CN115927131A

CN115927131A - 可分泌和高产果糖的聚球藻yd03及其制备方法

Info

Publication number: CN115927131A
Application number: CN202210460804.4A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 孙佳慧; 但玉
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明涉及一种具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻YD03，以PCC7002为出发藻株，敲除果糖激酶和磷酸甘油葡糖苷合酶，并过表达蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶。通过敲除果糖激酶，可使藻株具备高产果糖并将果糖转运至胞外的能力，通过进一步的遗传改造，可大幅提高工程藻株的果糖产量。在培养一定时间后，最高可在培养体系中产生6.3g/L的果糖含量。并且由于果糖基本被分泌到细胞外，可更容易地实现从培养液中提取果糖。因此，本发明实现了在单平台上以太阳能为驱动将二氧化碳和水直接转化为果糖，同时达到固碳减排和生产果糖的效果，提升了蓝细菌光驱固碳产糖技术的工程化应用潜力。

Description

可分泌和高产果糖的聚球藻YD03及其制备方法

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，更特别地，涉及一种具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻YD03及其制备方法。

背景技术

果糖在食品、医药以及化工等行业广泛应用，尤其可用于对糖尿病、肥胖症、龋齿等疾病的预防。目前，市场上的果糖产品有果葡糖浆、结晶果糖两种形式。果葡糖浆的生产是以淀粉为主要原料，通过化学催化合成路线，首先利用α-淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖，再利用葡萄糖异构酶，将葡萄糖转化为含有42％果糖和58％葡萄糖的果葡糖浆。结晶果糖(纯度大于97％的果糖)，是细小的粉末状晶体，其生产也是以果葡糖浆为基础，从葡萄糖-果糖混合体系中进行产物提取，需经过色谱分离、富集、浓缩、结晶、筛分等一系列操作进行制备，生产工艺繁琐复杂、转化率较低、耗粮较大，且对设备要求较高。因此，开发高效、绿色的新型果糖合成技术对于降低果糖产业的经济和环境成本，提高产品竞争力和市场接受度具有重要意义。

蓝细菌是一类进行植物型放氧光合作用的原核微生物，相较于微藻和高等植物，蓝细菌具有结构简单、生长迅速、遗传改造便捷等优势，因此成为极具潜力的生物能源和生物基化学品光合合成平台。但是，目前研究中尚未发现有潜力的高果糖含量蓝细菌，也没有发现蓝细菌具有向外分泌果糖的能力。Niederholtmeyer等通过向聚球藻PCC7942中转入己糖转运蛋白Glf基因，形成果糖分泌通路，使得该菌能够向外分泌果糖，但是即便在最优条件下，其产生的胞外果糖含量最高只有28.8mg/L，且果糖水平随着细胞密度的增加而下降，达不到工业化生产的要求(Niederholtmeyer,H.,Wolfstadter,B.T.,Savage,D.F.,Silver,P.A.,and Way,J.C.,Engineering cyanobacteria to synthesize and exporthydrophilic products.Appl.Environ.Microbiol.,2010.76(11):p.3462-3466)。

因此，需要一种新的具有高果糖产量并将果糖分泌到细胞外的蓝细菌。

发明内容

我们在对聚球藻PCC7002的研究过程中发现，当该藻的果糖激酶被敲除后，突变株出乎意料地表现出极高的果糖产量，并且这些果糖基本上均被分泌到胞外，使得培养体系中果糖含量高达数百毫克每升。在此基础上，我们进行了进一步的代谢工程改造该藻，得到了一株具有超高果糖产量的工程藻株YD03。

基于上述工作，本发明提供了一种制备具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻的方法，以聚球藻PCC7002为出发藻株，敲除所述出发藻株的果糖激酶。优选地，还敲除了磷酸甘油葡糖苷合酶，并在所述出发藻株中过表达蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶。通过敲除果糖激酶，可使聚球藻PCC7002具备高产果糖并将果糖转运至胞外的能力，通过过表达蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶并敲除磷酸甘油葡糖苷合酶，可大幅提高工程藻株的果糖产量。

在一个具体实施方案中，所述果糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个具体实施方案中，所述磷酸甘油葡糖苷合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一个具体实施方案中，所述蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一个具体实施方案中，所述蔗糖磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一个具体实施方案中，所述蔗糖磷酸磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

以上几个具体实施方案中，虽然列出了蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶的具体的氨基酸序列和核酸序列，但是，本领域技术人员在阅读了本申请的内容并在领会本申请的精神后，可在现有和将有的基因库里面选择适宜的氨基酸或核酸序列，用于在藻株中过表达，以提高藻株的果糖产量和产率。

在一个具体实施方案中，上述基因的过表达通过强启动子驱动，形成基因表达框。强启动子可在现有或将有的启动子库里面进行选择，只需要选择的启动子可在PCC7002细胞中进行强表达即可。例如，启动子可选择cpcB1启动子、cpcB560启动子、rbcL启动子等组成型强启动子，也可选择lac启动子、trc启动子等诱导型强启动子。

上述基因表达框可插入到PCC7002的基因组DNA中，例如，可插入到一些功能基因中或插入到无功能的中性平台(是指从基因组中鉴定的一些插入或缺失突变后不产生任何表型的位点)中。上述基因表达框也可以独立的可复制形式存在，例如，存在于在PCC7002中的可复制的质粒上。上述基因表达框可分别构成独立的操纵子，也可在一个操纵子下形成多顺反子。

本发明还提供了一种通过上述方法制备的具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻。

本发明还提供了一种使用上述聚球藻生产果糖的方法。

在一个优选实施方案中，培养所述聚球藻的培养基优选为MAD2培养基。在我们的研究过程中，MAD2培养基不仅具有较好的藻类培养效果，我们还意外地发现，该培养基能够比其他培养基导致显著更高的果糖产量。

在一个具体实施方案中，培养条件如下：培养温度为25-35℃，光照为200-350μmolphotons m^-2s^-1，通气培养，通入的气体为CO₂与空气的混合气体。

本发明以聚球藻PCC7002为出发藻株构建了一株具有高果糖产量的工程藻YD03。该藻株在培养一定时间后，最高可在培养物中产生6.3g/L的果糖含量，在培养体系中果糖占总糖的99.48％,纯度极高。并且由于果糖基本均被分泌到细胞外，可更容易地实现从培养物中提取果糖。因此，本发明实现了在单平台上以太阳能为驱动将二氧化碳和水直接转化为果糖，同时达到固碳减排和生产果糖的效果，提升了蓝细菌光驱固碳产糖技术的工程化应用潜力。

