabela 5: Lista de transições para metabólitos analisadas para identificação e quantificação de intermediários e produtos finais. Exemplo 2: Desenvolvimento de uma cepa de produção de lacto-N-triose II de E. coli

[0164] Escherichia coli BL21 (DE3) foi usada para construir uma cepa produtora de lacto-N-triose II (LNT-2). A engenharia metabólica incluiu mutagênese e deleções de genes específicos, respectivamente e integrações genômicas de genes heterólogos. Os genes lacZ e araA foram inativados pela mutagênese usando incompatibilidade de oligonucleotídeos.

[0165] Deleções genômicas foram realizadas de acordo com o método de Datsenko e Wanner. Para evitar a degradação intracelular de N- acetilglucosamina, genes codificando N-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase (nagA) e glucosamina-6-fosfato deaminase (nagB) foram excluídos do genoma da cepa E. coli cepa BL21 (DE3). Além disso, genes wzxC-wcaJ foram excluídos. WcaJ codifica uma UDP-glicose: undecaprenilfosfatoglicose-1-fosfato transferase que cataliza a primeira etapa na síntese de ácido colânico. Além disso, os genes fucl e fucK, que codificam para isomerase L-fucose e L-fuculose quinase, respectivamente, foram removidos.

[0166] A integração genômica dos genes heterólogos foi realizada por transposição. Ou a transposase EZ-Tn5™ (Epicentre, USA) foi usada para integrar fragmentos lineares de DNA ou o mutante C9 hiperativo da transposase mariner Himar1 foi empregado para transposição.

Para produzir transpossomas EZ-Tn5, o gene de interesse junto com um marcador flanqueado de sítio FRT de resistência à antibióticos foi amplificado com iniciadores 1119 e 1120; o produto PCR resultante carregava em ambos os sítios, os sítios de reconhecimento de 19 bp Mosaic End para a transposase EZ- Tn5. Para integração usando construtos de expressão transposase Himar1 (operons) de interesse foram similarmente clonados juntamente com um marcador flanqueado no sítio FRT de resistência à antibióticos no vetor pEcomar.

O vetor pEcomar codifica o mutante C9 hiperativo da transposase mariner Himar1 sob o controle do promotor indutivo de arabinose ParaB O fragmento de expressão <Ptet-lacYFRT-aadA -FRT> (SEQ ID NO: 31) foi integrado usando a transposase EZ-Tn5. Após a integração bem-sucedida do gene para o importador de lactose LacY de E. coli K12 TG1 (nº de acesso ABN72583) o gene de resistência foi eliminado dos clones resistentes à estreptomicina pela recombinase de FLP codificada no plasmídeo.

A cepa obtida pelas modificações foi a cepa nº 534. O gene lgtA da N-acetilglucosamina glicosiltransferase de Neisseria meningitidis MC58 (nº de acesso NP_274923) foi códon-otimizado para expressão em E. coli e preparado sinteticamente pela síntese de genes.

Juntamente com o gene galT, codificando uma galactose-1-fosfato uridililtransferase de E. coli K-12 substr.

MG1655 (nº de acesso NP_415279) que foi obtido da mesma forma pela síntese de genes, lgtA foi inserido por transposição (SEQ ID NO: 32) usando plasmídeo pEcomar-lgtA-galT.

Para melhorar a síntese de novo da UDP-N-acetilglucosamina, genes codificando L- glutamina: D-fuctose-6-fosfato aminotransferase (glmS), fosfoglucosaminamutase de E. coli K-12 substr.

MG1655 (glmM) e N- acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferase/glucosamina-1-fosfato acetiltransferase (glmU) de E. coli K-12 substr. MG1655 (nº de acesso NP_418185, NP_417643, NP_418186, respectivamente) foram códon- otimizados e obtidos pela síntese de genes. O operon glmUM foi clonado sob o controle do promotor constitutivo de tetraciclina Ptet, enquanto glmS foi clonado sob o promotor constitutivo PT5. O cassete transposon <Ptet-glmUM- PT5-glmS-FRT-dhfr-FRT> (SEQ ID NO: 33), flanqueado pelo terminal invertido repete especificamente reconhecido pela transposase Himar1 de elemento semelhante à mariner foi inserido a partir de pEcomar-glmUM-glmS revelando uma cepa de produção de lacto-N-triose 2 (nº 724). A cepa E. coli BL21 (DE3) foi usada como cepa hospedeira inicial para o desenvolvimento da cepa de produção de E. coli. Exemplo 3: Modificação de uma cepa de E. coli para a triagem de fucosiltransferases in vivo para a produção de LNT fucosilado

