ES2663627T3 - Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones - Google Patents
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Abstract
Célula hospedadora, transformada o transfectada con una secuencia polinucleotídica exógena, donde la secuencia polinucleotídica está contenida en un vector, y donde la secuencia polinucleotídica se selecciona a partir del grupo constituido por a) las SEQ ID NOs: 3 y 5 de la lista de secuencias adjunta; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a las SEQ ID NOs: 3 o 5; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias, estando ligada operablemente la secuencia polinucleotídica a secuencias de control reconocidas por la célula hospedadora transformada con el vector, donde la secuencia polinucleotídica codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3- fucosiltransferasa, y donde la célula hospedadora se selecciona a partir del grupo constituido por hongos, incluidas levaduras, y bacterias.
Description
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DESCRIPCION
Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
La presente invención se refiere a fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones.
Muchas (glico)proteínas, (glico)lípidos u oligosacáridos requieren la presencia de estructuras fucosiladas particulares, con el fin de mostrar una actividad biológica particular. Por ejemplo, muchos mecanismos de reconocimiento intercelular requieren un oligosacárido fucosilado: por ejemplo, con el fin de unirse a las moléculas de adhesión celular, tales como L-selectina, las estructuras celulares específicas han de comprender carbohidratos fucosilados. Otro ejemplo de estructuras fucosiladas que tienen una función biológica son las estructuras que forman el sistema del grupo sanguíneo AB0. Además, las (glico)proteínas terapéuticas representan la clase de reactivos farmacéuticos con un crecimiento más rápido, donde sus propiedades farmacocinéticas y estabilidad se adscriben a sus glicanos.
Debido a su compleja naturaleza y propiedades químicas inherentes, la síntesis química de los glicoconjugados es un desafío importante y asociado con dificultades considerables. A diferencia de las proteínas y ácidos nucleicos, para los cuales hay comercializados sintetizadores automáticos, los glicanos (y menos aún los glicoconjugados) no pueden (todavía) sintetizarse utilizando un sistema comercial general. Aparte del requisito de controlar la estereoquímica, la formación de uniones específicas sigue siendo difícil.
En vista de la complejidad asociada con la síntesis química o enzimática/química combinada de glicoconjugados, algunas estrategias recientes han utilizado glicosiltransferasas para sintetizar enzimáticamente (glico)proteínas y (glico)lípidos que comprenden residuos de oligosacáridos.
Las fucosiltransferasas, que pertenecen a la familia enzimática de glicosiltransferasas, están ampliamente expresadas en los vertebrados, invertebrados, plantas y bacterias. Catalizan la transferencia de un residuo de fucosa desde un donante, por lo general guanosina-difosfato fucosa (GDP-fucosa) a un aceptor, que incluye oligosacáridos, (glico)proteínas y (glico)lípidos. Los sustratos aceptores fucosilados de esta manera participan en diversos procesos biológicos y patológicos.
Se han identificado varias fucosiltransferasas, por ejemplo, en las bacterias Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella entérica, en mamíferos, Caenorhabditis elegans y Schistosoma mansoni, así como también en plantas, donde en función del sitio de la adición de fucosa, las fucosiltransferasas se clasifican en alfa 1,2, alfa 1,3/4 y O- fucosiltransferasas.
En los mamíferos, la GDP-fucosa se sintetiza en el citoplasma mediante la síntesis de novo y la ruta de recuperación. En la síntesis de novo, la GDP-manosa se convierte en GDP-fucosa mediante dos enzimas, mientras que la ruta de recuperación utiliza como sustrato la fucosa citosólica libre. En la célula, la GDP-fucosa se concentra en las vesículas y es reconocida por las fucosiltransferasas como un sustrato donante.
Cardeño-Tárraga et al. analizan la secuencia genómica completa de la bacteria Bacteroides fragilis, así como también las agrupaciones génicas de Bacteroides fragilis que participan potencialmente en la formación de cápsulas de antígeno O similares de E. coli.
El documento US 2006/0234354 A1 divulga métodos para la conversión enzimática práctica de GDP-manosa en GDP-fucosa, y estos métodos se utilizan para la preparación de oligosacáridos fucosilados. En el método descrito en él, se describe la enzima YEF B de E. coli catalizando la epimerización y reducción de GDP-4-ceto-6-D- desoximanosa en GDP-fucosa.
Los documentos WO 01/23398 A1 y US 5 922 577 divulgan la generación de oligosacáridos fucosilados, aplicando enzimas de tipo fucosiltransferasa humana.
Ya que la actividad biológica de muchos oligosacáridos, (glico)proteínas y (glico)lípidos importantes desde un punto de vista comercial depende de la presencia de residuos de fucosa concretos, en la técnica se requiere sintetizar o producir con eficacia glicoconjugados que tengan el(los) residuo(s) oligosacarídico(s) deseado(s).
Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar herramientas y métodos mediante los cuales se puedan producir sustratos fucosilados de una manera eficaz, y rentable respecto al tiempo y dinero, que generen cantidades elevadas del sustrato deseado.
De acuerdo con la invención, este objetivo se resuelve, entre otros, proporcionando una célula hospedadora fúngica o bacteriana, un uso y métodos de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, que comprenden o utilizan un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa y que comprende una secuencia o está constituido por una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por:
a) las SEQ ID NOs: 3 o 5 de la lista de secuencias adjunta;
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b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a las SEQ ID NOs: 3 o 5;
c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención representan fucosiltransferasas de la especie Bacteroides fragilis, donde las SEQ ID NOs: 3 y 5 muestran las secuencias polinucleotídicas de dos fucosiltransferasas de Bacteroides fragilis recién identificadas. La SEQ ID NO:1 de la lista de secuencias adjunta muestra la secuencia polinucleotídica de una fucosiltransferasa de Akkermansia muciniphila recién identificada.
Las fucosiltransferasas recién identificadas tienen efectos sorprendentes ya que utilizándolas se pueden llevar a cabo reacciones que no se producen de manera natural: En el alcance de la presente invención se ha descubierto que las alfa-1,3-fucosiltransferasas identificadas anteriormente son capaces de utilizar lactosa como sustrato y son capaces de producir oligosacáridos fucosilados, en particular 3-fucosillactosa. Hasta la fecha, ninguna de las alfa-
1,3-fucosiltransferasas conocidas aisladas a partir de bacterias ha mostrado que utilice lactosa como un sustrato natural para la producción de fucosillactosa. Por lo tanto, la idoneidad de las fucosiltransferasas recién identificadas que se van a utilizar para producir oligosacáridos fucosilados es sumamente sorprendente y, por lo tanto, su uso representa una herramienta excelente para producir fácilmente, con eficacia y ahorrando dinero, por ejemplo, oligosacáridos de la leche humana (HMO, por sus siglas en inglés), tales como fucosillactosa. En la actualidad, se han caracterizado estructuralmente más de 80 compuestos, que pertenecen a HMO; representan una clase de oligosacáridos complejos que actúan como prebióticos. Además, la homología estructural de HMO respecto a los epítopos epiteliales justifica las propiedades protectoras contra los patógenos bacterianos. Dentro del tubo gastrointestinal de los lactantes, los HMO fomentan selectivamente el crecimiento de cepas bacterianas seleccionadas y, por lo tanto, ceban el desarrollo de una microbiota intestinal única en los lactantes alimentados con leche materna.
