ES2965229T3 - Producción fermentativa de oligosacáridos mediante fermentación total usando una materia prima mixta - Google Patents

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Abstract

Resumen Se divulgan células microbianas genéticamente modificadas para la producción de oligosacáridos que comprenden un resto galactosa-β1,4-glucosa en su extremo reductor, en donde dichas células microbianas son capaces de producir dichos oligosacáridos en ausencia de lactosa añadida exógenamente, y un método para producir dichos oligosacáridos. oligosacáridos utilizando dichas células microbianas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Producción fermentativa de oligosacáridos mediante fermentación total usando una materia prima mixta
La presente invención se refiere a células microbianas modificadas genéticamente para la producción de lactosa o un oligosacárido de interés que comprende una unidad estructural galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor, así como a un método de producción de lactosa o un oligosacárido de interés que comprende una unidad estructural terminal galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor.
Antecedentes
La leche materna comprende una mezcla compleja de carbohidratos, grasas, proteínas, vitaminas, minerales y oligoelementos. La fracción más predominante de la leche humana consiste en carbohidratos. La fracción de carbohidratos de la leche humana además se puede dividir en (i) lactosa y (ii) oligosacáridos (oligosacáridos de la leche humana, HMO). Mientras que la lactosa (galactosa-p1,4-glucosa) se usa como fuente de energía, el lactante no metaboliza los oligosacáridos. La fracción de oligosacáridos representa hasta 1/10 de la fracción total de carbohidratos y probablemente consta de más de 150 oligosacáridos diferentes. La aparición y concentración de estos oligosacáridos complejos son específicas de los seres humanos y, de este modo, no se pueden encontrar en grandes cantidades en la leche de otros mamíferos, incluidos los animales de granja lechera.
Los oligosacáridos más destacados de la leche humana son la 2'-fucosillactosa y la 3'-fucosillactosa, que juntas pueden contribuir hasta 1/3 de la fracción total de HMO. HMO destacados adicionales presentes en la leche humana son la lacto-N-tetraosa, la lacto-N-neotetraosa y la lacto-N-fucopentaosa I. Además de estos oligosacáridos neutros, en la leche humana también se pueden encontrar HMO ácidos tales como la 3'-sialillactosa, 6'-sialillactosa y 3-fucosil-3'-sialillactosa, sialil-lacto-W-tetraosa, disialil-lacto-W-tetraosa. En particular, la gran mayoría de los HMO comprenden una unidad estructural galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor. Las estructuras de los HMO están estrechamente relacionadas con los epítopos de los glicoconjugados de la superficie de las células epiteliales, los antígenos del grupo histosanguíneo de Lewis, tales como Lewis x (LeX). La similitud estructural de los HMO con los epítopos epiteliales explica las propiedades protectoras de los HMO contra patógenos bacterianos.
La presencia de oligosacáridos en la leche humana se conoce desde hace mucho tiempo y las funciones fisiológicas de estos oligosacáridos han sido objeto de investigación médica durante muchas décadas. Para algunos de los oligosacáridos más abundantes de la leche humana ya se han identificado funciones específicas.
Además de los efectos locales en el tracto intestinal como se mencionó anteriormente en este documento, también se ha demostrado que los HMO provocan efectos sistémicos en los lactantes al ingresar a su circulación sistémica. Además, el impacto de los HMO en las interacciones entre proteínas y carbohidratos, por ejemplo, la unión de selectina-leucocitos puede modular las respuestas inmunes y reducir las respuestas inflamatorias. Además, cada vez se reconoce más que los HMO representan un sustrato clave para el desarrollo de los microbiomas de los lactantes.
Debido a las propiedades beneficiosas bien estudiadas de los oligosacáridos prebióticos, en particular de los HMO, pero su disponibilidad limitada a partir de fuentes naturales, es muy deseable una producción comercial eficiente de HMO, es decir, a gran escala.
Al intentar producir a gran escala oligosacáridos individuales de la leche humana, se desarrollaron rutas químicas para algunos de estos oligosacáridos. Sin embargo, tales métodos implican el uso de varios productos químicos nocivos, que imponen el riesgo de contaminar el producto final. Hasta hoy no se pueden obtener mediante síntesis química al menos cantidades a gran escala ni cualidades suficientes para aplicaciones alimentarias.
Para evitar los inconvenientes asociados con la síntesis química de los oligosacáridos de la leche humana, se desarrollaron varios métodos enzimáticos y enfoques fermentativos para su producción. Se han desarrollado procedimientos de producción fermentativos para varios HMO, tales como 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, 3'-sialillactosa y 6'-sialillactosa. Estos procedimientos de producción por lo general usan cepas bacterianas modificadas genéticamente, tales comoEscherichia colirecombinante.
Hoy en día, todos los procedimientos de producción fermentativa, así como las reacciones biocatalíticas para producir HMO, se basan exclusivamente en lactosa agregada de forma exógena como sustrato de partida. Se agregan uno o más monosacáridos a la lactosa en los procedimientos (US 7,521,212 B1; Albermann et al., (2001)Carbohydr. Res.
334(2) p 97-103). La adición de monosacáridos a la lactosa puede ser catalizada ya sea por glicosiltransferasas o por glicosidasas usando sustratos de monosacáridos activados apropiados. Además, se pueden agregar monosacáridos adicionales a la lactosa mediante reacciones de transglucosidasa.
En particular, la producción fermentativa de HMO demostró ser eficaz, porque los monosacáridos activados por nucleótidos necesarios pero difíciles de sintetizar son proporcionados por el metabolismo de las células microbianas empleadas. Sin embargo, el uso de células enteras para la síntesis de HMO también presenta - en comparación con el enfoque biocatalítico - varias desventajas importantes, que se relacionan con los procedimientos de transporte a través de la membrana celular, con reacciones metabólicas secundarias y con la necesidad de que los oligosacáridos que se sintetizan por las células microbianas deben purificarse a partir de una mezcla compleja que contiene, entre otros, diversos polioles (por ejemplo, carbohidratos), ácidos nucleicos, polipéptidos, material inorgánico, etc.
Un problema técnico relacionado con el uso de lactosa en procedimientos fermentativos que debe superarse, en particular cuando el oligosacárido que se va a producir se usará en el consumo humano, es la reordenación de la lactosa (beta-D-galactopiranosil-(1^4)-D-glucosa) en lactulosa (beta-D-galactopiranosil-(1^4)-D-fructofuranosa) tras el tratamiento térmico de la lactosa. Esta reordenación puede ocurrir ampliamente mediante esterilización térmica de la lactosa, lo que lleva a la reordenación de varios porcentajes de la lactosa para que esté presente en el medio de fermentación o en la alimentación de fermentación de la lactosa a la lactulosa. Sin embargo, la lactulosa es un azúcar no digerible para los humanos y se usa ampliamente como laxante en el tratamiento del estreñimiento crónico.