[0167] O gene de 1,3-galactosiltransferase wbdO de Salmonella salamae (nº de acesso AAV34525) foi códon-otimizado para expressão em E. coli e preparado sinteticamente pela cooperação da GenScript. O gene galE foi amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12. Ambos os genes foram inseridos como transposon <Ptet-wbdOco-PT5-galE-FRT-cat-FRT> (SEQ ID NO: 34) na cepa nº 724 por transposição usando plasmídeo pEcomar-wbdOgalE. A cepa resultante é a nº 753. Para aumentar o fornecimento de GDP-fucose, a fucosequinase/L-Fucose-1-fosfato-guaniltransferase (fkp) bifuncional de Bacteroides fragilis (nº de acesso AY849806) convertendo L-fucose em GDP- fucose foi superexpressa na cepa E. coli BL21 (DE3). O gene fkp (originalmente amplificado a partir do DNA genômico de Bacteroides fragilis (ATCC 25285D)) juntamente com um promotor anterior Ptet foi fundido ao gene de resistência à gentamicina flanqueado no sítio lox usando emenda por sobreposição de PCR de extensão (SOE-PCR) e iniciadores 1119 e 1120; o transposon EZ-Tn5 < Ptet-

fkp-lox-aacC1-lox> (SEQ ID NO: 35) resultante foi integrado na cepa E. coli BL21 (DE3) mediada pela transposase EZ-Tn5™, obtendo a cepa nº 993. Alternativamente, para a síntese de novo de genes de GDP-L-fucose codificando fosfomanomutase (manB), manose-1-fosfato guanosiltransferase (manC), GDP-manose-4,6-dehidratase (gmd), e GDP-L-fucose sintase (wcaG) de E. coli K12 DH5 superexpressa na cepa E. coli BL21 (DE3); o operon manCB foi colocado sob controle do promotor constitutivo Ptet, o operon gmd, wcaG é transcrito a partir do promotor também constitutivo PT5. O cassete transposon <PtetmanCB-PT5-gmd, wcaG-FRT-aacC1-FRT> (SEQ ID NO: 36), incluindo o gene aacC1 conferindo uma resistência à gentamicina ao hospedeiro bacteriano foi flanqueado pelas repetições terminais invertidas especificamente reconhecidas pelo elemento similar a mariner transposase Himar1. Foi inserido no genoma da cepa nº 753 de pEcomar C9-manCBgmd, wcaG-aacC1, produzindo a cepa nº

1445. Exemplo 4: Manipulação de uma cepa E. coli para a triagem de fucosiltransferases in vivo para a produção de LNnT fucosilado

[0168] Os genes β-1,4-galactosiltransferase lgtB de Neisseria meningitides (nº de acesso AAF42257) foi otimizado para expressão em E. coli e preparado sinteticamente por cooperação da GenScript. Juntamente com um gene de resistência à tetraciclina flanqueado no sítio FRT foi inserido como transposon <PT5-lgtB-FRT-tetA-FRT> (SEQ ID NO: 37) na cepa nº 724 por transposição usando plasmídeo pEcomar-lgtB. O gene galE foi amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 e fundido pela SOE-PCR com o promotor Ptet e um gene de resistência à cloranfenicol. Usando iniciadores que geram sítios de reconhecimento de 19-bp Mosaic End para a transposase EZ-Tn5 (iniciador 2194 e 2235) o EZ-transposon <Ptet-galE-FRT-cat-FRT> foi construído para ser integrado na cepa de E. coli BL21 (DE3) para obter a cepa nº 1046.

