ES2340888T3 - Metodo enzimatico para procudir alfa-d-glucosilglicerol (2-0-gliceril-alfa-d-glucopiranosida). - Google Patents
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Abstract
Método para producir 2-O-gliceril-α-D-glucopiranosida (αGG) a partir de un donador de glucosilo y un aceptor de glucosilo que comprende las etapas de: - proporcionar una sacarosa fosforilasa (EC 2.4.1.7) - incubar dicha sacarosa fosforilasa con una mezcla que comprende sacarosa como donador de glucosilo y glicerol como aceptor de glucosilo y - aislamiento y/o purificación de 2-O-gliceril-α-D-glucopiranosida.
Description
Método enzimático para producir
\alpha-D-glucosilglicerol
(2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida).
La presente invención se refiere a métodos para
producir \alpha-D-glucosilglicerol
(2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida).
Los hidratos de carbono simples y complejos
rigen una diversa gama de funciones celulares, entre las que se
incluyen el almacenamiento de energía, la estructura de la pared
celular, la interacción y señalización
célula-célula, las interacciones
huésped-patógeno y la glicosilación de proteínas.
También tienen una función como osmolitos y moléculas pequeñas de
estilos de vida extremos. Las glicosiltransferasas (GTs) son enzimas
responsables de la síntesis de glucosidos en la naturaleza,
mientras que las glicosilhidrolasas (GHs) han sido evolucionadas
para degradarlas. Entre las clases GT y GH, las glucósido
fosforilasas (GPs) son especiales en varios sentidos. GPs catalizan
la fosforolisis de \alpha y
\beta-D-glicósidos, principalmente
glicósidos (Glc-OR) incluyendo disacáridos y oligo-
o polisacáridos de diversos grados de polimerización. La
transferencia de glucosilo a fosfato (Pi) está favorecida
termodinámicamente in vivo porque el fosfato normalmente está
presente en un gran exceso con respecto a
\alpha-D-glucosa-1-fosfato
(Glc-1-P). No obstante, las
constantes de equilibrio termodinámico (K_{eq}) de las reacciones
catalizadas por GP son intermedias a los valores K_{eq} para la
reacción de GTs (K_{eq} <<1) y GHs (K_{eq}>>1). Los
valores K_{eq} favorables relativamente y el hecho de que los
azúcares fosfo-activados sean menos caros que los
activados por nucleótido, requeridos por la mayoría de las GTs,
hacen que GPs sean unos biocatalizadores interesantes para la
síntesis estéreo- y regioespecífica de glicósidos.
Recientemente se dedica una atención cada vez
mayor hacia nuevos
\alpha-D-glicósidos, en
particular, \alpha-D-glucosil
glicerilo
(2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida,
\alphaGG) para la cual se están desarrollando actualmente
diversas aplicaciones. \alphaGG funciona como un soluto compatible
en microorganismos que proporciona cierta protección contra las
tensiones producidas por altas concentraciones de sal, calor y
radiación de UV. \alphaGG es supuestamente útil como edulcorante
alternativa en productos alimenticios debido a su baja
cariogenicidad y su bajo valor calórico en comparación con la
sacarosa. Por otra parte, se está estudiando \alphaGG y sus
derivados como productos terapéuticos en enfermedades causadas por
un plegamiento fallido de proteínas y en terapia contra el cáncer.
En cosmética \alphaGG se puede emplear como agente anti
envejecimiento y compuesto para regular la hidratación.
\alphaGG se puede producir a través de métodos
químicos, así como métodos enzimáticos. Los métodos químicos pueden
implicar varios compuestos de partida como maltitol, isomaltosa,
trehalulosa, etc. (ver, v.g., Takenaka F. y cols., Biosci.
Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 378-385). Las
enzimas que catalizan la síntesis de \alphaGG pueden implicar
\alpha-glucosidasa (Takenaka F. y Uchiyama H.
Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 1821-1861),
ciclodextrin glucanotransferasa (Nakano H. y cols., J. Biosci.
Bioeng. (2003) 95: 583-588),
glucosil-glicerolfosfato sintasa (Marin K. y cols.,
J. Bacteriol (1998) 180:4843-4849) y glucosidasa
vegetal II (Kaushal GP y cols., Arch. Biochem. Biophys (1989)
272:481-487). Todos los procedimientos actuales para
la síntesis de \alphaGG presentan una o más de las siguientes
desventajas cruciales: múltiples etapas de reacción (incluyendo
activación, protección y desprotección); síntesis que requiere un
trabajo y una elaboración intensivas; un bajo rendimiento y
productividad; una baja economía atómica, tiempos de reacción
prolongados. En consecuencia, no se ha desarrollado ningún proceso
industrial para la producción de \alphaGG y el producto no está
disponible en el mercado.
La síntesis química de \alphaGG natural
esteréoquímicamente puro no es factible técnicamente debido a
procedimientos extremadamente laboriosos y aun rendimiento bajo. La
síntesis microbiana de \alphaGG ha sido demostrado pero la
productividad es escasa. La síntesis enzimática de \alphaGG
utilizando transglucosilación a través de
\alpha-glucosidasas es una posibilidad que ha sido
descrita, pero el principal inconveniente del proceso es la errónea
regioselectividad de las enzimas conocidas, que prefieren el grupo
hidroxi primario en lugar de secundario de glicerol. La mezcla
producto sintetizada a través de
\alpha-glucosidasas contiene solamente un 30% de
\alphaGG natural correcta, lo que requiere un esfuerzo sustancial
para aislar el producto.
La síntesis microbiana de \alphaGG actualmente
no es un proceso maduro, sobre todo cuando se tiene en cuenta el
rendimiento de \alphaGG ya que no permite la producción de
\alphaGG como un producto químico en masa. Las concentraciones de
producto que se pueden obtener son muy bajas (v.g., 29 mg/l; Roder y
cols., FEMS Microbiol. Lett. (2005) 243: 219-226) y
también la productividad (\geq 3 días de producción) no es
ventajosa desde el punto de vista industrial.