附图说明

图1为pYD08的质粒图谱。

图2为pYD01的质粒图谱。

图3为pYD05的质粒图谱。

图4为对YD08的果糖激酶敲除位点的PCR扩增产物的电泳照片。

图5为对藻株YD03的相关突变位点的检测结果，其中，左图为果糖激酶位点的PCR扩增产物的电泳照片；右图为GgpS位点的PCR扩增产物的电泳照片。

图6为糖类标样的HPLC出峰曲线。

图7为野生型PCC7002(WT)和果糖激酶敲除株YD08的培养生长曲线(A)、胞外果糖含量(B)统计图。

图8为YD03在不同培养基和光强下的培养生长曲线(A)、胞外果糖含量(B)统计图、胞内果糖含量(C)统计图和胞外葡萄糖含量(D)的统计图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、质粒构建

1.1构建PCC7002果糖激酶敲除质粒pYD08：从PCC7002基因组中找到其果糖激酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示)，及其上下游序列。根据这些序列设计引物，以PCC7002基因组为模板扩增得到果糖激酶上游同源臂(FK-上游)和下游同源臂(FK-下游)，在中间插入卡那霉素抗性片段，得到果糖激酶敲除质粒pYD08，质粒图谱如图1所示。

1.2构建敲除Ggps基因并原位过表达Ams基因的质粒pYD01：从PCC7002基因组中找到其磷酸甘油葡糖苷合酶基因(GgpS，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸序列如SEQ IDNO.4所示)，及其上下游序列。根据这些序列设计引物，以PCC7002基因组为模板扩增获得磷酸甘油葡糖苷合酶上游同源臂(ggsp-上游)和下游同源臂(ggsp-下游)。获得启动子P_rbcl(SEQ ID NO.5)和蔗糖水解酶基因(Ams，氨基酸序列SEQ ID NO.6所示，核酸序列如SEQ IDNO.7所示)，以及壮观霉素抗性片段，将P_rbcl和Ams基因连接成表达框，插在GgpS基因的上游同源臂和下游同源臂之间，抗性片段为筛选标记，整合到pUC19骨架上，得到质粒pYD01，质粒图谱如图2所示。

1.3构建敲除果糖激酶基因并原位过表达来自PCC6803的Sps-Spp的质粒pYD05：以PCC6803的基因组为模板扩增蔗糖磷酸合酶基因片段Sps(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.9所示)和蔗糖磷酸磷酸化酶Spp(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，核酸序列如SEQ ID NO.11所示)。将启动子P_rbcl与PCC6803来源的Sps基因和Spp基因串联成表达框，并将该表达框插入到果糖激酶的上游同源臂和下游同源臂之间，以卡那霉素抗性片段为筛选标记，整合到pUC19骨架上，得到质粒pYD05，质粒图谱如图3所示。

2、PCC7002转基因藻株的获得

向PCC7002中转入质粒pYD08得到藻株YD08。方法如下：

1)取1mL对数生长期的(OD₇₃₀约为1)的聚球藻PCC7002，5000g离心5min收集细胞，并用新鲜的A+培养基清洗细胞2次，弃上清，细胞沉淀重悬于250μL无抗A+培养基中；

A+培养基：由18g L^-1NaCl，0.6g L^-1KCl，1g L^-1NaNO₃，5g L^-1MgSO₄-7H₂O，0.3675gL^-1CaCl₂-2H₂O，2.86mg L^-1H₃BO₃，0.222mg L^-1ZnSO₄-7H₂O，0.079mg L^-1CuSO₄-5H₂O，1.81mg L^-1MnCl₂-4H₂O，1.26mg L^-1Na₂MoO₄-2H₂O，0.0403mg L^-1CoCl₂-6H₂O,0.004g L^-1FeCl₃-6H₂O，0.239mg L^-1NaVO₃，1.04g L^-1Tris-HCl(pH8.2)，0.05g L^-1KH₂PO₄，0.004g L^-1V_B12组成。

2)向上述重悬后的藻液中加入3000ng的质粒：质粒pYD08(浓度为100μg/mL)；

3)将加入质粒后的EP管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；

4)将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的A+平板(卡那霉素：50μg/mL)，30℃，100μmol photons m^-2s^-1条件下培养，5-7天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的A+平板(卡那霉素：50μg/mL)划线；通过筛选得到分离完全的藻株。

向PCC7002转入质粒pYD01和pYD05，得到藻株YD03。方法如下：

2)向上述重悬后的藻液中各加入3000ng的质粒：质粒pYD01和质粒pYD05(浓度为100μg/mL)；

3)将加入质粒后的EP管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；

4)将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的A+平板(壮观霉素：50μg/mL，卡那霉素：50μg/mL)，30℃，100μmol photons m^-2s^-1条件下培养，5-7天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的A+平板(壮观霉素：50μg/mL，卡那霉素：50μg/mL)划线；通过筛选得到分离完全的藻株。

如图4所示，YD08中果糖激酶被完全敲除。如图5所示，YD03中，果糖激酶被敲除，并在该位点过表达集胞藻PCC6803来源的Sps、Spp基因；GgpS基因被完全敲除，并在该位点过表达Ams基因。

3、YD08合成并分泌果糖

使用柱式光反应器，为3cm直径、20cm高的普通玻璃材质的圆底玻璃管；反应器总装液量可达100mL，实验过程中装液65mL。种子液为处于对数生长期的A+培养物(补充有相应抗生素：卡那霉素，50μg/mL)，初始接种浓度OD₇₃₀为1，培养基为A+，在30℃，200μmolphotons m^-2s^-1，通入混合气(3％CO₂+97％空气)的条件下进行培养。

对YD08进行柱式光照培养过程中监测菌株的生长，并绘制菌株生长曲线，同时对胞外果糖含量进行定量分析。

果糖含量分析使用HPLC法：取1mL培养过程中的工程菌株的藻液，13000rpm离心10min，将离心后的上清移入另一干净的1.5mL的EP管中，用于测定胞外果糖含量；对胞外提取的果糖稀释后利用液相色谱检测(使用安捷伦高效液相色谱仪1260，配备示差检测器，使用HPX-87H糖分析柱，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.5mL/min)，经预实验显示，果糖在20min附近出峰(图6)。