Hasta la fecha, la complejidad estructural de estos oligosacáridos ha impedido su producción sintética, y la principal fuente de HMO sigue siendo la leche humana. Por lo tanto, se necesitan HMO que se puedan obtener con facilidad y prontitud, los cuales se pueden proporcionar utilizando las fucosiltransferasas (sorprendentemente adecuadas) que se muestran en la presente.
De acuerdo con la presente invención, el término «polinucleótido(s)» se refiere por lo general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El término «polinucleótido(s)» incluye, sin carácter limitante, ADN mono- y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias o regiones mono-, bi- y tricatenarias, ARN mono- y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más comúnmente, regiones bicatenarias o tricatenarias, o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. Además, el término «polinucleótido», tal como se utiliza en la presente, se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las hebras en tales regiones pueden proceder de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero normalmente solo está implicada una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región helicoidal triple es a menudo un oligonucleótido. Tal como se utiliza en la presente, el término «polinucleótido(s)» también incluye ADN o ARN como los descritos anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con esqueletos modificados por estabilidad u otras razones son «polinucleótido(s)» con el significado que se le da al término en la presente. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos según se utiliza el término en la presente. Se apreciará que se han realizado una gran variedad de modificaciones en el ADN y ARN con muchos fines útiles que conocen los expertos en la técnica. El término «polinucleótido(s)», tal como se emplea en la presente, engloba tales formas modificadas de manera química, enzimática o metabólica de polinucleótidos, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluidas, por ejemplo, células simples y complejas. Asimismo, el término «polinucleótido(s)» también engloba polinucleótidos cortos denominados a menudo oligonucleótido(s).
El término «polipéptido(s)» se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. El término «polipéptido(s)» se refiere tanto a cadenas cortas, denominadas normalmente péptidos, oligopéptidos y oligómeros y a cadenas más largas denominadas generalmente proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos que no son los 20 aminoácidos codificados por genes. El término «polipéptido(s)» incluye los modificados mediante procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, pero también mediante técnicas de modificación químicas. Tales modificaciones se describen bien en los textos básicos y con más detalle en las monografías, así como también en una bibliografía de investigación voluminosa, y son muy conocidas por los expertos en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en un grado idéntico o variable en varios sitios en un polipéptido concreto. Asimismo, un polipéptido concreto puede contener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar de un polipéptido, incluidos el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos y el extremo amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto
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hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, selenoilación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación, y ubiquitinación. Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y circulares ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales y puede que se generen también mediante procesos totalmente sintéticos.
El término «aislado» significa alterado «por el hombre» respecto a su estado natural, es decir, si está presente en la naturaleza, se ha modificado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo no está «aislado», pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales con los que coexiste en su estado natural está «aislado», según se emplea el término en la presente. De manera similar, una secuencia «sintética», según se utiliza el término en la presente, se refiere a cualquier secuencia que se ha generado de manera sintética y no se ha aislado directamente de una fuente natural. El término «recombinante» se refiere a ADN modificado genéticamente preparado sometiendo genes a corte y empalme o trasplantándolos de una especie a las células de un organismo hospedador de una especie diferente. Tal ADN se vuelve parte de la dotación genética del hospedador y se replica.
La expresión «polinucleótido que codifica un polipéptido», tal como se utiliza en la presente, engloba polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, especialmente, una alfa-1,3- fucosiltransferasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en las SEQ ID NOs: 2, 4 y 6. La expresión también engloba polinucleótidos que incluyen una región continua única o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, interrumpidas por un fago integrado o una inserción de secuencia o edición) junto con regiones adicionales que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.
El término «variante(s)», tal como este se utiliza en la presente, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, de referencia pero retiene propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se explica más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Por lo general, las diferencias son limitadas de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son, en global, muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y el polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo aminoacídico sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede tener un origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante de la que no se sabe que ocurra en la naturaleza. Las variantes que no tienen un origen natural de polinucleótidos y polipéptidos se pueden generar mediante técnicas de mutagénesis, mediante síntesis directa y mediante otros métodos recombinantes conocidos por los expertos en la técnica.
Los términos «alfa-1,3-fucosiltransferasa» o «fucosiltransferasa» o un ácido nucleico/polinucleótido que codifica una «alfa-1,3-fucosiltransferasa» o «fucosiltransferasa» se refieren a una glicosiltransferasa que cataliza la transferencia de una fucosa de un sustrato donante, por ejemplo, GDP-fucosa, a una molécula aceptora en una unión alfa-1,3. La molécula aceptora puede ser un carbohidrato, un oligosacárido, una proteína o (glico)proteína, o un lípido o (glico)lípido, y puede ser, por ejemplo, A/-acetilglucosamina, W-acetillactosamina, galactosa, fucosa, ácido siálico, glucosa, lactosa o cualquier combinación de estos. En el alcance de la presente invención, también están comprendidas por esos términos variantes polimórficas de ácidos nucleicos/polinucleótidos y polipéptidos, alelos, mutantes y homólogos entre especies, que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más de aproximadamente un 60% de identidad secuencial de aminoácidos, un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferentemente un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% o más de identidad secuencial de aminoácidos, preferentemente en una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos, respecto a un polipéptido codificado por un ácido nucleico seleccionado entre las SEQ ID NOs: 1, 3 o 5, o una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 2, 4 o 6.
Además, el polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa puede estar alterado por adiciones o deleciones de secuencias peptídicas con el fin de modificar su actividad. Por ejemplo, las secuencias polipeptídicas se pueden fusionar al polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa con el fin de hacer efectiva una actividad enzimática adicional. Como alternativa, los aminoácidos se pueden eliminar para anular o modificar la actividad de la proteína. La proteína se puede modificar para que carezca de actividad enzimática alfa-1,3-fucosiltransferasa pero siga manteniendo su estructura tridimensional. Tal modificación puede ser útil en el desarrollo de anticuerpos contra el polipéptido alfa-
1,3-fucosiltransferasa.