Alternativamente, o gene β-1,4-galactosiltransferase lex1 de Aggregatibacter aphrophilus NJ8700 (nº de acesso YP_003008647), sinteticamente sintetizado e códon-otimizado para E. coli, foi integrado na cepa nº 724. O gene lex1 foi fundido ao gene malE, codificando a proteína de ligação à maltose (MBP), obtendo uma fusão N-terminal de MBP para Lex1. A fusão malE-lex1 foi integrada concomitantemente com galE (SEQ ID NO: 38), sob controle transcricional do promotor Ptet, por transposição usando pEcomar-malE-lex1- gale-cat. Usando fragmento-EZ EZ-Tn5<Ptet-fkp-FRT-aacC1-FRT> (vide Exemplo 3) o gene que codifica a fucosequinase/L-Fucose-1-fosfato-guaniltransferase (fkp) de Bacteroides fragilis foi cromossomicamente integrado na cepa nº 1046, produzindo a cepa nº 1076. Exemplo 5: Triagem in vivo de fucosiltransferases que fucosilando LNT e LNnT

[0169] Os meios de sais minerais (MS) utilizados para o cultivo de cepas para a síntese de fucopentaoses continham NH4H2PO4 a 7 g/L, K2HPO4 a 7 g/L, KOH a 2 g/L, ácido cítrico a 0,3 g/L, MgSO4 x 7H2O a 2 g/L, e CaCl2 x 6H2O a 0,015 g/L, complementado com solução de elemento traço a 1 ml/L (citrato férrico de amônio a 54,4 g/L, MnCl2 x 4H2O a 9,8 g/L, CoCl2 x 6H2O a 1,6 g/L, CuCl2 x 2H2O a 14 g/L, H3BO3 a 1,9 g/L, ZnSO4 x 7H2O a 9g/L, Na2MoO4 x 2H2O a 1,1 g/L, Na2SeO3 a 1,5 g/L, NiSO4 x 6H2O a 1,5 g/L).

[0170] Usando as cepas nº 993 ou nº 1445 para LNT, e nº 1076 para LNnT como substratos de FucT, respectivamente, os plasmídeos plNT-malE-fucT-zeo foram usados para produzir pentassacarídeos fucosilados in vivo. As cepas contendo plasmídeo foram cultivadas em 20 ml de meio de sal mineral (MS) com glicose a 2% como fonte de carbono, anhidrotetraciclina a 200 ng/ml como indutor de expressão gênica e os antibióticos ampicilina a 100 μg/ml e zeocina a 20 μg/ml. As bactérias foram cultivadas a 30° C em frascos de agitação perplexos para um OD600nm de 0,3 frente à lactose a 3 mM e L-fucose a 2 mM para derivados da cepa nº 993, e nº 076, e lactose a 3 mM para derivados da cepa nº 1445 foram adicionados.

[0171] Após 24 h a 72 h de cultivo, as células foram colhidas por centrifugação, lavadas uma vez em solução salina (0,9% (p/v) de NaCl), ressuspensas em 150 μI a 200 μI de solução salina (dependendo do tamanho do pellet) e rompidas mecanicamente usando esferas de vidro. O sobrenadante clarificado foi alcançado paletizando os detritos celulares. A formação de LNT fucosilado foi detectada analisando os metabólitos intracelulares por TLC, os resultados são resumidos na tabela 6. A fim de analisar a formação de LNFP-V por FucT109 de Bacteroides fragilis NTCT 9343 que é secretado na cultura sobrenadante, células intactas foram centrifugadas e o sobrenadante foi aplicado a uma análise TLC (Fig 4). A Fig. 4 retrata uma análise TLC de sobrenadantes da cultura de cepas de E. coli de produção de lacto-N- fucopentaose contendo plNT-malE-fucT109-zeo. LNFP-V é detectado no sobrenadante das cepas que expressam o gene de fusão malE-fucT109 por comparação da taxa de migração a purificação de um açúcar padrão. Açúcares de referência: faixa 1: lactose; faixa 2: LNT-2, faixa 3: LNT+LNFP-V, faixa 4: LNT; faixa 5: amostra sobrenadante da cepa nº 993, faixa 6: amostra sobrenadante da cepa nº 993 plNT-malE-fucT109-zeo, faixa 7: amostra sobrenadante da cepa nº 1445, faixa 8: amostra sobrenadante da cepa nº 1445 plNT-malE-fucT109- zeo. Exemplo 6: Síntese de LNFP-I em um processo fermentativo Integração de genes fucT em derivados de E. coli BL21 (DE3)

[0172] Usando a cepa nº 993 como hospedeiro, os genes codificando fucosiltransferases fucT41 (Gramella forsetii KT0803, nº de acesso WP_011708479), FucT 48 (Francisella philomiragia ssp. philomiragia ATCC