结果如图7所示，野生型PCC7002和果糖激酶敲除株YD08，在A+培养基和200μmolphotons m^-2s^-1的条件下培养得到的生长曲线相差不大。但是野生型不产生胞外果糖，而YD08藻株培养至第八天时胞外果糖浓度高达635mg/L。可见，果糖激酶的敲除不仅意外地大幅提高了聚球藻PCC7002的果糖产量，同时，还激活了果糖向细胞外分泌的通路。

4、YD03合成并分泌果糖

使用柱式光反应器，为3cm直径、20cm高的普通玻璃材质的圆底玻璃管；反应器总装液量可达100mL，实验过程中装液65mL。种子液为处于对数生长期的A+培养物(补充有相应抗生素：壮观霉素，50μg/mL；卡那霉素，50μg/mL)，初始接种浓度OD₇₃₀为1，培养基分别为A+和MAD2(补充有相应抗生素：壮观霉素，50μg/mL；卡那霉素，50μg/mL)，在25-35℃，200μmolphotons m^-2s^-1或350μmol photons m^-2s^-1，通入混合气(3％CO₂+97％空气)的条件下进行培养。果糖检测方法同上文。

MAD2培养基：由18g L^-1NaCl，0.6g L^-1KCl，16.32g L^-1NaNO₃，5g L^-1MgSO₄-7H₂O，0.3675g L^-1CaCl₂-2H₂O，8.53mg L^-1H₃BO₃，0.614mg L^-1ZnSO₄-7H₂O，0.237mg L^-1CuSO₄-5H₂O，5.43mg L^-1MnCl₂-4H₂O，3.78mg L^-1Na₂MoO₄-2H₂O，0.1209mg L^-1CoCl₂-6H₂O,0.1297g L^- ¹FeCl₃-6H₂O，0.239g L^-1NaVO₃，1.04g L^-1Tris-HCl(pH8.2)，0.3264g L^-1KH₂PO₄，0.012g L^- ¹V_B12组成。

对YD03进行柱式光照培养过程中监测菌株的生长，并绘制菌株生长曲线，同时对胞外果糖含量进行定量分析。

结果如图8所示，使用A+培养基对YD03的培养无法实现较好的培养效果，无论在200μmol photons m^-2s^-1还是350μmol photons m^-2s^-1的光照条件下，YD03的生长均受到抑制。尽管如此，在该培养基培养6天后的培养物中仍然能检测到高达2000mg/L以上的果糖浓度。YD03在MAD2培养基中生长良好，在350μmol photons m^-2s^-1下培养16天后，胞外果糖含量可达高达6.3g/L。

此外，培养14天后对350μmol photons m^-2s^-1、MAD2培养基条件下的藻株进行了胞内果糖、胞外葡萄糖检测。该条件下，藻株的OD₇₃₀为17.36，胞外分泌果糖量为5670mg/L(约为326.61mg/L/OD₇₃₀)，胞内果糖量为5.93mg/L/OD₇₃₀，胞外分泌葡萄糖量为29.86mg/L。经计算，果糖的胞外分泌率为98.21％。

该结果显示，通过遗传操作敲除果糖激酶、强化PCC7002中的果糖生产通路(采用强启动子驱动蔗糖水解酶Ams以及集胞藻PCC6803来源的蔗糖磷酸合酶基因Sps和蔗糖磷酸磷酸化酶Spp)并阻断蔗糖竞争途径(敲除GgpS)，得到了具有超高果糖产量的藻株YD03，对培养条件进行优化后，YD03胞外果糖含量可提高至野生型株系的总果糖含量的数千倍，相对于果糖激酶敲除株，也提高了约10倍，高达6.3g/L。并且，培养体系中果糖含量占总糖含量的99.48％，纯度极高，非常适用于果糖的工业化生产。

需要说明的是，在本发明实施例中出于举例说明的目的，我们描述了用具体的方法对聚球藻PCC7002进行遗传操作，包括使用了具体的方法、具体的筛选标记，对过表达的果糖生产通路上的酶的序列以及过表达片段插入的具体位置进行了具体限定。但是，这些举例不应用来限制本发明的范围。本领域技术人员在阅读了本申请披露的内容并领会本申请的精神之后，可以选择现有或将有的遗传操作方法、基因序列、抗性片段以及适宜的插入位点，只需敲除PCC7002中的果糖激酶以及过表达合适的蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶即可得到这样的高果糖产量藻株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 可分泌和高产果糖的聚球藻YD03及其制备方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 1

Met Ala Lys Asn Ile Val Ile Phe Gly Glu Val Leu Trp Asp Ile Phe

1 5 10 15

Pro Asp Asn Asp Arg Lys Leu Gly Gly Ala Pro Phe Asn Val Ala Trp

20 25 30

His Leu Lys Ala Phe Gly Ala Asn Pro Leu Leu Ile Ser Arg Ile Gly

35 40 45

Thr Asp Asp Leu Gly Ala Thr Ile Gln Thr Lys Met Gln Ala Trp Gln

50 55 60

Met Thr Leu Ala Gly Leu Gln Ile Asp Lys Ile His Pro Thr Gly Thr

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Leu Glu Lys Gly Gln Pro Gln Tyr Glu Ile Thr Ala