La conversión de lactosa en lactulosa no sólo conduce a la generación de lactulosa no deseada, sino que también proporciona un sustrato no deseado para reacciones de glucosilación en las células microbianas. Así, se generan como subproductos oligosacáridos más complejos (por ejemplo, 2'-fucosillactulosa). De este modo, la generación de lactulosa a partir de lactosa conduce a la contaminación del producto deseado con oligosacáridos estrechamente relacionados, que son difíciles o incluso imposibles de separar del producto deseado.
Adicionalmente, la lactosa se puede convertir en alolactosa (beta-D-galactopiranosil-(1^6)-D-glucopiranosa), otro contaminante no deseado (Huber et al., "Efflux of beta-galactosidase products fromEscherichia coli'(1980) J. Bacteriol. 141, 528- 533), si se suministra a una cepaE. colibeta-galactosidasa positiva.
Además, la adición de lactosa puede provocar un efecto bien documentado conocido como "muerte celular inducida por lactosa". Este efecto probablemente se debe a la absorción excesiva de lactosa por parte de la célula microbiana y al colapso asociado del gradiente de protones a través de la membrana bacteriana. En particular, la sobreexpresión del gen de la lactosa permeasa (por ejemplo,lacYdeE. coli)en combinación con la exposición de la célula microbiana recombinante a un exceso de lactosa puede provocar un retraso considerable en el crecimiento de la cepa recombinante y un aumento de la síntesis de polisacáridos celulares (Grube et al., "Hydrogen-producingEscherichia colistrains overexpressing lactose permease: FT-IR analysis of the lactose-induced stress" (2013) Biotechnol. Appl. Biochem. 5, 31).
Adicionalmente, cualquier lactosa disponible comercialmente en la actualidad se deriva del suero, un producto de desecho de la industria láctea. El suero se produce en enormes cantidades en la fabricación de queso y caseína. De este modo, al provenir de la industria láctea todavía existen preocupaciones relacionadas con una posible contaminación de la lactosa con proteínas priónicas que son el agente causante de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE), también conocida como enfermedad de las vacas locas. La BSE es una enfermedad neurodegenerativa mortal en el ganado, que provoca una degeneración esponjosa del cerebro y la médula espinal. La BSE puede transmitirse a los seres humanos y allí se la conoce como variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.
Sobre todo, la lactosa sigue siendo uno de los componentes más caros del medio de fermentación y su sustitución por glucosa, glicerol, sacarosa, etc. conduciría a una producción más rentable de HMO.
Para superar los inconvenientes antes mencionados, se desarrollaron medios y métodos mejorados para la producción de HMO. Por ejemplo, el documento WO 2015/150328 A1 divulga células hospedadoras bacterianas que son capaces de producir oligosacáridos que comprenden un disacárido terminal de galactosa-(1^4)-glucosa, en el que dicha célula hospedadora bacteriana expresa al menos una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa que es capaz de galactosilar un monosacárido de glucosa libre para generar lactosa intracelularmente, y que contiene y expresa al menos una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosamiltransferasa o una galactosiltransferasa. Dicha célula hospedadora bacteriana es capaz de generar el oligosacárido sin adición exógena de lactosa de manera que la célula hospedadora bacteriana puede cultivarse en un medio de cultivo sin adición exógena de lactosa para producir dicho oligosacárido. Más específicamente, el documento WO 2015/150328 A1 divulga una cepa deE. colimodificada genéticamente para la producción de 2'-fucosillactosa que usa sacarosa o una combinación de glucosa y sacarosa como fuente de carbono. Para el uso de sacarosa, dicha cepa deE. colifue modificada genéticamente para expresar los cuatro genes del grupo de genes csc deE. coliW, es decir, los genes que codifican la sacarosa permeasa (cscB), la fructocinasa (cscK), la sacarosa hidrolasa (cscA), y un represor transcripcional (cscR).
Sin embargo, producir 2'-FL mediante dicha cepa deE. colimodificada genéticamente que usa sacarosa como única fuente de carbono y energía tiene sus inconvenientes porque también es difícil esterilizar con calor la sacarosa sin un grado considerable de hidrolización y formación de productos secundarios no deseados. Como alternativa se puede emplear la filtración estéril de solución de sacarosa, pero la filtración estéril conlleva un alto riesgo de contaminación de la fermentación por crecimientos extraños, en particular en la fermentación a escala industrial.
Además, cultivar una célula microbiana para la producción de un HMO en presencia de sacarosa como fuente de carbono, en el que dicha célula microbiana ha sido modificada genéticamente para poseer un metabolismo dividido de modo que los monómeros que constituyen la sacarosa se utilicen en distintas rutas metabólicas, conduce a características de crecimiento no deseadas del cultivo de células bacterianas, presumiblemente debido a la estequiometría de los monómeros generados a partir de la hidrolización de sacarosa intracelular que no coincide con las necesidades cuantitativas de los diferentes monómeros en las distintas rutas.
Para superar los inconvenientes antes mencionados, se proporciona una célula microbiana modificada genéticamente que es capaz de producir un oligosacárido de interés que comprende una unidad estructural galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor cuando se cultiva en una materia prima de monosacárido mixto como fuente principal de carbono y energía, pero en la ausencia de lactosa agregada exógenamente.
Sumario
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un dibujo esquemático de un ejemplo de realización de una célula microbiana modificada genéticamente según la invención para la producción de 2'-fucosillactosa.
La figura 2 muestra un dibujo esquemático de otro ejemplo de realización de una célula microbiana modificada genéticamente según la invención para la producción de 2'-fucosillactosa.
La figura 3 muestra un dibujo esquemático de otro ejemplo de realización de una célula microbiana modificada genéticamente según la invención para la producción de 2'-fucosillactosa.
La figura 4 muestra características de crecimiento de cepas deE. colidurante el cultivo en glucosa (A) o una materia prima de monosacáridos mixtos que consiste en glucosa y fructosa (B) como única fuente de carbono y energía. Descripción detallada
Se proporciona un método de producción de lactosa o un oligosacárido de interés que comprende una unidad estructural galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor, comprendiendo el método las etapas de:
a) proporcionar una célula microbiana modificada genéticamente como se describe en este documento;
b) cultivar la célula microbiana en un medio de cultivo y en condiciones que sean permisivas para la producción de dicha lactosa u oligosacárido de interés, en el que el medio de cultivo contiene una mezcla de glucosa y al menos un compuesto adicional seleccionado del grupo que consiste en fructosa, galactosa, manosa, xilosa, ramnosa, glicerol, succinato, piruvato y malato como principal fuente de carbono; y
c) recuperar la lactosa u oligosacárido de interés del medio de cultivo y/o de la célula microbiana.
La célula microbiana modificada genéticamente para la producción de lactosa o un oligosacárido de interés que comprende una unidad estructural galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor posee al menos un transportador de glucosa para translocar glucosa desde el medio de cultivo al citoplasma de la célula microbiana, una ruta de biosíntesis de UDP-galactosa para la biosíntesis intracelular de UDP-galactosa, y al menos una galactosiltransferasa que es capaz de galactosilar glucosa intracelular libre para producir lactosa intracelularmente.
