ES2339278T3 - Metodo de produccion de d-psicosa por d-psicosa epimerasa. - Google Patents

Metodo de produccion de d-psicosa por d-psicosa epimerasa. Download PDF

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Abstract

El uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa, en la que SEQ ID NO: 1 es: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Description

Método de producción de D-psicosa por D-psicosa epimerasa.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir D-psicosa usando una D-psicosa epimerasa (denominada en este documento de aquí en adelante, psicosa 3-epimerasa) derivada de Agrobacterium tumefaciens.
Antecedentes de la invención
De forma general, la D-psicosa es un epímero de la D-fructosa, y es muy similar a la D-fructosa en los aspectos de intensidad y tipo del dulzor. Sin embargo, a diferencia de la D-fructosa, la D-psicosa apenas es metabolizada durante la asimilación en el cuerpo, y tiene un bajo grado de contribución calórica. Por lo tanto, la D-psicosa puede usarse como un ingrediente eficaz de alimentos de dieta. Mientras que los alcoholes de azúcar, que son ampliamente usados como edulcorantes no azucarados, causan efectos secundarios tales como la diarrea cuando se ingiere más de una dosis estipulada, la D-psicosa no tiene ninguno de tales efectos secundarios. Además, la D-psicosa tiene un valor calórico de casi cero, ya que casi no es metabolizable por el cuerpo humano, y tiene la función de reducir las grasas abdominales suprimiendo la actividad de enzimas lipogénicas. Por lo tanto, la D-psicosa puede usarse como un edulcorante que también es provechoso en la reducción del peso (Véase, por ejemplo, Matsuo, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori y H. Suzuki, "Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats", Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10:233-237 (2001); y Matsuo, T. y K. Izumori, "D-Psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition", Asia Pac. J. Clin. Nutr., 13:S127 (2004)).
En este sentido, la D-psicosa atrae un gran interés como edulcorante alimenticio, y hay una demanda creciente en el ramo de la alimentación para el desarrollo de un método para producir la D-psicosa eficazmente. Esto es debido a que la D-psicosa sólo existe en una muy pequeña cantidad en la naturaleza como intermedio durante el proceso de tratamiento de theriae o reacción de isomerización de la glucosa, y no puede ser sintetizada por medios químicos.
Por lo tanto, a fin de afrontar tales problemas como se describen anteriormente, se están desarrollando investigaciones sobre métodos para producir enzimáticamente D-psicosa usando D-fructosa como sustrato.
Sin embargo, hay un problema en los métodos desarrollados hasta ahora, que los gastos de producción son altos, debido al bajo rendimiento de la D-psicosa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es una gráfica que muestra la actividad de psicosa 3-epimerasa frente al pH de reacción;
La figura 1B es una gráfica que muestra la actividad de psicosa 3-epimerasa frente a la temperatura de reacción;
La figura 2 es una gráfica que muestra las proporciones de equilibrio entre D-psicosa (\blacksquare) y D-fructosa (\Box) obtenidas cuando la psicosa 3-epimerasa se hace reaccionar con D-fructosa a temperaturas en el intervalo de 30ºC y 60ºC; y
La figura 3 es un mapa de división de un vector de expresión recombinante.
Descripción detallada de la invención Problema técnico
Los inventores de la presente invención hicieron un intento de seleccionar una enzima que pudiera producir la D-psicosa con un alto rendimiento usando D-fructosa como sustrato, a partir de enzimas de epimerasa que se caracterizaban no por la función, sino simplemente por la secuencia de bases o la secuencia de aminoácidos, y demostraron los efectos específicos de la enzima seleccionada. La presente invención proporciona un nuevo método para producir la D-psicosa con un alto rendimiento usando la enzima seleccionada.
Solución técnica
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, y que tiene una actividad de psicosa 3-epimerasa en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir D-psicosa haciendo reaccionar una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con D-fructosa.
De aquí en adelante en este documento, la presente invención será descrita detalladamente.