85 90 95

Asp Cys Ala Tyr Asp Phe Ile Asn Ser Gln Gln Phe Pro Ile Leu Glu

100 105 110

Asp Lys Phe Trp Leu Tyr His Gly Ser Leu Ala Leu Arg Asn Ala Val

115 120 125

Ser Gln Ala Ser Phe Arg Ala Leu Gln Gln Arg Ala Asp Gln Ile Phe

130 135 140

Phe Asp Val Asn Leu Arg Gln Pro Trp Trp Thr Leu Glu Thr Ile Ala

145 150 155 160

Ser Ala Leu Ala Ala Ser Gln Tyr Val Lys Leu Asn Thr Glu Glu Leu

165 170 175

Arg Leu Leu Thr Pro Glu Phe Ser Ser Thr Asn Leu Ala Ile Asp His

180 185 190

Leu Leu Asn Gln Asn Ser Leu Arg His Ile Ile Leu Thr Ala Gly Glu

195 200 205

Ala Gly Ala Ser Leu Tyr Thr Gln Gly Asp Arg Gln Gln Ile Ser Pro

210 215 220

Leu Gln Asn Thr Thr Val Val Asp Thr Val Gly Ala Gly Asp Ala Phe

225 230 235 240

Cys Ser Ile Cys Leu Leu Gly Leu Met Asn Asp Trp Pro Ser Val Leu

245 250 255

Thr Leu Glu Arg Ala Gln Ala Phe Ala Ser Ala Ile Val Gly Ile Arg

260 265 270

Gly Ala Val Ser Glu Asp Pro Arg Phe Tyr Gln Pro Phe Ile Gln Ala

275 280 285

Trp Arg Leu

290

<210> 2

<211> 876

<212> DNA

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 2

atggcaaaaa atattgtaat ttttggtgaa gtgttgtggg atatttttcc cgacaatgat 60

agaaagctgg ggggagctcc cttcaatgtg gcctggcatc taaaggcgtt tggggccaat 120

cctttgttaa tttctcggat tggaaccgat gatcttgggg caacaattca aaccaaaatg 180

caggcttggc agatgaccct tgctggtctt caaatagata aaattcaccc caccggaacc 240

gttaaagtca ccctggaaaa gggtcaaccc caatatgaaa tcactgccga ctgcgcctat 300

gattttatta atagtcaaca gtttcccata ttagaagata aattttggct ttaccatggc 360

agtcttgccc ttagaaatgc tgtttctcaa gccagtttta gggcactaca gcaacgagca 420

gaccagattt tttttgatgt gaatttacgt caaccctggt ggacattaga aactattgct 480

tctgccctag ctgccagtca atatgtgaaa ttaaataccg aagaattaag gttattaaca 540

cctgagtttt cctcaactaa ccttgccatc gatcatttat tgaatcagaa ttcgctacgg 600

catattatcc taacagcggg agaagccggt gcgagtctct acacccaagg cgatcgccaa 660

caaatttctc ctctccaaaa taccactgtg gttgatacgg ttggagctgg ggatgctttt 720

tgtagtattt gcttattggg gcttatgaat gattggccat ctgtcctaac cctagaacgg 780

gcgcaagcct ttgccagcgc tattgtgggg attcgtggtg cggtaagtga agatccccga 840

ttttatcaac cttttattca ggcctggcgg ttataa 876

<210> 3

<211> 500

<212> PRT

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 3

Met Lys Ser Ser Leu Val Ile Leu Tyr His Arg Glu Pro Tyr Asp Glu

1 5 10 15

Val Arg Glu Asn Gly Lys Thr Phe Tyr Arg Asp Lys Thr Ser Pro Asn

20 25 30

Gly Ile Met Pro Thr Leu Lys Ser Phe Phe Ala Asn Ala Glu Gln Ser

35 40 45

Thr Trp Val Ala Trp Lys Gln Ile Ser Gly Lys Gln Gln Glu Asn Phe

50 55 60

Gln Ala Lys Met Ala Phe Pro Gly Gln Glu Asn Ser Val Val His Arg

65 70 75 80

Ile Pro Leu Ser Ala Asp Gln Val Lys Asn Phe Tyr His Ile Thr Ser

85 90 95

Lys Glu Ala Phe Trp Pro Ile Leu His Ser Phe Pro Trp Gln Phe Thr

100 105 110

Tyr Asp Ser Ser Asp Trp Glu Asn Phe Lys Gln Ile Asn Glu Met Phe

115 120 125

Ala Glu Ala Ala Cys Glu Asp Ala Asp Asp Asp Ala Leu Phe Trp Val

130 135 140

His Asp Tyr Asn Leu Trp Leu Thr Pro Tyr Phe Ile Arg Gln Lys Lys

145 150 155 160

Pro Asn Ala Lys Ile Ala Phe Phe His His Thr Pro Phe Pro Ser Val

165 170 175

Asp Ile Phe Asn Ile Leu Pro Trp Arg Glu Ala Ile Val Asp Ser Leu

180 185 190

Leu Cys Cys Asp Leu Cys Gly Phe His Leu Pro Arg Tyr Val Gln Asn

195 200 205

Phe Val Ala Val Ala Arg Ser Leu Arg Lys Val Glu Ile Thr Arg Gln

210 215 220

Val Pro Val Asp Glu His Ala Phe Thr Ala Val Gly Thr Ala Leu Ala

225 230 235 240

Glu Pro Glu Ile Thr Thr Gln Leu Lys Tyr Lys Asp His Leu Val Asn

245 250 255

Leu Asp Ala Phe Pro Val Gly Thr Asn Pro Thr Gln Ile Arg Ala Gln

260 265 270

Val Glu Lys Ala Ser Thr Gln Glu Arg Ile Arg Lys Ile Arg Glu Glu

275 280 285

Leu Gly Ser Asn Lys Leu Ile Leu Ser Ala Gly Arg Val Asp Tyr Val

290 295 300

Lys Gly Thr Lys Glu Met Leu Val Cys Tyr Glu Arg Leu Leu Glu Arg

305 310 315 320

Arg Pro Glu Leu Gln Thr Lys Val Asn Leu Val Val Ala Ala Ala Lys

325 330 335

Ala Ala Ser Gly Met Arg Val Tyr Lys Asn Ala Gln Ser Glu Ile Glu

340 345 350

Arg Leu Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Ala Lys Leu Asn Trp Thr

355 360 365

Pro Ile Leu Leu Phe Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Glu Leu Leu Gly

370 375 380

Phe Phe Gly Ala Ala Asp Ile Ala Trp Ile Thr Pro Leu Arg Asp Gly

385 390 395 400

Leu Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Val Ala His Gly Cys Asp Asp

405 410 415

Gly Val Leu Ile Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ser Ala Val Glu Leu Pro