La célula microbiana modificada genéticamente es capaz de producir lactosa. En determinadas realizaciones, la célula microbiana puede usar la lactosa que se produce por sí misma para la producción de un oligosacárido de interés que lleva una unidad estructural galactosa-p1,4-glucosa en su extremo reductor. Para la producción de dicho oligosacárido de interés, no es necesario proporcionar un suministro exógeno de lactosa a la célula microbiana.
La célula microbiana modificada genéticamente posee al menos un transportador de glucosa para translocar la glucosa del medio de cultivo en el que se cultiva dicha célula microbiana al citoplasma de la célula microbiana de manera que la glucosa libre quede disponible para la biosíntesis intracelular de lactosa.
Por lo general, la célula microbiana modificada genéticamente comprende al menos un gen funcional que codifica dicho transportador de glucosa que es capaz de translocar glucosa (Glu) del medio de cultivo al citoplasma de la célula.
El término "gen funcional", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o polipéptido, y que también contiene secuencias reguladoras unidas operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica proteínas de manera que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o el polipéptido se pueden expresar en/mediante la célula microbiana que porta dicho gen funcional. De este modo, cuando se cultiva en condiciones que son permisivas para la expresión del gen funcional, dicho gen funcional se expresa, y la célula microbiana que expresa dicho gen funcional comprende por lo general la proteína o polipéptido que está codificado por la región codificante de proteína del gen funcional. Como se usan en este documento, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a un desoxirribonucleótido o polímero de ribonucleótido en forma ya sea monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria de la misma.
El término "unido operativamente" como se usa en este documento significará un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, una secuencia señal o una serie de sitios de unión de factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en el que la secuencia de control de la expresión afecta a la transcripción y/o traducción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. De acuerdo con lo anterior, el término "Promotor" designa secuencias de ADN que normalmente "preceden" a un gen en un polímero de ADN y proporcionan un sitio para el inicio de la transcripción en ARNm. Las secuencias de ADN "reguladoras", que también suelen estar "aguas arriba" de (es decir, antes) de un gen en un polímero de ADN determinado, se unen a proteínas que determinan la frecuencia (o velocidad) de iniciación transcripcional. Denominadas colectivamente secuencia de ADN "promotora/reguladora" o "control", estas secuencias que preceden a un gen seleccionado (o una serie de genes) en un polímero de ADN funcional cooperan para determinar si se producirá la transcripción (y eventual expresión) de un gen. Las secuencias de ADN que "siguen" a un gen en un polímero de ADN y proporcionan una señal para la terminación de la transcripción en ARNm se denominan secuencias "terminadoras" de la transcripción.
El término "recombinante", como se usa en este documento con referencia a una célula hospedadora bacteriana indica que la célula bacteriana replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificado por un ácido nucleico heterólogo (es decir, una secuencia "extraña a dicha célula"). Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden contener genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, en la que los genes se modifican y se reintroducen en la célula por medios artificiales. El término también abarca células que contienen un ácido nucleico endógeno de la célula que ha sido modificado sin eliminar el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen las obtenidas mediante reemplazo de genes, mutación específica de sitio y técnicas relacionadas. De acuerdo con lo anterior, un "polipéptido recombinante" es aquel que ha sido producido por una célula recombinante. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", como se usa en este documento, es aquella que se origina a partir de una fuente extraña a la célula hospedadora particular (por ejemplo, de una especie diferente) o, si proviene de la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. De este modo, un ácido nucleico heterólogo unido operativamente a un promotor proviene de una fuente diferente de aquella de la que se deriva el promotor o, si es de la misma fuente, está modificado desde su forma original. La secuencia heteróloga puede introducirse de forma estable, por ejemplo, mediante transfección, transformación, conjugación o transducción, en el genoma de la célula del microorganismo hospedador, en el que se pueden aplicar técnicas que dependerán de la célula hospedadora en la que se va a introducir la secuencia. Una persona experta en la técnica conoce varias técnicas y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989).
De acuerdo con lo anterior, se entiende por "célula microbiana modificada genéticamente" una célula bacteriana que ha sido transformada o transfectada, o que es capaz de transformarse o transfectarse mediante una secuencia de polinucleótidos exógena.
De este modo, las secuencias de ácido nucleico como se usan en la presente invención pueden estar comprendidas, por ejemplo, en un vector que se va a transformar/transfectar de manera estable o introducir de otro modo en células de microorganismos hospedadores.
Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan además de generar la expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector apropiado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y sintetizar un polipéptido en un hospedador puede usarse para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook.et al., supra.
La técnica es rica en publicaciones de patentes y literatura relacionadas con metodologías de "ADN recombinante" para el aislamiento, síntesis, purificación y amplificación de materiales genéticos para su uso en la transformación de organismos huéspedes seleccionados. De este modo, es de conocimiento común transformar organismos huéspedes con ADN plasmídico viral o circular "híbrido" que incluye secuencias de ADN exógenas (es decir, extrañas o "heterólogas") seleccionadas. Los procedimientos conocidos en la técnica implican primero la generación de un vector de transformación escindiendo enzimáticamente ADN viral o plasmídico circular para formar cadenas de ADN lineales. Las cadenas de ADN extrañas seleccionadas que normalmente incluyen secuencias que codifican el producto proteico deseado se preparan en forma lineal mediante el uso de enzimas iguales o similares. El ADN viral o plasmídico lineal se incuba con el ADN extraño en presencia de enzimas ligantes capaces de efectuar un procedimiento de restauración y se forman vectores "híbridos" que incluyen el segmento de ADN exógeno seleccionado "empalmado" en el plásmido de ADN viral o circular.
El término "secuencia de nucleótidos que codifica..." generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonudeótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado, y generalmente representa la parte de un gen que codifica un determinado polipéptido o proteína. El término incluye, sin limitación, a Dn monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias o regiones monocatenarias, bicatenarias y de tres cadenas, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN es decir, una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser regiones monocatenarias o, más por lo general, bicatenarias o de tres cadenas, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, interrumpidas por un fago integrado o una secuencia de inserción o edición) junto con regiones adicionales que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.
El al menos un transportador de glucosa se selecciona del grupo que consiste en proteínas de difusión facilitada por glucosa y permeasas translocadoras de glucosa. Una proteína de fusión facilitada por glucosa apropiada está codificada por el genglfdeZymomonas mobilis subsp. mobilis(cepa ATCC 31821 / ZM4 / CP4). Una permeasa de translocación de glucosa apropiada está codificada por el gengalpdeE. coliK-12. La permeasa de translocación de glucosa también se conoce como simportador de galactosa-protón o galactosa permeasa, pero también importa glucosa a través de la membrana celular.
De este modo, en una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende y expresa al menos un gen que comprende la región codificante de proteína del genglfdeZymomonas mobilis subsp. mobilis(cepa ATCC 31821 / ZM4 / CP4), el gengalpdeE. coliK-12 o variantes funcionales del mismo.