Se sobrentiende que los términos técnicos y los términos científicos usados en este documento se refieren a los términos convencionalmente entendidos por los expertos ordinarios en la técnica, a menos que se establezca otra cosa.
Además, no serán repetidas las descripciones sobre constituciones técnicas y mecanismos que son idénticas a las constituciones técnicas y mecanismos convencionalmente conocidos.
Los presentes inventores investigaron las características de la tagatosa 3-epimerasa no caracterizada derivada de Agrobacterium tumefaciens clonando un gen de la tagatosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens o un gen correspondiente a la tagatosa 3-epimerasa, cultivando un microorganismo transformado con un vector de expresión que contiene el gen, y sobre-expresando la tagatosa 3-epimerasa. Consecuentemente, se encontró que la tagatosa 3-epimerasa tenía una especificidad más alta para la psicosa que para la tagatosa, y así, se demostró que la "supuestamente conocida" tagatosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens era realmente la psicosa 3-epimerasa. Así, la presente invención proporciona un método para producir la D-psicosa usando la psicosa 3-epimerasa.
Más expresamente, en una tentativa de obtener el gen de una conocida tagatosa 3-epimerasa útil para la presente invención, se usaron cepas bacterianas conocidas por producir el gen de la tagatosa 3-epimerasa, y las cepas bacterianas incluyen Thermotoga maritima, Streptomyces coelicolor, Mesorhizobium loti, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopirellula baltica, Pirellula sp., Photorhabdus luminescens subsp. laumondii y Sinorhizobium meliloti. Se demostró por primera vez por la presente invención que sólo la enzima (NP_355915; SEQ ID NO: 1) expresada a partir de un gen derivado de ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens tiene una actividad que puede convertir la D-fructosa en D-psicosa.
A fin de determinar las características de la tagatosa 3-epimerasa, en la presente invención, se obtuvieron los genes de tagatosa 3-epimerasa en grandes cantidades mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de cepas bacterianas que contienen genes de tagatosa 3-epimerasa que fueron designados simplemente según la secuencia de bases del ADN, no según los resultados de caracterización en el aspecto de la función enzimática. Después, los genes de tagatosa 3-epimerasa obtenidos se insertaron en los vectores de expresión apropiados para producir vectores recombinantes que contenían los genes de tagatosa 3-epimerasa, y los vectores recombinantes se transformaron dentro de los microorganismos apropiados. Los microorganismos transformados se cultivaron en medios de fermentación, y los productos proteicos de los genes de tagatosa 3-epimerasa se sobre-expresaron en los microorganismos. Los productos proteicos de los genes de tagatosa 3-epimerasa se aislaron entonces y se purificaron para su uso.
El método para producir la D-psicosa de la presente invención incluye hacer reaccionar una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que es la psicosa 3-epimerasa (conocida por lo general como la tagatosa 3-epimerasa) con D-fructosa usada como sustrato.
La psicosa 3-epimerasa empleada en la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos modificadas que resultan de la sustitución, introducción o deleción de algunos residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pueden ser capaces de convertir la D-fructosa en D-psicosa.
Un vector de expresión que puede usarse para producir un vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector de expresión convencionalmente usado en la tecnología de recombinación genética, y puede ser, por ejemplo, pET-24a(+). El microorganismo que puede transformarse con el vector de expresión recombinante puede ser BL21 (DE3) de E. coli. Sin embargo, el microorganismo no está limitado a condición de que sea cualquier cepa bacteriana que sea capaz de sobre-expresar el gen deseado, siendo transformado después con un vector de expresión recombinante que contiene el gen, y que sea también capaz de producir una proteína activa a consecuencia de la sobreexpresión.
