KR101577147B1 - 사이코스의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사이코스의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 기질인 과당과 그 에피머라제를 미생물 내에서 40℃ 이상의 온도로 반응시키는 단계를 포함함으로써, 사이코스의 생산량 및 생산 속도를 현저히 개선할 수 있는 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 미생물을 이용하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
사이코스 (D-psicose)는 과당 (D-fructose)의 3번 탄소의 에피머 (epimer)로써 일반 당류들처럼 감미를 가지지만 인체 내에서 대사가 되지 않아서 거의 칼로리는 제로에 가까워 당뇨 및 비만환자에게 설탕 대체 기능성 감미료로 사용될 수 있는 기능성 당이다. 또한 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제해서 복부비만을 감소시키는 기능을 가지고 있고 당뇨병과 동맥경화 치료제로 현재 연구 중에 있는 당이다.
이처럼 사이코스는 감미료로 각광받으면서 식품 산업 분야에 있어 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 점점 높아지고 있다. 사이코스는 천연물질 내에는 당밀 처리 과정 또는 포도당 이성화 반응과정 중에 매우 소량 존재하기에 기존의 사이코스 생산은 주로 화학적 과정을 거쳐 이루어졌다. 빌릭 (Bilik)등은 몰리브딕산(molybdic acid) 이온의 촉매작용을 활용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 기술을 개발하였다. 맥도날드 (McDonald)는 1,2:4,5-디-o-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노즈 (1,2:4,5-di-o-isppropylidene-bata-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 사이코스를 생산하였다. 또한, 도너 (Doner)는 에탄올과 트리에틸아민과 함께 과당을 가열하는 방법으로 사이코스를 생산하였다. 그러나, 이들 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 비용이 많이 소모되는 반면 그 생산효율은 낮고 또한 부산물의 과량 발생한다는 문제점이 있다.
생물학적 방법에 의한 사이코스 생산방법으로 이즈모리 (Ken Izumori)등은 미생물 세포반응을 활용하여 갈락시톨 (galacitol), 디-타가토스 (D-tagatose) 또는 디-탈리톨 (D-talitol) 등으로부터 사이코스를 생산할 수 있다는 것을 보였다. 그러나, 이 기질들 또한 자연계에서 비교적 희귀한 당 또는 당알코올로 그 원가가 높다는 단점이 있다.
효소 전환방법으로는 분리미생물 슈도모나스 치코리 ST-24 (Pseudomonas cichorii ST-24)의 디-타가토스-3-에피머화 효소 (D-tagatose-3-epimerase)를 재조합 대장균에서 생산하고 정제하여 과당을 사이코스로 효소 전환하는 방법이 있으며, 이즈모리 등은 디-타가토스-3-에피머화 효소를 고정화시킨 반응시스템으로 약 25%의 전환율로 사이코스를 생산한 바 있다.
이러한 종래 기술에 의하면, 과당으로부터 사이코스를 생산하기 위해서 효소를 정제하고 그 정제된 효소를 고정화하여 사이코스 생산성을 높이는 방향으로 연구되어왔다. 이처럼 효소를 정제하는 과정에는 시간 및 비용이 많이 요구되는 것이 현실이다.
따라서, 효소 정제의 과정을 생략하여 제조원가가 낮고 사이코스를 높은 효율로 생산할 수 있는 균주 및 이를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법이 요구되고 있다.
한국공개특허 제2006-125971호에는 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법이 개시되어 있다.
Choi JG, Ju YH, Yeom SJ and Oh DK (2011), Improvement in the Thermostability of D-Psicose 3-Epimerase from Agrobacterium tumefaciens by Random and Site-Directed Mutagenesis, Appl Environ Microbiol 77(20):7316-20
본 발명은 사이코스의 생산량 및 생산 속도를 현저히 개선할 수 있는 사이코스의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양상은 기질인 과당과 그 에피머라제를 미생물 내에서 40℃ 이상의 온도로 반응시키는 단계를 포함하는 사이코스의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 기질인 과당과 그 에피머라제와의 반응을 40℃ 이상의 온도로 수행하는 경우 사이코스의 생산량 및 생산 속도가 현저히 증가하고, 온도가 증가함에 따라 사이코스 생산량 및 생산 속도가 증가함을 발견하여 본 발명을 착안하였다.
한편, 에피머라제 등의 효소는 일반적으로 40℃ 이상의 고온에서는 열 변성되어 활성을 잃게 되나, 본 발명은 상기 반응을 미생물 내에서 수행함으로써, 효소 상태로 외부에 노출된 경우에 비해 외부로부터 보호됨에 따라 고온에서도 변성 없이 상기 반응을 수행할 수 있다.
반응 온도가 증가함에 따라 사이코스 생산능이 더 증가하므로, 반응 온도는 40℃ 이상이면서 미생물이 열에 의해 손상되거나 단백질이나 당이 변성되지 않는 범위 내라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 40 내지 50℃, 40 내지 60℃, 40 내지 70℃, 40 내지 80℃, 40 내지 90℃, 45 내지 60℃, 45 내지 70℃, 45 내지 80℃, 45 내지 90℃, 50 내지 70℃, 50 내지 80℃, 50 내지 90℃, 55 내지 60℃, 55 내지 70℃, 55 내지 80℃, 55 내지 90℃, 60 내지 70℃, 60 내지 80℃, 60 내지 90℃, 70 내지 80℃, 70 내지 90℃ 등일 수 있다. 상기 사이코스 생산능을 극대화한다는 측면에서 바람직하게는 하한은 50℃ 이상일 수 있고, 열 손상 및 변성의 억제 측면에서 바람직하게는 상한은 90℃ 이하 일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "미생물"은 액체 배지 중에서 배양될 수 있는 세포일 수 있다.
상기 미생물은 상기 에피머라제를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다. 그러한 경우, 미생물 내에서 에피머라제가 생성되어 상기 과당과 에피머라제의 미생물 내에서의 반응에 의한 사이코스의 생산이 연속적으로 수행될 수 있다.
상기 미생물이 에피머라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되어 에피머라제를 발현시키는 경우, 상기 에피머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아그로박테리움 튜메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 2의 아내로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자일 수 있다.
아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 아내로스티페스 카캐 유래 사이코스-3-에피머라제는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
에피머라제가 보다 우수한 고온 안정성을 갖는다는 측면에서 바람직하게는 에피머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열에서 33번 아미노산이 류신으로, 213번 아미노산이 시스테인으로 교체된 서열로, 참고문헌 1에 의해 열 안정성이 우수하다고 알려져 있다.
본 발명의 발명자들은 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제가 열 안정성이 우수함을 확인하였는데, 도 7을 참조해보면, 열 안정성이 높았던 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제의 경우 한 개의 아미노산이 이에 상응하는 서열을 가지고 있거나 혹은 두 개 모두를 가지고 있음을 확인하였다.
이에, 아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제 뿐만이 아니라, 다른 균주로부터 유래한 사이코스-3-에피머라제라도 상기 아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열의 33번, 213번 아미노산에 대응되는 아미노산 서열이 열 안정성 증대에 중요한 서열임을 확인하였다.
이러한 아미노산 서열의 구체적인 예를 들자면, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 32번째 아미노산이 류신으로 치환되거나, 196번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 서열일 수 있다. 서열번호 6은 도 7의 박스로 표시한 서열을 나열한 것으로 본 발명에서 사용한 아그로박테리움 튜메패시엔스, 아내로스티페스 카캐, 클로스트리디움 볼테애, 클로스트리디움 힐레모내 유래 사이코스-3-에피머라제 아미노산 서열들(서열번호 3번, 4번, 9번, 10번)의 공통 염기 서열이다. 따라서 상기 미생물은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 유전자로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 마찬가지로 우수한 고온 안정성, 그리고 사이코스 생산능의 측면에서 에피머라제는 클로스트리디움 속 유래 사이코스-3-에피머라제일 수 있고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 클로스트리디움 볼테애(Clostridium bolteae) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 8의 클로스트리디움 힐레모내(Clostridium hylemonae) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자일 수 있다. 고온 안정성을 극대화하는 측면에서 바람직하게는 서열번호 8의 클로스트리디움 힐레모내 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자일 수 있다.