El término "variante(s)", tal como se usa en este documento, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero que conserva las propiedades (enzimáticas) esenciales del polinucleótido o polipéptido de referencia. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones o deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una variante alélica de origen natural, o puede ser una variante que no se sabe que se produzca de forma natural. Se pueden preparar variantes no naturales de polinucleótidos y polipéptidos mediante técnicas de mutagénesis, mediante síntesis directa y mediante otros métodos recombinantes conocidos para los expertos en la técnica.
Dentro del alcance de la presente invención, también se incluyen variantes polimórficas de ácido nucleico/polinucleótido y polipéptido, alelos, mutantes y homólogos entre especies, que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior a aproximadamente el 60 %, 65%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, preferiblemente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente sobre una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos, a un polipéptido codificado por una proteína de tipo salvaje.
De acuerdo con lo anterior, una "variante funcional" de cualquiera de los genes/proteínas divulgados en el mismo pretende designar variantes de secuencia de los genes/proteínas que aún conservan la misma o algo menor actividad del gen o proteína del que deriva el fragmento respectivo.
La célula microbiana modificada genéticamente posee una ruta de biosíntesis de UDP-galactosa para la formación intracelular de GDP-galactosa (GDP-Gal), porque se necesita un suministro eficiente de UDP-galactosa para la biosíntesis intracelular de lactosa.
En una realización adicional y/o alternativa, la UDP-galactosa se puede obtener a partir del propio metabolismo de las células microbianas, es decir, de la actividad de una fosfoglucomutasa, una UTP-glucosa-1-fosfato-uridiltransferasa y una UDP-glucosa-4-epimerasa.
El suministro intracelular de GDP-galactosa se puede mejorar mediante modificaciones genéticas tales como una expresión o sobreexpresión de uno o más de los genes que codifican polipéptidos que exhiben actividad fosfoglucomutasa, actividad UDP-glucosa-1-fosfato-uridiltransferasa y actividad UDP-glucosa-4-epimerasa, respectivamente.
El término "sobreexpresión" o "sobreexpresado" como se usa en este documento se refiere a un nivel de expresión de enzima o polipéptido que es superior a lo que se mide en una célula de tipo salvaje de la misma especie que la célula hospedadora que no ha sido alterada genéticamente.
La fosfoglucomutasa es una enzima que facilita la interconversión de glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato en un monómero de a-D-glucosa desde la posición 1' a la 6' o de la posición 6' a 1'. Un gen de ejemplo que codifica una fosfoglucomutasa apropiada es el genpgmdeE. coliK-12 (GenBank: U08369.1). De este modo, en una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende y expresa/sobreexpresa un gen que codifica una fosfoglucomutasa, comprendiendo el gen preferiblemente la región codificante de proteína del genpgmdeE. colio una variante del mismo.
La UTP-glucosa-1-fosfato-uridiltransferasa tal como GalU o una variante funcional de la misma cataliza la conversión de a-D-glucosa-1-fosfato en UDP-glucosa usando UTP Un gen de ejemplo que codifica una UTP-glucosa-1-fosfatouridiltransferasa apropiada es el gengalUdeE. coliK-12 (GenBank: M98830.1). De este modo, en una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende y expresa/sobreexpresa un gen que codifica una UTP-glucosa-1-fosfato-uridiltransferasa, comprendiendo el gen preferiblemente la región codificante de proteína del gengalUdeE. colio una variante del mismo.
La UDP-glucosa-4-epimerasa tal como GalE o una variante funcional de la misma cataliza la epimerización de UDP-glucosa a UDP-galactosa. Un gen de ejemplo que codifica una UDP-glucosa-4-epimerasa es el gengalEdeE. coliK-12. De este modo, en una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende y expresa/sobreexpresa un gen que codifica una UDP-glucosa-4-epimerasa, comprendiendo el gen preferiblemente la región codificante de proteína del gengalEdeE. colio una variante del mismo.
En una realización adicional y/o alternativa, la ruta de biosíntesis de UDP-galactosa comprende adicionalmente la actividad enzimática de una glucosa-6-fosfato isomerasa que convierte la fructosa-6-fosfato en glucosa-6-fosfato y viceversa. Un gen de ejemplo que codifica una glucosa-6-fosfato isomerasa es el genpgideE. coliK-12. De este modo, en una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende y expresa/sobreexpresa un gen que codifica una glucosa-6-fosfato isomerasa, comprendiendo el gen preferiblemente la región codificante de proteína del genpgideE. colio una variante del mismo.
Alternativamente, se puede obtener UDP-galactosa alimentando con galactosa las células microbianas a través del medio de cultivo. La galactosa es absorbida por la célula y fosforilada a galactosa-1-fosfato que luego se convierte en UDP-galactosa. Los genes que codifican las enzimas que poseen las actividades enzimáticas requeridas se conocen en la literatura (Groissoird et al., "Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway (2003) J. Bacteriol. 185(3) 870-878).
La célula microbiana modificada genéticamente comprende una p-1,4-galactosiltransferasa que es capaz de galactosilar monosacárido de glucosa libre. En una realización adicional y/o alternativa, una p-1,4-galactosiltransferasa apropiada se deriva deNeisseria menningitidis,deAggregatibacter aphrophilus de Pasteurella multocida,preferiblemente una p-1,4-galactosiltransferasa codificada por el genIgtBdeNeisseria menningitidis,por el genlex-1deAggregatibacter aphrophiluso por el gengalTpm1141dePasteurella multocida(GenBank: AEC04686) a p-1,4-galactosiltransferasa. De este modo, en una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende y expresa/sobreexpresa un gen que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa, comprendiendo el gen preferiblemente la región codificante de proteína del genIgtBdeNeisseria menningitidis,el genlex-1deAggregatibacter aphrophilus,el gengalTpm1141dePasteurella multocidao una variante de los mismos.
La p-1,4-galactosiltransferasa usa UDP-galactosa como sustrato para la transferencia de la unidad estructural galactosa al monosacárido de glucosa libre, sintetizando así un disacárido de galactosa-p1,4-glucosa, es decir, lactosa.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende al menos una glicosiltransferasa adicional, es decir, además de dicha p-1,4-galactosiltransferasa.
Generalmente, y a lo largo de la presente divulgación, el término "actividad glicosiltransferasa" o "glicosiltransferasa" designa y abarca enzimas que son responsables de la biosíntesis de disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, y catalizan la transferencia de unidades estructurales de monosacáridos a partir de un monosacárido/azúcar de nucleótido activado (el "donante de glicosilo") a una molécula aceptora de glicosilo.
En una realización preferida, la al menos una glicosiltransferasa adicional es una fucosiltransferasa, una sialiltransferasa, una glucosaminiltransferasa o una galactosiltransferasa, más preferiblemente, la al menos una glicosiltransferasa adicional se selecciona de al menos una de las siguientes: alfa-1,2-fucosiltransferasa, alfa-1,3-fucosiltransferasa, beta-1,3-N-acetilglucosamiltransferasa, beta-1,3-galactosiltransferasa, alfa-2,3-sialiltransferasa, alfa-2,6-sialiltansferasa, beta-1,4-galactosiltransferasa o beta-1,6-galactosiltransferasa.