Más detalladamente, pueden realizarse los siguientes procesos para cultivar un microorganismo transformado e inducir la sobreexpresión de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, según el ejemplo siguiente, descrito más abajo. Un inóculo almacenado criogénicamente BL21 (DE3) de Escherichia coli se inocula en un matraz de 250 ml que contiene 50 ml de un medio LB, y la cepa se cultiva en una incubadora con agitación mantenida a 37ºC, hasta que la absorbancia a 600 nm alcance 2,0. La solución cultivada se añade a un fermentador de 7-L (Biotron, Ltd., Corea) que contiene 5 L de un medio de fermentación formado por 10 g/L de glicerol, 1 g/L de peptona, 30 g/L de extracto de levadura, 0,14 g/L de difosfato de potasio y 1 g/L de monofosfato de sodio, y la mezcla se incuba en el fermentador hasta que la absorbancia a 600 nm alcance 2,0. Después, se añade ITPG 1 mM para inducir la sobreexpresión de la proteína de la presente invención. Durante la operación, la velocidad de agitación puede ser mantenida a 500 revoluciones por minuto, la velocidad de ventilación a 1,0 vvm, y la temperatura de incubación a 37ºC, y tales condiciones de incubación que se describen antes son favorables para la fabricación en serie de la psicosa 3-epimerasa.
A fin de purificar la proteína producida por la sobreexpresión, la solución del cultivo de la cepa bacteriana transformada se centrifuga a 6.000xg a 4ºC durante 30 minutos, y luego se lava dos veces con NaCl al 0,85%. Posteriormente, las células se añaden a una solución reguladora citolítica (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0) que contiene 1 mg/ml de lisozima, y la solución reguladora citolítica que contiene las células se deja reposar en un baño de hielo durante 30 minutos. Las células en la solución reguladora citolítica se rompen mediante una prensa francesa a una presión de 15.000 lb/in^{2} (10^{5} KPa) y las células rotas se someten a centrifugación a 13.000xg a 4ºC durante 20 minutos y se eliminan, mientras que el sobrenadante se filtra a través de un papel de filtro con un diámetro de poro de 0,45 \mum, y se purifica por cromatografía de proteína rápida (FPLC) bajo una condición criogénica. El filtrado, que contiene la proteína empleada en la presente invención, se aplica a una columna HP de HisTrap que ha sido equilibrada con una solución reguladora de fosfato 50 mM a pH 8,0 que contiene cloruro de sodio (NaCl) 300 mM e imidazol 10 mM. Posteriormente, la columna HP de HisTrap se lava con la misma solución reguladora de fosfato, y luego la proteína unida a la columna se eluye con la misma solución reguladora de fosfato que contiene imidazol a una concentración de gradiente de 10 mM a 200 mM, a un caudal de 1 ml/min. La fracción eluída que contiene la proteína de la presente invención se añade a una columna de resina desmineralizada 16/60 de HiPrep que ha sido equilibrada con una solución reguladora de PIPES 50 mM a pH 7,5, y luego, la proteína se lava a un caudal de 6 ml/min. Una solución de la proteína así recuperada se aplica a una columna HR S-100 de Sephacryl que se ha equilibrado con una solución reguladora de PIPES 50 mM a pH 7,5 que contiene cloruro de sodio 0,15 M, a un caudal de 6,6 ml/min para eluir la proteína. La proteína eluída finalmente se dializa en una solución reguladora de PIPES 50 mM.
La proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 obtenida como se describe antes es la psicosa 3-epimerasa, que es un monómero que tiene un peso molecular de 32.600 Da. Esta psicosa 3-epimerasa es una metaloenzima, cuya activación es regulada por un ión metálico.
Según una realización preferida de la presente invención, la reacción entre la psicosa 3-epimerasa y la D-fructosa puede realizarse en presencia de un ión metálico seleccionado entre el grupo que consiste en manganeso, magnesio, hierro, cobalto y aluminio, preferiblemente a una concentración de 0,5 a 5 mM, por ejemplo, 1 mM, para mejorar el rendimiento de producción de la D-psicosa. Cuando la concentración del ión metálico es menor de 0,5 mM, el efecto de mejorar el rendimiento de producción es insignificante, mientras que cuando la concentración del ión metálico es mayor que 5 mM, la mejora es menos eficaz con relación a la cantidad en exceso.
