ES2339278T3 - Metodo de produccion de d-psicosa por d-psicosa epimerasa. - Google Patents
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Abstract
El uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa, en la que SEQ ID NO: 1 es: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
Description
Método de producción de
D-psicosa por D-psicosa
epimerasa.
La presente invención se refiere a un método
para producir D-psicosa usando una
D-psicosa epimerasa (denominada en este documento
de aquí en adelante, psicosa 3-epimerasa) derivada
de Agrobacterium tumefaciens.
De forma general, la D-psicosa
es un epímero de la D-fructosa, y es muy similar a
la D-fructosa en los aspectos de intensidad y tipo
del dulzor. Sin embargo, a diferencia de la
D-fructosa, la D-psicosa apenas es
metabolizada durante la asimilación en el cuerpo, y tiene un bajo
grado de contribución calórica. Por lo tanto, la
D-psicosa puede usarse como un ingrediente eficaz
de alimentos de dieta. Mientras que los alcoholes de azúcar, que son
ampliamente usados como edulcorantes no azucarados, causan efectos
secundarios tales como la diarrea cuando se ingiere más de una
dosis estipulada, la D-psicosa no tiene ninguno de
tales efectos secundarios. Además, la D-psicosa
tiene un valor calórico de casi cero, ya que casi no es
metabolizable por el cuerpo humano, y tiene la función de reducir
las grasas abdominales suprimiendo la actividad de enzimas
lipogénicas. Por lo tanto, la D-psicosa puede
usarse como un edulcorante que también es provechoso en la reducción
del peso (Véase, por ejemplo, Matsuo, T., Y. Baba, M. Hashiguchi,
K. Takeshita, K. Izumori y H. Suzuki, "Dietary
D-psicose, a C-3 epimer of
D-fructose, suppresses the activity of hepatic
lipogenic enzymes in rats", Asia Pac. J. Clin. Nutr.,
10:233-237 (2001); y Matsuo, T. y K. Izumori,
"D-Psicose, a rare sugar that provides no energy
and additionally beneficial effects for clinical nutrition",
Asia Pac. J. Clin. Nutr., 13:S127 (2004)).
En este sentido, la D-psicosa
atrae un gran interés como edulcorante alimenticio, y hay una
demanda creciente en el ramo de la alimentación para el desarrollo
de un método para producir la D-psicosa eficazmente.
Esto es debido a que la D-psicosa sólo existe en
una muy pequeña cantidad en la naturaleza como intermedio durante
el proceso de tratamiento de theriae o reacción de
isomerización de la glucosa, y no puede ser sintetizada por medios
químicos.
Por lo tanto, a fin de afrontar tales problemas
como se describen anteriormente, se están desarrollando
investigaciones sobre métodos para producir enzimáticamente
D-psicosa usando D-fructosa como
sustrato.
Sin embargo, hay un problema en los métodos
desarrollados hasta ahora, que los gastos de producción son altos,
debido al bajo rendimiento de la D-psicosa.
La figura 1A es una gráfica que muestra la
actividad de psicosa 3-epimerasa frente al pH de
reacción;
La figura 1B es una gráfica que muestra la
actividad de psicosa 3-epimerasa frente a la
temperatura de reacción;
La figura 2 es una gráfica que muestra las
proporciones de equilibrio entre D-psicosa
(\blacksquare) y D-fructosa (\Box) obtenidas
cuando la psicosa 3-epimerasa se hace reaccionar con
D-fructosa a temperaturas en el intervalo de 30ºC y
60ºC; y
La figura 3 es un mapa de división de un vector
de expresión recombinante.
Los inventores de la presente invención hicieron
un intento de seleccionar una enzima que pudiera producir la
D-psicosa con un alto rendimiento usando
D-fructosa como sustrato, a partir de enzimas de
epimerasa que se caracterizaban no por la función, sino simplemente
por la secuencia de bases o la secuencia de aminoácidos, y
demostraron los efectos específicos de la enzima seleccionada. La
presente invención proporciona un nuevo método para producir la
D-psicosa con un alto rendimiento usando la enzima
seleccionada.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona el uso de una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:1, y que tiene una actividad de psicosa
3-epimerasa en la producción de
D-psicosa a partir de
D-fructosa.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para producir D-psicosa
haciendo reaccionar una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:1 con D-fructosa.