La actividad enzimática de la al menos una glicosiltransferasa adicional permite la producción de oligosacáridos de interés que comprenden una unidad estructural galactosa-p-1,4-glucosa en su extremo reductor usando lactosa como aceptor para la actividad de la glicosiltransferasa adicional. La tabla 1 identifica los HMO más abundantes que pueden ser producidos por las células microbianas y los métodos divulgados en este documento como oligosacáridos de interés.
Tabla 1: Lista de oligosacáridos de interés que se pueden producir usando una célula microbiana modificada genéticamente y/o un método como se describe en este documento.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana comprende un sistema de fosfotransferasa translocadora de glucosa (PtsG). El sistema fosfotransferasa translocador de glucosa cataliza la fosforilación de la glucosa entrante al mismo tiempo que su translocación a través de la membrana celular.
El mecanismo general del sistema Pts es el siguiente: un grupo fosforilo del fosfoenolpiruvato (PEP) se transfiere, a través de una ruta de transducción de señales, a la enzima I (EI), que a su vez lo transfiere a un portador de fosforilo, la proteína histidina (HPr). Luego, Phospho-HPr transfiere el grupo fosforilo a una permeasa específica de azúcar, un complejo unido a una membrana conocido como enzima 2 (Ell), que transporta el azúcar a la célula. Ell consta de al menos tres dominios estructuralmente distintos: IIA, IIB y IIC. Estos pueden ya sea fusionarse en una sola cadena polipeptídica o existir como dos o tres cadenas interactivas, anteriormente llamadas enzimas II (EII) y III (EIII).
El primer dominio (IIA o EIIA) lleva el primer sitio de fosforilación específico de la permeasa, una histidina que está fosforilada por fosfo-HPr. El segundo dominio (IIB o EllB) está fosforilado por fosfo-IIA en un residuo cisteinilo o histidilo, dependiendo del azúcar transportado. Finalmente, el grupo fosforilo se transfiere del dominio IIB al sustrato de azúcar concomitantemente con la absorción de azúcar procesada por el dominio IIC. Este tercer dominio (IIC o ElIC) forma el canal de translocación y el sitio de unión al sustrato específico.
De este modo, el sistema PtsG adquiere glucosa exógena y proporciona glucosa-6-fosfato en la célula microbiana. La glucosa-6-fosfato puede usarse en la ruta de biosíntesis de UDP-galactosa y/o convertirse en fructosa-6-fosfato que a su vez puede usarse para generar trifosfatos ricos en energía en el metabolismo central y/o, por ejemplo, en la biosíntesis de sacáridos activados por nucleótidos tales como la GDP-fucosa.
En una realización adicional y/o alternativa, los genes de glucoquinasa de la célula microbiana se han eliminado o inactivado funcionalmente de manera que la célula microbiana no posee ningún polipéptido que tenga actividad de glucoquinasa. La glucoquinasa (Glk)b fosforila la glucosa libre en su átomo de carbono 6 para generar glucosasfosfato. En ausencia de actividad glucoquinasa, la glucosa libre que se transloca al citoplasma de la célula microbiana queda disponible como sustrato para que la p1,4-galactosiltransferasa produzca lactosa, mientras que la glucosa-6-fosfato obtenida de la actividad PtsG puede usarse para la formación de UDP-galactosa u otras ruitas metabólicas.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende un transportador de fructosa para translocar fructosa (Fru) del medio de cultivo al citoplasma de la célula microbiana. Un transportador de fructosa apropiado para la absorción de fructosa libre es una isoforma (PtsG-F) como se describe por Kornberg et al. PNAS 97: 1808-1812 (2000)).
La fructosa internalizada puede luego ser fosforilada por una fructoquinasa (FrK) para proporcionar fructosa-6-fosfato (Fru-6-P). La fructosa-6-fosfato se puede usar en la ruta de biosíntesis de UDP-galactosa y/o en otras rutas metabólicas tales como la generación de trifosfatos ricos en energía en el metabolismo central y/o, por ejemplo, en la biosíntesis de sacáridos activados por nucleótidos tales como GDP-fucosa.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende polipéptidos que exhiben actividad fructoquinasa-6 y polipéptidos que exhiben actividad 6-fosfofructoquinasa-1 (FruK o fosfofructoquinasa) para proporcionar una ruta metabólica desde la fructosa internalizada a través de la fructosa-6-fosfato hasta fructosa-1,6-bifosfato.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende un sistema de fosfotransferasa translocadora de fructosa (PtsF). El sistema de fosfotransferasa translocadora de fructosa cataliza la fosforilación de la fructosa entrante al mismo tiempo que su translocación a través de la membrana celular.
De este modo, el sistema PtsF adquiere fructosa exógena y proporciona fructosa-1-fosfato a la célula microbiana. El sistema PtsF comprende una proteína que atraviesa la membrana FruA, una 1-fosfofructosa quinasa (FruK) y una proteína de transferencia de difosforilo FruB. La fructosa se transloca mediante FruA y FruB para proporcionar fructosa-1-fosfato en el citoplasma. La fructosa-1-fosfato puede ser fosforilada aún más por una fosfofructoquinasa (FruK) para producir fructosa-1,6-bifosfato que a su vez puede ser usada por la célula microbiana para generar trifosfatos ricos en energía en el metabolismo central.
Otro sistema PtsF apropiado comprende LevD, LevE, LevF y LevG. LevD es el componente de la enzima fosfotransferasa IIA específica de fructosa. LevE es el componente de la enzima fosfotransferasa IIB específica de la fructosa. LevF es el componente IIC de la permeasa de fructosa, LevG es el componente IID de la permeasa de fructosa. Genes correspondienteslevD, levE, levFylevGson - por ejemplo conocidos deBacillus subtilis(cepa 168). Dicho sistema PtsF aporta fructosa-1-fosfato a la célula.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende al menos una 1-fosfofructoquinasa (FruK).
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende una fructosa-1,6-bisfosfatasa (GIpX). Dicha fructosa-1,6-bisfosfatasa desfosforila la fructosa-1,6-bisfosfato para proporcionar fructosa-6-fosfato. La fructosa-6-fosfato puede ser usada por la célula microbiana en la ruta de biosíntesis de GDPgalactosa o en otra ruta metabólica, por ejemplo, en la biosíntesis de sacáridos activados por nucleótidos tales como GDP-fucosa.