La reacción entre la psicosa 3-epimerasa y la D-fructosa puede realizarse usando una concentración de sustrato (es decir, de D-fructosa) del 55 al 75% (p/p), a pH de 7 a 8, y a una temperatura de 55 a 65ºC. Cuando la concentración del sustrato, que es la D-fructosa, está en el intervalo de 55 a 75% (p/p), el rendimiento de producción de la D-psicosa es bueno, y las condiciones de pH y temperatura de los intervalos anteriormente mencionados están en los intervalos de pH óptimo y de temperatura para la actividad de psicosa 3-epimerasa.
Según otra realización de la presente invención, la reacción entre la psicosa 3-epimerasa y la D-fructosa para producir D-psicosa puede realizarse inmovilizando la psicosa 3-epimerasa sobre un vehículo durante la reacción, ya que la psicosa 3-epimerasa inmovilizada sobre un vehículo puede mantener la actividad enzimática durante un período de tiempo prolongado. El vehículo útil para esta realización de la presente invención puede ser cualquiera de los vehículos conocidos para su uso en la inmovilización de enzimas, y puede ser, por ejemplo, el alginato de sodio. El alginato de sodio es un polisacárido coloidal natural que es abundante en las paredes de las células de algas, y contiene residuos de ácido \beta-D-manurónico y ácido \alpha-L-gulurónico, que están conectados aleatoriamente por enlaces \beta-1,4. Así, el alginato de sodio permite una inmovilización estable de la psicosa 3-epimerasa, y es ventajoso para obtener un rendimiento de D-psicosa alto. A fin de obtener el máximo rendimiento de la D-psicosa, puede usarse alginato de sodio para la inmovilización de la psicosa 3-epimerasa a una concentración de 1,5 a 4,0% en peso, por ejemplo, 2,5% en peso. Cuando se usa el alginato de sodio como vehículo para inmovilizar la psicosa 3-epimerasa, puede añadirse una solución de psicosa 3-epimerasa a una solución acuosa de alginato de sodio con uno o dos volúmenes de la solución de psicosa 3-epimerasa, y luego la mezcla se añade gota a gota a una solución del ión calcio 0,2 M usando una bomba de jeringuilla y una bomba neumática, de modo que se formen perlas de un complejo de psicosa 3-epimerasa-alginato de sodio. Estas perlas del complejo de psicosa 3-epimerasa-alginato de sodio pueden usarse directamente en la reacción con D-fructosa.
El método para producir D-psicosa según las realizaciones de la presente invención es ecológico porque se usa una enzima derivada de un microorganismo, requiere un proceso simple para la inmovilización de enzimas, y aumenta considerablemente el rendimiento de producción de la D-psicosa, reduciendo así los gastos de producción, maximizando el efecto de producción.
La D-psicosa así producida puede ser usada útilmente como aditivo alimenticio o farmacéutico.
Efectos ventajosos
Como se describe anteriormente, el método para producir D-psicosa según las realizaciones de la presente invención es ecológico porque se usa una enzima derivada de un microorganismo, requiere un proceso simple para la inmovilización de las enzimas, usa un sustrato que es más barato que el usado en un método convencional, y aumenta considerablemente el rendimiento de producción de la D-psicosa, reduciendo así los gastos de producción, maximizando al mismo tiempo el efecto de producción.
La D-psicosa así producida puede ser usada útilmente como aditivo alimenticio o farmacéutico.
El mejor modo
En lo sucesivo de aquí en adelante en este documento, la presente invención será descrita más detalladamente en cuanto a los Ejemplos específicos. Estos Ejemplos tienen sólo objetivos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.