De aquí en adelante en este documento, la
presente invención será descrita detalladamente.
Se sobrentiende que los términos técnicos y los
términos científicos usados en este documento se refieren a los
términos convencionalmente entendidos por los expertos ordinarios en
la técnica, a menos que se establezca otra cosa.
Además, no serán repetidas las descripciones
sobre constituciones técnicas y mecanismos que son idénticas a las
constituciones técnicas y mecanismos convencionalmente
conocidos.
Los presentes inventores investigaron las
características de la tagatosa 3-epimerasa no
caracterizada derivada de Agrobacterium tumefaciens clonando
un gen de la tagatosa 3-epimerasa derivada de
Agrobacterium tumefaciens o un gen correspondiente a la
tagatosa 3-epimerasa, cultivando un microorganismo
transformado con un vector de expresión que contiene el gen, y
sobre-expresando la tagatosa
3-epimerasa. Consecuentemente, se encontró que la
tagatosa 3-epimerasa tenía una especificidad más
alta para la psicosa que para la tagatosa, y así, se demostró que
la "supuestamente conocida" tagatosa
3-epimerasa derivada de Agrobacterium
tumefaciens era realmente la psicosa
3-epimerasa. Así, la presente invención proporciona
un método para producir la D-psicosa usando la
psicosa 3-epimerasa.
Más expresamente, en una tentativa de obtener el
gen de una conocida tagatosa 3-epimerasa útil para
la presente invención, se usaron cepas bacterianas conocidas por
producir el gen de la tagatosa 3-epimerasa, y las
cepas bacterianas incluyen Thermotoga maritima, Streptomyces
coelicolor, Mesorhizobium loti, Agrobacterium tumefaciens,
Rhodopirellula baltica, Pirellula sp., Photorhabdus
luminescens subsp. laumondii y Sinorhizobium meliloti.
Se demostró por primera vez por la presente invención que sólo la
enzima (NP_355915; SEQ ID NO: 1) expresada a partir de un gen
derivado de ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens tiene una
actividad que puede convertir la D-fructosa en
D-psicosa.
A fin de determinar las características de la
tagatosa 3-epimerasa, en la presente invención, se
obtuvieron los genes de tagatosa 3-epimerasa en
grandes cantidades mediante una reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) a partir de cepas bacterianas que contienen genes de tagatosa
3-epimerasa que fueron designados simplemente según
la secuencia de bases del ADN, no según los resultados de
caracterización en el aspecto de la función enzimática. Después,
los genes de tagatosa 3-epimerasa obtenidos se
insertaron en los vectores de expresión apropiados para producir
vectores recombinantes que contenían los genes de tagatosa
3-epimerasa, y los vectores recombinantes se
transformaron dentro de los microorganismos apropiados. Los
microorganismos transformados se cultivaron en medios de
fermentación, y los productos proteicos de los genes de tagatosa
3-epimerasa se sobre-expresaron en
los microorganismos. Los productos proteicos de los genes de
tagatosa 3-epimerasa se aislaron entonces y se
purificaron para su uso.
El método para producir la
D-psicosa de la presente invención incluye hacer
reaccionar una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 1, que es la psicosa 3-epimerasa
(conocida por lo general como la tagatosa
3-epimerasa) con D-fructosa usada
como sustrato.
La psicosa 3-epimerasa empleada
en la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es
SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos modificadas que
resultan de la sustitución, introducción o deleción de algunos
residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
1, pueden ser capaces de convertir la D-fructosa en
D-psicosa.
Un vector de expresión que puede usarse para
producir un vector de expresión recombinante puede ser cualquier
vector de expresión convencionalmente usado en la tecnología de
recombinación genética, y puede ser, por ejemplo,
pET-24a(+). El microorganismo que puede
transformarse con el vector de expresión recombinante puede ser BL21
(DE3) de E. coli. Sin embargo, el microorganismo no está
limitado a condición de que sea cualquier cepa bacteriana que sea
capaz de sobre-expresar el gen deseado, siendo
transformado después con un vector de expresión recombinante que
contiene el gen, y que sea también capaz de producir una proteína
activa a consecuencia de la sobreexpresión.