Preferiblemente, la célula microbiana también comprende una deleción o inactivación funcional de su(s) gen(es) de fosfofructocinasa. La deleción o inactivación funcional del gen o genes de fosfofructoquinasa conduce a una célula microbiana que carece de actividad de fosfofructoquinasa de modo que se previene la conversión de Fru-6-P en Fru-I , 6-bisP. EnE. coli,Están presentes dos isoformas de fosfofructoquinasa, denominadas PfkA y PfkB. Los genes correspondientes sonpfkAypfkB.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente posee una ruta de biosíntesis de GDP-L-fucosa. En una realización adicional y/o alternativa, la ruta de biosíntesis de GPD-fucosa comprende una manosa-6-fosfato isomerasa (ManA), una fosfomanomutasa (ManB), una manosa-1-fosfatoguanililtransferasa (ManC), una GDP-manosa- 4,6-deshidratasa (Gmd), una GDP-L-fucosa sintasa (WcaG). Preferiblemente, la célula microbiana que posee una ruta de biosíntesis de GDP-L-fucosa también posee una fucosiltransferasa.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana comprende una proteína exportadora o una permeasa que exporta el oligosacárido de interés desde la célula, preferiblemente un transportador de eflujo de azúcar.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana modificada genéticamente comprende una deleción de la inactivación funcional de su gen de glucosa-6-fosfato isomerasa de modo que la célula microbiana carece de actividad glucosa-6-fosfato isomerasa. Glucosa-6-fosfato isomerasa, enE. colidenominado Pgi, convierte la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Al eliminar el gen o los genes de glucosa-6-fosfato o al inactivar su expresión, cualquier glucosa-6-fosfato presente en el citoplasma de la célula microbiana puede dirigirse hacia la producción de lactosa.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana es una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en bacterias del géneroEscherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, LactococcusyClostidium,preferiblemente una célula bacteriana que se selecciona del grupo de especies bacterianas que consiste enEscherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clotridium cellulolyticum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii,yLactococcus lactis.En otra realización, la célula microbiana es unaEscherichia coli.Un experto en la técnica conocerá otras cepas bacterianas al leer la presente divulgación.
En una realización adicional y/o alternativa, el oligosacárido de interés es un oligosacárido de la leche humana seleccionado del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, 3-sialillactosa, 6'-sialillactosa, 3-fucosil-3'-sialillactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-A/-neotetraosa, lacto-A/-fucopentaosa I, lacto-W-fucopentaosa II, lacto-W-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-difucosilhexosa I, lacto-W-difucosilhexaosa II, lacto-W-sialpentaosa LSTa, LSTb, LSTc.
Preferiblemente, la mezcla de glucosa y al menos un monosacárido adicional es una materia prima mixta de glucosa y fructosa, obtenida preferiblemente mediante hidrolización de sacarosa.
En una realización adicional y/o alternativa, la célula microbiana se cultiva sin suministro exógeno de lactosa, en particular cuando se cultiva para la producción del oligosacárido de interés.
La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a los dibujos, pero la invención no se limita a los mismos sino únicamente a las reivindicaciones. Adicionalmente, los términos primero, segundo y similares en la descripción y en las reivindicaciones se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir una secuencia, ya sea temporal, espacialmente, en clasificación o de cualquier otra manera. Debe entenderse que los términos así usados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en este documento son capaces de funcionar en otras secuencias que las descritas o ilustradas en este documento.
Cabe señalar que el término "que comprende", usado en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringido a los medios enumerados a continuación; no excluye otros elementos o etapas. De este modo, debe interpretarse como que especifica la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. De este modo, el alcance de la expresión "un dispositivo que comprende los medios A y B" no debe limitarse a dispositivos que consisten únicamente en los componentes A y B. Significa que con respecto a la presente invención, los únicos componentes relevantes del dispositivo son A y B.
En una realización, una cepa deE. colique posee el genotipolacY-, lacZ-, fuclK-, wcaJ-está diseñada metabólicamente para producir eficientemente 2'-fucosillactosa mediante fermentación total usando una materia prima de monosacáridos mixtos (por ejemplo, sacarosa hidrolizada) como fuente principal de carbono y energía. Por lo tanto, la expresión del gen de la glucocinasaglky/o el gen de la glucosa deshidrogenasagcdy/o el gen de la permeasa PTS de glucosaptsGse reduce y/o se suprime. Además, un gen de permeasa de glucosa se expresa o sobreexpresa en dicha cepa deE. coli.
Adicionalmente, al menos uno de los genes deE. coli manA, manC, manB, gmd, wcaG, pgm, galUygalEasí como la expresión de una p-1,4-galactosiltransferasa heteróloga, capaz de transferir galactosa de UDP-galactosa a glucosa, generando de este modo lactosa, y una a-1,2-fucosiltransferasa, capaz de transferir fucosa de GDP-fucosa a la lactosa, generando de este modo 2'-fucosillactosa, se expresan/sobreexpresan.
En una realización preferida, esta cepa de producción se modifica adicionalmente reduciendo y/o disminuyendo la expresión de los genes de fosfofructoquinasapfkAy/opfkBy/o el gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasazwfy/o el gen de la glucosa-6-fosfato isomerasapgi.Esta modificación genética adicional permite el cultivo de la cepa de producción diseñada de este modo en una materia prima de monosacáridos mixtos (por ejemplo, sacarosa hidrolizada) como fuente principal de carbono y energía, evitando al mismo tiempo obstaculizar el metabolismo de la cepa pero aumentando el suministro de precursores (glucosa y fructosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato) para la producción de 2'-fucosillactosa por fermentación total.
Con referencia a la figura 1, se muestra esquemáticamente una célula microbiana de ejemplo de la invención. Dicha célula microbiana es capaz de producir 2'-FL cuando se cultiva en una materia prima mixta que consiste en glucosa (Glu) y fructosa (Fru), pero dicha materia prima mixta no contiene lactosa (Lac). La célula microbiana expresa polinucleótidos que codifican un transportador de glucosa (Glf) y un transportador de fructosa para la importación de glucosa y fructosa a la célula, respectivamente. Como la expresión de la glucosaquinasa Glk ha sido abolida por la deleción o inactivación funcional del(los) gen(es)glk,cualquier glucosa importada por la célula queda disponible como sustrato para la p1,4-galactosiltransferasa GalTpm1141 mediante la ruta de biosíntesis de UDP-galactosa para generar lactosa (Lac) intracelularmente.
La fructosa-6-quinasa de la célula fosforila la fructosa importada para generar una reserva intracelular de Fru-6-P. Una parte de la reserva de Fru-6-P se usa en la "ruta de biosíntesis de UDP-Gal" para sintetizar intracelularmente UDP-Gal, que sirve como donante de Gal para que la galactosiltransferasa GalTpm1141 genere Lac. Otra parte de la reserva de fru-6-P se usa en la "ruta de biosíntesis de GDP-L-Fuc" para la producción de GDP-L-fucosa. Dicha GDP-L-fucosa sirve como donante de fucosa para la 2'-fucosiltransferasa WbgL. Sin embargo, una tercera parte de la reserva intracelular de Fru-6-P se usa para la producción de energía y biomasa, ya que su fru-6-P se convierte en Fru-1,6-bisP mediante las fosfofructoquinasas celulares PfkA y/o PfkB.