클로스트리디움 볼테애 유래 사이코스-3-에피머라제는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 클로스트리디움 힐레모내 유래 사이코스-3-에피머라제는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 미생물은 원핵 세포 또는 진핵 세포로 액체 배지에서 배양될 수 있으면서, 전술한 고온의 온도에서 배양이 가능한 것일 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, 박테리아, 곰팡이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 박테리아는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 사이코스 생산성 증가의 측면에서 바람직하게는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 그람 음성 박테리아는 에세리키아 (Escherichia) 속일 수 있다. 그람 양성 박테리아는 바실러스 속, 코리네박테리움 속, 액티노마이세스 속, 유산균 또는 이들의 조합일 수 있다. 곰팡이는 효모, 클루베로마이세스 속, 또는 이들의 조합일 수 있다.
에세리키아 속 미생물은 대장균일 수 있고, 구체적으로 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합에 에피머라제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
또한, 상기 대장균은 내재적 6-포스포프락토키나제를 코딩하는 유전자 및 알로즈 대사 오페론 (allose metabolic operon)으로 이루어진 하나의 영역이 불활성화된 것일 수 있다.
상기 6-포스포프락토키나제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있고, 6-포스포프락토키나제는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 알로즈 대사 오페론을 구성하는 유전자는 rpiB, alsR, alsB, alsA, alsC, alsE 및 alsK로서, 이들 중 하나 이상의 유전자가 불활성화된 것일 수 있다.
상기 rpiB, alsR, alsB,alsA, alsC, alsE, 및 alsK 유전자는 예를 들면, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 것일 수 있다.
상기 rpiB, alsR, alsB,alsA, alsC, alsE, 및 alsK 유전자는 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26의 아미노산 서열을 각각 코딩하는 것일 수 있다.
용어 "불활성화"란 상기 유전자의 발현이 감소되거나 발현이 이루어지지 않는 것을 의미한다. 상기 "불활성화"는 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상동 재조합 (homologuous recombination)에 의 하여 불활성화된 것일 수 있다. 상기 상동 재조합은 예를 들면, 전이인자 돌연변이 (transposon mutagenesis) 또는 P1 형질도입 (P1 transduction)에 의하여 매개된 것일 수 있다.
코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 에피머라제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
코리네박테리움 속 미생물은 내재적 디-프락토오스를 디-프락토오스 1-포스페이트로 전환하면서 균체 내로 수송하는 PTS 수송 시스템인 ptsF(EIIFru, fruA, NCgl1861, GI:19553141, EC 2.7.1.69) 유전자를 결손 또는 불활성화시킨 것일 수 있다.
ptsF 유전자는 서열번호 27의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있고, 서열번호 28의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
사이코스는 D-프락토오스(D-fructose)로부터 생성되므로, 상기 유전자를 결손 또는 불활성화시키면 프락토오스의 인산화를 억제할 수 있으므로, 사이코스의 생성 효율을 현저히 개선할 수 있다.
또한, 코리네박테리움 속 미생물은 만니톨 2-디하이드로게나아제(mannitol 2-dehydrogenase)를 코딩하는 mtlD (NCgl0108, GI:19551360, EC 1.1.1.67) 유전자를 결손 또는 불활성화시킨 것일 수 있다.
mtlD 유전자는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있고, 서열번호 30의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
상기 과당과 그 에피머라제의 반응은 미생물 내에서 수행되는 것인바, 미생물을 과당을 포함하는 배지 중에서 배양할 수 있다.
상기 배지는 2YT 배지, LB 배지, TB 배지 등의 효모추출물과 질소원을 포함하는 영양배지일 수 있다.
배지에 포함되는 과당 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 포함될 수 있고, 상기 범위 내에서 예컨대, 1%(w/v) 내지 35%(w/v), 10%(w/v) 내지 80%(w/v), 20%(w/v) 내지 80%(w/v), 30%(w/v) 내지 80%(w/v), 40 %(w/v) 내지 80 %(w/v) 등 일 수 있다. 바람직하게는 1%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있다.
또한, 포도당, 글리세롤 등을 포함하는 탄소원; 암모니아, 우레아(urea) 등을 포함하는 질소원; 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간, 코발트 등의 필수 금속이온; 비타민 등을 포함하는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 구명배지(defined 배지)일 수 있다.
상기 배양은 연속, 반연속, 또는 배치 (batch) 형식 배양일 수 있다.
상기 미생물은 과당을 포함하는 배지에서 균체의 탁도(600nm 흡광도에서의 측정치, 이하 OD600)가 0.01 내지 300, 예를 들면 1 내지 300, 10 내지 300, 20 내지 300, 5 내지 300, 또는 40 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 균체를 사용함으로써, 배지 중에서 고농도로 과당이 포함된 배지에서 효율적으로 과당을 사이코스로 전환할 수 있다.
상기 배양은 에피머라제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하는 물질을 더 첨가하여 수행될 수 있다.
유전자의 발현을 유도하는 물질은 특별히 한정되지 않으며, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 물질일 수 있다.
본 발명의 사이코스의 생산 방법이 상기 반응 이전에, 후술할 휴면 세포를 갖도록 유도하는 단계를 더 포함하는 경우, 상기 반응은 기질인 과당과 보조인자의 공급을 위한 무기염만을 포함하는 배지 중에서 수행될 수 있다. 상기 무기염은 예를 들면 망간염 또는 코발트염일 수 있다. 보다 개선된 사이코스의 생산 속도를 나타낸다는 측면에서는 코발트염이 바람직하고, 생산된 사이코스를 식품 등으로 안전하게 활용할 수 있다는 측면에서는 망간염이 바람직하다.
상기 미생물의 배양물은 사이코스를 포함하는데, 사이코스를 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 예를 들면 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법을 들 수 있다.
구체적으로. 배양물을 원심분리하여 배양액을 미생물로부터 분리하고, 상기 회수 방법에 의하여 사이코스를 배양액으로부터 분리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 사이코스의 생산 방법은 상기 과당과 에피머라제의 반응 이전에, 상기 미생물을 상기 과당이 포함되지 않은 배지에서 배양하여 상기 미생물이 휴면 세포를 갖도록 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 휴면 세포를 갖도록 하는 유도는 상기 미생물은 과당을 포함하지 않는 배지 중에서 정지기(stationary phase)까지 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 휴면세포(resting cell)는 더 이상 증식하지 않는 상태의 배양 세포를 의미한다. 본 명세서에서 정지기(stationary phase)는 세포를 배양하는 경우 대수기(exponential phase)를 지나 세포의 분열 및 증식이 정지하여 세포 개체 수의 증가가 나타나지 않으며, 세포 성분의 합성과 분해가 균형을 이룬 상태를 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 휴면 세포는 성장이 완료되고, 세포 내에서 에피머라제의 발현이 충분히 이루어진 상태의 세포를 의미하는 것으로서, 미생물이 휴면 세포를 갖도록 유도되는 경우 에피머라제의 발현량이 최대치를 나타내는 바, 사이코스의 생산을 극대화할 수 있다.
과당을 포함하지 않은 배지는, 과당을 포함하지 않은 것을 제외하고는 전술한 과당을 포함한 배지와 동일한 배지일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 과당과 그 에피머라제의 반응 이후에, 상기 미생물을 회수하여 다른 기질의 사이코스로의 전환에 재사용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 과당과 그 에피머라제의 반응을 미생물 내에서 수행하는 바, 고온에 노출되어도 미생물에 의해 에피머라제가 보호되어 여전히 효소 활성을 나타내는 바, 재사용이 가능하다.
즉, 상기 반응 이후에 상기 미생물을 회수하여 또 다른 기질을 사이코스로의 전환에 재사용할 수 있다.
분리된 미생물의 생육이 유지되는 환경 중에서 반응을 수행한다면 재사용 회수는 한정되지 않고, 수백회 이상, 수천회 이상도 재사용이 가능하다.
미생물을 재사용하는 단계를 더 포함하는 경우 미생물이 고온에 복수회 노출되므로, 열 안정성이 높은 고온성 미생물(thermophiles)을 사용하는 것이 재사용시에 효소 활성이 높다는 점에서 바람직하다.
전술한 예시 중에서는 바람직하게는 코리네박테리움 속, 액티노마이세스 속일 수 있고, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 전술한 에피머라제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면 사이코스의 생산량 및 생산 속도가 현저히 개선된다.
본 발명의 방법에 의하면 미생물을 회수하여 과당의 사이코스로의 전환에 반복적으로 재사용이 가능하여, 공정 수율을 현저히 개선할 수 있다.