JP 0509 1891 se refiere a un proceso para
obtener componentes de azúcar que se comparan con una fracción de
glucosa y una fracción de alcohol de azúcar unidos por reacción de
sacarosa o ácido glucosa-1-fosfórico
y un alcohol de azúcar en presencia de sacarosa fosforilasa.
En la publicación de Kitao S. y cols. (Biotec.
Biochem. 56(1992): 2011-2014) se describe la
transferencia de glucosa a varios aceptores por incubación de
sacarosa fosforilasa con
glucosa-1-fosfato y dichos aceptores
de glucosa.
JP 2001/245690 A se refiere a un método para
producir glicósidos y oligosacáridos utilizando una glucosidasa, en
particular \beta-galactosidasa.
El objeto de la presente invención consiste en
proporcionar un método enzimático para la producción de \alphaGG
estéreoquímicamente puro en un alto rendimiento superando los
inconvenientes de los métodos conocidos en la técnica. Asimismo, el
método deberá permitir preferiblemente el uso de sustratos
económicos.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un método para producir
2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida
(\alphaGG) a partir de un donador de glucosilo y un aceptor de
glucosilo que comprende las etapas de:
- proporcionar una sacarosa fosforilasa (EC
2.4.1.7)
- incubar dicha sacarosa fosforilasa con una
mezcla que comprende sacarosa como donador de glucosilo y glicerol
como aceptor de glucosilo y aislar y/o purificar
2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida.
\vskip1.000000\baselineskip
Sacarosa fosforilasa (SPasa; EC 2.4.1.7)
cataliza la conversión de sacarosa y fosfato en
D-fructosa y Glc 1-P. SPasa también
ha sido aislada a partir de una serie de fuentes bacterianas. Los
genes que codifican SPasa han sido clonados a partir de diferentes
bacterias y han sido expresados heterólogamente (Kawasaki H y
cols., Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60: 322-324;
Kitao S. y Nakano E. J. Ferment. Bioeng. (1992) 73:
179-184; van den Broek LAM y cols. Appl. Microbiol.
Biotechnol. (2004) 65: 219-227). De acuerdo con la
clasificación basada en secuencias sistemáticas de glucosil
hidrolasas (GH) y glicosil transferasas (GT) (Coultinho PM y cols.,
J. Mol. Biol. (2003) 328:307-317; Henrissat B.
Biochem. J. (1999) 280:309-316) SPasa pertenece a la
familia GH13 (Clan GH-H), denominada frecuentemente
como la familia \alpha-amilasa. La estructura
tridimensional de SPasa desde Bifidobacterium adolescentis ha sido
resuelta recientemente, revelando un plegamiento de barril
(\beta/\alpha) 8 y un sitio catalítico en el que dos grupos
carboxilato probablemente cumplen el papel de un nucleófilo (Asp
192) y un ácido/base general (Glu232).
La reacción de SPasa prosigue con retención neta
de la configuración anomérica y tiene lugar a través de un
mecanismo de desplazamiento doble que implica dos etapas de
inversión en la configuración: segmentación de la unión
carbono-oxígeno del donador glucosilo y formación de
un producto intermedio
\beta-glucosilo-enzima
(\beta-Glc-E) covalente; y la
reacción del producto intermedio con fosfato para producir Glc
1-P. En una reacción lateral, el producto
intermedio \beta-Glc-E puede ser
interceptado por agua, llevando a hidrólisis. La conversión
hidrolítica de sacarosa es irreversible, pero prosigue casi dos
órdenes de magnitud más lenta que la reacción fosforolítica. SPasa
también cataliza las reacciones de transglucosilación que tienen
lugar en competencia con la hidrólisis y de esta manera el producto
intermedio \beta-Glc-E es atacado
por nucleófilos externos y se producen nuevos
\alpha-D-glicósidos.
Los estudios bioquímicos han demostrado que
SPasa es estrictamente específica para transferir una fracción
glucosilo y no tolera modificaciones estructurales en el anillo de
glucopiranosilo, incluyendo epimerización y desoxigenación. La
lista de donadores de glucosilo conocidos para SPasa es por lo tanto
corta: sacarosa, Glc 1-P y
1-fluoruro de
\alpha-D-glucosa. En contraste, la
especificidad de SPAsa para aceptores de glucosilo es
comparablemente relajada.
La selectividad de SPasa que forma solamente
\alphaGG natural en un rendimiento muy cuantitativo (> 95%)
son puntos cruciales del método según la presente invención. El
método de la presente invención puede emplear sustratos muy baratos
(de los que se dispone de procesos industriales a gran escala) sin
ninguna formación de derivado química (requerida en síntesis
química) y se caracteriza por una eficacia atómica extremadamente
alta porque todo el sustrato convertido va cuantitativamente al
producto. Durante la fermentación microbiana, por ejemplo, se
utiliza la mayor parte del sustrato para el crecimiento y la energía
de mantenimiento y solamente se emplea una pequeña parte de él para
la producción de \alphaGG. En el método de la presente invención
solamente se requiere una enzima y esta puede ser natural o
preparada por recombinación, utilizada en forma libre o
inmovilizada, como una enzima aislada o en otra forma de catalizador
(células permeabilizadas o en reposo).
El método de la presente invención se lleva a
cabo preferiblemente in vitro con una enzima purificada o un
extracto de enzima, en virtud de lo cual se puede obtener SPasa
empleada a partir de al menos una fuente, lo que significa que se
pueden emplear también SPasas de más de un tipo (origen).
La síntesis de \alphaGG se lleva a cabo
preferiblemente utilizando una concentración de proteína de
sacarosa fosforilasa que proporcione una actividad comprendida entre
1.000 y 1.000.000 unidades/litro (una unidad se define como la
actividad de enzima que convierte 1 \mumol de sustrato por minuto
en condiciones de reacción normales, típicamente 30ºC registrado en
la bibliografía).