La figura 2 muestra esquemáticamente otra célula microbiana de ejemplo de la invención que es capaz de producir 2'-FL cuando se cultiva en una materia prima mixta que consiste en glucosa (Glu) y fructosa (Fru), pero dicha materia prima mixta no contiene lactosa (Lac). Además de la célula microbiana de ejemplo que se muestra en la figura 1, la célula microbiana comprende además un sistema Pts específico de glucosa (PtsG). Dicho sistema PtsG importa y fosforila Glu para proporcionar Glu-6-P en el citosol de la célula. Dicho Glu-6-P puede ser usado por la célula microbiana para generar UDP-Gal o Fru-6-P. En una variante de la célula microbiana (no mostrada), se elimina(n) el(los) gen(es)pgide la célula que codifican una glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi). Junto con la deleción del genglk,el microbiano ha sido modificado genéticamente de modo que el monómero de glucosa libre adquirido por Glf queda disponible como sustrato para la p1,4-galactosiltransferasa, mientras que cualquier Glu-6-P adquirido mediante PtsG queda disponible para la biosíntesis de UDP-Gal.
La figura 3 muestra esquemáticamente otra célula microbiana de la invención de ejemplo capaz de producir 2'-FL cuando se cultiva en una materia prima mixta que consiste en glucosa (Glu) y fructosa (Fru), pero dicha materia prima mixta no contiene lactosa (Lac). Además de la célula microbiana de ejemplo que se muestra en la figura 2, la célula microbiana comprende además un sistema Pts específico de fructosa (PtsF). Dicho sistema PtsF importa y fosforila Fru para proporcionar Fru-1-P. Fru-1-P es fosforilada por FruK para proporcionar Fru-1,6-bisP. La célula microbiana posee actividad fructosa-1,6-bisfosfatasa (GlpX). Así, la célula microbiana modificada genéticamente se modifica metabólicamente de manera que la célula pueda usar fructosa y/o fructosa-1-P para la biosíntesis de UDP-Gal.
Además, el(los) gen(es) de fosfofructoquinasa se eliminan o se inactivan funcionalmente de manera que la célula no posee actividad de fosfofructoquinasa (PfkA/PfkB). La deleción o inactivación funcional de los genes de fosfofructoquinasa perjudica la conversión de Fru-6P en Fru-1,6-P, de modo que se evita el uso de Fru-6-P para generar trifosfatos ricos en energía y se potencia la producción de 2'-FL.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación de una materia prima de monosacáridos mixtos
Se preparó una solución de sacarosa al 50 % (p/v) disolviendo 500 g de sacarosa en agua. El volumen final de la solución fue de 1 litro. A una temperatura de 30 °C a 35 °C, el pH se ajustó usando ácido sulfúrico al 96 % (v/v). Posteriormente, la solución se esterilizó en un autoclave vertical (Systec VX-65, Linden, Alemania) a 121 °C durante 45 minutos. Se tomaron muestras antes y después de la esterilización térmica y se mantuvieron congeladas antes del análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La HPLC se llevó a cabo usando un detector de índice de refracción RID-10A (Shimadzu, Alemania) y una columna de amida Waters XBridge de 3.5 pm (250 * 4.6 mm) (Eschborn, Alemania) conectada a un sistema de HPLC Shimadzu. La elución isocrática se llevó a cabo con 30 % de disolvente A (50 % (v/v) de acetonitrilo en agua bidestilada, 0.1 % (v/v) de NH4OH) y 70 % de disolvente B (80 % (v/v) de acetonitrilo en agua bidestilada, 0.1 % (v/v) NH4OH) a 35 °C y a un caudal de 1.4 mL min-1. Las muestras se aclararon mediante extracción en fase sólida sobre una matriz de intercambio iónico (Strata ABW, Phenomenex). Se aplicaron a la columna diez microlitros de la muestra (dilución de 1:5). Finalmente, se determinó la cantidad relativa de azúcares detectados. Como se muestra en la tabla 1, la conversión de sacarosa en monosacáridos glucosa y fructosa aumentó al disminuir los valores de pH de las soluciones antes del tratamiento térmico. La escisión completa de la sacarosa se pudo observar a valores de pH < 3.50 cuando la acidificación se llevó a cabo con ácido sulfúrico.
Tabla 1: Cantidad relativa de azúcares detectados en una solución de sacarosa al 50 % (p/v) con pH ajustado antes y después de la esterilización térmica. El ajuste del pH se llevó a cabo usando ácido sulfúrico al 96 % (v/v). Se muestra la cantidad porcentual de azúcares (área bajo la curva; AUC) detectada por HPLC.
Ejemplo 2: Crecimiento dependiente de la materia prima de varias cepas de deleción de genes
Se comparó el comportamiento de crecimiento de una cepa deE. coliBL21(DE3) (tipo salvaje), así como las cepas mutadasE. coli pfkA-(ApfkA),E. coli pfkB- (ApfkB), E. coli pfkA- pfkB- (ApfkA ApfkA).Las deleciones genómicas se realizaron según el método de Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Todas las cepas se cultivaron a 30 °C en matraces de 100 mL con agitación y 20 mL de medio de sales minerales que contenía 7 g L<' 1>de NH4H2PO4, 7 g-L<' 1>de k2HPO4, 2 g L<-1>de KOH, 0.3 g L<-1>de ácido cítrico, 2 g-L<-1>de MgSO4 * 7 H2O y 0.015 g L -<1>de CaCh * 6 H2O, complementado con 1 mL L<-1>de solución de oligoelementos (54.4 g L<-1>de citrato férrico de amonio, 9.8 g L<-1>de MnCh * 4 H2O, 1.6 g L<-1>de CoCh * 6 H2O, 1 g L<-1>de CuCh * 2 H2O, 1.9 g L<-1>de H3BO3, 9 g L<-1>de ZnSO4 * 7 H2O, 1.1 g L<-1>de Na2MoO4 * 2 H2O, 1.5 g L<-1>de Na2SeO3, 1.5 g L<-1>de NiSO4 * 6 H2O) y que contiene ya sea 2 % (m/v) de glucosa (A) o 1 % (p/v) de glucosa/1 % (p/v) de fructosa (B) como fuente de carbono. Los cultivos se inocularon hasta OD 0.1 y el desarrollo del crecimiento se controló durante 26 horas mediante medición de OD600. Como se muestra en la figura 2,E. coli pfkA- pfkB-apenas mostró crecimiento cuando se proporcionó glucosa como única fuente de carbono y energía, mientras que su crecimiento fue indistinguible de la cepa de tipo salvaje, así como de los mutantes de deleción única cuando estaba disponible la materia prima de monosacáridos mixtos.
Ejemplo 3 - Fermentación total de 2'-fucosillactosa mediante una cepa deE. colidiseñada durante el crecimiento en una materia prima de monosacáridos mixtos
Una cepa deE. coliBL21 (DE3) que exhibe el genotipo.pfkA-, lacZ-, fuclK-, wcaJ-, glk-, gcd-, ptosG-,además se modificó genéticamente mediante la sobreexpresión de enzimas para la síntesis de novo de GDP-fucosa (ManB, ManC, Gmd, WcaG), el gen de la 2'-fucosiltransferasawbgLdeE.coli:O126, el gen transportador de eflujo de azúcaryberc0001_9420deYersinia bercovieriATCC 43970, el gen facilitador de la glucosaglfdeZymomonas mobilis,el gen de la p-1,4-galactosiltransferasagalTpm1141dePasteurella multocida(GenBank: AEC04686) así como los genesgalEypgmdeE. coli,que codifican una UDP-glucosa 4-epimerasa y una fosfoglucomutasa, respectivamente. Las deleciones genómicas se realizaron según el método de Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). La integración genómica de genes heterólogos se realizó mediante transposición. Se usó la transposasa EZ-Tn5TM (Epicentre, EE. UU.) para integrar fragmentos de ADN lineales o el mutante C9 hiperactivo de la transposasa mariner Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96:11428-11433) se usó para la transposición. Los genes fueron optimizados con codones para su expresión enE. coliy preparados sintéticamente mediante la cooperación de GenScript.