25015, nº de acesso EET21243. 1), FucT49 (Pseudogulbenkiania ferrooxidans, nº de acesso EEG10438. 1), FucT54 (Sideroxydans lithotrophicus ES-11, nº de acesso ADE13114. 1), FucT61 (Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505, nº de acesso EGl74693. 1), FucT66 (Roseovarius nubinhibens ISM, nº de acesso EAP78457. 1), e FucT69 (Thalassospira profundimaris WP0211, nº de acesso EkF09232. 1), foram cromossomicamente integrados. O gene de fusão malE- fucT juntamente com o promotor anterior Ptet e o gene da resistência à zeocina foram amplificados com iniciadores 1119 e 1120 usando plasmídeos plNT- malE-fucT-zeo como modelos; o transposon EZ Tn5 <Ptet-malE-fucT-zeo> foi inserido na cepa E. coli BL21 (DE3) usando a transposase EZ Tn5™.

[0173] As cepas que abrigam a integração malE-fucT foram cultivadas a 30° C em placas de 96 poços em 200 μI de meio MS contendo glicose a 2% e zeocin a 20 μg/ml com agitação. Após 24 h do cultivo, 50 μI das culturas foram transferidas para 400 μI de meio MS fresco com glicose a 2%, zeocin a 20 μg/ml, lactose a 3 mM e L-fucose a 2 mM. Após 48h do cultivo, os sobrenadantes das culturas foram analisados por LC/MS. Os resultados de diferentes genes FucT são mostrados na Fig. 5, em que as barras de erro apresentam desvio padrão de cinco culturas separadas da mesma cepa. A cepa expressando fucT61 (#1197) alcançou o maior título LNFP-I em comparação com os outros integrantes (Fig. 5). Modificação da importação de fucose para a produção de LNFP-I

[0174] A produção melhorada de LNFP-I pela cepa 1197 foi alcançada pela integração do principal facilitador transportador FucP de E. coli MG1655 (nº de acesso AIZ90162). FucP juntamente com um promotor anterior Ptet e um gene de resistência estreptomicina foi amplificado com iniciador 1119 e 1120 (<Ptet- fucP-FRT-aad1-FRT>, SEQ ID NO: 39) e cromossomicamente integrados pela transposição usando a transposase EZ Tn5™. A cepa com fucT61 e fucP foi nomeada como cepa nº 1772.

[0175] As cepas de crescimento nº 1197 e nº 1772 em placas de 96 poços no meio MS com glicose a 2% como fonte de carbono nas presença de lactose a 3 mM e L-fucose a 2 mM, a concentração de LNFP-I detectada no sobrenadante da cepa nº 1772 foi duas vezes maior do que o encontrado no sobrenadante da cepa nº 1197. Produção de LNFP-I por fermentação

[0176] A fermentação piloto da cepa nº 1772 foi realizada a 30° C em um fermentador de 3L contendo 1L de meio MS, glicose a 2% e NH4CI a 2,5 g/L foram adicionados ao meio antes da inoculação; a fermentação foi realizada sem a adição de antibióticos. O pH era mantido constantemente em 7,0 por titulação com de amônia a 10%. O fermentador foi semeado com culturas de frascos agitados a um OD600nm de 0. 1. Em um OD600nm de cerca de lactose a 10 1 mM e L-fucose a 1 mM foram adicionados; os dois substratos foram alimentados em doses de 1-2 mM repetidamente de acordo com o crescimento e taxas de produção. Quando a batelada de glicose a 2% foi esgotada, a glicose foi alimentada continuamente de um estoque de glicose a 50%. Após 87h de cultivo, a cultura atingiu um OD600nm de 185. Uma concentração de LNFP-I de 4,3 g/L foi determinada na cultura sobrenadante pela análise LC/MS. Lactose, LNT-2 e LNT foram encontrados como subprodutos do açúcar no sobrenadante (Fig. 6). O gráfico da Fig. 6 demonstra a produção de LNFP-I por E. coli (cepa #1772) em uma fermentação de 1L usando glicose como fonte de carbono. As concentrações de produtos foram medidas na cultura sobrenadante após 87h de fermentação. Foram detectados no sobrenadante, além do LNFP-I (4,3 g/L), lactose (13,11 g/L), LNT-2 (4,6 g/L) e LNT (1,1 g/L).