도 1은 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체로부터 휴면세포전환반응의 반응 온도에 따른 기질인 과당으로부터의 사이코스 생산량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 2는 사이코스-3-에피머라제를 도입한 대장균 MG1655 형질전환체로부터 휴면세포전환반응의 반응 온도에 따른 기질인 과당으로부터의 사이코스 생산량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 3은 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰과 대장균 MG1655 형질전환체를 이용해서 60℃에서 3시간 동안 사이코스 생산 휴면세포전환반응을 한 후에 균체를 다시 회수하여 동일 반응 조건 하에서 반응을 시켜서 얻은 사이코스 생산량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 4는 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 휴면세포전환반응에 사용되는 사이코스 생산반응 배지의 조성 변화에 따른 과당으로부터 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 휴면세포전환반응시에 사이코스-3-에피머라제의 유래 균주 및 사이코스 생산반응 배지 조성에 따른 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 휴면세포전환반응시에 사이코스-3-에피머라제의 유래 균주 및 가열 시간에 따른 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 균주 유래의 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 8은 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰의 재사용 횟수에 따른 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 2는 사이코스-3-에피머라제를 도입한 대장균 MG1655 형질전환체로부터 휴면세포전환반응의 반응 온도에 따른 기질인 과당으로부터의 사이코스 생산량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 3은 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰과 대장균 MG1655 형질전환체를 이용해서 60℃에서 3시간 동안 사이코스 생산 휴면세포전환반응을 한 후에 균체를 다시 회수하여 동일 반응 조건 하에서 반응을 시켜서 얻은 사이코스 생산량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 4는 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 휴면세포전환반응에 사용되는 사이코스 생산반응 배지의 조성 변화에 따른 과당으로부터 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 휴면세포전환반응시에 사이코스-3-에피머라제의 유래 균주 및 사이코스 생산반응 배지 조성에 따른 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 휴면세포전환반응시에 사이코스-3-에피머라제의 유래 균주 및 가열 시간에 따른 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 균주 유래의 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 8은 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰의 재사용 횟수에 따른 사이코스의 생산량을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1.
코리네박테리움
글루타미쿰
균주를 이용한 과당으로부터
사이코스를
생산하는 과정에서 온도에 따른
사이코스
생산속도 및 생산량 변화
(1) 재조합 균주의 제조
대장균-코리네박테리움 셔틀벡터인 pCES208 (J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)를 변형하여 종결자(terminator)와 lac 프로모터가 삽입된 pSGT208 셔틀벡터를 제작하여 사용하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 사이코스를 생산하기 위하여 사이코스-3-에피머라제는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens str. C58; taxid:176299; GenBank NID: NC_003062, ATCC33970)의 dpe 유전자(AGR_L_260, GI:15890243, 서열번호 1)를 상기 제작한 pSGT208 셔틀벡터에 도입하여 사용하였다.
상세히 설명하면 서열번호 31의 프라이머 1과 서열번호 32의 프라이머 2를 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 게놈으로부터 dpe 유전자를 증폭하고, 이를 제한효소 KpnI와 BamHI로 절단하여 pSGT208 셔틀벡터의 동일 부위로 삽입하여 사이코스-3-에피머라제를 포함하는 pS208-dpe 재조합 셔틀벡터를 제작하였다.
이후에, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 사이코스-3-에피머라제의 발현량을 증대시키기 위하여 pS208-dpe에서 lac 프로모터를 pTrc99a에서 유래한 trc 프로모터로 교체하였으며, 이를 pS208cT-dpe로 명명하였다.
상기 제작한 사이코스-3-에피머라제를 포함하는 재조합 벡터 pS208-dpe, pS208cT-dpe와 이에 대한 음성 대조군인 pSGT208 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 도입하여 형질전환시키고, 이를 과당으로부터 사이코스 생산에 이용하였다. 형질전환법은 Handbook of Corynebacterium glutamicum (Lothar Eggeling 등, ISBN 0-8493-1821-1, 2005 by CRC press)에 명시된 방법을 따랐다.
(2) 재조합 균주의 배양 및 이를 이용한
사이코스의
생산
고농도의 균체를 확보하기 위해 상기 위에서 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체를 20㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 5 ㎖의 LB 배지(Difco)에 접종하여 30℃, 250rpm 조건으로 종배양한 후, 10g/L 포도당 및 20㎍/㎖의 카나마이신이 있는 최소 배지(1리터 당 1g K2HPO4, 10g (NH4)2SO4, 0.4g MgSO47H2O, 20mg FeSO47H2O, 20mg MnSO45H2O, 50mg NaCl, 2g urea, 0.1mg biotin, 0.1mg thiamine)에 접종하여 본배양하였다. 본배양은 홈이 파인 500 ㎖ 삼각플라스크에 100㎖ 부피로 30℃, 180 rpm 조건에서 12 시간 배양하여 충분한 균체량과 단백질의 충분한 발현을 유도하였다.
얻어진 상기 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체를 회수하여, 기질인 40%(w/v) 과당을 함유하는 상기와 동일한 최소배지에 균체농도를 40 OD600로 재현탁한 뒤, 25, 30, 37, 50, 60 또는 70℃, 180rpm 조건에서 휴면세포전환반응을 하였다.
과당 및 사이코스의 농도는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정하였다. HPLC는 Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm)을 장착한 SCL-10A(Shimadzu, 일본)를 사용하였으며, 이동상은 75% 아세토니트릴을 이용하여 1.5 mL/분으로 흘리면서 40℃에서 분리한 후 RI (Reflective Index) 검출기를 이용하여 분석하였다. 상기의 조건에서 과당의 머무름시간 (retention time)은 5.5분, 사이코스는 4.6분이었다.
측정 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, pSGT208cT-dpe 셔틀벡터를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주를 40% 과당을 함유하는 배지에서 전환반응을 시킨 결과, 반응 온도가 높아질수록 사이코스의 생산 속도가 현저히 빨라지고 생산량도 증가하는 것으로 보인다. 특히 50, 60, 70℃에서 반응시킨 실험군의 경우 대략 3시간 안에 사이코스-3-에피머라제 효소의 반응평형에 도달하여 약 120g/L의 사이코스를 생산했으며, 이는 사이코스-3-에피머라제의 과당으로부터 사이코스의 전환속도 및 생산량은 온도에 의존적임을 나타내는 결과로 볼 수 있다.
50℃를 기점으로 생산량이 급격히 증가하였는데, 이는 통상의 효소 반응에 요구되는 온도보다 현저히 높은 온도로서, 해당 온도에서 효소와 기질간의 반응의 양상이 달라진 것으로 판단된다.
2.
대장균을 이용한 과당으로부터
사이코스를
생산하는 과정에서 온도에 따른
사이코스
생산속도 및 생산량 변화
대한민국 특허등록번호 제 10-1106253호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라, pTrc99A 벡터에 아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제를 도입한 pTPE 플라스미드로 형질전환된 E. coli MG1655(ΔpfkA, als2) 균주를 제조하였다.
사이코스 분해경로를 차단하기 위해 pfkA(서열번호 11)와 als2(서열번호 14, 15, 16, 17, 18 및 19) 유전자가 결손된 대장균 MG1655를 이용하였다.
고농도의 균체를 확보하기 위해 상기 위에서 제조된 대장균 MG1655 형질전환체를 100㎍/㎖의 엠피실린을 포함하는 5 ㎖의 LB 배지(Difco)에 접종하여 37℃, 250rpm 조건으로 종배양한 후, 10g/L 포도당 및 100㎍/㎖의 엠피실린이 있는 2YT 배지에 접종하여 본배양 하였다. 본배양은 홈이 파인 500 ㎖ 삼각플라스크에 100㎖ 부피로 37℃, 180 rpm 조건에서 12 시간 배양하여 충분한 균체량과 단백질의 충분한 발현을 유도하였다.