Más detalladamente, pueden realizarse los
siguientes procesos para cultivar un microorganismo transformado e
inducir la sobreexpresión de la proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1, según el ejemplo siguiente, descrito
más abajo. Un inóculo almacenado criogénicamente BL21 (DE3) de
Escherichia coli se inocula en un matraz de 250 ml que
contiene 50 ml de un medio LB, y la cepa se cultiva en una
incubadora con agitación mantenida a 37ºC, hasta que la absorbancia
a 600 nm alcance 2,0. La solución cultivada se añade a un
fermentador de 7-L (Biotron, Ltd., Corea) que
contiene 5 L de un medio de fermentación formado por 10 g/L de
glicerol, 1 g/L de peptona, 30 g/L de extracto de levadura, 0,14 g/L
de difosfato de potasio y 1 g/L de monofosfato de sodio, y la
mezcla se incuba en el fermentador hasta que la absorbancia a 600 nm
alcance 2,0. Después, se añade ITPG 1 mM para inducir la
sobreexpresión de la proteína de la presente invención. Durante la
operación, la velocidad de agitación puede ser mantenida a 500
revoluciones por minuto, la velocidad de ventilación a 1,0 vvm, y
la temperatura de incubación a 37ºC, y tales condiciones de
incubación que se describen antes son favorables para la
fabricación en serie de la psicosa 3-epimerasa.
A fin de purificar la proteína producida por la
sobreexpresión, la solución del cultivo de la cepa bacteriana
transformada se centrifuga a 6.000xg a 4ºC durante 30 minutos, y
luego se lava dos veces con NaCl al 0,85%. Posteriormente, las
células se añaden a una solución reguladora citolítica
(NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0) que contiene 1 mg/ml
de lisozima, y la solución reguladora citolítica que contiene las
células se deja reposar en un baño de hielo durante 30 minutos. Las
células en la solución reguladora citolítica se rompen mediante una
prensa francesa a una presión de 15.000 lb/in^{2} (10^{5} KPa) y
las células rotas se someten a centrifugación a 13.000xg a 4ºC
durante 20 minutos y se eliminan, mientras que el sobrenadante se
filtra a través de un papel de filtro con un diámetro de poro de
0,45 \mum, y se purifica por cromatografía de proteína rápida
(FPLC) bajo una condición criogénica. El filtrado, que contiene la
proteína empleada en la presente invención, se aplica a una columna
HP de HisTrap que ha sido equilibrada con una solución reguladora
de fosfato 50 mM a pH 8,0 que contiene cloruro de sodio (NaCl) 300
mM e imidazol 10 mM. Posteriormente, la columna HP de HisTrap se
lava con la misma solución reguladora de fosfato, y luego la
proteína unida a la columna se eluye con la misma solución
reguladora de fosfato que contiene imidazol a una concentración de
gradiente de 10 mM a 200 mM, a un caudal de 1 ml/min. La fracción
eluída que contiene la proteína de la presente invención se añade a
una columna de resina desmineralizada 16/60 de HiPrep que ha sido
equilibrada con una solución reguladora de PIPES 50 mM a pH 7,5, y
luego, la proteína se lava a un caudal de 6 ml/min. Una solución de
la proteína así recuperada se aplica a una columna HR
S-100 de Sephacryl que se ha equilibrado con una
solución reguladora de PIPES 50 mM a pH 7,5 que contiene cloruro de
sodio 0,15 M, a un caudal de 6,6 ml/min para eluir la proteína. La
proteína eluída finalmente se dializa en una solución reguladora de
PIPES 50 mM.
La proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1 obtenida como se describe antes es la
psicosa 3-epimerasa, que es un monómero que tiene
un peso molecular de 32.600 Da. Esta psicosa
3-epimerasa es una metaloenzima, cuya activación es
regulada por un ión metálico.