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Además, los productos génicos de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa pueden incluir proteínas o polipéptidos que representan productos génicos funcionalmente equivalentes. Un producto génico de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa equivalente de este tipo puede comprender deleciones, adiciones o sustituciones de residuos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias génicas de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa descritas anteriormente, pero que dan como resultado un cambio silencioso, y proporcionan de esta manera un producto génico de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa funcionalmente equivalente. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en función de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros planos incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. En el contexto de esta invención, la expresión «funcionalmente equivalente», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido capaz de mostrar una actividad in vivo sustancialmente similar a la de los productos génicos de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa endógenos codificados por las secuencias génicas de tipo alfa-
1,3-fucosiltransferasa descritas anteriormente, tal como se evalúa según varios criterios que incluyen, sin carácter limitante, la antigenicidad, es decir, la capacidad de unirse a un anticuerpo anti-alfa-1,3-fucosiltransferasa, inmunogenicidad, es decir, la capacidad de generar un anticuerpo que es capaz de unirse a una proteína o polipéptido de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa, así como también la actividad enzimática.
En el alcance de la invención se incluyen proteínas, polipéptidos y derivados (incluidos fragmentos) de tipo alfa-1,3- fucosiltransferasa que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción. Además, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en la secuencia del polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa.
El polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Se pueden utilizar métodos con los que están muy familiarizados los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen las secuencias que codifican la alfa-1,3- fucosiltransferasa y las señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, las técnicas de ADN recombinantes in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Remítase, por ejemplo, a las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Un «oligosacárido», tal como se utiliza el término en la presente y se entiende generalmente en la técnica, se refiere a un polímero sacarídico que contiene un número pequeño, normalmente de tres a diez, de azúcares simples, es decir, monosacáridos.
De acuerdo con la invención, la secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3- fucosiltransferasa está contenida en un vector, donde la secuencia polinucleotídica está ligada operablemente a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector. En una realización especialmente preferida, el vector es un vector de expresión y, de acuerdo con otro aspecto de la invención, el vector puede estar presente en forma de un plásmido, cósmido, fago, liposoma o virus.
Para la producción recombinante, las células hospedadoras se pueden modificar genéticamente para incorporar sistemas de expresión o porciones de estos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora se puede llevar a cabo mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), y Sambrook et al., 1989, supra.
Por lo tanto, el polinucleótido de acuerdo con la invención está comprendido en un vector con el que se van a transformar/transfectar de manera estable las células hospedadoras. En el vector, el polinucleótido de la invención está controlado, por ejemplo, por un promotor inducible, de manera que se puede actuar específicamente sobre la expresión del gen/polinucleótido y, si se desea, se pude sobreexpresar el gen de esta manera.
Se puede utilizar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriofagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus y vectores derivados de combinaciones de estos, tales como los derivados del plásmido y elementos genéticos de bacteriofagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los constructos del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como también generan la expresión. Por lo general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un hospedador se puede utilizar para la expresión en este sentido. Se puede insertar la secuencia de ADN apropiada en el sistema de expresión mediante una cualquiera de varias técnicas de uso común y muy conocidas tal como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., remítase a la referencia anterior.
En consecuencia, la presente invención también se refiere al uso de un polipéptido aislado con actividad alfa-1,3- fucosiltransferasa constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por:
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(a) una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6;
b) una secuencia de aminoácidos de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5; y
c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5.
La expresión «condiciones rigurosas» se refiere a condiciones en las que una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridarán específicamente a temperaturas más elevadas. Por lo general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 15 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (en una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la cual un 50% de las sondas complementarias a la secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio. Las condiciones de hibridación rigurosas ilustrativas pueden ser las siguientes: 50% de formamida, 5x SSC y un 1% de SDS, incubación a 42 °C, o 5x SSC, un 1% de SDS incubación a 65 °C, con un lavado en 0.2x SSC y un 0.1% de SDS a 65 °C.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la invención se refiere a una célula hospedadora que contiene un vector tal como se ha definido anteriormente, donde la célula hospedadora que se selecciona a partir del grupo constituido por hongos, incluidas levaduras, y bacterias. Se prefiere especialmente que la célula hospedadora sea una célula de Escherichia coli.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión «célula hospedadora» se define actualmente como una célula fúngica o bacteriana que ha sido transformada o transfectada, o es capaz de ser transformada o transfectada por una secuencia polinucleotídica exógena.
Se pueden utilizar varios sistemas vectoriales de expresión en hospedadores para expresar las secuencias codificantes del gen de la alfa-1,3-fucosiltransferasa de la invención. Tales sistemas de expresión en hospedadores representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés se pueden producir y purificar posteriormente, pero también representan células las cuales, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, muestran el producto génico de tipo alfa-1,3-fucosiltransferasa de la invención in situ.
Se pueden consultar varios sistemas de expresión y hospedadores adecuados, por ejemplo, en el documento WO 98/55630, el cual trata sobre fucosiltransferasas aisladas de Helicobacter pylori, a cuya publicación se hace referencia de manera explícita en la presente.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, el ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad alfa-1,3- fucosiltransferasa se adapta para el uso de codones de la célula respectiva.
La invención se refiere a un método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los pasos de:
a. proporcionar un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por a) una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6; b) una secuencia de aminoácidos una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5; y c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5,
b. poner en contacto el polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa del paso a. con una mezcla que comprende un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un mono- u oligosacárido en condiciones en las que el polipéptido cataliza la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado.
De acuerdo con la invención, el método para producir oligosacáridos fucosilados se puede realizar en un sistema exento de células o en un sistema que contiene células. Se permite que los sustratos reaccionen con el polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa durante un tiempo suficiente y en condiciones suficientes para permitir la formación del producto enzimático. Se debe entender que estas condiciones variarán dependiendo de las cantidades y pureza del sustrato y enzima, independientemente de si el sistema es un sistema exento de células o con células. Los expertos en la técnica pueden ajustar fácilmente estas variables.
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En los sistemas exentos de células, el polipéptido de acuerdo con la invención, el(los) sustrato(s) aceptor(es), sustrato(s) donante(s) y, según proceda, otros ingredientes de la mezcla de reacción, incluidas otras glucosiltransferasas y enzimas accesorias se combinan mediante mezcla en un medio de reacción acuoso. Las enzimas se pueden utilizar libres en solución o se pueden unir o inmovilizar a un soporte tal como un polímero y los sustratos se pueden añadir al soporte. El soporte puede estar, por ejemplo, empaquetado en una columna.
Los sistemas que contienen células para la síntesis de oligosacáridos fucosilados pueden incluir células hospedadoras modificadas de manera recombinante.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los pasos de:
a. cultivar, en condiciones adecuadas de nutrientes permisivas para la producción del oligosacárido fucosilado y permisivas para la expresión de un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa, una célula hospedadora tal como se ha descrito anteriormente;
b. proporcionar, simultáneamente o después del paso a., un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un oligosacárido, de manera que la alfa-1,3- fucosiltransferasa expresada en dicha célula hospedadora catalice la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado; y
c. aislar dicho oligosacárido fucosilado a partir de la célula hospedadora o el medio de su crecimiento.
En el método de acuerdo con la invención, el sustrato donante puede ser GDP-fucosa. Se prefiere especialmente que el sustrato donante sea GDP-fucosa.