얻어진 상기 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체를 회수하여, 기질인 40%(w/v) 과당을 함유하는 대장균 최소배지 M9 배지(1리터당 11.3g M9 minimal salts(Difco), 0.1mL 1M CaCl2, 2mL 1M MgSO4, 1mL 100mM MnSO45H2O)에 균체농도를 40 OD600로 재현탁한 뒤, 각각 37, 60 또는 70℃, 180rpm 조건에서 휴면세포전환반응을 하였다. 과당 및 사이코스의 농도는 상기의 실시예 1에 기술된 방법에 따라서 분석하였다. 측정 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, pTPE 벡터를 도입한 대장균 MG1655 (ΔpfkA, als2) 균주도 역시 40% 과당을 함유하는 배지에서 전환반응을 시킨 결과, 반응 온도가 높아질수록 사이코스의 생산속도가 빨라지고 생산량도 증가하는 것으로 보인다. 특히 60, 70℃에서 반응시킨 실험군의 경우 코리네박테리움에서의 실험과 마찬가지로 약 2시간 안에 사이코스-3-에피머라제의 반응평형에 도달하여 약 120g/L의 사이코스를 생산했다.
이는 사이코스-3-에피머라제의 과당으로부터 사이코스의 전환속도 및 생산량은 온도에 의존적임을 나타내는 결과로 다시 확인되었다.
대표적인 그람양성 세균인 코리네박테리움과 대표적인 그람음성세균인 대장균을 대상으로 고온에서 휴면세포전환반응 실험을 해 본 결과, 당 전환 효소인 사이코스-3-에피머라제가 세포 안에서 극한 외부환경으로부터 보호받기 때문에 순수한 효소 상태에서 보다는 고온에서 열변성이 되지 않고 더 빠른 속도로 사이코스를 생산하는 것을 알 수 있었다. 이런 세포전환반응의 이점은 대부분의 미생물에도 적용이 될 것으로 보인다.
3.
코리네박테리움
글루타미쿰
형질전환 균체의 휴면세포전환반응에서의 균체 회수 및 재사용을 통한 과당으로부터
사이코스의
연속생산
상기 실시예 1, 2의 결과에서 사이코스-3-에피머라제를 코리네박테리움과 대장균 형질전환체 내에 도입하여 50℃ 이상의 고온의 조건으로 전환반응하였을 때, 3시간 이내에 사이코스 생산량의 최대치에 도달한 이후에 더 이상 증가하지 않았다.
즉 사이코스 생산이 최대가 되는 반응평형에 도달한 3시간 이후에도 사이코스-3-에피머라제가 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 얼마나 잔존하는 가를 확인하기 위하여, 과당의 존재 하에서 3시간 동안 휴면세포전환반응을 통해서 사이코스 생산에 이용된 균체를 회수하여, 다시 사이코스 생산 휴면세포전환반응에 재사용하였다.
상기의 균체 재사용 휴면세포전환반응은 60℃ 온도에서 3회 반복하였다. 최초의 휴면세포전환반응은 R0, 앞의 반응액에서 균체를 회수해서 1차 재사용한 휴면세포전환반응은 R1, 2차 재사용한 휴면세포전환반응은 R2, 3차 재사용한 휴면세포전환반응은 R3로 표시하였다. 배양 조건 및 분석 방법은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 60℃ 고온의 당 전환 반응 시에도 균체의 재사용이 가능하다. 하지만 균체를 재사용할수록 효소 활성이 일정부분 감소하는 것으로 보인다. 또한 고온에서 균체를 재사용함에 있어서 그람양성균인 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 그람음성균인 대장균 MG1655 균주보다 잔존 효소 활성이 더 높은 것을 알 수 있다.
4.
다양한 휴면세포전환반응 배지에서의 과당으로부터
사이코스의
생산
상기 실시예 1에서 코리네박테리움 글루타미쿰에서 과당으로부터 사이코스를 생산하는 전환반응에 있어 40% Fructose를 포함한 최소 배지(1리터 당 1g K2HPO4, 10g (NH4)2SO4, 0.4g MgSO47H2O, 20mg FeSO47H2O, 20mg MnSO45H2O, 50mg NaCl, 2g urea, 0.1mg biotin, 0.1mg thiamine)를 이용하였다. 이 전환반응에 사용되는 배지의 구성성분들을 최소화해서 보다 경제적이고 간편한 배지를 조제하고 실시예 1에 사용한 배지와의 사이코스 생산성 비교를 수행하였다.
도 4를 참조하면 40% Fructose와 0.1mM MnSO4를 포함한 phosphate buffer (pH 7) 배지, 더 간편하게는 오직 40% Fructose와 0.1mM MnSO4 만을 포함한 배지를 사용하여도 최종적으로 생산되는 사이코스 생산량에는 별다른 차이가 없었다. 상기의 양상은 반응 온도 30℃와 60℃에서 모두 동일하게 관찰되었다. 0.1mM MnSO4는 사이코스-3-에피머레이즈의 보조인자로 첨가하지 않은 경우에는 생산량의 감소하는 결과를 얻었다.
상기 실시예에서 사이코스 생산 휴면세포전환반응에 사용하는 배지의 성분은 기질인 과당과 사이코스-3-에피머레이즈의 보조인자인 MnSO4만 있으면 된다는 것을 알 수 있었다.
5.
다양한 균주 유래의
사이코스
-3-
에피머라제
아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합
코리네박테리움
글루타미쿰의
제조
아내로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae DSM 14662; taxid: 411490)의 전제 유전자를 독인 DSMZ사에서 구입하였다. 구입한 전체 게놈을 주형으로 하여 사이코스-3-에피머라제 추정 유전자(AP endonuclease; Sequence ID: gb|EDR98778.1|; GI: 167654649; 서열번호 4)를 포함하도록 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍을 프라이머로 하여 첫 번째 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 주형으로 하여 사이코스-3-에피머라제 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 35 및 36의 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하여 두 번째 PCR을 수행하였다.
얻어진 PCR 산물을 제한 효소 BamHⅠ과 XbaⅠ을 사용하여 pS208cT-dpe(대한민국 특허출원번호 10-2013-0060703의 실시예 1에서 기술한 벡터)의 동일한 효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pS208cT-AcDPE를 제조하였다.
제작한 pS208cT-AcDPE 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 도입하여 형질전환시키고, 이를 과당으로부터 사이코스 생산에 이용하였다. 형질전환법은 Handbook of Corynebacterium glutamicum (Lothar Eggeling 등, ISBN 0-8493-1821-1, 2005 by CRC press)에 명시된 방법을 따랐다.
얻어진 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 -80℃에 보관한 후 배양에 사용하였다.
클로스트리디움 볼테애(Clostridium bolteae ATCC BAA-613; taxid:411902)의 사이코스-3-에피머라제 추정 유전자(hypothetical protein CLOBOL_00069; Sequence ID: gb|EDP19602.1|; GI:15844190; 서열번호 9)를 포함한 플라스미드를 ㈜한국야쿠르트로부터 얻었다. 사이코스-3-에피머라제 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 37 및 38의 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.
얻어진 PCR 산물을 제한 효소 KpnⅠ과 XbaⅠ을 사용하여 pS208cT-dpe(대한민국 특허출원번호 10-2013-0060703의 실시예 1에서 기술한 벡터)의 동일한 효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pS208cT-CbDPE를 제조하였다.
제작한 재조합 벡터 pS208cT-CbDPE 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 위와 같은 방법으로 도입, 형질전환시키고, 이를 과당으로부터 사이코스 생산에 이용하였다. 얻어진 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 -80℃에 보관한 후 배양에 사용하였다
클로스트리디움 힐레모내(Clostridium hylemonae DSM 15053; taxid:553973)의 전체 유전자를 독일 DSMZ사에서 구입하였다. 구입한 전체 게놈을 주형으로 하여 사이코스-3-에피머라제 추정 유전자(dolichol monophosphate mannose synthase; Sequence ID:ref|WP_006442985.1|; GI:225161759; 서열번호 10)를 포함하도록 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하여 첫 번째 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 주형으로 하여 사이코스-3-에피머라제 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 41 및 42의 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하여 두 번째 PCR을 수행하였다.
얻어진 PCR 산물을 제한 효소 BamHⅠ과 XbaⅠ을 사용하여 pS208cT-dpe(대한민국 특허출원번호 10-2013-0060703의 실시예 1에서 기술한 벡터)의 동일한 효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pS208cT-ChDPE를 제조하였다.
제작한 pS208cT-ChDPE 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 위와 같은 방법으로 도입, 형질전환시키고, 이를 과당으로부터 사이코스 생산에 이용하였다. 얻어진 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 -80℃에 보관한 후 배양에 사용하였다.
6.
다양한 균주 유래의
사이코스
-3-
에피머라제를
도입한 재조합
코리네박테리움
글루타미쿰
균주를 이용한 과당으로부터
사이코스
생산
상기 실시예 5에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체를 이용하여 고농도의 과당으로부터 사이코스 생산을 확인하였다.