Tabela 6: Fucosiltransferases analisadas neste estudo. As atividades de fucosiltransferase foram determinadas usando LNT e LNnT como substratos glicanos. A formação de fucopentaoses foi determinada tanto in vitro, quanto in vivo, usando a transformação de celula inteira. A identificação do fucopentaose foi realizada por LC/MS. + designa a detecção de um produto de reação, - designa nenhuma atividade, n. t. significa não testada. Degradação dos subprodutos

[0177] Para facilitar a separação do produto desejado LNFP-I dos subprodutos lactose, LNT-2 e LNT, esses açúcares podem ser digeridos enzimaticamente e os produtos de degradação resultantes são metabolizados por cepas de E. coli.

[0178] β-1,4 galactosidases, por exemplo, Lacz de E. coli degrada eficientemente a lactose a D-glicose e D-galactose. Estes dois monossacarídeos são metabolizados por cepas de E. coli que expressam um gal-operon funcional.

[0179] A β-N-acetilhexosaminidase Bbhl de Bifidobacterium bifidum J CM1254 hidrolisa LNT-2 altamente específico e eficiente para N- acetilglucosamina e lactose.

[0180] As β-1,3-galactosidases Bga42A de Bifidobacterium longum subsp. Infantis hidrolises LNT especificamente para galactose e LNT-2. Modificação de uma cepa E. coli para degradação de subprodutos

[0181] Escherichia coli BL21 (DE3) nº 534 foi usada para construir uma cepa de degradação, a fim de recuperar LNFP-I após a produção fermentativa do sobrenadante sem subprodutos de açúcar.

[0182] Um operon galETKM funcional juntamente com seu promotor natural foi amplificado a partir de DNA genômico de E. coli K12 usando oligonucleotídeos 6473 e 6474, produzindo um fragmento com sítios de reconhecimento de 5' 19-bp Mosaic End para a transposase EZ-Tn5. O fragmento <galETKM> (SEQ ID NO: 40) foi integrado ao genoma da cepa E. coli mediada pela transposase EZ-Tn5™. Clones com integrações corretas foram selecionados em ágar MacConcey (Difeo, Sparks, EUA) contendo 1% de galactose, eles apareceram como colônias vermelhas após 36 h de incubação a 37° C.

[0183] O gene que codifica a β-N-acetilhexosaminidase Bbhl de Bifidobacterium bifidum JCM1254 foi sintetizado sinteticamente e códon- otimizado para a expressão em E. coli. Bbhl sob controle transcricional do promotor Ptet e um gene conferindo ao hospedeiro uma resistência à zeocina (<Ptet-bbhl-zeo> (SEQ ID NO: 41) foi integrado a partir de plasmídeo pEcomar- bbhl-zeo mediado pela transposase Himar1.

[0184] Para garantir a atividade de β-1,4-galactosidases total, lacZ de E. coli BL21(DE3) (nº de acesso AM946981) foi clonado sob o controle transcricional do promotor constitutivo Ptet. Juntamente com o gene de resistência à gentamicina aacC1 o fragmento <Ptet-lacZ-FRTaacC1-FRT> (SEQ ID NO: 42) foi amplificado com iniciadores 1119 e 1120 e integrado pela transposição EZ Tn5, obtendo a cepa nº 1369.

[0185] A β-1,3-galactosidases Bga42A de Bifidobacterium longum subsp. infantis foi códon-otimizada para E. coli e sintetizada sinteticamente. Bga42A sob controle transcricional do promotor Ptet e o gene cat conferindo ao hospedeiro uma resistência a cloramfenicol (<Ptet-bga42A-cat>(SEQ ID NO: 43) foi integrado usando a transposase EZTn5. A cepa que expressa todos os três genes de hidrolase é designada como cepa nº 1886.

[0186] A degradação da lactose e LNT-2 foi alcançado de forma eficiente, adicionando uma cultura da cepa nº 1886 a uma LNFP-1 produzindo cultura da cepa nº 1772. Para demonstrar a degradação do LNT-2 e lactose por Lacz e

Bbhl, uma cultura de cepa nº 1886, cultivada em meio MS com glicose como fonte de carbono foi adicionada em uma razão de 1:40 para uma cultura de cepa nº 1772, cultivada em meio MS com glicose na presença de lactose e L- fucose para a produção de LNFP-1 .