De acuerdo con un aspecto de la invención, el sustrato aceptor se selecciona entre N-acetilglucosamina, N- acetillactosamina, galactosa, fucosa, ácido siálico, glucosa, lactosa o cualquier combinación de estos. En particular, se prefiere la lactosa como sustrato aceptor.
El término «sustrato», tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier material o combinaciones de diferentes materiales sobre los cuales puede actuar el polipéptido de la invención para dar lugar a oligosacáridos, (glico)proteínas o (glico)lípidos fucosilados.
Se permite que los sustratos reaccionen con el polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa durante un tiempo suficiente y en condiciones suficientes para permitir la formación del producto enzimático. Estas condiciones variarán dependiendo de las cantidades y pureza del sustrato y enzima, independientemente de si el sistema es un sistema exento de células o con células. Los expertos en la técnica pueden ajustar fácilmente estas variables.
De acuerdo con un aspecto del método de acuerdo con la invención, se proporciona el sustrato donante en el paso b. al producirlo dentro de la célula hospedadora. De esta forma, una enzima que convierte, por ejemplo, fucosa, que se va a añadir a la célula hospedadora, en GDP-fucosa se expresa simultáneamente en la célula hospedadora. Esta enzima puede ser, por ejemplo, una fucosa-cinasa/fucosa-1-fosfato guanililtransferasa bifuncional, como Fkp de Bacteroides fragilis, o la combinación de una fucosa-cinasa independiente junto con una fucosa-1-fosfato guanililtransferasa independiente como las que hay conocidas de varias especies que incluyen Homo sapiens, Sus scrofa y Rattus norvegicus.
Como alternativa, en el paso b., el sustrato donante se puede añadir en medio de cultivo/células hospedadoras o puede ser producido por el propio metabolismo de las células.
En una realización adicional más, la invención se refiere a un método que comprende los siguientes pasos
a) cultivar células hospedadoras transformadas o transfectadas para que comprendan una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre i) la SEQ ID NO: 3 o 5 de la lista de secuencias adjunta, ii) secuencia de ácido nucleico complementaria a la SEQ ID NO: 3 o 5 y iii) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en i) y ii) o sus hebras complementarias, en condiciones adecuadas de nutrientes de manera que la secuencia de ácido nucleico seleccionada entre i), ii) y iii) se exprese como un péptido que tiene actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa;
b) proporcionar, simultáneamente o después del paso a., un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un oligosacárido, de manera que la alfa-1,3-fucosiltransferasa expresada en dicha célula hospedadora catalice la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado; y
c) aislar dicho oligosacárido fucosilado a partir de la célula hospedadora o el medio de su crecimiento.
En los métodos de acuerdo con la invención, el péptido que se expresa en la célula hospedadora, muestra actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa y, por lo tanto, transfiere un residuo de fucosa de un donante, por ejemplo, guanosina- difosfato fucosa (GDP-fucosa), a un aceptor, el cual incluye oligosacáridos, (glico)proteínas y (glico)lípidos. De esta
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manera, el sustrato aceptor así fucosilado se puede utilizar como un aditivo alimentario, para complementar alimentos para bebés, o como un compuesto terapéutica o farmacéuticamente activo. Con los métodos novedosos, se pueden proporcionar de manera fácil y eficaz productos fucosilados, sin necesitar procesos sintéticos complicados, caros y que requieren tiempo.
Tal como se utiliza en la presente, el término «aislar» se refiere a recolectar, recoger o separar del sistema de expresión génica el producto producido por la alfa-1,3-fucosiltransferasa de acuerdo con la invención.
En consecuencia, la invención también divulga oligosacáridos fucosilados obtenidos mediante los métodos de acuerdo con la invención, así como también el uso de un polinucleótido, el vector o el polipéptido tal como se ha descrito anteriormente para la producción de oligosacáridos fucosilados.
De acuerdo con otra realización más, la producción de dicho oligosacárido fucosilado se realiza mediante la (sobre)expresión heteróloga u homóloga del polinucleótido que codifica la alfa-1,3-fucosiltransferasa.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen por lo general el mismo significado que les adjudica normalmente un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Por lo general, la nomenclatura utilizada en la presente y los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química e hibridación de ácidos nucleicos descritos anteriormente y a continuación son aquellos conocidos y empleados normalmente en la técnica. Se usan técnicas estándar para la síntesis de ácidos nucleicos y péptidos. Por lo general, las reacciones enzimáticas y los pasos de purificación se realizan de acuerdo con las indicaciones del proveedor.
La invención también cubre fragmentos de las secuencias polinucleotídicas divulgadas en ella.
De la descripción de las realizaciones y los dibujos adjuntos se derivan más ventajas.
La presente solicitud divulga:
(1) Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa y que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por: a) las SEQ ID NOs: 3 o 5 de la lista de secuencias adjuntas; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a las SEQ ID NOs: 3 o 5; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias.
(2) El polinucleótido aislado del apartado (1), constituido por las SEQ ID NOs: 3 o 5 que codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa.
(3) Un vector, que contiene la secuencia de ácido nucleico del apartado (1) o (2) que codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa, estando la secuencia de ácido nucleico ligada operablemente a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector.
(4) Un péptido aislado con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por: (a) una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6;
b) una secuencia de aminoácido de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5;
c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5; y (d) un fragmento de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6, donde dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos.
(5) La célula hospedadora que contiene el vector del apartado (3).
(6) La célula hospedadora del apartado (5), donde la célula hospedadora se selecciona a partir del grupo constituido por hongos, incluidas levaduras, y bacterias.
(7) La célula hospedadora del apartado (5) o (6), donde la célula hospedadora es una célula de Escherichia coli.
(8) La célula hospedadora de cualquiera de los apartados (5) a (7), donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa se adapta para el uso de codones de la célula respectiva.
(9) El uso del polinucleótido de cualquiera de los apartados (1) o (2), o del vector del apartado (3), o del polipéptido del apartado (4), para la producción de un oligosacárido fucosilado.
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(10) El uso del apartado (9), donde la producción de dicho oligosacárido fucosilado se realiza mediante la expresión heteróloga u homóloga del polinucleótido que codifica la alfa-1,3-fucosiltransferasa.
(11) El uso del apartado (9) o (10), donde el oligosacárido fucosilado es 3-fucosillactosa.
(12) Un método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los pasos de:
a. proporcionar el polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa del apartado (4),
b. poner en contacto el polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa del paso a. con una mezcla que comprende un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un mono- u oligosacárido en condiciones en las que el polipéptido cataliza la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado.
(13) Un método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los pasos de:
a. cultivar, en condiciones adecuadas de nutrientes permisivas para la producción del oligosacárido fucosilado y permisivas para la expresión de un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa, la célula hospedadora de cualquiera de los apartados (5) a (8);
b. proporcionar, simultáneamente o después del paso a., un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un mono- u oligosacárido, con el fin de que el polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa catalice la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado; y
c. aislar dicho oligosacárido fucosilado a partir de la célula hospedadora o el medio de su crecimiento.