Ejemplo experimental
En el actual Ejemplo Experimental, se usó MALDI-TOF-MS para la medida del peso molecular de la psicosa 3-epimerasa, y se usó ácido cinámico como matriz. La actividad enzimática se midió usando la D-fructosa como sustrato. Para la medida de la actividad enzimática, se permitió que la psicosa 3-epimerasa reaccionara con la D-fructosa en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contenía D-fructosa al 1,0%, a pH 7,5 y a 50ºC durante 20 minutos, y luego la solución de reacción se calentó a 100ºC durante 5 minutos para terminar la reacción. La solución reguladora de PIPES que contiene la D-fructosa se preparó disolviendo la D-fructosa en la disolución reguladora de PIPES a pH de 7 a 8 a una concentración del 60 a 70% en peso, y la solución reguladora de PIPES que contiene la D-fructosa se añadió continuamente a un fermentador mantenido entre 40 y 60ºC. Para una fácil comparación de la actividad enzimática, se define una unidad de psicosa 3-epimerasa como la cantidad de psicosa 3-epimerasa necesaria para producir 1 mol de D-psicosa por minuto a pH 7,5 y a 50ºC.
Las concentraciones de D-fructosa, D-psicosa, D-sorbosa, D-tagatosa, D-xilulosa y D-ribulosa se midieron usando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una columna de hidrocarburo de ión calcio BP-100 y un detector IR. La columna se acondicionó para permitir un flujo de agua destilada a un caudal de 0,5 ml/min a 80ºC.
Ejemplos Propiedades físicas de psicosa 3-epimerasa Ejemplo 1 Producción en masa de psicosa 3-epimerasa
El gen de la psicosa 3-epimerasa fue obtenido en grandes cantidades amplificando el ADN de ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un cebador diseñado basado en la secuencia de bases de ADN de un gen que había sido sugerido como un gen de tagatosa 3-epimerasa de C58 de Agrobacterium tumefaciens, pero que no había sido funcionalmente caracterizado. El gen obtenido de la psicosa 3-epimerasa se insertó en un vector de expresión, pET-24a(+) (Novagen, Inc), usando enzimas de restricción XhoI y NdeI para producir un vector de expresión recombinante pET-24a(+) / psicosa 3-epimerasa (Véase FIG. 3). Este vector de expresión recombinante se transformó en BL21(DE3) de Escherichia coli por un método de transformación convencional. La cepa transformada BL21(DE3) de E. coli se almacenó criogénicamente en nitrógeno licuado antes de ser cultivada para la fabricación en serie.
A partir de entonces, un inóculo de la cepa BL21(DE3) de E. coli criogénicamente almacenado se inoculó en un matraz de 250 ml que contenía 50 ml del medio LB, y se precultivó en una incubadora con agitación a 37ºC hasta que la absorbancia de la solución del precultivo a 600 nm alcanzó 2,0. La solución del precultivo se añadió a un fermentador de 7 L (Biotron, Ltd., KR) que contenía 5 L de un medio de fermentación (10 g/L de glicerol, 1 g/L de peptona, 30 g/L de extracto de levadura, 0,14 g/L de fosfato de di-potasio y 1 g/L de fosfato de monosodio), y se sometió al cultivo principal. Cuando la absorbancia de la solución del cultivo principal a 600 nm alcanzó 2,0, se añadió 1 mM de ITPG a la solución de cultivo principal para inducir la fabricación en serie de la psicosa 3-epimerasa. Durante el proceso de cultivo, la velocidad de agitación se mantuvo a 500 revoluciones por minuto, la velocidad de ventilación a 1,0 vvm (volumen/volumen/minuto), y la temperatura de incubación a 37ºC.
Ejemplo 2 Purificación de psicosa 3-epimerasa
A fin de realizar la caracterización de la psicosa 3-epimerasa, la psicosa 3-epimerasa se purificó usando cromatografía de afinidad (columna HP de HisTrap), una desmineralización (columna HiPrep 16/60), y una filtración de gel (columna Sephacryl S-100 HR).
El peso molecular de la psicosa 3-epimerasa purificada se midió, y se encontró que la psicosa 3-epimerasa era un monómero con un peso molecular de 32.600 Da. La secuencia de aminoácidos de la psicosa 3-epimerasa se confirmó que era idéntica a la secuencia de aminoácidos con número de entrada de NCBI NP_355915.