"Sacarosa fosforilasa" tal como se utiliza
aquí se refiere no solamente a enzimas de la case EC 2.4.1.7 sino
también a las moléculas que presentan las mismas propiedades en
relación con sus sustratos y productos. Dichas moléculas incluyen
también proteínas de fusión de sacarosa fosforilasa con otros
péptidos, polipéptidos o proteínas, que presentan potencialmente
también actividades enzimáticas o de unión.
De acuerdo con un modo de realización preferible
de la presente invención, la mezcla comprende un donador de
glicosilo adicional seleccionado del grupo que consiste en
\alpha-glucosa-1-fosfato,
\alpha-D-glucosa-1-fluoruro
y mezclas de ellos.
El uso de sacarosa (un disacárido que consiste
en glucosa y fructosa) en el método de la presente invención
llevará no solamente a la formación de \alphaGG sino también a la
formación de fructosa. Si se emplean los sustratos Glc
1-P o
\alpha-D-glucosa-1-fluoruro,
se formarán como productos fosfato o fluoruro además de \alphaGG.
El rendimiento que se puede conseguir dependerá del contenido en
energía del donador de glucosilo y es superior a 30%,
preferiblemente, mayor de 50% y en particular mayor de 90%.
La sacarosa fosforilasa utilizada en el método
según la presente invención es preferiblemente de origen
microbiano, preferiblemente de origen bacteriano.
La ventaja de utilizar SPasas microbianas es la
simple producción y aislamiento y estabilidad de estas enzimas. Se
pueden obtener a partir de microorganismos que expresan de forma
natural o por recombinación SPasa.
De acuerdo con un modo de realización preferible
de la presente invención, la sacarosa fosforilasa bacteriana se
obtiene a partir de Agrobacterium vitis (NCBI P33910),
Bifidobacterium adolescentis (Q84HQ2), Bifidobacterium
longum (Q84BY1), Escherichia coli (P76041),
Escherichia coli 06 (Q8FHS2), Lactobacilus acidophilus
(Q7WWP8, Q7WWQ5), Lactobacilus delbrueckii subsp. lactis
(Q71/99), Leuconostoc mesenteroides (Q59495, Q9R5Q3),
Listeria monocytogenes (Q4ENE7, Q4EQR2, Q4ETN7, Q4EHA0,
Q4EJW2, Q4ELY7), Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas
saccharophila (AAD40317), Rhodopirellula baltica
(Q7UIS9), Shewanella baltica (Q3Q4P1), Shewanella
frigidimarina (Q3NMD1), Solibacter usitatus (Q43TL5),
Streptococcus mutans (P10249), y/o Synechococcus sp.
(068858, Q7U3J7).
Se prefiere de manera particular el uso de al
menos una SPasa derivada de Leuconostoc mesenteroides.
La SPasa se produce preferiblemente por
recombinación como una proteína de longitud completa o un fragmento
catalíticamente activo de la misma o una proteína de fusión. No
obstante, naturalmente también es posible utilizar SPasa
directamente desde el organismo que produce naturalmente dicha
SPasa. Los métodos para la producción de SPasa por recombinación
son conocidos entre las personas especializadas en este campo (v.g.
Sambrook J. y cols., Molecular cloning: a laboratory manual ISBN
0-87969-309-6).
Tal como se utiliza aquí "proteína de longitud
completa" se refiere a una SPasa codificada por un gen derivado
de un organismo, como por ejemplo los que se han enumerado
anteriormente. Dicho gen que se da de forma natural, en particular
la SPasa que codifica la región de dicho gen, se emplea directamente
para la producción de SPasa por recombinación.
Un "fragmento catalíticamente activo" de
SPasa se refiere a fragmentos de proteína de SPasa que tienen la
misma actividad o sustancialmente la misma actividad y especificidad
de sustrato que la SPasa nativa. La longitud de los fragmentos no
es crucial siempre y cuando los fragmentos tengan una especificidad
de sustrato igual o similar y que catalicen la formación de los
mismos productos que la SPasa nativa.
Tal como se utiliza aquí, una "proteína de
fusión" se refiere a SPasa o a fragmentos catalíticamente
activos de la misma, condensados por recombinación con al menos otra
proteína, polipéptido o péptido más. Dicha al menos una proteína,
polipéptido o péptido más puede ser de cualquier tipo (v.g.,
enzima).
Debe señalarse que dentro del marco de la
invención, se engloban también variantes (es decir, mutaciones que
incluyen supresiones, sustituciones e inserciones) de SPasa, siempre
y cuando dichas variantes tengan la misma actividad o
sustancialmente la misma actividad (v.g., una mayor actividad
catalítica) que la SPasa nativa.
La SPasa se puede emplear en la etapa de
incubación tanto como una enzima de células en forma libre, que se
puede purificar parcialmente, aunque no es necesario, como un
sistema de células completas tratado previamente física o
químicamente para mejorar la permeabilidad de la membrana celular
(permeabilización) y la estabilidad mecánica, como catalizador
encapsulado en el que está atrapada dicha enzima libre o sistema de
células completas, preferiblemente en estructuras de tipo gel, o
inmovilizada sobre un soporte. En Cao L.,
Carrier-bound Immobilized Enzimes (2005)
Wiley-VCH, Weinheim, se ofrece un reciente resumen
completo de los métodos para la inmovilización de enzimas,
incluyendo la permeabilización de células.
Ventajosamente, se inmoviliza la SPasa en un
soporte que es preferiblemente un soporte sólido. Se puede utilizar
cualquier material que se una a dicha SPasa no covalentemente,
preferiblemente, polímeros naturales o no naturales con propiedades
de intercambio de aniones, o covalentemente, preferiblemente, un
polímero, más preferiblemente un polímero acrílico, en particular,
un copolímero de metacrilamida,
N,N'-metilenbis(acrilamida) y un monómero
que lleva grupos oxirano.
El vehículo es preferiblemente una resina de
cromatografía, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste
en una resina de cromatografía de intercambio aniónico, una resina
de cromatografía de intercambio de cationes, una resina de
cromatografía de afinidad (v.g., que comprende anticuerpos
específicos de SPasa inmovilizada) y una resina de cromatografía de
interacción hidrófoba.