(14) El método del apartado (12) o (13), donde el sustrato donante es GDP-fucosa.
(15) El método de cualquiera de los apartados (12) a (14), donde la GDP-fucosa la proporciona una enzima expresada simultáneamente en la célula hospedadora o el metabolismo de la célula hospedadora.
(16) El oligosacárido fucosilado obtenido mediante el uso de cualquiera de los apartados (9) a (11) o mediante el método de cualquiera de los apartados (12) a (15).
En las figuras se ilustran varias realizaciones de la invención y se explican más detalladamente en la siguiente descripción. En las figuras:
La Fig. 1 muestra la expresión de Amuc0760co a partir de pDEST14-amuc0760co en Escherichia coli JM109(DE3); se separaron 15 |jg de proteína soluble a partir del extracto crudo en SDS-PAGE al 15% y se tiñeron con azul brillante de Coomassie;
La Fig. 2 muestra la detección de Amuc0760co con una etiqueta de His mediante inmunoelectrotransferencia;
La Fig. 3 muestra el mapa vectorial de pDEST14-amuc0760co, es decir, el gen con codones optimizados amuc0760co que codifica la nueva alfa-1,3-fucosiltransferasa Amuc0760co clonada en pDEST14 (Invitrogen) mediante la reacción Gateway (A); el mapa vectorial de pDEST14-fucT6, es decir, el gen fucT6 de Bacteroides fragilis que codifica la nueva alfa-1,3-fucosiltransferasa FucT6 clonada en pDEST14 (Invitrogen, Alemania) mediante la reacción Gateway y (B); y el mapa vectorial de pDEST14-fucT7, es decir, el gen fucT7 de Bacteroides fragilis que codifica la nueva alfa-1,3-fucosiltransferasa FucT7 clonada en pDEST14 (Invitrogen, Alemania) mediante la reacción Gateway (C).
La Fig. 4 muestra el mapa vectorial de pACYC-amuc0760co, es decir, el gen con codones optimizados amuc0760co que codifica la nueva alfa-1,3-fucosiltransferasa Amuc0760co clonada en pACYCDuet-1 (Novagen mediante Ncol / PstI) (A); el mapa vectorial de pACYC-fucT6, es decir, el gen con codones optimizados fucT6 de Bacteroides fragilis que codifica la nueva alfa-1,3-fucosiltransferasa FucT6 clonada en pACYCDuet-1 (Novagen, UK) mediante Ncol / BamHI (B); y el mapa vectorial de pACYC-fucT7, es decir, el gen con codones optimizados fucT7 de Bacteroides fragilis que codifica la nueva alfa-1,3-fucosiltransferasa FucT7 clonada en pACYCDuet-1 (Novagen, UK) mediante Ncol / EcoRI (C).
La Fig. 5 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del gen amuc0760co y la proteína Amuc0760co;
La Fig. 6 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del gen fucT6 y la proteína FucT6.
La Fig. 7 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del gen fucT7 y la proteína FucT7;
La Fig. 8 muestra el análisis de la purificación de 3-fucosillactosa mediante cromatografía de permeación en gel BioGel P-2 utilizando cromatografía de capa fina con una fase móvil de butanol/acetona/ácido acético/agua
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(35/35/7/23) y solución de tinción de difenilaminoanilina (2% de difenilamina, 2% de anilina, 10% de ácido fosfórico en metanol); y
La Fig. 9 muestra el cromatograma de HPLC; separación mediante la columna Rezex RCM Ca2+ de Phenomenex con agua como eluyente (0.6 mL/min durante 30 minutos a 80 °C) y detección mediante el detector de índice de refracción (Shimadzu, Alemanina) (A); y el cromatograma de HPLC; separación mediante la columna Dionex CarboPac PA1 con NaOH 50 mM como eluyente (1 mL/min durante 30 minutos a 30 °C) y detección mediante el detector electroquímico DECADE II (Antec Leyden, Países Bajos) (B).
Ejemplo
Clonación de los genes
Se optimizaron los codones del gen que codifica la fucosiltransferasa Amuc0760 y se sintetizaron mediante GenScript, Piscataway, Nueva Jersey (eE. UU.). Con dos secuencias flanqueantes se codifican los sitios attB para la clonación Gateway (5'-secuencia: GGGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACC (SEQ ID NO: 7), 3'-secuencia: T-AGGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC (SEQ ID NO: 8)) se clonó en pUC57 mediante GenScript. La transferencia Gateway en el vector pDEST14 (Invitrogen GmbH, Alemania) (remítase a la fig. 3A) se llevó a cabo según el manual proporcionado por el proveedor (Invitrogen GmbH, Alemania). El polinucleótido que codifica Amuc0760co con una etiqueta de His en el extremo N se amplificó a partir de pUC57- amuc0760co utilizando los cebadores GG-
GGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGGGCCATCA-
CCATCATCACCACAAAACGCT GAAAATTAGCTTTC (SEQ ID NO: 9) y GGGGACC-
ACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC (SEQ ID NO: 10). El polinucleótido que codifica amuc0760co con una etiqueta de His en el extremo C se amplificó a partir de pUC57-amuc0760co utilizando los cebadores GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC (SEQ ID NO: 11) y GGGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC (SEQ ID NO: 12).
Los genes que codifican las fucosiltransferasas FucT6 y FucT7 se amplificaron a partir de ADN genómico de NCTC 9343 de Bacteroides fragilis con los cebadores GGGGACA-
AGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGTGTGATTGCTTGTC-TATCATATTG (SEQ ID NO:
13) / GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAT-TTTCTATCAAACAATTGAGAATAATATTC (SEQ ID NO:
14) y GGGGACAAGTTTGT -ACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAACCATGGATATATTGATTCTTTTTTATA- ATACGATG (SEQ ID NO: 15)/ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAT C-CCTCCCAATTTTAGTTCG (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y también se clonó en pDEST14 utilizando la tecnología Gateway (Invitrogen GmbH, Alemania) (remítase a la fig. 3B y 3C).