상기의 형질전환체를 카나마이신 20㎍/㎖을 포함하는 2YT배지에 접종하여 30℃, 250rpm으로 종배양한 후, 다시 형질전환체를 카나마이신 20㎍/㎖을 포함하는 2YT 배지에 접종하여 본배양하였다. 본배양은 홈이 파인 300 ㎖ 삼각플라스크에 60㎖ 부피로 30℃, 180 rpm 조건에서 7시간 배양하여 충분한 균체량과 단백질의 발현을 유도하였다.
얻어진 상기 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체를 회수하여, 20㎍/㎖ 카나마이신, 기질인 40%(w/v) 과당과 사이코스-3-에피머라제의 주 보조인자로 알려진 망간 또는 코발트를 0.1mM 농도로 가지는 간단한 전환반응 배지를 사용하여 55℃에서 휴면세포전환반응을 진행하였다. 과당과 사이코스의 농도는 상기 실시예 1의 기술방법과 동일하게 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. (AtDPE는 기존 사용중인 아그로박테리움 투메패시엔스의 사이코스-3-에피머라제를 말한다.)
도 5를 참조하면, 모든 다양한 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 균주에서 망간보다 코발트를 보조인자로 하였을 때, 사이코스의 생산속도가 조금 더 빨라지는 것으로 보인다.
아내로스티페스와 아그로박테리움 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 사이코스 생산량은 6시간에 평형에 도달하는 것으로 보이지만, 클로스트리디움 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 사이코스 생산량은 망간을 보조인자로 사용하였을 때에도 3시간에 평형에 도달한 것으로 보인다.
이로써 클로스트리디움 유래의 사이코스-3-에피머라제의 과당으로부터 사이코스 생산을 확인할 수 있을 뿐 아니라, 아그로박테리움 유래의 사이코스-3-에피머라제보다 사이코스 생산 속도가 더 빠른 것을 알 수 있다.
7.
다양한 균주 유래의
사이코스
-3-
에피머라제를
도입한 재조합
코리네박테리움
글루타미쿰
균주의 고온에서의 지속적인
사이코스
생산 활성 유지
상기 실시예 1, 2의 결과에서 50℃ 이상의 고온 조건으로 전환 반응을 하였을 때, 3시간 이내에 모든 사이코스 생산이 이루어짐을 확인하였다. 이처럼 고온의 조건에서, 과당으로부터 사이코스의 생산이 빠르기 때문에 균체를 재 사용할 시에 오랜 시간 고온에서도 안정적인 사이코스-3-에피머라제가 필요하다. 따라서 다양한 균주 유래의 사이코스-3-에피머라제가 고온에서 어느 정도나 활성을 유지하는지 확인하였다.
상기 실시예 1의 기술방법으로 얻은 균체를 2YT에 부유시켜 진탕배양기를 이용해 0, 3, 6, 9, 12, 24시간 동안 60℃의 열을 지속적으로 주었다. 각 시간별로 열을 준 후, 균체를 회수하여 20㎍/㎖ 카나마이신과 0.1mM 망간과 40%(w/v) 과당만을 포함하는 간단한 전환반응 배지에 부유시켜 다시 60℃에서 3시간 동안 휴면세포전환반응을 진행하였다. 과당과 사이코스의 농도는 상기 실시예 1의 기술방법과 동일하게 측정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조해보면, 기존에 사용하던 아그로박테리움 유래의 사이코스-3-에피머라제와 아내로스티페스 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 60℃의 열을 3시간 받은 후에는 사이코스 생산을 거의 하지 못하는 것으로 보인다. 그에 반해 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 24시간의 열을 받은 후에도 사이코스 생산을 유지하는 것으로 보여 고온 공정에서의 사이코스 생산에서 아그로박테리움 유래의 사이코스-3-에피머라제보다 유리한 것으로 생각된다.
아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제의 열안정성에 중요한 서열(참고문헌 1) 중 33번 또는 213번 아미노산이 각각 루신, 시스테인으로 교체되었을 때, 50℃에서 효소의 반 수명이 각각 3.3배, 7.2배 또는 두 개 모두 교체되었을 때 29.9배 증가한다고 알려져 있다.
아그로박테리움 튜메패시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열과 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제의 아미노산 서열간의 비교는 도 7에 나타내었는데, 이를 참조하면, 열 안정성이 높았던 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제의 경우 한 개의 아미노산이 이에 상응하는 서열을 가지고 있거나 혹은 두 개 모두를 가지고 있었다.
8.
클로스트리디움
속 유래의
사이코스
-3-
에피머라제
도입한 재조합
코리네박테리움
글루타미쿰
균체의 휴면세포전환반응에서의 균체 회수 및 재사용을 통한 과당으로부터
사이코스의
생산
상기 실시예 7에서 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제가 고온에 대한 안정성이 높다는 것을 확인하였으므로, 두 클로스트리디움 속 유래의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 균주 중 대표적으로 클로스트리디움 힐레모내의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균체의 고온에서의 휴면세포전환반응 후 균제 재사용 효과를 확인하였다.
상기 실시예 3에 기술한 방법과 동일하게 얻은 균체를 60℃에서 3시간 동안 휴면세포전환반응을 시킨 후, 균체를 다시 회수하여 동일하게 휴면세포전환반응을 실시하였고 균체는 총 3번 재사용하였다(상기 실시 예 3과 동일한 조건으로 실험 진행). 최초의 휴면세포전환반응은 R0, 앞의 반응액에서 균체를 회수해서 1차 재사용한 휴면세포전환반응은 R1, 2차 재사용한 휴면세포전환반응은 R2, 3차 재사용한 휴면세포전환반응은 R3로 표시하였다. 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조해보면, 고온에서 균체를 여러 번 재사용 함에 있어서 클로스트리디움 속의 사이코스-3-에피머라제를 도입한 재조한 균체는 어떠한 사이코스 생산량 감소도 없이 일정량 유지됨을 알 수 있다. 상기 실시예 7에서의 결과와 함께 보았을 때, 효소 자체의 열 안정성이 고온에서의 지속적인 당 전환반응뿐만 아니라 균체의 재사용에 있어서도 매우 유리함을 확인할 수 있다.