420 425 430

Asp Ala Ile Leu Thr Asn Pro Tyr Ala Ala Lys Arg Met Asp Glu Ser

435 440 445

Ile Asp Gln Ala Leu Ala Met Pro Val Glu Glu Gln Gln Arg Arg Met

450 455 460

Lys Ser Met Tyr Gln Ala Ile Gln Arg Tyr Asp Val Gln Gln Trp Ala

465 470 475 480

Asn His Met Phe Arg Glu Ala Lys Ala Thr Ala Val Leu Gly Lys Glu

485 490 495

Pro Thr Pro Val

500

<210> 4

<211> 1503

<212> DNA

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 4

atgaaatctt ctctcgtcat tctctaccat agggaaccct atgatgaggt gcgcgaaaac 60

ggtaaaacct tctaccgtga caaaacaagc cctaacggga tcatgccgac ccttaaaagc 120

ttctttgcca acgctgaaca aagcacctgg gtcgcttgga aacaaatctc tggcaaacaa 180

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tggccgattc tgcactcctt cccctggcag tttacctatg actcctcaga ctgggaaaat 360

tttaagcaaa tcaacgaaat gtttgccgag gctgcctgcg aagatgccga cgatgacgcc 420

ctcttttggg tccatgacta taatctctgg ctgaccccct actttatccg ccagaagaaa 480

cccaacgcta aaattgcctt tttccaccac acgccatttc cgagtgttga tatttttaac 540

attctgccgt ggcgtgaagc gatcgtagac agtctcctct gctgtgacct gtgtggcttc 600

catttgcccc gctacgtgca aaactttgtc gccgtcgccc ggagtttgcg caaggtcgaa 660

attacccgcc aagtgcccgt cgatgagcac gcctttactg ccgtaggcac cgccctcgca 720

gaacccgaaa ttaccaccca gttgaaatat aaagatcacc tggtgaattt ggatgctttc 780

cccgtgggca caaaccccac ccagatccgt gcccaggtag agaaagccag tacccaggag 840

cgaatccgca aaatccggga agaactaggc agcaacaagc tgattttgtc cgctggacgg 900

gtggactacg tgaagggcac caaggaaatg ttggtctgct atgaacgcct actagaacgg 960

cgaccggagt tgcaaaccaa agtgaatctg gtggttgccg cggccaaggc tgcctctggg 1020

atgcgagttt ataaaaatgc ccaaagtgaa attgagcgac tcgtaggtcg gatcaatggt 1080

cgctttgcca agttgaactg gaccccgatt ttgctcttta ccagtgccct ctcctacgag 1140

gaacttctcg gtttctttgg ggccgcagat attgcctgga ttacgccgct gcgggatggc 1200

ttgaatctag tcgccaaaga gtatgtggtc gcccatggtt gcgatgatgg ggtcttgatc 1260

ctgtcagaat tcgccgggtc agcggtggaa ctgcccgatg cgatcctcac caatccttac 1320

gcggcgaagc ggatggatga atccattgat caagccctgg ccatgcccgt cgaggaacaa 1380

caacggcgta tgaagagtat gtaccaggcg atccaacgct atgacgtgca gcagtgggcc 1440

aatcatatgt tccgggaagc caaggcaacg gcagtcctgg gtaaggagcc gacccccgtc 1500

tag 1503

<210> 5

<211> 1292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accctttacc cgcttactgc gtccggaaca gtacggcaat ctccaggtga ccaccactgg 60