Expresión de fucosiltransferasas
Los genes amuc0760co, fucT6 y fucT7 se clonaron adicionalmente en el vector de expresión pACYCDuet-1 (Novagen, UK). Para la clonación de amuc0760co mediante restricción con NcoI / PstI y el posterior ligado se utilizaron los cebadores AGCTAGCCATGGGCAA-AACGCTGAAAATTAGCTTTCTG (SEQ ID NO: 17) y AGCTAGCTGCAGTTAGCGAC-GCAGGCGATTTTTC (SEQ ID NO: 18) (los sitios de restricción están subrayados) y el producto resultante se denominó pACYC-amuc0760co (remítase a la fig. 4A). Se clonó fucT6 mediante NcoI / BamHI utilizando los cebadores GATCACCATGGGCTGTGATTGCTTGTCTATCATAT-TG (SEQ ID NO: 19) y GATCAGGATCCTTATTTTCTATCAAACAATTGAGAATAATA-TTC (SEQ ID NO: 20) (sitios de restricción subrayados) lo que dio como resultado pACYC-fucT6 (remítase a la fig. 4B), y se clonó fucT7 mediante NcoI / EcoRI utilizando los cebadores GATCACCATGGATATATT-GATTCTTTTTTATAATACGATGTGG (SEQ ID NO: 21) y GATCAGAATTCTCATATC-CCTCCCAATTTTAGTTCGTG (SEQ ID NO: 22) (sitios de restricción subrayados) lo que dio como resultado pACYC-fucT7 (remítase a la fig. 4C).
Se transformaron las cepas JM109(DE3) o BL21(DE3) AlacZ de E. coli con los plásmidos apropiados tal como se ha descrito anteriormente. Se inocularon 5 mL de medio 2YT mediante una sala de inoculación y se cultivaron a 37 °C y 180 rpm durante toda la noche. Se inocularon 400 mL de 2YT con 4 mL del cultivo de toda la noche y se cultivaron a 37 °C y 180 rpm hasta que se alcanzó una DO660 de 0.5. Se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 0.1 mM y se prolongó el cultivo a 28 °C y 180 rpm durante toda la noche. Se recolectaron las células y se resuspendieron en 4 v/p de Tris-HCl 50 mM pH 7.5 + MgCh 5 mM o, cuando se utilizaron para la purificación mediante la columna Ni Sepharose FF (HisPrep FF 16/10, GE Healthcare, Suecia), en 4 v/p de Tris-HCl 20 mM pH 7.5 + NaCl 500 mM + imidazol 30 mM. Se añadió una cantidad de microesferas de vidrio que fue hasta seis veces el peso del sedimento celular y la suspensión celular se agitó en vórtex dos veces durante 5 minutos, mientras que en el periodo intermedio la suspensión celular se colocó en hielo durante 5 minutos. Después de la desorganización de la integridad física se retiraron los desechos celulares centrifugando durante 10 minutos a 15 000 x g. El sobrenadante resultante se utilizó para su análisis en SDS-PAGE o para purificación mediante Ni Sepharose FF.
Detección mediante inmunoelectrotransferencia
Se expresó Amuc0760co con una etiqueta de His tal como se ha descrito anteriormente. A partir del extracto celular crudo, se separaron 10 mg de proteína en un gel de SDS al 10%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF utilizando un tanque Mini Trans-Blot (Bio-Rad, Alemania) de acuerdo con el manual suministrado por el proveedor. Se detectó Amuc0760co con una etiqueta de His en la membrana utilizando el kit con anticuerpo con 5 etiqueta de His conjugado con HRP (His-Tag Antibody HRP Conjúgate Kit) (Novagen, UK) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor (remítase a la fig. 2).
Producción de compuestos fucosilados
Se transformaron células BL21(DE3) lacZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP de E. coli con pACYC que portaba el gen de fucosiltransferasa apropiado. Se cultivaron las colonias en placas con 2YT con los antibióticos apropiados. De 10 cada cepa se cultivaron 5 mL de los cultivos de toda la noche (2YT con antibióticos) y a partir de estos cultivos se inocularon 30 mL de medio mineral en cada caso hasta un 1%. Las células se cultivaron utilizando glicerol como fuente de carbono y a DO600 = 0.2 se indujeron con IPTG 0.1 mM y se añadieron lactosa 20 mM y fucosa 20 mM. La producción de 3-fucosillactosa se monitorizó mediante TLC y análisis por HPLC. La comparación de la cantidad de 3-fucosillactosa (3-FL) producida por la expresión de FutA a partir de Helicobacter pylori en comparación con la 15 expresión de Amuc0760co a partir de Akkermansia muciniphila así como también FucT6 y FucT7 a partir de Bacteroides fragilis se muestra en la siguiente tabla 1:
Tabla 1: Comparación de la cantidad de 3-fucosillactosa obtenida utilizando alfa-1,3-fucosiltransferasa FutA de Helicobacter pylori, Amuc0760co de Akkermansia muciniphila y FucT6 y FucT7 de Bacteroides fragilis
- Fucosiltransferasa
- Producción de 3-FL [mM]
- sin (control negativo)
- 0
- FutA (Helicobacter pylori)
- 3.83
- Amuc0760co (Akkermansia muciniphila)
- 5.39
- FucT6 (Bacteroides fragilis)
- 4.95
- FucT7 (Bacteroides fragilis)
- 6.89
20 Tal como se puede apreciar en la tabla 1, la cantidad del producto fucosilado 3-fucosillactosa fue significativamente más elevado cuando se utilizaron las alfa-1,3-fucosiltransferasas de acuerdo con la invención, es decir Amuc0760co de Akkermansia muciniphila y FucT6 y FucT7 de Bacteroides fragilis, en comparación con la alfa-1,3- fucosiltransferasa FutA de Helicobacter pylori, que es de vanguardia.
Purificación del producto de la fucosilación
25 Se produjo 3-fucosillactosa tal como se ha descrito anteriormente en varios pasos. El primer paso fue la purificación mediante adsorción sobre carbono activo. Se aplicó el sobrenadante del cultivo del paso de producción sobre un lecho de carbono activo. Se recogió el flujo que atravesó el lecho y se analizó pero no se detectó la presencia de 3- fucosillactosa. Para eliminar compuestos del medio unidos de manera no específica tales como, por ejemplo, sales y aminoácidos, se lavó el lecho con agua destilada (no 3-FL en el flujo que lo atravesó). A continuación, se eluyeron 330 FL y la lactosa y fucosa aún presentes con etanol al 96%. Posteriormente, se evaporó el etanol en un evaporador rotatorio y el residuo se filtró mediante un módulo de flujo cruzado de 10 kDa (Microdyn Nadir, Alemania). Las sales aún presentes se eliminaron mediante electrodiálisis y posteriormente las endotoxinas se eliminaron mediante filtración utilizando un módulo de flujo cruzado (Pall, Alemania). A continuación, se separó 3-FL de la lactosa y fucosa a escala de gramos utilizando material cromatográfico de permeación en gel Biogel P-2 (BioRad, Alemania) 35 empaquetado en una columna de vidrio de 520 mm x 428 mm con una placa fritada. La purificación de 3-FL se monitorizó mediante cromatografía de capa fina (remítase a la fig. 8). Las fracciones que contenían únicamente 3- fucosillactosa se combinaron y liofilizaron.