Ejemplo 3 Especificidad del metal de psicosa 3-epimerasa
A fin de investigar el efecto de la adición de un ión metálico, se midió la actividad enzimática de la psicosa 3-epimerasa después de tratar la psicosa 3-epimerasa con EDTA, o después de añadir 1 mM de cada uno de los iones metálicos indicados en la Tabla 1 de más abajo, a la psicosa 3-epimerasa. La reacción de la psicosa 3-epimerasa se realizó en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contenía 0,04 unidades/ml de la psicosa 3-epimerasa y 1,0% en peso de la D-fructosa a pH 7,5 y a 50ºC durante 20 minutos, y luego la solución de reacción fue calentada a 100ºC durante 5 minutos para terminar la reacción. Después, se midió la actividad enzimática de la psicosa 3-epimerasa.
Por consiguiente, se encontró que la psicosa 3-epimerasa tenía una metaloenzima, ya que los iones de manganeso y cobalto realzaron la actividad enzimática, mientras que los iones de cobre y cinc suprimieron la actividad enzimática como se indica más abajo en la Tabla 1.
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TABLA 1
1 
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Ejemplo 4 Especificidad del sustrato de psicosa 3-epimerasa
La reacción de la psicosa 3-epimerasa se realizó en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contenía 0,04 unidades/ml de psicosa 3-epimerasa y 10 mM, cada uno individualmente, de los monosacáridos indicados en la Tabla 2 más abajo, a pH 7,5 y a 50ºC durante 20 minutos, y luego cada una de las soluciones de reacción fue calentada a 100ºC durante 5 minutos para terminar la reacción. Después, se midió la actividad enzimática de la psicosa 3-epimerasa de cada solución de reacción.
Por consiguiente, se encontró que la psicosa 3-epimerasa tenía una afinidad más alta para la D-psicosa que para la D-tagatosa. Así, esta psicosa 3-epimerasa fue nuevamente reconocida como una enzima capaz de la epimerización de psicosa, no una tagatosa 3-epimerasa.
TABLA 2
2
Ejemplo 5 Actividad de psicosa 3-epimerasa según los cambios de pH y temperaturas
En el Ejemplo 5, la psicosa 3-epimerasa se hizo reaccionar con D-fructosa a varios valores de pH y temperaturas, y las actividades enzimáticas obtenidas a varios valores de pH y temperaturas fueron comparados. A fin de investigar el efecto del pH, la reacción de la psicosa 3-epimerasa se realizó en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contiene 0,04 unidades de psicosa 3-epimerasa/ml y 1,0% de D-fructosa a valores de pH en el intervalo de 6,5 a 7,5, y la misma reacción fue realizada en una solución reguladora de EPPS 50 mM que contenía 0,04 unidades de psicosa 3-epimerasa/ml y 1,0% de D-fructosa a valores de pH en el intervalo de 7,5 a 8,5. En esta invención, las reacciones respectivas fueron realizadas a 50ºC cuando los iones metálicos no fueron añadidos, y a 60ºC cuando los iones de manganeso fueron añadidos, respectivamente durante 20 minutos. Después, las reacciones se terminaron por tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midieron las actividades enzimáticas. Los resultados se representan en la Figura 1A.
A fin de investigar el efecto de la temperatura, la reacción se realiza en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contiene 0,04 unidades de psicosa 3-epimerasa/ml y 1,0% de D-fructosa a temperaturas en el intervalo de 30ºC a 70ºC durante 20 minutos, a pH 7,5 cuando los iones metálicos no fueron añadidos, y a pH 7,0 cuando los iones de manganeso fueron añadidos. Las reacciones se terminaron por tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midieron las actividades enzimáticas. Los resultados se representan en la Figura 1B.
Por consiguiente, el pH óptimo y la temperatura para la psicosa 3-epimerasa cuando los iones metálicos no fueron añadidos se encontró que eran 7,5 y 50ºC, respectivamente. El pH óptimo y la temperatura para la psicosa 3-epimerasa cuando se añadieron los iones Mn^{2+} era 7,0 y 60ºC, respectivamente.