La SPasa de la presente invención se puede
inmovilizar (temporalmente o covalentemente) en cualquier soporte,
preferiblemente, partículas (v.g., perlas), en particular, una
resina de cromatografía, siempre y cuando no quede afectada la
actividad enzimática de la enzima de forma que se cambie su
especificidad de sustrato o que se reduzca su actividad
disminuyendo los índices de conversión.
El soporte puede comprender grupos funcionales
que requieren, con el fin de unirse la SPasa en la resina, que la
enzima lleve también los socios de unión correspondientes (v.g.,
estreptavidina-biotina, iones metálicos quelados
-His_{6}-tag).
Para mejorar la afinidad de la enzima con los
soportes que carecen de dichos grupos funcionales, se puede
producir por recombinación SPasa como una proteína de fusión que
alberga un péptido de unión, preferiblemente, una proteína de
fusión que presenta propiedades de intercambio iónico, o un dominio
de unión, preferiblemente, un dominio de unión a polisacárido, en
particular, un dominio de unión a celulosa.
El uso de enzimas inmovilizadas insolubles
proporciona varias ventajas (unidas a soporte, encapsuladas,
sistemas de células completa) en el método de la presente
invención:
1. La enzima inmovilizada se puede recuperar
fácilmente de la mezcla de reacción una vez concluida la reacción
para su reutilización, mientras que la enzima soluble se recupera
únicamente con dificultad y con pérdida de la actividad;
2. La enzima inmovilizada es más estable que la
enzima soluble, tanto en el número de recambios de enzima obtenido
frente a la enzima soluble, como en cuanto a la actividad de la
enzima recuperada una vez concluida la reacción o después de un
almacenamiento prolongado en un tampón acuoso.
\vskip1.000000\baselineskip
No se puede seleccionar ningún método específico
de inmovilización para una enzima en particular a la espera de que
la inmovilización tenga éxito. Por otra parte, las expectativas para
una inmovilización conjunta con éxito de más de una enzima es
incluso menos predecible. Las personas especializadas en este campo
coinciden de forma general en que una inmovilización con éxito de
cualquier enzima debe descubrirse a través de una detección
selectiva de una serie de métodos, y obtenerse un resultado óptimo
por prueba y error. La inmovilización de SPAsa en un soporte
estabiliza la actividad de enzima. La bibliografía demuestra que el
atrapado de la enzima también mejora la estabilidad (Soetaert W. y
cols., Progress in Biotechnology Vol. 10 (Petersen S.B., Svensson,
B. Pederesen, S. Eds), Elsevier, Ámsterdam). La inmovilización de
enzimas se puede realizar aplicando diversas técnicas, incluyendo:
(1) la unión de la enzima con un soporte o vehículo, a través de una
unión covalente, absorción física, unión electrostática o unión por
afinidad, (2) la reticulación con reactivos bifuncionales o
multifuncionales, (3) el atrapado en matrices de gel, polímeros,
emulsiones, y alguna forma de membrana y (4) una combinación de
cualquiera de estos métodos. Las descripciones detalladas de muchos
de estos métodos de inmovilización de enzimas, y los distintos
factores que afectan a la selección del método de inmovilización se
recogen en los siguientes volúmenes de Methods in Enzymology, K.
Mosbach (ed.) Academic Press, Nueva York: vol. 44 (1976), vol., 135
(1987), vol., 136 (1987), vol., 137 (1988) y las referencias
citadas en ellos.
La inmovilización de SPasa en perlas acrílicas
de oxirano Eupergit C y Eupergit C-250L (Rohm
Pharma) tuvo como resultado un catalizador (enzima + soporte) que
fue particularmente estable en las condiciones de reacción y que
tenía una actividad específica suficientemente alta (unidades de
actividad de enzima/gramo de catalizador). No obstante, para se
útil en el método de la presente invención, se pueden utilizar
preparaciones de SPasa tanto libre como inmovilizada.
No obstante, se pueden eliminar muchas de las
deficiencias de las enzimas solubles empleando el catalizador de
enzima inmovilizada. La estabilidad de la SPasa inmovilizada en
tampones acuosos es mucho mayor que la de la enzima soluble. La
recuperación y reutilización del catalizador inmovilizado se realizó
fácilmente filtrando simplemente el catalizador para extraerlo de
la mezcla de reacción y reciclándolo para utilizarlo en una mezcla
de reacción nueva; de esta manera, para la SPasa inmovilizada se
puede conseguir un alto número de recambios (es decir, el número de
moléculas de sustrato que se convierten en moléculas producto por
molécula de catalizador antes de la inactivación de la enzima).
La SPasa inmovilizada utilizadas en la reacción
deberá estar presente en una concentración efectiva, normalmente
una concentración de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100,0
IU/ml, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50
IU/ml. Una IU (unidad internacional) se define como la cantidad de
enzima que cataliza la transformación de una micromol de sustrato
por minuto.
Una vez completada la reacción, se puede separar
por filtración o centrifugado la SPasa unida a un soporte. Si la
SPasa inmovilizada se carga en una columna (v.g., una columna de
cromatografía), la producción de \alphaGG se puede conseguir de
una forma continua sin necesidad de separar la SPasa inmovilizada de
la mezcla de reacción.
De acuerdo con un modo de realización preferible
de la presente invención, la incubación de SPasa con los sustratos
se lleva a cabo a un valor de pH de 4 a 10, preferiblemente de 5 a
9, más preferiblemente de 6 a 8, en particular de 7.
El valor de pH en el método según la presente
invención se selecciona preferiblemente de los intervalos antes
indicados, lo que permite una conversión eficiente de los sustratos
en \alphaGG.
De acuerdo con otro modo de realización
preferible de la presente invención, la incubación se lleva a cabo
durante al menos 15 minutos, preferiblemente durante al menos 60
minutos, más preferiblemente durante al menos 3 horas, siendo
incluso más preferible durante al menos 5 horas.