Confirmación de la identidad del producto
La 3-fucosillactosa purificada producida utilizando las fucosiltransferasas presentadas en esta invención se analizó 40 mediante 1H-RMN y espectrometría de masas. Los espectros resultantes fueron coherentes con los espectros esperados para 3-FL. Además de esto, se aplicaron diferentes métodos de HPLC para verificar la identidad de la 3- FL resultante. Un método fue la separación utilizando una columna Rezex RCM Ca2+ de Phenomenex con agua
como eluyente (0.6 mL/min durante 30 minutos a 80 °C) y detección mediante el detector de índice de refracción (Shimadzu, Alemania) (remítase a la fig. 9A). El otro método fue la separación mediante la columna Dionex CarboPac PA1 con NaOH 50 mM como eluyente (1 mL/min durante 35 minutos a 30 °C) y detección mediante el detector electroquímico DECADE II (Antec Leyden, Países Bajos) (remítase a la fig. 9B).
Claims (14)
10
15
20
25
30
35
40
45
50
REIVINDICACIONES
1. Célula hospedadora, transformada o transfectada con una secuencia polinucleotídica exógena, donde la secuencia polinucleotídica está contenida en un vector, y donde la secuencia polinucleotídica se selecciona a partir del grupo constituido por a) las SEQ ID NOs: 3 y 5 de la lista de secuencias adjunta; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a las SEQ ID NOs: 3 o 5; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias, estando ligada operablemente la secuencia polinucleotídica a secuencias de control reconocidas por la célula hospedadora transformada con el vector, donde la secuencia polinucleotídica codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3- fucosiltransferasa, y donde la célula hospedadora se selecciona a partir del grupo constituido por hongos, incluidas levaduras, y bacterias.
2. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la célula hospedadora es una célula de Escherichia coli.
3. Célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que el ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa se adapta para el uso de codones de la célula respectiva.
4. Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa y que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por a) las SEQ ID NOs: 3 o 5 de la lista de secuencia adjuntas; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a las SEQ ID NOs: 3 o 5; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias; o del vector tal como se reivindica en la reivindicación 1, o de un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por (a) una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6; b) una secuencia de aminoácidos de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5; y c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5, para la producción de un oligosacárido fucosilado.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que la producción de dicho oligosacárido fucosilado se realiza mediante la expresión heteróloga u homóloga del polinucleótido que codifica la alfa-1,3-fucosiltransferasa.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, caracterizado por que el oligosacárido fucosilado es 3-fucosillactosa.
7. Método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los pasos de:
a. proporcionar un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por (a) una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6; b) una secuencia de aminoácidos de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5; y c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 4 o 6, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en las SEQ ID NOs: 3 o 5,
b. poner en contacto el polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa del paso a. con una mezcla que comprende un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un mono- u oligosacárido en condiciones en las que el polipéptido cataliza la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado.
8. Método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los pasos de:
a. cultivar, en condiciones adecuadas de nutrientes permisivas para la producción del oligosacárido fucosilado y permisivas para la expresión de un polipéptido con actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa, una célula hospedadora tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 3;
b. proporcionar, simultáneamente o después del paso a., un sustrato donante que comprende un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprende un mono- u oligosacárido, con el fin de que el polipéptido alfa-1,3-fucosiltransferasa catalice la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante al sustrato aceptor, para producir de esta manera un oligosacárido fucosilado; y
c. aislar dicho oligosacárido fucosilado a partir de la célula hospedadora o el medio de su crecimiento.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que el sustrato donante es GDP-fucosa.
10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado por que la GDP-fucosa la proporciona una enzima expresada simultáneamente en la célula hospedadora o el metabolismo de la célula hospedadora.