La Figura 1A es una gráfica que muestra la actividad de la psicosa 3-epimerasa frente al pH de reacción. Respecto a la Figura 1A, ñ indica el resultado obtenido en una solución reguladora de PIPES que no contiene ningún ion metálico; \bullet indica el resultado obtenido en una solución reguladora de PIPES que contiene iones Mn^{2+}; \Box indica el resultado obtenido en una solución reguladora de EPPS que no contiene ningún ion metálico; y \blacksquare indica el resultado obtenido en una solución reguladora de EPPS que contiene iones Mn^{2+}.
La Figura 1B es una gráfica que muestra la actividad de la psicosa 3-epimerasa frente a la temperatura de reacción. Respecto a la Figura 1B, ñ indica el resultado obtenido en ausencia de iones metálicos; y \bullet indica el resultado obtenido en presencia de 1 mM de iones Mn^{2+}.
Ejemplo 6 Equilibrio entre D-psicosa y D-fructosa conseguido por psicosa 3-epimerasa
En el Ejemplo 6, la reacción de la psicosa 3-epimerasa fue realizada en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contenía 0,04 unidades de psicosa 3-epimerasa/ml, 1 mM de iones Mn^{2+}, y 0,1% de D-psicosa y D-fructosa juntas, a pH 7,0 y a temperaturas en el intervalo de 30ºC a 60ºC durante 24 horas para permitir que la reacción procediera suficientemente, a fin de determinar el equilibrio entre D-psicosa y D-fructosa. Después, las reacciones se terminaron por tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midió la actividad enzimática.
La Figura 2 es una gráfica que muestra la relación de equilibrio de D-psicosa (\blacksquare) y D-fructosa (\Box) conseguida después de la reacción de la psicosa 3-epimerasa según una realización de la presente invención con D-fructosa a temperaturas en el intervalo de 30ºC a 60ºC.
Por consiguiente, la reacción fue comenzada con 5 proporciones iniciales de D-psicosa y D-fructosa, de 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 y 100:0, y las proporciones finales de D-psicosa frente a D-fructosa fueron determinadas después de 24 horas de reacción, como se muestra en la Figura 2. Respecto a la Figura 2, la proporción de D-psicosa frente a D-fructosa era 32:68 a 30ºC, mientras que la misma proporción fue 37:63 a 60ºC. Estos resultados son aproximadamente un 20% superior al rendimiento alcanzable por métodos convencionales para producir D-psicosa.
Ejemplo 7 Producción de D-psicosa por psicosa 3-epimerasa
A fin de producir D-psicosa a concentraciones altas, la reacción se realizó en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contenía 14 unidades de psicosa 3-epimerasa/ml, 1 mM de iones Mn^{2+}, y 700 g/L de D-fructosa, a pH 7,0 y a 60ºC durante varios tiempos de reacción. Después, la reacción fue terminada por tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midió la actividad enzimática. Las tasas de producción de D-psicosa según el tiempo de reacción se muestran en la Tabla 3 más abajo.
TABLA 3
3
Por consiguiente, se produjeron 211 g/L de la D-psicosa usando un tiempo de reacción de 120 minutos, y esta tasa de producción corresponde a un rendimiento de conversión de D-psicosa del 30,2%.
Ejemplo 8 Producción de D-psicosa por inmovilización enzimática
A fin de investigar la eficacia del método para producir la D-psicosa, la psicosa 3-epimerasa fue inmovilizada. Los rendimientos de producción de la psicosa 3-epimerasa inmovilizada fueron medidos y comparados con los de la psicosa 3-epimerasa (libre) no inmovilizada.
Para la psicosa 3-epimerasa inmovilizada sobre un vehículo, se usaron perlas del complejo psicosa 3-epimerasa-alginato de sodio, que fueron producidas añadiendo una solución de psicosa 3-epimerasa a una solución de alginato de sodio al 2,5% con un volumen 1,5 veces el volumen de la solución de psicosa 3-epimerasa, y añadiendo esta mezcla a una solución de ión de calcio 0,2 M con una bomba de jeringuilla y una bomba neumática.