Según una realización preferida de la presente
invención, la reacción entre la psicosa 3-epimerasa
y la D-fructosa puede realizarse en presencia de un
ión metálico seleccionado entre el grupo que consiste en manganeso,
magnesio, hierro, cobalto y aluminio, preferiblemente a una
concentración de 0,5 a 5 mM, por ejemplo, 1 mM, para mejorar el
rendimiento de producción de la D-psicosa. Cuando la
concentración del ión metálico es menor de 0,5 mM, el efecto de
mejorar el rendimiento de producción es insignificante, mientras que
cuando la concentración del ión metálico es mayor que 5 mM, la
mejora es menos eficaz con relación a la cantidad en exceso.
La reacción entre la psicosa
3-epimerasa y la D-fructosa puede
realizarse usando una concentración de sustrato (es decir, de
D-fructosa) del 55 al 75% (p/p), a pH de 7 a 8, y a
una temperatura de 55 a 65ºC. Cuando la concentración del sustrato,
que es la D-fructosa, está en el intervalo de 55 a
75% (p/p), el rendimiento de producción de la
D-psicosa es bueno, y las condiciones de pH y
temperatura de los intervalos anteriormente mencionados están en
los intervalos de pH óptimo y de temperatura para la actividad de
psicosa 3-epimerasa.
Según otra realización de la presente invención,
la reacción entre la psicosa 3-epimerasa y la
D-fructosa para producir D-psicosa
puede realizarse inmovilizando la psicosa
3-epimerasa sobre un vehículo durante la reacción,
ya que la psicosa 3-epimerasa inmovilizada sobre un
vehículo puede mantener la actividad enzimática durante un período
de tiempo prolongado. El vehículo útil para esta realización de la
presente invención puede ser cualquiera de los vehículos conocidos
para su uso en la inmovilización de enzimas, y puede ser, por
ejemplo, el alginato de sodio. El alginato de sodio es un
polisacárido coloidal natural que es abundante en las paredes de
las células de algas, y contiene residuos de ácido
\beta-D-manurónico y ácido
\alpha-L-gulurónico, que están
conectados aleatoriamente por enlaces \beta-1,4.
Así, el alginato de sodio permite una inmovilización estable de la
psicosa 3-epimerasa, y es ventajoso para obtener un
rendimiento de D-psicosa alto. A fin de obtener el
máximo rendimiento de la D-psicosa, puede usarse
alginato de sodio para la inmovilización de la psicosa
3-epimerasa a una concentración de 1,5 a 4,0% en
peso, por ejemplo, 2,5% en peso. Cuando se usa el alginato de sodio
como vehículo para inmovilizar la psicosa
3-epimerasa, puede añadirse una solución de psicosa
3-epimerasa a una solución acuosa de alginato de
sodio con uno o dos volúmenes de la solución de psicosa
3-epimerasa, y luego la mezcla se añade gota a gota
a una solución del ión calcio 0,2 M usando una bomba de jeringuilla
y una bomba neumática, de modo que se formen perlas de un complejo
de psicosa 3-epimerasa-alginato de
sodio. Estas perlas del complejo de psicosa
3-epimerasa-alginato de sodio pueden
usarse directamente en la reacción con
D-fructosa.
El método para producir
D-psicosa según las realizaciones de la presente
invención es ecológico porque se usa una enzima derivada de un
microorganismo, requiere un proceso simple para la inmovilización de
enzimas, y aumenta considerablemente el rendimiento de producción
de la D-psicosa, reduciendo así los gastos de
producción, maximizando el efecto de producción.
La D-psicosa así producida puede
ser usada útilmente como aditivo alimenticio o farmacéutico.
Como se describe anteriormente, el método para
producir D-psicosa según las realizaciones de la
presente invención es ecológico porque se usa una enzima derivada
de un microorganismo, requiere un proceso simple para la
inmovilización de las enzimas, usa un sustrato que es más barato
que el usado en un método convencional, y aumenta considerablemente
el rendimiento de producción de la D-psicosa,
reduciendo así los gastos de producción, maximizando al mismo
tiempo el efecto de producción.
La D-psicosa así producida puede
ser usada útilmente como aditivo alimenticio o farmacéutico.
En lo sucesivo de aquí en adelante en este
documento, la presente invención será descrita más detalladamente
en cuanto a los Ejemplos específicos. Estos Ejemplos tienen sólo
objetivos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de
la presente invención.