La incubación de los sustratos con la SPasa no
unida o inmovilizada puede llevarse a cabo durante al menos 15
minutos. No obstante, es especialmente preferible seleccionar el
tiempo de incubación entre 1 y 48 horas o entre 5 y 24 horas. La
período de incubación depende también de la temperatura de
incubación seleccionada. Esto significa que si la temperatura de
incubación está por debajo de la temperatura óptima de la enzima,
el período de incubación puede extenderse.
De acuerdo con un modo de realización preferible
de la presente invención, la incubación se lleva a cabo a un
intervalo de temperatura comprendido entre 10 y 50ºC,
preferiblemente entre 15 y 40ºC, siendo más preferible a una
temperatura de 30ºC.
La mezcla que se incuba con arreglo a la
presente invención con la SPasa comprende donador de glucosilo, en
particular sacarosa, en una concentración de 0,01 a 3 moles/l,
preferiblemente de 0,05 a 2 moles/l, más preferiblemente de 0,1 a
1,5 moles/l.
Resulta que la actividad de la SPasa y su
recambio de sustrato que lleva a \alphaGG es óptimo en las
concentraciones de donador de glucosilo que se describen aquí.
De acuerdo con un modo de realización preferible
de la presente invención, la mezcla de sustrato comprende glicerol
en una concentración de 0,01 a 10 moles/l, preferiblemente de 0,05 a
5 moles/l, más preferiblemente de 0,1 a 3 moles/l, siendo incluso
más preferible de 0,1 a 1,5 moles/l.
La relación de glicerol a donador de glucosilo
en la mezcla oscila preferiblemente entre 0,1:1 y 10:1,
preferiblemente, entre 0,5:1 y 5:1, más preferiblemente entre 1:1 y
3:1.
El \alphaGG
\alpha-D-glucosilglicerol que se
puede obtener a través del método de la presente invención puede
aislarse a través de diferentes métodos cromatográficos,
preferiblemente, por cromatografía de elución sobre carbono activo
combinado con celite como auxiliar de filtro. Se carga la mezcla
producto que se obtiene a través del método según la presente
invención en una columna de dicho material equilibrado en agua, y se
consigue la elución de \alphaGG unida con etanol al 2%. Las
fracciones que contienen \alphaGG están libres de glicerol
residual y el producto que resulta de la segmentación del donador de
glucosilo. Se obtiene \alphaGG en un rendimiento de más de 70%,
preferiblemente más de 80%, en particular más de 90%. La pureza del
producto tras la cromatografía es superior a 80%, preferiblemente
superior a 90%, en particular superior a 95%. Tras la concentración
a presión reducida, se obtiene preferiblemente \alphaGG sólido por
deshidratación, preferiblemente liofilización.
Preferiblemente, se utiliza carbón como
suspensión, o más preferiblemente cargado en la columna (v.g.,
columna de cromatografía). Se pone en contacto la mezcla de reacción
que comprende potencialmente la enzima o enzima residual y sustrato
con el carbón (v.g., se aplica sobre una columna de carbón) y se
eluye a continuación. Dicho eluato, o incluso la propia mezcla de
reacción, puede purificarse además utilizando una resina de
intercambio de iones, por ejemplo.
De acuerdo con otro modo de realización
preferible de la presente invención, se obtiene la sacarosa
fosforilasa a partir de Leuconostoc mesenteroides (Q59495,
Q9R5Q3) y se utiliza como preparación de enzima libre o
preferiblemente enzima inmovilizada, preferiblemente inmovilizada en
un polímero acrílico, en particular un copolímero de metacrilamida,
N,N'-metilen-bis(acrilamida)
y un polímero que lleva grupos oxirano, incubándose la sacarosa
fosforilasa inmovilizada con sacarosa como donador de glucosilo.
En particular, una SPasa derivada de
Leuconostoc mesenteroides inmovilizada en partículas de
polímero (o geles) que lleva grupos oxirano fue excepcionalmente
estable y muy adecuada para reacciones continuas, por ejemplo.
La \alphaGG o el producto que comprende
\alphaGG, que se puede obtener a través del método de la presente
invención, comprende la \alphaGG que se da de forma natural
(2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida)
en altas cantidades, ya que la SPasa es capaz de catalizar
específicamente la formación de dicha \alphaGG sin que se formen
de forma significativa subproductos como resultado de la
transglucosilación. Por lo tanto, es de particular importancia que
no esté contenida ninguna mezcla de regioisómero además de la
2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida
deseada también
1-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida.
La separación de estos dos productos podría ser enormemente
difícil. También es de particular importancia que, en las
condiciones de reacción del método de la presente invención, se
evite la formación de productos de hidrólisis de forma eficaz, de
manera que más de un 90%, preferiblemente más de un 95%, siendo más
preferible más de un 98% de la fracción de glucosilo del donador
convertido se transfiera al producto deseado.
Si se utiliza por ejemplo sacarosa como donador
de glucosilo, se obtiene un producto que contienen \alphaGG
natural y fructosa. Si se utiliza Glc 1-P como
donador de glucosilo, se obtiene un producto que comprende
\alphaGG natural y fosfato.
Por lo tanto, el producto que se puede obtener a
través del método de la presente invención puede comprender además
fructosa, preferiblemente, en una cantidad equimolar a \alphaGG
\alpha-D-glucosilglicerol.
\alphaGG es una molécula que se da de forma
natural (un derivado de hidrato de carbono; un glucósido) que tiene
la función de una sustancia osmoprotectora y estabilizante en
diversos microorganismos. Se ha demostrado en diversas
publicaciones que \alphaGG aislado tiene una gama de propiedades
destacadas que son de un sustancial interés por su aplicación
tecnológica. Los usos de \alphaGG y sus derivados incluyen, sin
limitarse sólo a ellos, los campos de la medicina (terapia contra
el cáncer), cosmética (hidratación y aditivos estabilizantes para
una serie de productos) y productos de alimentación
(antidiabéticos). Asimismo, \alphaGG es un estabilizante muy
eficaz de biomoléculas (proteínas, lípidos) y microorganismos.