<110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY OFFICE OF ACADEMY AND INDUSTRY COLLABORATION
<120> PREPARING METHOD FOR PSICOSE
<130> P2014-451
<160> 42
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 1
atgaaacacg gcatctatta ttcttactgg gaacatgagt ggagcgccaa gttcggtccc 60
tatatcgaga aggtcgccaa gctcggtttc gacatcatcg aagtcgccgc ccaccatatc 120
aacgaataca gcgacgccga actcgcgacc atcaggaaga gcgcgaagga taacggcatc 180
atcctcaccg ccggcatcgg tccgtcgaaa accaagaacc tgtcgtcgga agatgctgcg 240
gtgcgtgcgg ccggcaaggc gttctttgaa agaacccttt cgaacgtcgc caagctcgat 300
atccacacca tcggcggcgc attgcattcc tattggccaa tcgattattc gcagcccgtc 360
gacaaggcag gcgattatgc gcgcggcgtc gagggtatca acggcattgc cgatttcgcc 420
aatgatctcg gcatcaacct gtgcatcgaa gtcctcaacc gctttgaaaa ccacgtcctc 480
aacacggcgg cggaaggcgt cgcttttgtg aaggatgtcg gcaagaacaa tgtgaaagtc 540
atgctggata ccttccacat gaacatcgag gaagacagtt tcggtgacgc catccgcacg 600
gccggcccgc ttctggggca cttccatacc ggtgaaagca atcgccgcgt accgggcaag 660
ggcagaatgc cgtggcacga aatcggcctt gcgctgcgtg atatcaacta caccggcgcg 720
gtaatcatgg agcctttcgt caagacaggc ggcaccatcg gctcggatat caaggtgtgg 780
cgcgacctga gcggtggcgc cgacatcgcg aaaatggatg aagatgcccg caatgcgctg 840
gcattctccc gcttcgttct tggtggctaa 870
<210> 2
<211> 858
<212> DNA
<213> Anaerostipes caccae
<400> 2
atgaaaaata aattcggagt tgacagtttt atttggactg aatccttttc taaaaaagat 60
ttatggatca tccccaaggc aaaagaactg ggatttgaag tcatcgactt tgcgatctcc 120
aacccattca cattccctgt agagaaagtg aaggcagagc tagagagagt gggaatcgac 180
tgtgtctgca ctaccacgct gacacctgaa accaatccga tttctccgga tgccgagatc 240
cgtgcggcag gcgtaaaagc catgaaaaaa tgtgtggata tctgcaacga actgggtgca 300
ccgatcttag gcggtgtaaa ttatgcaggc tggggatatc tgacgaagaa gccaaggacc 360
gaggaagagt ggaactgggg cgtagagtgc atgagggaag ttgccgagta cgcaaagcaa 420
accggagatg ttaccatctg tgtggaatgt gtcaacagat ttgaaaccca cttcttaaac 480
attgcggaag atgcagtggc cttctgtaag gatgttggaa caggaaatgt caaggttcat 540
ctcgactgct tccatatgat cagagaagaa aagagctttg caggggcagt aaagacctgc 600
ggcaaagaat atctcggata cattcatgtc aatgaaaacg acagaggtat tcctggaaca 660
gggcttgtac cgtttaaaga atttttcaat gcattagtag agatcgggta tgacggacct 720
ttggtgatcg aatcttttga tccgagcttt gaagaactgt ccggcaactg tgcgatctgg 780
agaaaacttg ccgatactgg agaagaactt gcgattgaag ggctgaaaaa tctgaaagcc 840
atcgctgctg agatataa 858
<210> 3
<211> 289
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 3
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala
65 70 75 80
Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala
225 230 235 240
Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Gly
<210> 4
<211> 285
<212> PRT
<213> Anaerostipes caccae
<400> 4
Met Lys Asn Lys Phe Gly Val Asp Ser Phe Ile Trp Thr Glu Ser Phe
1 5 10 15
Ser Lys Lys Asp Leu Trp Ile Ile Pro Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe
20 25 30
Glu Val Ile Asp Phe Ala Ile Ser Asn Pro Phe Thr Phe Pro Val Glu
35 40 45
Lys Val Lys Ala Glu Leu Glu Arg Val Gly Ile Asp Cys Val Cys Thr
50 55 60
Thr Thr Leu Thr Pro Glu Thr Asn Pro Ile Ser Pro Asp Ala Glu Ile
65 70 75 80
Arg Ala Ala Gly Val Lys Ala Met Lys Lys Cys Val Asp Ile Cys Asn
85 90 95
Glu Leu Gly Ala Pro Ile Leu Gly Gly Val Asn Tyr Ala Gly Trp Gly
100 105 110
Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Trp Asn Trp Gly Val
115 120 125
Glu Cys Met Arg Glu Val Ala Glu Tyr Ala Lys Gln Thr Gly Asp Val
130 135 140
Thr Ile Cys Val Glu Cys Val Asn Arg Phe Glu Thr His Phe Leu Asn
145 150 155 160
Ile Ala Glu Asp Ala Val Ala Phe Cys Lys Asp Val Gly Thr Gly Asn
165 170 175
Val Lys Val His Leu Asp Cys Phe His Met Ile Arg Glu Glu Lys Ser
180 185 190
Phe Ala Gly Ala Val Lys Thr Cys Gly Lys Glu Tyr Leu Gly Tyr Ile
195 200 205
His Val Asn Glu Asn Asp Arg Gly Ile Pro Gly Thr Gly Leu Val Pro
210 215 220
Phe Lys Glu Phe Phe Asn Ala Leu Val Glu Ile Gly Tyr Asp Gly Pro
225 230 235 240
Leu Val Ile Glu Ser Phe Asp Pro Ser Phe Glu Glu Leu Ser Gly Asn
245 250 255
Cys Ala Ile Trp Arg Lys Leu Ala Asp Thr Gly Glu Glu Leu Ala Ile
260 265 270
Glu Gly Leu Lys Asn Leu Lys Ala Ile Ala Ala Glu Ile
275 280 285
<210> 5
<211> 289
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 5
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala
65 70 75 80
Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala
225 230 235 240
Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Gly
<210> 6
<211> 269
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> psicose 3-epimerase
<400> 6
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Thr Glu Trp Ser Ala Lys
1 5 10 15
Tyr Lys Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile Ile
20 25 30
Glu Ile Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Ser Asp Asp Leu Glu Leu Lys Lys
35 40 45
Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Thr Lys
50 55 60
Asn Leu Ser Glu Asp Ala Glu Val Arg Ala Ala Ala Leu Phe Phe Lys
65 70 75 80
Arg Leu Leu Asp Ile Leu Ala Glu Leu Asp Ile His Ile Ile Gly Gly
85 90 95
Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp Pro Val Asp Phe Ser Asn Asp Lys Gly Asp
100 105 110
Trp Ala Trp Gly Val Glu Gly Met Arg Glu Leu Ala Asp Phe Ala Asp
115 120 125
Asp Ile Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile
130 135 140
Leu Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser
165 170 175
Phe Ala Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Asp Leu Leu Gly His Phe His
180 185 190
Thr Gly Glu Asn Asn Arg Leu Val Pro Gly Lys Gly Arg Ile Pro Trp
195 200 205
Lys Glu Ile Gly Asn Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Ala
210 215 220
Val Met Glu Pro Phe Val Lys Ser Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp Ile
225 230 235 240
Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Ala Asp Glu Ala Ala Leu Asp Asp
245 250 255
Asp Ala Arg Ala Leu Glu Phe Ala Arg His Val Leu Gly
260 265
<210> 7
<211> 876
<212> DNA
<213> Clostridium bolteae
<400> 7
atgaaatatg gtatttattt tgcttattgg acgaaggaat ggtttgctga ttataagaag 60
tatatggata aggtgtctgc tttggggttt gatgtcctgg aaatttcctg tgcagccctc 120
agagatgtat acacaaccaa ggaacagctg attgagctac gtgaatacgc caaagaaaaa 180
gggcttgttc taacagctgg ttatggacct actaaagcag aaaatctgtg ttcagaagac 240
ccggaggcag tgagacgggc catgacattc ttcaaggacc tgcttccaaa gctgcagtta 300
atggatatcc atatcctggg agggggatta tattcctact ggcccgtgga ttttaccatt 360
aataatgaca agcagggaga ccgggccagg gctgtcagga atctgaggga attgtccaaa 420
acagcggagg aatgtgacgt ggtgcttgga atggaggtac tgaaccgcta tgaggggtat 480
attcttaata cctgtgaaga ggcaattgat tttgtcgatg agattggaag cagccatgta 540
aaaatcatgc tggatacttt ccatatgaat attgaagaga caaatatggc tgatgcaatc 600