En el actual Ejemplo Experimental, se usó
MALDI-TOF-MS para la medida del peso
molecular de la psicosa 3-epimerasa, y se usó ácido
cinámico como matriz. La actividad enzimática se midió usando la
D-fructosa como sustrato. Para la medida de la
actividad enzimática, se permitió que la psicosa
3-epimerasa reaccionara con la
D-fructosa en una solución reguladora de PIPES 50
mM que contenía D-fructosa al 1,0%, a pH 7,5 y a
50ºC durante 20 minutos, y luego la solución de reacción se calentó
a 100ºC durante 5 minutos para terminar la reacción. La solución
reguladora de PIPES que contiene la D-fructosa se
preparó disolviendo la D-fructosa en la disolución
reguladora de PIPES a pH de 7 a 8 a una concentración del 60 a 70%
en peso, y la solución reguladora de PIPES que contiene la
D-fructosa se añadió continuamente a un fermentador
mantenido entre 40 y 60ºC. Para una fácil comparación de la
actividad enzimática, se define una unidad de psicosa
3-epimerasa como la cantidad de psicosa
3-epimerasa necesaria para producir 1 mol de
D-psicosa por minuto a pH 7,5 y a 50ºC.
Las concentraciones de
D-fructosa, D-psicosa,
D-sorbosa, D-tagatosa,
D-xilulosa y D-ribulosa se midieron
usando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) con una columna de hidrocarburo de ión calcio
BP-100 y un detector IR. La columna se acondicionó
para permitir un flujo de agua destilada a un caudal de 0,5 ml/min
a 80ºC.
El gen de la psicosa 3-epimerasa
fue obtenido en grandes cantidades amplificando el ADN de ATCC33970
de Agrobacterium tumefaciens por una reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) usando un cebador diseñado basado en la
secuencia de bases de ADN de un gen que había sido sugerido como un
gen de tagatosa 3-epimerasa de C58 de
Agrobacterium tumefaciens, pero que no había sido
funcionalmente caracterizado. El gen obtenido de la psicosa
3-epimerasa se insertó en un vector de expresión,
pET-24a(+) (Novagen, Inc), usando enzimas de
restricción XhoI y NdeI para producir un vector de
expresión recombinante pET-24a(+) / psicosa
3-epimerasa (Véase FIG. 3). Este vector de
expresión recombinante se transformó en BL21(DE3) de
Escherichia coli por un método de transformación
convencional. La cepa transformada BL21(DE3) de E.
coli se almacenó criogénicamente en nitrógeno licuado antes de
ser cultivada para la fabricación en serie.
A partir de entonces, un inóculo de la cepa
BL21(DE3) de E. coli criogénicamente almacenado se
inoculó en un matraz de 250 ml que contenía 50 ml del medio LB, y
se precultivó en una incubadora con agitación a 37ºC hasta que la
absorbancia de la solución del precultivo a 600 nm alcanzó 2,0. La
solución del precultivo se añadió a un fermentador de 7 L (Biotron,
Ltd., KR) que contenía 5 L de un medio de fermentación (10 g/L de
glicerol, 1 g/L de peptona, 30 g/L de extracto de levadura, 0,14 g/L
de fosfato de di-potasio y 1 g/L de fosfato de
monosodio), y se sometió al cultivo principal. Cuando la absorbancia
de la solución del cultivo principal a 600 nm alcanzó 2,0, se
añadió 1 mM de ITPG a la solución de cultivo principal para inducir
la fabricación en serie de la psicosa 3-epimerasa.
Durante el proceso de cultivo, la velocidad de agitación se mantuvo
a 500 revoluciones por minuto, la velocidad de ventilación a 1,0 vvm
(volumen/volumen/minuto), y la temperatura de incubación a
37ºC.
A fin de realizar la caracterización de la
psicosa 3-epimerasa, la psicosa
3-epimerasa se purificó usando cromatografía de
afinidad (columna HP de HisTrap), una desmineralización (columna
HiPrep 16/60), y una filtración de gel (columna Sephacryl
S-100 HR).