[0187] A Fig. 7 demonstra degradação da lactose e LNT-2 por hidrolases sendo expressas na cepa de E. coli nº 1886. Uma cultura de crescimento da cepa de E. coli nº 1886 foi adicionada a uma cultura da cepa de E. coli nº 1772 que produziu LNFP-1 como produto principal e LNT, e LNT-2 como subprodutos. LNT-2 e lactose estavam quase completamente esgotados no sobrenadante da cultura dentro de 10 h de incubação. Os metabólitos são marcados como, círculos: lactose, quadrados: LNT-2, triângulos: LNFP-1, cruz: LNT. Dentro de 10 h, LNT-2 e lactose foram degradados para quase completa depleção, enquanto LNFP-1 e LNT não foram degradados pelas células da nº

1886. Uma vez que a cepa nº 1886 contém um ativo galETKM-operon os monossacarídeos glicose e galactose resultantes de hidrolises de lactose são completamente metabolizados.

[0188] A hidrolase Bga42A não está ativa extracelularmente. No entanto, quando as células de cepa nº 1886, cultivadas no meio MS com glicose como fonte de carbono, foram rompidas mecanicamente, a atividade hidrolítica de Bga42A para LNT foi demonstrada como mostrado na Fig. 8 exibindo uma imagem de um cromatograma em camada delgada. Amostras contendo lisato celular da cepa de E. coli nº 1886 (faixa 1: sem enzima, faixas 2 a 6: 100 μg de proteína) e 5 mM LNT em um tampão de fosfato de sódio de pH 7 a 20 mM foram incubados durante um período de tempo de até 120 minutos (faixa 1: 120 min, faixa 2: 0 min, faixa 3: 15 min, faixa 4: 30 min, faixa 5: 60 min, faixa 6: 120 min) a 30° C e antes que a enzima fosse inativada pelo aquecimento a 95° C por 5 minutos.

[0189] Na Fig. 8 são mostrados hidrólises de LNT e os produtos de degradação resultantes LNT-2 e lactose em extrato livre de células da cepa nº

1886.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um oligossacarídeo fucosilado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) prover pelo menos uma célula geneticamente modificada que foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga, em que a referida fucosiltransferase heteróloga é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, a referida molécula aceptora sendo uma lactotetraose; b) cultivar pelo menos uma célula geneticamente modificada na presença de pelo menos uma fonte de carbono, e sob condições adequadas para pelo menos uma célula geneticamente modificada transferir o resíduo de fucose do substrato doador para a molécula aceptora; e c) opcionalmente recuperar o oligossacarídeo fucosilado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula aceptora é selecionada a partir do grupo que consiste em LNT e LNnT.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a fucosiltransferase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em polipeptídeos representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, variantes funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fucosiltransferase heteróloga é codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo: i) uma sequência de nucleotídeos como representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15; ii) uma sequência de nucleotídeos que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% com uma das sequências de nucleotídeos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15, preferencialmente em toda a extensão da sequência; iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; v) uma sequência de nucleotídeos codificando um fragmento funcional de qualquer um dos polipeptídeos de acordo com iii) e iv); ou vi) em que a molécula de ácido nucleico hibridiza a uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com i), ii), iii), iv) ou v) sob condições de estringência.

5. Célula geneticamente modificada para produzir um oligossacarídeo fucosilado / para uso em um método definido na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula foi geneticamente modificada para expressar uma fucosiltransferase heteróloga, em que a referida fucosiltransferase heteróloga é capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador a uma molécula aceptora, a referida molécula aceptora sendo uma lactotetraose.

6. Célula geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a fucosiltransferase heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em polipeptídeos como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, variantes funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30, e variantes funcionais dos fragmentos funcionais dos polipeptídeos, como representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30.

7. Célula geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a fucosiltransferase heteróloga é codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo: i) uma sequência de nucleotídeos como representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15; ii) uma sequência de nucleotídeos que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% com uma das sequências de nucleotídeos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15, preferencialmente em toda a extensão da sequência; iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; iv) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos como representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 30; v) uma sequência de nucleotídeos codificando um fragmento funcional de qualquer um dos polipeptídeos de acordo com iii) e iv); ou vi) em que a molécula de ácido nucleico hibridiza a uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com i), ii), iii), iv) ou v) sob condições de estringência.