La reacción se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 7, salvo que se usó la psicosa 3-epimerasa inmovilizada. La cantidad de psicosa 3-epimerasa usada en la reacción fue 140 unidades por 10 ml, y se midieron las tasas de producción de D-psicosa. Los resultados se muestran en la Tabla 4 más abajo.
TABLA 4
4
La psicosa 3-epimerasa libre del Ejemplo 7 causó una tasa de conversión máxima de 211 g/L usando un tiempo de reacción de 120 minutos. Sin embargo, en el caso de la psicosa 3-epimerasa inmovilizada del Ejemplo actual, la velocidad de producción fue inferior que la de la psicosa 3-epimerasa libre, pero la estabilidad termal de la psicosa 3-epimerasa inmovilizada fue superior, y la concentración de D-psicosa aumentó con el tiempo. Así, la tasa de producción de D-psicosa fue 245 g/L después de un tiempo de reacción de 360 minutos, y esta tasa de producción correspondió a un rendimiento de conversión del 35%.
Ejemplo 9 Rendimiento de producción de D-psicosa en fermentador
La siguiente reacción fue realizada en un fermentador para verificar el rendimiento de producción de la psicosa 3-epimerasa inmovilizada del Ejemplo 8.
Primero, se prepararon psicosa 3-epimerasa inmovilizada y D-fructosa de la misma manera que en el Ejemplo 8, se añadió la D-fructosa a la psicosa 3-epimerasa inmovilizada, y la mezcla se ajustó entonces a un volumen de 100 ml. Posteriormente, se rellenó un fermentador (Pharmacia Biotechnologies, Inc, XK26, Reino Unido) con una altura de 100 cm y un diámetro de 26 cm con la mezcla de psicosa 3-epimerasa inmovilizada y D-fructosa, y la reacción se realizó a un caudal de 10 ml/h y a 60ºC. La cantidad de psicosa 3-epimerasa usada fue 500 unidades, y la concentración de D-fructosa usada se restringió a 600 g/L, debido al problema de la precipitación de la D-fructosa en exceso durante una operación a largo plazo. Los resultados se muestran en la Tabla 5 más abajo.
TABLA 5
5
Por consiguiente, la reacción entre psicosa 3-epimerasa y D-fructosa fue estable durante todo el período del experimento de 30 días, y la productividad fue 21 g/L/h, la tasa de conversión entre D-fructosa y D-psicosa fue del 35%, mientras que la tasa de producción fue 210 g/L. El rendimiento es un valor de la producción excelente en la fabricación en serie de azúcares.
Así, puede proporcionarse un sistema de producción de D-psicosa usando un fermentador que es capaz de la fabricación en serie a escala industrial.

Claims (8)

1. El uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa, en la que SEQ ID NO: 1 es:
6
7
2. Un método para producir D-psicosa haciendo reaccionar la proteína definida en la reivindicación 1 con D-fructosa.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la proteína es un producto proteico obtenido cultivando un microorganismo transformado con el vector de expresión recombinante que comprende un gen que codifica una proteína, cuya proteína tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y aislando la proteína de la solución de cultivo del microorganismo en el que SEQ ID NO: 1 es:
8
9
4. El método de la reivindicación 2, en el que la reacción se realiza en presencia de un ión metálico seleccionado entre el grupo que consiste en manganeso, magnesio, hierro, cobalto y aluminio.
5. El método de la reivindicación 2, en el que la concentración de D-fructosa usada en la reacción está entre 55 y 75% (p/p).
6. El método de la reivindicación 2, en el que la reacción se realiza entre un pH de 7 y 8 y a una temperatura entre 55 y 65ºC.
7. El método de la reivindicación 2, en el que la proteína se hace reaccionar con D-fructosa estando inmovilizada sobre un vehículo.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el ión metálico está presente a una concentración entre 0,5 mM y 5 mM.
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