El peso molecular de la psicosa
3-epimerasa purificada se midió, y se encontró que
la psicosa 3-epimerasa era un monómero con un peso
molecular de 32.600 Da. La secuencia de aminoácidos de la psicosa
3-epimerasa se confirmó que era idéntica a la
secuencia de aminoácidos con número de entrada de NCBI
NP_355915.
A fin de investigar el efecto de la adición de
un ión metálico, se midió la actividad enzimática de la psicosa
3-epimerasa después de tratar la psicosa
3-epimerasa con EDTA, o después de añadir 1 mM de
cada uno de los iones metálicos indicados en la Tabla 1 de más
abajo, a la psicosa 3-epimerasa. La reacción de la
psicosa 3-epimerasa se realizó en una solución
reguladora de PIPES 50 mM que contenía 0,04 unidades/ml de la
psicosa 3-epimerasa y 1,0% en peso de la
D-fructosa a pH 7,5 y a 50ºC durante 20 minutos, y
luego la solución de reacción fue calentada a 100ºC durante 5
minutos para terminar la reacción. Después, se midió la actividad
enzimática de la psicosa 3-epimerasa.
Por consiguiente, se encontró que la psicosa
3-epimerasa tenía una metaloenzima, ya que los iones
de manganeso y cobalto realzaron la actividad enzimática, mientras
que los iones de cobre y cinc suprimieron la actividad enzimática
como se indica más abajo en la Tabla 1.
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La reacción de la psicosa
3-epimerasa se realizó en una solución reguladora de
PIPES 50 mM que contenía 0,04 unidades/ml de psicosa
3-epimerasa y 10 mM, cada uno individualmente, de
los monosacáridos indicados en la Tabla 2 más abajo, a pH 7,5 y a
50ºC durante 20 minutos, y luego cada una de las soluciones de
reacción fue calentada a 100ºC durante 5 minutos para terminar la
reacción. Después, se midió la actividad enzimática de la psicosa
3-epimerasa de cada solución de reacción.
Por consiguiente, se encontró que la psicosa
3-epimerasa tenía una afinidad más alta para la
D-psicosa que para la D-tagatosa.
Así, esta psicosa 3-epimerasa fue nuevamente
reconocida como una enzima capaz de la epimerización de psicosa, no
una tagatosa 3-epimerasa.
En el Ejemplo 5, la psicosa
3-epimerasa se hizo reaccionar con
D-fructosa a varios valores de pH y temperaturas, y
las actividades enzimáticas obtenidas a varios valores de pH y
temperaturas fueron comparados. A fin de investigar el efecto del
pH, la reacción de la psicosa 3-epimerasa se realizó
en una solución reguladora de PIPES 50 mM que contiene 0,04
unidades de psicosa 3-epimerasa/ml y 1,0% de
D-fructosa a valores de pH en el intervalo de 6,5 a
7,5, y la misma reacción fue realizada en una solución reguladora de
EPPS 50 mM que contenía 0,04 unidades de psicosa
3-epimerasa/ml y 1,0% de D-fructosa
a valores de pH en el intervalo de 7,5 a 8,5. En esta invención,
las reacciones respectivas fueron realizadas a 50ºC cuando los iones
metálicos no fueron añadidos, y a 60ºC cuando los iones de
manganeso fueron añadidos, respectivamente durante 20 minutos.
Después, las reacciones se terminaron por tratamiento con calor a
100ºC durante 5 minutos, y se midieron las actividades enzimáticas.
Los resultados se representan en la Figura 1A.
A fin de investigar el efecto de la temperatura,
la reacción se realiza en una solución reguladora de PIPES 50 mM
que contiene 0,04 unidades de psicosa 3-epimerasa/ml
y 1,0% de D-fructosa a temperaturas en el intervalo
de 30ºC a 70ºC durante 20 minutos, a pH 7,5 cuando los iones
metálicos no fueron añadidos, y a pH 7,0 cuando los iones de
manganeso fueron añadidos. Las reacciones se terminaron por
tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midieron las
actividades enzimáticas. Los resultados se representan en la Figura
1B.