cgcaaggcgg gagacaggct gggacatctc catctgggag aacagaaccg cctggtgccg 660
ggaaaaggca gcctgccatg ggctgagata gggcaggcgc tccgtgatat taactatcag 720
ggagccgctg tcatggaacc ttttgtcatg cagggaggga ccatcggttc tgagataaag 780
gtatggagag acatggtgcc ggatctttct gaggaagcac tggacaggga tgcaaagggt 840
gcgctggaat tctgcaggca tgtgtttggt atctaa 876
<210> 8
<211> 870
<212> DNA
<213> Clostridium hylemonae
<400> 8
atgaaacatg gtatctatta tgcatactgg gaacaagaat gggcggccga ctacaagcgc 60
tatgttgaaa aggtggcaaa gcttgggttt gacattctgg agatcggcgc tgggccgctg 120
ccggaatacg cagagcagga tgtgaaggaa ctgaagaaat gtgcgcagga caatgggatc 180
acgctgacgg ccggatatgg tccgacgttc aaccacaata tcggttcttc agacgccggg 240
gtaagggaag aggcgctgga atggtataag aggttatttg aagtgctggc agagcttgat 300
atccacctga tcggaggggc gctctattct tactggcctg tcgattttgc aaacgccgat 360
aaaacggaag actggaagtg gagtgtagag ggcatgcaga ggctggcgcc ggccgcggcc 420
aaatatgaca tcaacctggg catggaagtt ctgaaccggt ttgagagcca tatcctgaat 480
acagccgagg aaggtgtgaa gtttgtagag gaagtcggca tggacaacgt aaaggtcatg 540
ctggatacat tccatatgaa tatagaagag caaagcatag gcggcgcgat ccgccgggca 600
ggaaaactgc tcgggcattt ccacaccgga gaatgcaacc gcatggtgcc cgggaaggga 660
cgtattccat ggcgtgagat aggggatgct ctccgtgata tcggatatga cggaactgct 720
gtaatggagc cgttcgttcg catgggagga caggtcggcg ctgatatcaa ggtgtggaga 780
gacataagcc gtggagcaga cgaggcacag cttgacgatg acgcgcgccg tgcgctggag 840
ttccagagat atatgctgga gtggaagtaa 870
<210> 9
<211> 291
<212> PRT
<213> Clostridium bolteae
<400> 9
Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Phe Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Lys Tyr Met Asp Lys Val Ser Ala Leu Gly Phe Asp Val
20 25 30
Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Arg Asp Val Tyr Thr Thr Lys Glu
35 40 45
Gln Leu Ile Glu Leu Arg Glu Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Val Leu
50 55 60
Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Thr Lys Ala Glu Asn Leu Cys Ser Glu Asp
65 70 75 80
Pro Glu Ala Val Arg Arg Ala Met Thr Phe Phe Lys Asp Leu Leu Pro
85 90 95
Lys Leu Gln Leu Met Asp Ile His Ile Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser
100 105 110
Tyr Trp Pro Val Asp Phe Thr Ile Asn Asn Asp Lys Gln Gly Asp Arg
115 120 125
Ala Arg Ala Val Arg Asn Leu Arg Glu Leu Ser Lys Thr Ala Glu Glu
130 135 140
Cys Asp Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Ile Leu Asn Thr Cys Glu Glu Ala Ile Asp Phe Val Asp Glu Ile Gly
165 170 175
Ser Ser His Val Lys Ile Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Thr Asn Met Ala Asp Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Gly
195 200 205
His Leu His Leu Gly Glu Gln Asn Arg Leu Val Pro Gly Lys Gly Ser
210 215 220
Leu Pro Trp Ala Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln
225 230 235 240
Gly Ala Ala Val Met Glu Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Ile Gly
245 250 255
Ser Glu Ile Lys Val Trp Arg Asp Met Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu
260 265 270
Ala Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Cys Arg His Val
275 280 285
Phe Gly Ile
290
<210> 10
<211> 289
<212> PRT
<213> Clostridium hylemonae
<400> 10
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Ile Gly Ala Gly Pro Leu Pro Glu Tyr Ala Glu Gln Asp Val
35 40 45
Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Gln Asp Asn Gly Ile Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Tyr Gly Pro Thr Phe Asn His Asn Ile Gly Ser Ser Asp Ala Gly
65 70 75 80
Val Arg Glu Glu Ala Leu Glu Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Leu
85 90 95
Ala Glu Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Phe Ala Asn Ala Asp Lys Thr Glu Asp Trp Lys Trp Ser
115 120 125
Val Glu Gly Met Gln Arg Leu Ala Pro Ala Ala Ala Lys Tyr Asp Ile
130 135 140
Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn
145 150 155 160
Thr Ala Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Glu Glu Val Gly Met Asp Asn
165 170 175
Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Gln Ser
180 185 190
Ile Gly Gly Ala Ile Arg Arg Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His
195 200 205
Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Ile Pro Trp
210 215 220
Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Asp Ile Gly Tyr Asp Gly Thr Ala
225 230 235 240
Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ala Asp Ile
245 250 255
Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Arg Gly Ala Asp Glu Ala Gln Leu Asp
260 265 270
Asp Asp Ala Arg Arg Ala Leu Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp
275 280 285
Lys
<210> 11
<211> 963
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 11
atgattaaga aaatcggtgt gttgacaagc ggcggtgatg cgccaggcat gaacgccgca 60
attcgcgggg ttgttcgttc tgcgctgaca gaaggtctgg aagtaatggg tatttatgac 120
ggctatctgg gtctgtatga agaccgtatg gtacagctag accgttacag cgtgtctgac 180
atgatcaacc gtggcggtac gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag 240
aacatccgcg ccgtggctat cgaaaacctg aaaaaacgtg gtatcgacgc gctggtggtt 300
atcggcggtg acggttccta catgggtgca atgcgtctga ccgaaatggg cttcccgtgc 360
atcggtctgc cgggcactat cgacaacgac atcaaaggca ctgactacac tatcggtttc 420
ttcactgcgc tgagcaccgt tgtagaagcg atcgaccgtc tgcgtgacac ctcttcttct 480
caccagcgta tttccgtggt ggaagtgatg ggccgttatt gtggagatct gacgttggct 540
gcggccattg ccggtggctg tgaattcgtt gtggttccgg aagttgaatt cagccgtgaa 600
gacctggtaa acgaaatcaa agcgggtatc gcgaaaggta aaaaacacgc gatcgtggcg 660
attaccgaac atatgtgtga tgttgacgaa ctggcgcatt tcatcgagaa agaaaccggt 720
cgtgaaaccc gcgcaactgt gctgggccac atccagcgcg gtggttctcc ggtgccttac 780
gaccgtattc tggcttcccg tatgggcgct tacgctatcg atctgctgct ggcaggttac 840
ggcggtcgtt gtgtaggtat ccagaacgaa cagctggttc accacgacat catcgacgct 900
atcgaaaaca tgaagcgtcc gttcaaaggt gactggctgg actgcgcgaa aaaactgtat 960
taa 963
<210> 12
<211> 320
<212> PRT
<213> eschreichia coli
<400> 12
Met Ile Lys Lys Ile Gly Val Leu Thr Ser Gly Gly Asp Ala Pro Gly
1 5 10 15
Met Asn Ala Ala Ile Arg Gly Val Val Arg Ser Ala Leu Thr Glu Gly
20 25 30
Leu Glu Val Met Gly Ile Tyr Asp Gly Tyr Leu Gly Leu Tyr Glu Asp
35 40 45
Arg Met Val Gln Leu Asp Arg Tyr Ser Val Ser Asp Met Ile Asn Arg
50 55 60
Gly Gly Thr Phe Leu Gly Ser Ala Arg Phe Pro Glu Phe Arg Asp Glu
65 70 75 80
Asn Ile Arg Ala Val Ala Ile Glu Asn Leu Lys Lys Arg Gly Ile Asp
85 90 95
Ala Leu Val Val Ile Gly Gly Asp Gly Ser Tyr Met Gly Ala Met Arg
100 105 110
Leu Thr Glu Met Gly Phe Pro Cys Ile Gly Leu Pro Gly Thr Ile Asp
115 120 125
Asn Asp Ile Lys Gly Thr Asp Tyr Thr Ile Gly Phe Phe Thr Ala Leu
130 135 140
Ser Thr Val Val Glu Ala Ile Asp Arg Leu Arg Asp Thr Ser Ser Ser
145 150 155 160