8. Célula geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a célula foi geneticamente modificada para compreender uma maior capacidade de produção de GDP-fucose intracelular em comparação com a célula antes de ser geneticamente modificada, preferencialmente em que a célula foi geneticamente modificada i) para expressar um gene codificando uma fucosequinase/L-fucose-1-fosfato- guaniltransferase bifuncional catalisando a formação da GDP-fucose a partir da L-fucose, ou ii) para superexpressar pelo menos um dos genes codificando fosfomanomutase, mannose-1-fosfato guanosiltransferase, GDP-manose-4,6- desidratase e GDP-L-fucose sintase.

9. Célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que a célula foi geneticamente modificada para possuir uma maior importação de L-fucose exógena através de sua membrana celular, preferencialmente em que a célula também foi geneticamente modificada para expressar ou superexpressar - em comparação com a célula progenitora antes de ser geneticamente modificada - uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de nucleotídeos que codificam o principal transportador facilitador FucP de E. coli., sequências de nucleotídeos que codificam variantes funcionais do principal transportador facilitador FucP de E. coli, sequências de nucleotídeos que codificam fragmentos funcionais do principal transportador facilitador FucP de E. coli, e sequência de nucleotídeos que codificam variantes funcionais dos fragmentos funcionais do principal transportador facilitador FucP de E. coli.

10. Célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a célula também foi geneticamente modificada para prevenir a depleção do conjunto (pool) intracelular de GDP-fucose da célula, preferencialmente na expressão do gene da célula codificando WcaJ, que catalisa a primeira etapa na síntese de ácido colônico, é reduzida ou inativada, ou em que a sequência de nucleotídeos do gene codificando WcaJ foi alterada de tal forma que um polipeptídeo enzimaticamente inativo é codificado pelo gene WcaJ alterado.

11. Célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizada pelo fato de que a célula também foi geneticamente modificada em que os genes fucl e/ou fucK, que codificam a isomerase L-fucose e a quinase L-fuculose, respectivamente, são excluídos, a sequência de nucleotídeos de fucl e/ou fucK é alterada para inativar irreversivelmente a atividade enzimática do(s) polipeptídeo(s) correspondente(s), ou em que a expressão de fucl e/ou fucK é reduzida.

12. Célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizada pelo fato de que a célula também foi geneticamente modificada para possuir uma maior capacidade de sintetizar um ou mais de ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-N-acetilglucosamina e UDP- galactose, em comparação com a célula antes de ser geneticamente modificada, em que preferencialmente a referida maior capacidade de produção de UDP-N- acetilglucosamina, UDP-galactose e mais preferencialmente, ácido CMP-N- acetilneuramínico compreende a superexpressão de um ou mais genes codificando proteínas que compreendem as seguintes atividades para uma: L- glutamina: D-frutose-6-fosfato aminotransferase, N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferase/glucosamina-1-fosfato acetil transferase, fosfoglucosamina mutase, UDP-galactose-4'-epimerase, fosfoglucomutase, glicose-1-fosfato uridililtransferase, glucosamina-6-fosfato acetiltransferase, N-acetilglucosamina 2-epimerase, UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase, fosfoenolpiruvato sintetase, ácido siálico sintase, ácido siálico permease, CMP-ácido siálico sintetase.

13. Célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) opcionalmente uma β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferase, (ii) uma β-1,3-galactosiltransferase ou uma β-1,4-galactosiltransferase; e (iii) uma α-1,2- e/ou α-1,3-fucosiltransferase como glicosiltransferase.

14. Método para produzir um oligossacarídeo fucosilado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) prover uma fucosiltransferase em uma mistura de reação, a fucosiltransferase sendo capaz de transferir um resíduo de fucose de um substrato doador para uma molécula aceptora, a referida molécula aceptora sendo uma lactotetraose; e b) colocar em contato a referida fucosiltransferase com um substrato doador compreendendo um resíduo de fucose e uma molécula aceptora, em que a molécula aceptora é uma lactotetraose.

15. Uso de um oligossacarídeo fucosilado produzido por um método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 14, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição nutricional, preferencialmente uma fórmula infantil.

16. Composição nutricional, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um oligossacarídeo fucosilado, em que o referido pelo menos um oligossacarídeo fucosilado foi produzido por um método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 14.

17. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.