Las preparaciones cosméticas pueden comprender
\alphaGG que se pueden obtener a través del método de la presente
invención.
Los productos cosméticos se caracterizan
especialmente por el hecho de no comprender \alphaGG natural, que
se puede obtener a través del método de la presente invención.
Las preparaciones farmacéuticas pueden
comprender \alphaGG que se puede obtener a través del método de
la presente invención.
Los suplementos alimenticios pueden comprender
\alphaGG o un producto que comprenda \alphaGG que se puede
obtener a través del método de la presente invención.
\alphaGG o productos que comprenden
\alphaGG, que se pueden obtener a través del método de la
invención se pueden utilizar como edulcorantes. En particular las
mezclas de \alphaGG y fructosa que se pueden obtener a través del
método de la presente invención se pueden utilizar como
edulcorantes.
\alphaGG se puede utilizar como aditivo
estabilizante para preparaciones de biomoléculas durante el
almacenamiento o procesado, en particular, durante la
deshidratación. En particular, \alphaGG puede servir como
estabilizante de microorganismos vivos, proteínas y estructuras
derivadas de lípidos. Puede estabilizar preparaciones de proteínas,
por ejemplo, sin limitarse sólo a ellas, anticuerpos, fragmentos de
anticuerpos y enzimas, contra la desnaturalización y la pérdida de
actividad biológica.
\alphaGG puede utilizarse como aditivo que
puede facilitar el plegamiento de proteínas, en particular, el
plegamiento de proteínas recombinantes en condiciones tanto in
vitro como in vivo.
\alphaGG puede utilizarse en particular como
producto de limpieza de la piel (JP 2004/331583), cosmético de base
acuosa (JP 2004/331582), inhibidor de la acumulación de grasa neutra
(JP 2004/331580), promotor de la producción de la matriz corium (JP
2004/331579), activador celular (JP 2004/331578) y agente
antibacteriano (JP 2004/331577).
La presente invención quedará mejor ilustrada
con las figuras adjuntas y los ejemplos que se exponen a
continuación sin quedar por ello limitarla.
La figura 1 presenta la estructura química de
\alphaGG.
La tabla 1 presenta los datos de RMN para
\alphaGG producida y purificada con arreglo al método de la
presente invención y se demuestra de forma inequívoca la estructura
química en la figura 1.
La figura 2 presenta la producción de \alphaGG
a partir de sacarosa y glicerol utilizando SPasa libre de
Leuconostoc mesenteroides. Se llevó a cabo la reacción
enzimática en un sistema discontinuo en agitación. Se utilizó
tampón MES 50 mM (pH 7) que contenía sacarosa 300 mM y glicerol 2M
como sustratos. La concentración de enzima fue 20 IU/ml. En
detalle, se incubó la mezcla de reacción que contenía sacarosa 300
mM, glicerol 2 M y 20 IU/ml de SPasa en tampón MES 50 mM (pH 7) a
30ºC y 550 rpm durante 7,5 horas. En estas condiciones óptimas
seleccionadas, el rendimiento de \alphaGG fue más de 95%. La
cantidad de glucosa liberada se restó de la cantidad de fructosa
liberada para definir el producto.
La figura 3 presenta la estabilidad operativa de
SPasa de Leuconostoc mesenteroides inmovilizada en un polímero que
lleva grupos oxirano. Se presentan los resultados de la conversión
continua de sacarosa en un reactor de enzima de lecho cargado. La
solución de sustrato contenía 600 mM de sacarosa y de fosfato, en
tampón MES 20 mM, pH 7,0. Se llevó a cabo la reacción a 30ºC y una
velocidad de flujo constante de 6 ml-h^{-1}, que
correspondía al tiempo de residencia medio de 8,8 h (53 ml,
\bullet) y 18,5 h (111 ml, o) respectivamente.
La figura 4 presenta la síntesis de \alphaGG
por glucosilación enzimática de glicerol utilizando SPasa de
Leuconostoc mesenteroides a diferentes valores de pH. La mezcla de
reacción contenía 0,1 M de Glc 1-P, 3 M glicerol y
3 IU/ml de SPasa en tampón mes 40 mM (pH 6,0, 6,5, 7,0) y tampón TES
40 mM (pH 7,5, 8,0), respectivamente. Las conversiones se
realizaron a 30ºC y una velocidad de agitación de 550 rpm. La
cantidad de glucosa liberada (cglc) fue restada de la cantidad de
fosfato liberado (cP) para definir la productividad.
La figura 5 presenta la competición nucleófila
de la hidrólisis de sacarosa a través de SPasa llevando a la
síntesis de \alpha-D-glicósidos
nuevas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede obtener SPasa como enzima nativa o como
una enzima recombinante (por ejemplo, pero sin limitarse sólo a
ella, producida en Escherichia coli) con arreglo a los informes de
la bibliografía (Guibert A y Monsan P., Ann. N.Y. Acad. Sci (1988)
504:307-311; Vandamme EJ y cols., Adv. Appl.
Microbiol. (1987) 32: 163-201; Kawasaki H. y cols.,
Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60:322-324; Kitao
S. y Nakano E., J. Ferment. Bioeng. (1992)
73:179-184; van den Broek LAM y cols., Appl.
Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:219-227).