tgagctatcg ggggtaggtc tgcaaatcaa catcaaccct gaaaccaacc agttagaaat 120

tatggccccc ctggccggtt cccctgcgga ggaggccggg ctgcaacccc atgaccaaat 180

tttggcgatc gacggtgtag atacccaaac cctgagctta gacgaagcag cggccagaat 240

gcggggccca aaaaacacca aagtttccct ggaaattctg tcagcgggca ccgaagtacc 300

ccaagaattt accctgactc ggcagttaat ttccctcagt ccggtggcgg cccaattgga 360

cgattcccgc ccaggtcaat cggtgggtta cattcgcctc agtcaattta gtgccaatgc 420

ctataaagaa gtagcccacg ctctgcatca acttgaggaa cagggggccg acggttatat 480

cttggatttg cgtaacaacc ccggtggctt actccaggct ggtattgaca ttgctcggtt 540

gtggttaccg gaaagcacca ttgtctacac cgttaatcgc caaggcaccc aggaaagttt 600

cactgccaat ggagaagcgg cgaccgatcg cccgttggtg gtgttggtca accagggtac 660

tgccagtgcc agcgaaattt tagccggagc tttgcaggat aatcagcggg ccactctagt 720

gggggaaaaa acctttggta agggtttgat tcaatccttg tttgaactat ccgatggggc 780

cggcattgcc gtcacggtgg ccaaatacga aaccccccaa catcacgaca tccataaact 840

gggcattatg cccgatgaag tggtggagca acccctgatt agctttgcgg aaattacttc 900

ccccgccgat gtgcaatacc aagccgcctt agatttgctc accggaggag tggcaatcgc 960

ccataaatct tcttcaattc ccgccatggc aacggctcac aagcccaact aatcaccatt 1020

tggacaaaac atcaggaatt ctaattagaa agtccaaaaa ttgtaattta aaaaacagtc 1080

aatggagagc attgccataa gtaaaggcat cccctgcgtg ataagattac cttcagaaaa 1140

cagatagttg ctgggttatc gcagattttt ctcgcaacca aataactgta aataataact 1200

gtctctgggg cgacggtagg ctttatattg ccaaatttcg cccgtgggag aaagctaggc 1260

tattcaatgt ttatggagga ctgacctaga tg 1292

<210> 6

<211> 661

<212> PRT

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 6

Met Tyr Glu Gln Phe Ser His Ser Ile Leu Asn Glu Ile Leu Asp Gln

1 5 10 15

Leu Arg Pro Glu Leu Lys Glu Gln Glu Leu Ser His Phe Tyr Thr Arg

20 25 30

Leu Gly Ala Asn Phe Tyr Ser Leu Phe Ser Leu Phe Tyr Lys Leu Tyr

35 40 45

Gly Arg Arg Ser Asp Phe Lys Ala Gln Leu Leu Arg Leu Val Glu Val

50 55 60

Met Ala Tyr Gln Tyr Ile Gly Arg Ser Pro Glu Phe Lys Gln Thr Asp

65 70 75 80

Leu Val Arg Glu Lys Asn Phe Asn Trp Phe Leu Glu Ser Gln Trp Val

85 90 95

Gly Met Thr Leu Tyr Ala Asp Gly Phe Ala Asp Asp Leu Gln Asp Leu

100 105 110

Gly Asp Arg Val Ala Tyr Phe Ser Glu Leu Gly Val Asn Phe Ile His

115 120 125

Ile Met Pro Ile Leu Glu Cys Pro Arg His Ala Ser Asp Gly Gly Tyr

130 135 140

Ala Ile Ser Asn Tyr Arg Gln Ile Asn Pro Lys Ile Gly Thr Leu Gln

145 150 155 160

Asp Leu Gln His Leu Val Glu Ile Phe Arg Gln Lys Glu Ile Leu Leu

165 170 175

Ala Leu Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala

180 185 190

Gln Lys Ala Arg Lys Gly Asp Lys Lys Tyr Gln Lys Tyr Tyr Tyr Met

195 200 205

Phe Asp Thr Arg Asp Ile Pro Asp Met Phe Glu Lys Asn Leu Pro Glu

210 215 220

Ile Phe Pro Glu Thr Ala Pro Gly Asn Phe Thr Trp Asp Glu Glu Leu

225 230 235 240

Gln Lys Trp Val Met Thr Val Phe Asn Asn Tyr Gln Trp Asp Leu Asn

245 250 255

Tyr Gln Asn Pro Ala Val Leu Ile Glu Met Val Asp Ile Ile Leu Phe

260 265 270

Trp Ala Asn Gln Gly Val Asp Val Leu Arg Leu Asp Ala Val Ala Phe

275 280 285

Leu Trp Lys Lys Ile Gly Ser Gln Ser Gln Asn Glu Lys Glu Ala His

290 295 300

Met Ile Leu Gln Ile Phe Lys Asp Cys Cys Gln Ile Thr Ala Pro Gly

305 310 315 320

Val Ile Phe Ile Ala Glu Ala Ile Val Ala Pro Val Glu Ile Val Arg

325 330 335

Tyr Phe Gly Glu Asp Ala Ile Asn Ala Lys Glu Cys Glu Ile Ala Tyr

340 345 350

Asn Ala Thr Leu Met Ala Leu Leu Trp Asp Ala Ala Ala Thr Lys Asn

355 360 365

Ala Lys Leu Leu Ile Gln Gly Leu Lys Asn Ile Pro Ala Lys Leu Asp

370 375 380

Arg Ala Thr Trp Leu Asn Tyr Ile Arg Cys His Asp Asp Ile Gly Leu

385 390 395 400

Gly Phe Thr Asp Ala Asp Ile Ala Gln Ala Gly Tyr Asp Pro Lys Ser

405 410 415

His Arg Arg Phe Leu Ile Asp Tyr Phe Cys Gly Gln Phe Glu Gly Thr

420 425 430

Asp Ala Arg Gly Leu Leu Phe Gly Gln Asn Ser Lys Asn Asp Asp Ala

435 440 445

Arg Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ser Leu Met Gly Leu Glu Thr Ala Ile

450 455 460

Glu Ala Asn Asp Gln Gln Lys Ile Ala Ile Ile Ile Lys His Ile Leu

465 470 475 480

Leu Leu Tyr Ser Ile Ile Phe Ser Phe Gly Gly Ile Pro Leu Ile Tyr

485 490 495

Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Thr Leu Asn Asp Tyr Ser Tyr Met Gly Asn

500 505 510

Leu Ser Lys Ala Asn Asp Thr Arg Trp Ala His Arg Pro Lys Ile Asn

515 520 525

Trp Lys Lys Ala Glu Leu Arg His Ile Glu Gly Thr Ile Glu His Arg

530 535 540

Ile Phe Ser Ala Leu Gln His Met Ile Val Val Arg Lys Ala Ile Pro

545 550 555 560

Ala Phe Ala Asp Phe Asn Asn Arg Gln Leu Leu Ser Ile Asp Asn Pro

565 570 575

His Leu Phe Gly Phe Val Arg Ile Ser Pro Asn Lys Arg Asp His Ile

580 585 590

Leu Val Ile Gly Asn Phe Ser Pro Asp Tyr Gln Asn Leu Asp Leu Ser

595 600 605

His Leu Ala Cys His Pro Phe Asp Cys His Asp Gln Asp Leu Leu Ile

610 615 620

Asp Leu Tyr Ser Gln Asn Ala Pro Glu Ile Phe Glu Lys Gln Leu Val

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Leu Ala Pro Phe Gln Phe Tyr Trp Leu Ser Lys Met Gln Pro Ser Leu

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Thr Thr Thr Leu Leu

660

<210> 7

<211> 1986

<212> DNA

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 7

atgtacgaac agttttctca ctcgatttta aatgagattt tagatcaatt aaggcccgaa 60

ctcaaagaac aagaattaag tcatttttat acccgtttag gagcaaactt ctatagcctt 120

ttctctctct tttataaact ctatggtcgc cgctcagact ttaaggcgca actgctgaga 180

ctggtcgaag tgatggccta tcaatacatt gggcgatcgc cagaatttaa acagactgat 240

ttagtacggg aaaaaaactt taactggttt cttgaatccc aatgggtcgg tatgactttg 300

tatgccgatg gctttgccga cgatctccaa gacctaggcg atcgcgttgc ctatttcagc 360

gaattagggg ttaatttcat ccacattatg ccgattttag aatgtccccg ccatgccagt 420

gacggcggct atgcgattag taattatcga caaattaacc ccaaaattgg caccctccag 480

gatctccaac acctcgtaga aatctttcgc caaaaagaaa ttttgttggc cctcgatatt 540

gtaattaatc acacttcaaa cgaacacgaa tgggcacaaa aagcacgtaa aggggacaaa 600

aaatatcaaa aatattatta tatgttcgac acgcgggata ttcccgacat gtttgaaaaa 660

aatcttccag aaatttttcc agaaacggct ccgggtaatt ttacctggga tgaagaatta 720

caaaaatggg tgatgactgt ttttaataac taccaatggg atcttaatta tcaaaacccg 780

gcggtgctca ttgaaatggt cgatattatt cttttttggg ccaaccaagg cgttgatgtg 840

ctgcggctcg atgcggtcgc ttttctatgg aaaaagatcg gcagccagag tcaaaacgaa 900

aaagaagccc acatgatttt gcagatcttc aaagactgct gccaaattac cgccccaggg 960

gtcattttca ttgccgaggc gatcgttgcc cccgtagaaa ttgtgcggta tttcggggaa 1020

gatgcgatca acgccaagga atgtgaaatt gcctacaatg ccacgctcat ggccctcctg 1080

tgggatgccg ccgccaccaa gaatgccaaa cttttaatcc aaggactcaa aaatattccg 1140

gcaaagctgg accgcgccac ctggctcaat tatatccgct gccatgatga cattggcctg 1200

gggtttaccg atgcagacat cgctcaggca ggctatgacc caaaatccca ccgacggttt 1260

ctcattgact atttttgtgg ccaatttgaa ggcaccgatg cgaggggttt actgtttggt 1320

caaaattcta aaaatgacga tgcccgtatt tcaggtactc tgacgtcttt aatgggctta 1380

gaaacagcta ttgaggccaa cgaccagcaa aaaatagcga tcattatcaa acatatttta 1440

ttgctctaca gtattatttt ttcctttggg ggcattccac taatctatta tggcgatgaa 1500

attggcactt taaatgatta ttcctacatg ggaaatttga gtaaagccaa tgatactcgc 1560

tgggctcatc ggcctaaaat caactggaaa aaagcagaac tacgacatat tgaaggcacc 1620

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gactatcaaa atttagatct tagtcactta gcctgtcatc cttttgattg ccatgaccag 1860