Por consiguiente, el pH óptimo y la temperatura
para la psicosa 3-epimerasa cuando los iones
metálicos no fueron añadidos se encontró que eran 7,5 y 50ºC,
respectivamente. El pH óptimo y la temperatura para la psicosa
3-epimerasa cuando se añadieron los iones Mn^{2+}
era 7,0 y 60ºC, respectivamente.
La Figura 1A es una gráfica que muestra la
actividad de la psicosa 3-epimerasa frente al pH de
reacción. Respecto a la Figura 1A, ñ indica el resultado obtenido
en una solución reguladora de PIPES que no contiene ningún ion
metálico; \bullet indica el resultado obtenido en una solución
reguladora de PIPES que contiene iones Mn^{2+}; \Box indica el
resultado obtenido en una solución reguladora de EPPS que no
contiene ningún ion metálico; y \blacksquare indica el resultado
obtenido en una solución reguladora de EPPS que contiene iones
Mn^{2+}.
La Figura 1B es una gráfica que muestra la
actividad de la psicosa 3-epimerasa frente a la
temperatura de reacción. Respecto a la Figura 1B, ñ indica el
resultado obtenido en ausencia de iones metálicos; y \bullet
indica el resultado obtenido en presencia de 1 mM de iones
Mn^{2+}.
En el Ejemplo 6, la reacción de la psicosa
3-epimerasa fue realizada en una solución reguladora
de PIPES 50 mM que contenía 0,04 unidades de psicosa
3-epimerasa/ml, 1 mM de iones Mn^{2+}, y 0,1% de
D-psicosa y D-fructosa juntas, a pH
7,0 y a temperaturas en el intervalo de 30ºC a 60ºC durante 24 horas
para permitir que la reacción procediera suficientemente, a fin de
determinar el equilibrio entre D-psicosa y
D-fructosa. Después, las reacciones se terminaron
por tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midió la
actividad enzimática.
La Figura 2 es una gráfica que muestra la
relación de equilibrio de D-psicosa (\blacksquare)
y D-fructosa (\Box) conseguida después de la
reacción de la psicosa 3-epimerasa según una
realización de la presente invención con D-fructosa
a temperaturas en el intervalo de 30ºC a 60ºC.
Por consiguiente, la reacción fue comenzada con
5 proporciones iniciales de D-psicosa y
D-fructosa, de 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 y 100:0,
y las proporciones finales de D-psicosa frente a
D-fructosa fueron determinadas después de 24 horas
de reacción, como se muestra en la Figura 2. Respecto a la Figura 2,
la proporción de D-psicosa frente a
D-fructosa era 32:68 a 30ºC, mientras que la misma
proporción fue 37:63 a 60ºC. Estos resultados son aproximadamente
un 20% superior al rendimiento alcanzable por métodos convencionales
para producir D-psicosa.
A fin de producir D-psicosa a
concentraciones altas, la reacción se realizó en una solución
reguladora de PIPES 50 mM que contenía 14 unidades de psicosa
3-epimerasa/ml, 1 mM de iones Mn^{2+}, y 700 g/L
de D-fructosa, a pH 7,0 y a 60ºC durante varios
tiempos de reacción. Después, la reacción fue terminada por
tratamiento con calor a 100ºC durante 5 minutos, y se midió la
actividad enzimática. Las tasas de producción de
D-psicosa según el tiempo de reacción se muestran
en la Tabla 3 más abajo.
Por consiguiente, se produjeron 211 g/L de la
D-psicosa usando un tiempo de reacción de 120
minutos, y esta tasa de producción corresponde a un rendimiento de
conversión de D-psicosa del 30,2%.
A fin de investigar la eficacia del método para
producir la D-psicosa, la psicosa
3-epimerasa fue inmovilizada. Los rendimientos de
producción de la psicosa 3-epimerasa inmovilizada
fueron medidos y comparados con los de la psicosa
3-epimerasa (libre) no inmovilizada.
Para la psicosa 3-epimerasa
inmovilizada sobre un vehículo, se usaron perlas del complejo
psicosa 3-epimerasa-alginato de
sodio, que fueron producidas añadiendo una solución de psicosa
3-epimerasa a una solución de alginato de sodio al
2,5% con un volumen 1,5 veces el volumen de la solución de psicosa
3-epimerasa, y añadiendo esta mezcla a una solución
de ión de calcio 0,2 M con una bomba de jeringuilla y una bomba
neumática.