Naturalmente, se puede producir en varias escalas representadas por
cultivos en matraz en agitación de un microorganismo adecuado y
bioreactores, preferiblemente, un reactor de tanque en agitación
ventilado o sin ventilar o un reactor de columna, como por ejemplo
una columna de burbujeo o un reactor de arrastre (airlift). La
purificación parcial o aislamiento de la enzima se realiza
aplicando los procedimientos descritos para SPasa o adoptando los
protocolos generales para la purificación de proteínas según el
estado de la técnica. Los procedimientos de inmovilización, como
por ejemplo, pero sin limitarse solamente a ellos, unión covalente y
no covalente con soportes insolubles, encapsulación y sistemas de
célula completa, se realizan empleando los protocolos ya
desarrollados para SPasa o adoptando los protocolos generales con
arreglo al estado de la técnica (Pimentel MCB y Ferreira MSS,
Appl., Biochem. Biotechnol. (1991) 27: 37-43;
Soetaert W. y cols. Progress in Biotechnology vol., 10 (Petersen
S.B. Svensson, B., Pederesen, S., Eds), Elsevier, Ámsterdam;
Vandamme EJ y cols., Adv. Appl. Microbiol. (1987) 32:
163-201).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la actividad de SPasa a 30ºC
utilizando un ensayo enzimático acoplado continuo, en el que se
acopla la producción de Glc 1-P de sacarosa y
fosfato inorgánico para la reducción de NAD^{+} en presencia de
fosfoglucomutasa (PGM) y
glucosa-6-fosfato dehidrogenasa
(G6P-DH). Se realizó el ensayo normal esencialmente
tal como se describe en otras partes en tampón fosfato potásico 50
mM, pH 7,0, que contenía EDTA 10 mM, MgCl_{2} 10 mM y 10 \muM
de \alpha-D-glucosa
1,6-bisfosfato. La mezcla de reacción contenía 250
mM de sacarosa, 2,5 mM de NAD^{+}, 3 U.ml^{-1} de PGM, 3,4
U.ml^{-1} de G6P-DH dependiente de NAD^{+} y
solución de enzima en dilución apropiada. Se llevó un seguimiento de
la formación de NADH con el tiempo por electrofotometría a 340 nm.
Una unidad de actividad de SPasa corresponde a la cantidad de enzima
que causó la reducción de 1 \mumol de NAD^{+} por minuto en las
condiciones que se han descrito anteriormente. Se determinaron las
concentraciones de proteína utilizando el método de unión a tinte
BioRad con albúmina de suero bovino. Se determinó el fosfato
colorimétricamente a 850 nm y se ensayó Glc 1-P en
un sistema enzimático acoplado con PGM y
G6P-DH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó una cantidad total de 700 U de una
preparación de SPasa en bruto con una actividad específica de SPasa
de 50 U.mg^{-1} a 4ºC con 10 g de Eupergit C en tampón fosfato
potásico 0,7 M, pH 7,0 durante 14 horas. La velocidad de agitación
fue 250 rpm. Se lavó el inmovilizado varias veces con tampón MES 20
mM, pH 7,0. La eficacia de unión, dada según la relación de la
actividad residual medida en el sobrenadante tras la inmovilización
y la actividad total empleada (U) fue 0,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargó Eupergit C, en el que se había unido
SPasa, en una columna de vidrio GE Healthcare XK26/40 (2,6 cm; 53
ml o 111 ml, 34 U.g^{-1} Eupergit C), equipada con un manguito
termostático. Se equilibró la columna con tampón MES 20 mM, pH 7,0.
La solución del sustrato contenía 600 mM de sacarosa y de fosfato en
el mismo tampón, y se llevó a la temperatura de reacción (30ºC) por
incubación en un baño de agua. Se bombeó la solución a través del
lecho cargado a una velocidad de flujo constante de 6 ml.h^{-1}
suministrado desde una bomba de pistón GE Healthcare (modelo
P-500). Se llevó un seguimiento continuo de la
temperatura en la salida del reactor. En determinados momentos, se
extrajeron muestras de 1 m. y se utilizaron para un posterior
análisis.
En la figura 3 se muestra el transcurso del
tiempo de la producción de Glc 1-P en un reactor de
lecho fijo continuo que funciona a una velocidad de flujo axial
constante de 1,13 cm.h^{-1}. Dependiendo del tiempo de residencia
medio determinado por la altura del lecho, 8,8 h o 18,5 h, la
conversión de sacarosa (600 mM) fue 68% y 91% respectivamente. Las
productividades correspondientes, calculadas como g.l^{-1}
producto x tiempo de residencia recíproco fueron 15,4 g
(l.h)^{-1} y 10,9 g (1.h)^{-1}. Debe advertirse
que la velocidad de conversión permaneció constante durante los
tiempos de reacción prolongados de 650 horas, lo que resalta la
excelente estabilidad de SPasa inmovilizada en las condiciones
operativas.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción contenía Glc
1-P 0,1 M, glicerol 3 M y 3 IU.ml^{-1} de LmSPasa
en tampón MES 40 mM (pH 6,0, 6,5, 7,0) o tampón TES 40 mM (pH 7,5,
8,0). Se siguió la conversión enzimática a lo largo del tiempo a
30ºC y una velocidad de agitación de 550 rpm. Se determinaron las
concentraciones de fosfato liberado (cP) y glucosa (cglc). La
cantidad de producto de transglucosilación formada corresponde a cP
- cglc. En la figura 4 se muestran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó la mezcla de reacción, que contenía
300 mM de sacarosa, 2 M de glicerol y 20 U/ml de SPasa en tampón
MES 50 mM (pH 7), a 30ºC y 550 rpm durante 7,5 horas. En estas
condiciones óptimas seleccionadas, el rendimiento de \alphaGG fue
superior a 95% (figura 2). Se llevó a cabo el análisis del producto
utilizando HPLC empleando una columna BioRad
HPX-87C y detección del índice de reflexión. Se
mantuvo la columna a 85ºC y se utilizó agua desionizada como
eluyente a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Se midió la
cantidad de glucosa liberada utilizando ensayo glucosa
oxidasa/peroxidasa según el estado de la técnica. Los análisis de
RMN presentados en la tabla 1, confirmaron la estructura correcta de
\alphaGG y la composición de la mezcla de producto. Debe
advertirse que se previene la hidrólisis (es decir formación de
glucosa) eficazmente en las condiciones empleadas en los ejemplos
10a a 10b.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron aproximadamente 90 ml del producto,
obtenido según el ejemplo 6 a excepción de que se utilizaron 800 mM
de sacarosa, en una columna (XK 50/60, GE Healthcare) cargada con
aproximadamente 1 litro de una mezcla 1:1 de carbono activo Norit®
(Tipo Norit SX Ultra) y Celite® 501 (Auxiliar de filtro calcinado).