gatttattga ttgatttata cagtcaaaat gcaccggaaa tttttgaaaa acaacttgtg 1920

ctggcaccgt tccagtttta ttggttgagt aaaatgcagc cgagtctgac cacaactttg 1980

ctatag 1986

<210> 8

<211> 720

<212> PRT

<213> Synechocystis PCC6803

<400> 8

Met Ser Tyr Ser Ser Lys Tyr Ile Leu Leu Ile Ser Val His Gly Leu

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Ile Arg Gly Glu Asn Leu Glu Leu Gly Arg Asp Ala Asp Thr Gly Gly

20 25 30

Gln Thr Lys Tyr Val Leu Glu Leu Ala Arg Ala Leu Val Lys Asn Pro

35 40 45

Gln Val Ala Arg Val Asp Leu Leu Thr Arg Leu Ile Lys Asp Pro Lys

50 55 60

Val Asp Ala Asp Tyr Ala Gln Pro Arg Glu Leu Ile Gly Asp Arg Ala

65 70 75 80

Gln Ile Val Arg Ile Glu Cys Gly Pro Glu Glu Tyr Ile Ala Lys Glu

85 90 95

Met Leu Trp Asp Tyr Leu Asp Asn Phe Ala Asp His Ala Leu Asp Tyr

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Leu Lys Glu Gln Pro Glu Leu Pro Asp Val Ile His Ser His Tyr Ala

115 120 125

Asp Ala Gly Tyr Val Gly Thr Arg Leu Ser His Gln Leu Gly Ile Pro

130 135 140

Leu Val His Thr Gly His Ser Leu Gly Arg Ser Lys Arg Thr Arg Leu

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Leu Leu Ser Gly Ile Lys Ala Asp Glu Ile Glu Ser Arg Tyr Asn Met

165 170 175

Ala Arg Arg Ile Asn Ala Glu Glu Glu Thr Leu Gly Ser Ala Ala Arg

180 185 190

Val Ile Thr Ser Thr His Gln Glu Ile Ala Glu Gln Tyr Ala Gln Tyr

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Asp Tyr Tyr Gln Pro Asp Gln Met Leu Val Ile Pro Pro Gly Thr Asp

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Leu Glu Lys Phe Tyr Pro Pro Lys Gly Asn Glu Trp Glu Thr Pro Ile

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Val Gln Glu Leu Gln Arg Phe Leu Arg His Pro Arg Lys Pro Ile Ile

245 250 255

Leu Ala Leu Ser Arg Pro Asp Pro Arg Lys Asn Ile His Lys Leu Ile

260 265 270

Ala Ala Tyr Gly Gln Ser Pro Gln Leu Gln Ala Gln Ala Asn Leu Val

275 280 285

Ile Val Ala Gly Asn Arg Asp Asp Ile Thr Asp Leu Asp Gln Gly Pro

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Pro Ser His Val Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Ile Asn Ala Leu Thr Gln

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Gln Thr Ser Val Leu Lys Arg Ser Asp Leu Lys Arg Arg Arg Thr Leu

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Tyr Tyr Asn Gly Ala Leu Val Thr Ser Leu Asp Gln Asn Leu Leu Gly

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Ala Leu Gln Gly Gly Leu Pro Gly Asp Arg Gln Thr Leu Asp Glu Leu

485 490 495

Leu Glu Val Leu Tyr Gln His Arg Lys Asn Val Gly Phe Cys Ile Ala

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Thr Gly Arg Arg Leu Asp Ser Val Leu Lys Ile Leu Arg Glu Tyr Arg

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Tyr Leu Trp Asn Arg Asn Ala Ile Val Arg Ile Leu Gly Glu Leu Pro

565 570 575

Gly Leu Ala Leu Gln Pro Lys Glu Glu Leu Ser Ala Tyr Lys Ile Ser

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Tyr Phe Tyr Asp Ala Ala Ile Ala Pro Asn Leu Glu Glu Ile Arg Gln

595 600 605

Leu Leu His Lys Gly Glu Gln Thr Val Asn Thr Ile Ile Ser Phe Gly

610 615 620

Gln Phe Leu Asp Ile Leu Pro Ile Arg Ala Ser Lys Gly Tyr Ala Val

625 630 635 640

Arg Trp Leu Ser Gln Gln Trp Asn Ile Pro Leu Glu His Val Phe Thr

645 650 655

Ala Gly Gly Ser Gly Ala Asp Glu Asp Met Met Arg Gly Asn Thr Leu

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Ser Val Val Val Ala Asn Arg His His Glu Glu Leu Ser Asn Leu Gly

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Glu Ile Glu Pro Ile Tyr Phe Ser Glu Lys Arg Tyr Ala Ala Gly Ile