M
. 70 '.30
95
72
ss
■13
34
25
M Conjunto de patrones proteicos pretenidos PageRuler
1. JM109(DE3)~
2. JM 109(DE3) pDEST 14-Aivi ueO 7 Cüco
3. JMiQ9(DE3) pDESTi4-N-His-AiriueQ7ÉÜca A JM1D9(DE3) pDEST I4-C-Hi;-Amuc0760E:ü
10
Fig. 1
ivi Conjunto de patrones proteicos preteñidos PageRuler
1. JM 1Ü9(DE3) pDE ST 14-Affi uc0760eo
2. JM109(DE3) pDEST 14-N-His-Amuc07S0co
3. JM1Ü9(0£3) pDEST 14-C*HIs-Aitiuc076Ücd
Fig. 2
TerminadorT7
Fig. 3A
Hindlll ' EooRI
fucT7
Promotor bla
pDEST14-fucT7
5535 pb
promotor T7 1
adwc0760co
Psll
'Sal
’HindIII
Nuil
BsrGI
pACYC-amuc0760co promotor T7 ?
4950 pb
TérmlnauarTT [
BénH
Xho
Ncol
Sphl
Fig. 3C
- :il
Mlul
3a VI
5*01
XHol
Xbai
Fig. 4A
N=o¡
Fig. 4B
Ncol
Fig. 4C
ATGAAAACGCTGAAAATTAGCTTTCTGCAAAGCACCCCGGATTTCGGCCGTGAGGGTATGCTGCAACTGCTGA
AATCTCGCTATCATGTGGTTGAAGATGATAGTGATTTTGATTACCTGGTGGCGACGCCGTGGTTCTATGTTAAC
CGTGAAGCCTTTTACGATTTCCTGGAACGCGCACCGGGCCATATTACCGTGATGTATGGTTGCCACGAAGCGA
TCGCCCCGGATTTTATGCTGTTCGATTATTACATTGGCCTGGACACCGTGCCGGGTAGCGATCGTACCGTTAAA
CTGCCGT AT CT GCGCCAT CACCTGGAAG AAGTT C AT GGCGGTAAAG AAGGCCT GG AT GCACAT GCCCTGCTGG
CCAGCAAAACGGGTTTTTGTAACTTCATCTACGCCAATCGTAAATCTCATCCGAACCGCGATGCAATGTTTCAC
AAACTGAGTGCGTTTCGTTTCGTGAATAGCCTGGGCCCGCATCTGAACAATACCCCGGGCGATGGTCACCGTG
CGGAAGATTGGTATGCCAGCTCTATTCGCATGAAAAAACCGTACAAATTTTCTATCGCCTTCGAAAACGCATGG
TACCCGGGTT ACACCAGCGAAAAAAT CGTT ACGTCT AT GCTGGCCGGCACCATT CCGAT CT ATT GGGGT AATCC
GGATATTAGCCGTGAATTTAACAGTGCGAGCTTTATCAATTGCCATGATTTTCCGACGCTGGATGATGCGGCG
GCGTAT GT GAAAAAAGTT GAT GAAGAT GAT AACCT GTGGTGT GAAATT AT GAGCCGCCCGT GG AAAACCCCG
GAACAGGAAGCACGTTTTCTGGAAGAAACCGAACGCGAAACGGCGAAACTGTATAAAATCTTCGATCAGAGT
CCGGAAGAAGCCCGTCGCAAAGGCGATGGTACCTGGGTGAGCTATTACCAGCGTTTTCTGAAACGTGGTCATC
GTATGCAGCTGGCCTGGCGTCGCCTGAAAAATCGCCTGCGTCGCTAA
Secuencia de la proteina Amuc0760co:
MKTLKiSFLQSTPDFGREGMLQLLKSRYHWEDDSDFDYLVATPWFYVNREAFYDFLERAPGHITVMYGCHEAIAP
DFMLFDYYIGLDTVPGSDRTVKLPYLRHHLEEVHGGKEGLDAHALLASKTGFCNFIYANRKSHPNRDAMFHKLSAFR
FVNSLGPHLNNTPGDGHRAEDWYASSIRMKKPYKFSIAFENAWYPGYTSEKIVTSMLAGTIPIYWGNPDISREFNSA
SFINCHDFPTLDDAAAYVKKVDEDDNLWCEIMSRPWKTPEQEARFLEETERETAKLYKIFDQSPEEARRKGDGTWV
SYYQRFLKRGHRMQLAWRRLKNRLRR
Fig. 5
ATGTGTGATTGCTTGTCTATCATATTGTTAGTCAAAATGAAAAAGATTTAT7TGAAATTTGTTGATTTTTGGGAT
GGATTTG ATACTATTTCTAACTTTATTGTGG ATGCTTTGTCCATTC AATACG AAGT AGT ACTATCT AATGAGCC A
G ATTATTT ATT CT ATT C.AT GTTTT GG AACGT C ACATTT AG AAT AT G ATT GT AT AAAAAT C ATGTTTAT AGG T G AA
AATATAGTTCCTGATTTTAACGTTTGTGATTATGCCATAGGTTTTAATTATATTGATTTTGGGGACCGTTACTTG
AGGTTGCCTTTATATGCTATATATGATGGATTTTCAAACTTGCAGAATAAAAAGATTGATGTAAATAAAGCTTT
AGACCGTAAATTTTGTAGTATTGTTGTTTCAAATAATAAATGGGCAGATCCTATTCGTGAGACTTTCTTTAAATT
ACTATCTAGTTATAAGAAAGTAGACTCTGGTGGAAGAGCTTGGAATAATATAGGAGGACCTGTTGATAATAAA
TTGGATTTTATT A6CCAA TAI AAGTT T AA IATTGCTT1TGAAAAIAGTAGGGT ACTGGGATATAC AACAGAAAA
AATAATGGAACCTATGCAGGTGAATTCTATTCCAGTATATTGGGGAAATCCTTTGGTTGGTAAAGATTTTAATG
TGGACTCCTTTGTAAATGCTCATGATTTTGATTCTTTAGAAAGATTAGTTGAGTATATTATAGAATTGGATTCTT
CAAAGGATAAATATCTGGAAATGTTGGAAAAACCTTGGCTTCTCGATAAGACATATTTGGATTGGAAACAATT
GCTGTTAAATTTTATTAATAATATTATGATGAAATCATATAAGGATGCGAAGTATTTGGTTAATTATGGTCATGC
T GG AAAGT AT AG AAAT G AAC AACGCTTTTGGG G GAG AT GT G AACGT AAATTT AAACTTC AAAG AATT ATT G AA
T ATTATT CTC AATT GTTT GATAGAA AAT A A
Secuencia de la proteína FucT6:
MCDCLSIILLVKMKKIVLKFVDFWDGFDTISNFIVDALSiaYEWLSNEPDYLFYSCFGTSHLEYDCIKIMFIGENIVPDF
NVCDYAIGFNYIDFGDRYLRLPLYAIYDGFSNLQNKKIDVNKALDRKFCSIWSNNKWADPIRETFFKLLSSYKKVDSG
GRAWNNIGGPVDNKLDFISQYKFNIAFENSRVLGYTTEKIMEPMQVNSIPVYWGNPLVGKDFNVDSFVNAHDFDS
LERIVEYIIELDSSKDKYLEMLEKPWLLDKTYLDWKQLLLNFINNIMMKSYKDAKYLVNYGHAGKYRNEQRFWGRC
ERKFKLQRIIEYYSQLFDRK
ATGGATATATTGATTCTTTTTTA7AATACGATGTGGGGATTTCCACTCGAGTTCCGAAAGGAAGATTTACCTGG GGGCT GT GTGAT AACGACT GAT CGAAACCTCATTGCAAAGGCGGAT GCT GTGGTTTT CC ATTT GCCCG ATTT GC CTT CGGT GAT GGAGGAT GAAATCGATAAGCGGGAAGGACAGCTTT GGGT GGGATGG AGT CTGGAAT GT GAA GAGAATTATAGTTGGACGAAGGATCCCGAGTTCAGAGAGAGTTTTGACTTATGGATGGGGTATCATCAGGAG GATGATATTGTGTATCCTTATTATGGACCGGATTATGGGAAGATGCTGGTTACGGCACGGAGGGAAAAGCCTT ATAAGAAGAAGGCAT GTAT GTTT ATTT CG AGT GAT AT G AACCGG AGT C AT C G ACAAGAGT AT CTT AAGG AATT GATGCAGTATACCGACATCGATTCGTATGGGAAACTATACCGTAATTGTGAATTACCTGTTGAGGATCGGGGA CGGGATACACTTCTTAGTGTGATCGGGGATTATCAGTTTGTGATAAGTTTTGAGAATGCGATAGGGAAGGATT AT GT GACAGAAAAGTTTTT C AATCCTTT GTTGGCCGGT ACT GTT CCGGT CT AT CT GGGAGCT CCCAAT ATT CGG GAATTTGCTCCGGGAGAAAATTGTTTTCTGGATATTTGTACTTTCGATTCTCCCGAGGGAGTAGCCGCTTTTAT GAATCAATGCTATGATGACGAGGCATTGTATGAACGTTTTTATGCATGGAGGAAACGGCCTTTATTATTGTCGT TTAC.AAAAAAGTTAGAGCAAGTCCGGAGCAATCCGTTAATCAGGCTTTGCCAAAAAATACACGAACTAAAATT GGGAGGGATAT GA
Secuencia de la proteína FucT7:
MDILILFYNTMWGFPLEFRKEDLPGGCVITTDRNLIAKADAWFHLPDLPSVMEDEIDKREGQLWVGWSLECEENY
SWTKDPEFRESFDLWMGYHQEDDIVYPYYGPDY6KMLVTARREKPYKKKACMFISSDMNRSHRQEYLKELMQYT
DIDSYGKLYRNCELPVEDRGRDTILSVIGDYQFVISFENAIGKDYVTEKFFNPLLAGTVPVYLGAPNIREFAPGENCFL
DICTFDSPEGVAAFMNQCYDDEALYERFYAWRKRPLLLSFTKKLEQVRSNPLIRLCQKIHELKLGGI
Fig. 7
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