Se equilibró la columna con agua. La solución de producto contenía
16,3 g de \alphaGG, 12,4 g de fructosa, 2,2 g de sacarosa, 13,1 g
de glicerol y 0,8 g de glucosa. Se llevó a cabo la elución
utilizando un gradiente escalonado de etanol en agua, utilizando 4
litros de agua, seguido de 4 litros de etanol al 2%, y finalmente 2
litros de etanol al 15%. \alphaGG eluye a 2% de etanol, separado
de la sacarosa sin reaccionar al igual que la fructosa. Glicerol
está presente en la fracción de agua. El rendimiento de \alphaGG
recuperado es 56% y la pureza de \alphaGG valorada por HPLC es
superior a 98%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó la proteína de interés (v.g., manitol
dehidrogenasa, MDH) a una concentración de 0,8 mg/ml en presencia
de 0, 20, 50, 100, 500, 1000 o 1500 mM \alphaGG en tampón
Tris/HCl, 100 mM, pH 7. Se liofilizaron las muestras durante toda
la noche y se disolvieron en el mismo tampón de nuevo. Se determinó
la actividad de enzima específica utilizando ensayos apropiados
para la enzima correspondiente tal como se ha descrito en otras
partes (Slatner M. y cols. Biochemistry 38:
10489-10498) antes y después del liofilizado. Sin
añadir ningún estabilizante, la actividad enzimática de MDH
descendió a 2% tras el liofilizado, mientras que \alphaGG fue
capaz de mantener la actividad enzimática hasta un 48%
independientemente de la concentración de \alphaGG añadida.
Claims (15)
1. Método para producir
2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida
(\alphaGG) a partir de un donador de glucosilo y un aceptor de
glucosilo que comprende las etapas de:
- proporcionar una sacarosa fosforilasa (EC
2.4.1.7)
- incubar dicha sacarosa fosforilasa con una
mezcla que comprende sacarosa como donador de glucosilo y glicerol
como aceptor de glucosilo y
- aislamiento y/o purificación de
2-O-gliceril-\alpha-D-glucopiranosida.
2. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la mezcla comprende un donador de
glucosilo adicional seleccionado del grupo que consiste en
\alpha-D-glucosa-1-fosfato,
\alpha-D-glucosa-1-fluoruro
y mezclas de ellos.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la sacarosa fosforilasa es de origen
microbiano, preferiblemente de origen bacteriano.
4. Un método según la reivindicación 3,
caracterizado porque la sacarosa fosforilasa bacteriana se
obtiene de Agrobacterium vitis, Bifidobacterium adolescentis,
Bifidobacterium longum, Escherichia coli, Escherichia coli 06,
Lactobacilus acidophilus, Lactobacilus delbrueckii subsp.
lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria monocytogenes,
Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas saccharophila, Rhodopirellula
baltica, Shewanella baltica, Shewanella frigidimarina, Solibacter
usitatus, Streptococcus mutans y/o Synechococcus sp.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sacarosa
fosforilasa se produce por recombinación como proteína de longitud
completa, o un fragmento catalíticamente activo de la misma, o una
proteína de fusión.
6. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se inmoviliza la
sacarosa fosforilasa antes de la etapa de incubación sobre un
soporte.
7. El método según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicho soporte es un soporte sólido,
preferiblemente un polímero, más preferiblemente un polímero
acrílico, en particular, un copolímero de metacrilamida,
N,N'-metilen-bis(acrilamida)
y un monómero que lleva grupos oxirano.
8. El método según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizado porque el soporte es una resina de
cromatografía, seleccionada preferiblemente del grupo que consiste
en una resina de cromatografía de intercambio aniónico, una resina
de cromatografía de intercambio de cationes, una resina de
cromatografía de afinidad y una resina de cromatografía de
interacción hidrófoba.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la incubación se
lleva a cabo a un valor de pH de 4 a 10, preferiblemente de 5 a 9,
más preferiblemente de 6 a 8, en particular de 7, y/o durante al
menos 15 minutos, preferiblemente, durante al menos 60 minutos, más
preferiblemente durante al menos 3 horas, siendo más preferible
incluso durante al menos 5 horas.
10. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la incubación se
lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 10 y 50ºC,
preferiblemente de 15 a 40ºC, más preferiblemente a una temperatura
de 30ºC.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la mezcla
comprende un donador de glucosilo en una concentración comprendida
entre 0,01 y 3 moles/l, preferiblemente entre 0,05 y 2 moles/l, más
preferiblemente entre 0,1 y 1,5 moles/l, y/o glicerol en una
concentración comprendida entre 0,01 y 10 moles/l, preferiblemente,
entre 0,05 y 5 moles/l, más preferiblemente entre 0,1 y 3 moles/l,
siendo incluso más preferible entre 0,1 y 1,5 moles/l.
12. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la relación de
glicerol a donador de glucosilo en la mezcla oscila entre 0,1:1 y
10:1, preferiblemente entre 0,5: 1 y 5:1, más preferiblemente entre
1:1 y 3:1.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se aísla
\alpha-D-glucosilglicerol por
cromatografía por elución sobre carbono activo en un rendimiento de
55%, preferiblemente 70%, más preferiblemente 85%.
14. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la sacarosa
fosforilasa se obtiene a partir de Leuconostoc mesenteroides
y se inmoviliza en un polímero acrílico, en particular, un
copolímero de metacrilamida,
N,N'-metilen-bis(acrilamida)
y un polímero que lleva grupos oxirano, incubándose la sacaroasa
fosforilasa inmovilizado con sacarosa como donador de glucosilo.
15. El método según la reivindicación 1 para
producir una mezcla que contiene
\alpha-D-glucosilglicerol y
fructosa que comprende las etapas de:
- proporcionar una sacarosa fosforilasa (EC
2.4.1.7),
- incubar dicha sacarosa fosforilasa con una
mezcla que comprende sacarosa y glicerol como aceptor de glucosilo
y
- aislar y/o purificar la mezcla de
\alpha-D-glucosilglicerol y
fructosa.
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