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<210> 9

<211> 2163

<212> DNA

<213> Synechocystis PCC6803

<400> 9

atgagctatt catcaaaata cattttacta attagtgtcc atggtttaat tcggggagaa 60

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ttacaggccc aggccaattt ggtcattgtg gcgggcaatc gggatgacat cacggatcta 900

gaccaggggc cgagggaagt actgacggat ttactgttga ccattgaccg ttacgatctc 960

tacggcaaag tggcttaccc caaacagaat caggcggagg atgtgtatgc tttgtttcgc 1020

ctcactgctt tatcccaggg agtatttatc aatccggctt tgacggaacc ctttggttta 1080

actttgattg aagcggcggc ctgtggtgtg cccattgtgg ccacggagga tgggggcccg 1140

gtggatatta tcaaaaattg tcagaatggc tatctaatta atcccctcga tgaagtggat 1200

attgcggata aattgctcaa agtactaaac gacaaacaac aatggcaatt cctttctgaa 1260

agtggtctag agggagttaa gcgccattat tcttggcctt cccacgttga aagttattta 1320

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cggcggactt tgtactataa cggtgccctg gttactagtt tggaccaaaa tttactgggg 1440

gcattacagg ggggattacc gggcgatcgc cagacgttgg acgaattact ggaagtgctg 1500

tatcaacatc gaaaaaatgt cggcttttgc attgccactg ggagaagatt ggattcggtg 1560

ctgaaaattt tgcgggagta tcgcattccc caaccggata tgttgatcac cagcatgggc 1620

acggaaattt attcttcccc ggatttgatc cccgaccaga gttggcgcaa tcacattgat 1680

tatttgtgga accgtaacgc cattgtgcgt attttggggg aattacccgg tttagccctc 1740

caacccaagg aagaactgag cgcctataaa attagctatt tctacgatgc ggcgatcgcc 1800

cctaacctag aagaaattcg gcaactgttg cataaagggg aacaaaccgt aaataccatc 1860

atttcctttg gtcaattttt ggatattctg cccatccgag cttccaaagg ctatgctgtg 1920

cgttggttga gccaacagtg gaatattccc ctggagcacg ttttcaccgc cggaggatcg 1980

ggagccgacg aagatatgat gcggggtaac accctttccg tcgtcgtggc taaccgtcac 2040

catgaggaac tttctaatct aggggagatc gaaccgattt atttttccga aaaacgttac 2100

gccgccggta ttctggacgg tctggcccat taccgcttct ttgagttgtt agaccccgtt 2160

taa 2163

<210> 10

<211> 244

<212> PRT

<213> Synechocystis PCC6803

<400> 10

Met Arg Gln Leu Leu Leu Ile Ser Asp Leu Asp Asn Thr Trp Val Gly

1 5 10 15

Asp Gln Gln Ala Leu Glu His Leu Gln Glu Tyr Leu Gly Asp Arg Arg

20 25 30

Gly Asn Phe Tyr Leu Ala Tyr Ala Thr Gly Arg Ser Tyr His Ser Ala

35 40 45

Arg Glu Leu Gln Lys Gln Val Gly Leu Met Glu Pro Asp Tyr Trp Leu

50 55 60

Thr Ala Val Gly Ser Glu Ile Tyr His Pro Glu Gly Leu Asp Gln His

65 70 75 80

Trp Ala Asp Tyr Leu Ser Glu His Trp Gln Arg Asp Ile Leu Gln Ala

85 90 95

Ile Ala Asp Gly Phe Glu Ala Leu Lys Pro Gln Ser Pro Leu Glu Gln

100 105 110

Asn Pro Trp Lys Ile Ser Tyr His Leu Asp Pro Gln Ala Cys Pro Thr

115 120 125

Val Ile Asp Gln Leu Thr Glu Met Leu Lys Glu Thr Gly Ile Pro Val

130 135 140

Gln Val Ile Phe Ser Ser Gly Lys Asp Val Asp Leu Leu Pro Gln Arg

145 150 155 160

Ser Asn Lys Gly Asn Ala Thr Gln Tyr Leu Gln Gln His Leu Ala Met

165 170 175

Glu Pro Ser Gln Thr Leu Val Cys Gly Asp Ser Gly Asn Asp Ile Gly

180 185 190

Leu Phe Glu Thr Ser Ala Arg Gly Val Ile Val Arg Asn Ala Gln Pro

195 200 205

Glu Leu Leu His Trp Tyr Asp Gln Trp Gly Asp Ser Arg His Tyr Arg

210 215 220

Ala Gln Ser Ser His Ala Gly Ala Ile Leu Glu Ala Ile Ala His Phe

225 230 235 240

Asp Phe Leu Ser

<210> 11

<211> 735

<212> DNA

<213> Synechocystis PCC6803

<400> 11

atgcgacagt tattgctaat ttctgacctg gacaatacct gggtcggaga tcaacaagcc 60

ctggaacatt tgcaagaata tctaggcgat cgccggggaa atttttattt ggcctatgcc 120

acggggcgtt cctaccattc cgcgagggag ttgcaaaaac aggtgggact catggaaccg 180

gactattggc tcaccgcggt ggggagtgaa atttaccatc cagaaggcct ggaccaacat 240

tgggctgatt acctctctga gcattggcaa cgggatatcc tccaggcgat cgccgatggt 300

tttgaggcct taaaacccca atctcccttg gaacaaaacc catggaaaat tagctatcat 360

ctcgatcccc aggcttgccc caccgtcatc gaccaattaa cggagatgtt gaaggaaacc 420

ggcatcccgg tgcaggtgat tttcagcagt ggcaaagatg tggatttatt gccccaacgg 480

agtaacaaag gtaacgccac ccaatatctg caacaacatt tagccatgga gccgtctcaa 540

accctggtgt gtggggactc cggcaatgat attggcttat ttgaaacttc cgctcggggt 600

gtcattgtcc gtaatgccca gccggaatta ttgcactggt atgaccaatg gggggattct 660

cgtcattatc gggcccaatc gagccatgct ggcgctatcc tagaggcgat cgcccatttc 720

gattttttga gctga 735

Claims

1.一种制备具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻的方法，其特征在于，以聚球藻PCC7002为出发藻株，敲除所述出发藻株的果糖激酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果糖激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还敲除了所述出发藻株中的磷酸甘油葡糖苷合酶，所述磷酸甘油葡糖苷合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还在所述出发藻株中过表达蔗糖水解酶，所述蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还在所述出发藻株中过表达蔗糖磷酸合酶，所述蔗糖磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还在所述出发藻株中过表达蔗糖磷酸磷酸化酶，所述蔗糖磷酸磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

7.一种具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻，其特征在于，通过权利要求1-6中任一项的方法制备得到。

8.一种生产果糖的方法，其特征在于，包括培养权利要求7所述的聚球藻并使所述聚球藻生产果糖的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，培养所述聚球藻的培养基为MAD2培养基。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚球藻的培养条件为：培养温度为25-35℃，光照为200-350μmol photons m^-2s^-1，通气培养，通入的气体为CO₂与空气的混合气体。