La reacción se realizó de la misma manera que en
el Ejemplo 7, salvo que se usó la psicosa
3-epimerasa inmovilizada. La cantidad de psicosa
3-epimerasa usada en la reacción fue 140 unidades
por 10 ml, y se midieron las tasas de producción de
D-psicosa. Los resultados se muestran en la Tabla 4
más abajo.
La psicosa 3-epimerasa libre del
Ejemplo 7 causó una tasa de conversión máxima de 211 g/L usando un
tiempo de reacción de 120 minutos. Sin embargo, en el caso de la
psicosa 3-epimerasa inmovilizada del Ejemplo actual,
la velocidad de producción fue inferior que la de la psicosa
3-epimerasa libre, pero la estabilidad termal de la
psicosa 3-epimerasa inmovilizada fue superior, y la
concentración de D-psicosa aumentó con el tiempo.
Así, la tasa de producción de D-psicosa fue 245 g/L
después de un tiempo de reacción de 360 minutos, y esta tasa de
producción correspondió a un rendimiento de conversión del 35%.
La siguiente reacción fue realizada en un
fermentador para verificar el rendimiento de producción de la
psicosa 3-epimerasa inmovilizada del Ejemplo 8.
Primero, se prepararon psicosa
3-epimerasa inmovilizada y
D-fructosa de la misma manera que en el Ejemplo 8,
se añadió la D-fructosa a la psicosa
3-epimerasa inmovilizada, y la mezcla se ajustó
entonces a un volumen de 100 ml. Posteriormente, se rellenó un
fermentador (Pharmacia Biotechnologies, Inc, XK26, Reino Unido) con
una altura de 100 cm y un diámetro de 26 cm con la mezcla de psicosa
3-epimerasa inmovilizada y
D-fructosa, y la reacción se realizó a un caudal de
10 ml/h y a 60ºC. La cantidad de psicosa 3-epimerasa
usada fue 500 unidades, y la concentración de
D-fructosa usada se restringió a 600 g/L, debido al
problema de la precipitación de la D-fructosa en
exceso durante una operación a largo plazo. Los resultados se
muestran en la Tabla 5 más abajo.
Por consiguiente, la reacción entre psicosa
3-epimerasa y D-fructosa fue estable
durante todo el período del experimento de 30 días, y la
productividad fue 21 g/L/h, la tasa de conversión entre
D-fructosa y D-psicosa fue del 35%,
mientras que la tasa de producción fue 210 g/L. El rendimiento es un
valor de la producción excelente en la fabricación en serie de
azúcares.
Así, puede proporcionarse un sistema de
producción de D-psicosa usando un fermentador que es
capaz de la fabricación en serie a escala industrial.
Claims (8)
1. El uso de una proteína que tiene una
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la producción de
D-psicosa a partir de D-fructosa,
en la que SEQ ID NO: 1 es:
2. Un método para producir
D-psicosa haciendo reaccionar la proteína definida
en la reivindicación 1 con D-fructosa.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
la proteína es un producto proteico obtenido cultivando un
microorganismo transformado con el vector de expresión recombinante
que comprende un gen que codifica una proteína, cuya proteína tiene
la secuencia de SEQ ID NO: 1 y aislando la proteína de la solución
de cultivo del microorganismo en el que SEQ ID NO: 1 es:
4. El método de la reivindicación 2, en el que
la reacción se realiza en presencia de un ión metálico seleccionado
entre el grupo que consiste en manganeso, magnesio, hierro, cobalto
y aluminio.
5. El método de la reivindicación 2, en el que
la concentración de D-fructosa usada en la reacción
está entre 55 y 75% (p/p).
6. El método de la reivindicación 2, en el que
la reacción se realiza entre un pH de 7 y 8 y a una temperatura
entre 55 y 65ºC.
7. El método de la reivindicación 2, en el que
la proteína se hace reaccionar con D-fructosa
estando inmovilizada sobre un vehículo.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 9, en el que el ión metálico está presente a
una concentración entre 0,5 mM y 5 mM.
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