La cepa deE. coliresultante se cultivó a 30 °C en un fermentador de 3 L (New Bruns-wick, Edison, EE. UU.) comenzando con 1000 mL de medio de sales minerales que contenía 7 g L .-1 de NH4H2PO4, 7 g L-1 de k2HPO4, 2 g L-1 de KOH, 0.3 g L -1 de ácido cítrico, 2 g L-1 de MgSO4 x 7 H2O y 0.015 g L -1 de CaCh x 6 H2O, complementado con 1 m LL-1 de solución de oligoelementos (54.4 g L-1 de citrato férrico de amonio, 9.8 g L-1 de MnCh x 4 H2O, 1.6 g L-1 de COCl2 x 6 H2O, 1 g L-1 de CuCh x 2 H2O, 1.9 g L-1 de H3BO3, 9 g L-1 de ZnSO4 x 7 H2O, 1.1 g L-1 de Na2MoO4 x 2 H2O, 1.5 g L-1 de Na2SeO3, 1.5 g L-1 de NiSO4 x 6 H2O) y que contiene 2 % (m/v) de sacarosa hidrolizada como fuente de carbono. El cultivo se inició con la adición de un inóculo al 2.5 % (v/v) de un precultivo cultivado en el mismo medio. El final de la fase discontinua se caracterizó por un aumento del nivel de oxígeno disuelto. Una alimentación de carbono que consiste en sacarosa completamente hidrolizada, complementada con 2 g L-1 de MgSO4 x 7 H2O, 0.015 g L-1 de CaCh x 6 H2O y 1 m LL -1 solución de oligoelementos, se aplicó instantáneamente después de salir de la fase discontinua. Una tasa de alimentación de 12.0 - 15.0 ml-L-1- h-1 se aplicó, refiriéndose al volumen inicial. La aireación se mantuvo a 3 L min.-1. El oxígeno disuelto se mantuvo al 20-30 % de saturación controlando la velocidad de agitación. El pH se mantuvo en 6.7 agregando una solución de amoníaco al 25 %. El cultivo duró 86 horas y produjo cantidades sustanciales de 2'-FL en el sobrenadante del cultivo.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método de producción de lactosa o un oligosacárido de interés que comprende una unidad estructural galactosap1,4-glucosa en su extremo reductor, comprendiendo el método las etapas de:
a) proporcionar una célula microbiana modificada genéticamente, en el que dicha célula microbiana posee:
- al menos un transportador de glucosa para translocar glucosa del medio de cultivo al citoplasma de la célula microbiana de manera que la glucosa libre esté disponible para la biosíntesis intracelular de lactosa, en el que el al menos un transportador de glucosa se selecciona del grupo que consiste en proteínas de difusión facilitada por glucosa y permeasas translocadoras de glucosa;
- una ruta de biosíntesis de UDP-galactosa; y
- siendo capaz al menos una p-1,4-galactosiltransferasa de galactosilar la glucosa libre para producir lactosa intracelularmente;
b) cultivar la célula microbiana en un medio de cultivo y en condiciones que sean permisivas para la producción de dicha lactosa u oligosacárido de interés, en el que el medio de cultivo contiene una mezcla de glucosa y al menos un compuesto adicional seleccionado del grupo que consiste en fructosa, galactosa, manosa, xilosa, ramnosa, glicerol, succinato, piruvato y malato como principal fuente de carbono; y
c) recuperar la lactosa u oligosacárido de interés del medio de cultivo y/o de la célula microbiana.
2. El método según la reivindicación 1, en el que el oligosacárido de interés es un oligosacárido de la leche humana seleccionado del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, 3'-sialillactosa, 6'-sialillactosa, 3-fucosil-3'-sialillactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-A/-fucopentaosa I, lacto-W-fucopentaosa II, lacto-W-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-difucosilhexosa I, lacto-W-difucosilhexaosa II, lacto-W-sialilpentaosa LSTa, LSTb, LSTc.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que la mezcla de glucosa y al menos un monosacárido adicional es una materia prima mixta de glucosa y fructosa, obtenida preferiblemente mediante hidrolización de sacarosa.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula microbiana se cultiva sin suministro exógeno de lactosa.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha célula microbiana expresa o sobreexpresa al menos un gen que codifica el transportador de glucosa, preferiblemente al menos un gen seleccionado del grupo que consiste englf, galPy variantes funcionales de los mismos.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha célula microbiana posee una fosfoglucomutasa, una UTP-glucosa-1-fosfato-uridiltransferasa y una UDP-glucosa 4-epimerasa.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la p-1,4-galactosiltransferasa está codificada por un gen seleccionado del grupo que consiste enNeisseria meningitidis IgtB, Aggregatibacter aphrophilus lex-1, Pasteurella multocida galTpm1141y variantes funcionales de los mismos.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha célula microbiana posee al menos una glicosiltransferasa adicional, preferiblemente una glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en fucosiltransferasas, sialiltransferasas, glucosaminiltransferasas y galactosiltransferasas.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula microbiana comprende un sistema de fosfotransferasa translocadora de glucosa.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha célula microbiana posee un transportador de fructosa.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la célula microbiana posee un sistema de fosfotransferasa específico de fructosa, y en el que la célula comprende además 1-fosfofructoquinasa.
12. El método según la reivindicación 10, en el que dicha célula microbiana comprende actividad fructoquinasa-6 y actividad 6-fosfofructoquinasa-1.
13. El método según la reivindicación 11, en el que la célula microbiana comprende una fructosa-1,6-bisfosfatasa.
14. El método según la reivindicación 11 o 13, en el que dicha célula microbiana comprende una deleción o inactivación funcional de su glucosa-6-fosfato isomerasa.
15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que la glicosiltransferasa adicional es una fucosiltransferasa, y en el que dicha célula microbiana posee una manosa-6-fosfato isomerasa, una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato-guanililtransferasa, una GDP-manosa-4,6-deshidratasa, una GDP-L-fucosa sintasa.
16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha célula microbiana comprende una proteína exportadora o una permeasa que exporta el oligosacárido de interés desde la célula, preferiblemente un transportador de eflujo de azúcar.
17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha célula microbiana es una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en bacterias de los génerosEscherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, LactococcusyClostidium,preferiblemente una célula bacteriana que se selecciona del grupo de especies bacterianas que consiste enEscherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clotridium cellulolyticum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii,yLactococcus lactis.
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