His Gln Arg Ile Ser Val Val Glu Val Met Gly Arg Tyr Cys Gly Asp
165 170 175
Leu Thr Leu Ala Ala Ala Ile Ala Gly Gly Cys Glu Phe Val Val Val
180 185 190
Pro Glu Val Glu Phe Ser Arg Glu Asp Leu Val Asn Glu Ile Lys Ala
195 200 205
Gly Ile Ala Lys Gly Lys Lys His Ala Ile Val Ala Ile Thr Glu His
210 215 220
Met Cys Asp Val Asp Glu Leu Ala His Phe Ile Glu Lys Glu Thr Gly
225 230 235 240
Arg Glu Thr Arg Ala Thr Val Leu Gly His Ile Gln Arg Gly Gly Ser
245 250 255
Pro Val Pro Tyr Asp Arg Ile Leu Ala Ser Arg Met Gly Ala Tyr Ala
260 265 270
Ile Asp Leu Leu Leu Ala Gly Tyr Gly Gly Arg Cys Val Gly Ile Gln
275 280 285
Asn Glu Gln Leu Val His His Asp Ile Ile Asp Ala Ile Glu Asn Met
290 295 300
Lys Arg Pro Phe Lys Gly Asp Trp Leu Asp Cys Ala Lys Lys Leu Tyr
305 310 315 320
<210> 13
<211> 450
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 13
atgaaaaaga ttgcatttgg ctgtgatcat gtcggtttca ttttaaaaca tgaaatagtg 60
gcacatttag ttgagcgtgg cgttgaagtg attgataaag gaacctggtc gtcagagcgt 120
actgattatc cacattacgc cagtcaagtc gcactggctg ttgctggcgg agaggttgat 180
ggcgggattt tgatttgtgg tactggcgtc ggtatttcga tagcggcgaa caagtttgcc 240
ggaattcgcg cggtcgtctg tagcgaacct tattccgcgc aactttcgcg gcagcataac 300
gacaccaacg tgctggcttt tggttcacga gtggttggcc tcgaactggc aaaaatgatt 360
gtggatgcgt ggctgggcgc acagtacgaa ggcggtcgtc atcaacaacg cgtggaggcg 420
attacggcaa tagagcagcg gagaaattga 450
<210> 14
<211> 891
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 14
atgagccagt cagagtttga ttcagcgctt ccgaacggta tagggttagc gccttacctg 60
cgaatgaagc aggaaggaat gacagaaaat gaaagccgca tcgtggagtg gttactcaaa 120
cccggtaacc tgagttgtgc acccgcaatt aaagatgtcg cagaagctct ggcggtatct 180
gaagcgatga tagttaaggt atcaaagctg ctggggttta gcggctttcg taacttacgc 240
agtgcgctgg aagattattt ttctcagtca gaacaggtat tgccttccga gttggctttt 300
gatgaagcgc cgcaggatgt ggtgaataag gtatttaaca tcactttacg caccattatg 360
gaaggtcagt cgatcgtcaa cgttgatgag atccaccgtg ccgcccgctt tttctatcag 420
gccagacagc gggatttgta cggtgccgga ggatcaaatg ctatctgtgc tgatgtacag 480
cacaagttct tgcgcattgg cgtacgctgt caggcctatc ctgatgctca catcatgatg 540
atgtccgctt cgttgttaca ggaaggagat gttgtgctgg tagtgaccca ttccgggcga 600
accagtgatg taaaagcggc cgtagaactg gcaaaaaaga acggggcaaa gattatttgt 660
ataacccata gctaccattc accgatagcg aaactggccg attatattat ttgctcacca 720
gccccggaaa cgccgttatt aggtcgtaat gcctcggcaa gaatattaca actaactttg 780
ctggacgctt tttttgtctc tgtcgcccag ctcaacattg aacaagctaa tattaatatg 840
caaaaaaccg gcgcaattgt tgatttcttc tcaccaggcg cgctgaaata a 891
<210> 15
<211> 936
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 15
atgaataaat atctgaaata tttcagcggc acactcgtgg gcttaatgtt gtcaaccagc 60
gcttttgctg ccgccgaata tgctgtcgta ttgaaaaccc tctccaaccc attttgggta 120
gatatgaaaa aaggcattga agatgaagca aaaacactgg gcgtcagcgt tgatattttt 180
gcctctcctt cagaaggcga ttttcaatct caattgcagt tatttgaaga tctcagtaat 240
aaaaattaca aaggtatcgc cttcgctcca ttatcctcag tgaatctggt catgcctgtc 300
gcccgcgcat ggaaaaaagg catttatctg gttaatctcg atgaaaaaat cgacatggat 360
aatctgaaaa aagctggcgg caatgtggaa gcttttgtca ccaccgataa cgttgctgtc 420
ggggcgaaag gcgcgtcgtt cattattgac aaattgggcg ctgaaggtgg tgaagtcgca 480
atcattgagg gtaaagccgg taacgcctcc ggtgaagcgc gtcgtaatgg tgccaccgaa 540
gccttcaaaa aagcaagcca gatcaagctt gtcgccagcc agcctgccga ctgggaccgc 600
attaaagcac tggatgtcgc cactaacgtg ttgcaacgta atccgaatat taaagcgatc 660
tattgcgcga atgacacgat ggcaatgggt gttgctcagg cagtcgcaaa cgccggaaaa 720
acgggaaaag tgctggtcgt cggtacagat ggcattccgg aagcccgcaa aatggtggaa 780
gccggacaaa tgaccgcgac ggttgcccag aacccggcgg atatcggcgc aacgggtctg 840
aagctgatgg ttgacgctga gaaatccggc aaggttatcc cgctggataa agcaccggaa 900
tttaaactgg tcgattcaat cctggtcact caataa 936
<210> 16
<211> 1533
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 16
atggccacgc catatatatc gatggcgggg atcggcaagt cctttggtcc ggttcacgca 60
ttaaagtcgg ttaatttaac ggtttatcct ggtgaaatac atgcattact aggagaaaat 120
ggcgcgggta aatccacgct aatgaaagtt ttatccggaa tacatgagcc gaccaaaggc 180
accattacca ttaataacat tagctataac aagctggatc ataaattagc ggcacaactc 240
ggtatcggga ttatttatca ggaactcagc gttattgatg aattaaccgt actggaaaat 300
ttatatattg gtcgtcatct gacgaaaaaa atctgtggcg tcaatattat cgactggcga 360
gaaatgcgtg tccgcgccgc catgatgtta ttacgcgtgg gcttgaaagt tgatctagat 420
gagaaagtgg cgaatttatc tatcagccac aagcagatgc tagaaattgc caaaacgctg 480
atgctcgatg ccaaagtcat catcatggat gaacccacct cctcactcac caataaagag 540
gtggactatc tgtttctgat catgaatcag ttgcgtaaag agggtacggc catcgtctat 600
atctcgcata agttggcgga aattcgccgt atttgcgacc gctatacggt gatgaaagac 660
ggcagcagcg tttgcagcgg catagtaagc gatgtgtcaa atgacgatat cgtccgtctg 720
atggtaggcc gcgaactgca aaaccgtttt aacgcgatga aggagaatgt cagcaacctt 780
gcgcacgaaa cggtttttga ggtgcggaac gtcaccagtc gtgacagaaa aaaggtccgg 840
gatatctcat ttagcgtctg ccggggagaa atattaggct ttgccggact ggtcggttcc 900
ggacgtactg aactgatgaa ttgtctgttt ggcgtggata aacgcgctgg cggagaaatc 960
cgtcttaatg gcaaagatat ctctccacgt tcacccctgg atgccgtgaa aaaagggatg 1020
gcttacatca ctgaaagccg ccgggataac ggttttttcc ccaacttttc catcgctcag 1080
aacatggcga tcagccgcag tctgaaagac ggcggctata aaggcgcgat gggcttgttt 1140
catgaagttg acgagcaacg taccgctgaa aatcaacgcg aactgctggc gctgaaatgt 1200
cattcggtaa accagaatat caccgaactc tccgggggaa atcagcagaa agtcctgatc 1260
tccaaatggc tgtgctgttg cccggaagtg attattttcg atgaacctac ccgcggcatc 1320
gacgttggcg cgaaagccga aatttacaaa gtgatgcgcc aactggcgga cgacggaaaa 1380
gtcatcctga tggtgtcatc tgaactacct gaaattatca ccgtctgcga ccgcatcgcc 1440
gtgttctgcg aaggacgact gacgcaaatc ctgacgaatc gcgatgacat gagcgaagag 1500
gagattatgg catgggcttt accacaagag taa 1533
<210> 17
<211> 981
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 17
atgggcttta ccacaagagt aaaaagcgaa gcgagcgaga agaaaccgtt caactttgcg 60
ctgttctggg ataaatacgg cacctttttt atcctggcga tcatcgtcgc catctttggt 120
tcgctgtcac cagaatattt tctgaccacc aataatatta cccagatttt tgttcaaagc 180
tccgtgacgg tattgatcgg catgggcgag tttttcgcta tcctggtcgc tggtatcgac 240
ctctcggttg gcgcgattct ggcgctttcc ggtatggtga ccgccaaact gatgttggca 300
ggtgttgacc cgtttctcgc agcgatgatt ggcggtgtac tggttggcgg cgcactgggg 360
gcgatcaacg gctgcctggt caactggacg gggctacacc cgttcatcat cacccttggc 420
accaacgcga ttttccgtgg gatcacgctg gtgatctccg atgccaactc ggtatacggc 480
ttctcatttg acttcgtgaa cttctttgcc gccagcgtaa ttgggatacc tgtccccgtt 540
atcttctcac taattgtcgc gctcatcctt tggtttctga caacgcgtat gcggctcggg 600
cgcaacatct acgcactggg cggcaacaaa aattcggcgt tctattccgg gattgacgtg 660
aaattccaca tcctggtggt gtttatcatc tccggtgttt gtgcaggtct ggcaggcgtc 720
gtctcaactg cacgactcgg tgccgcagaa ccgcttgccg gtatgggttt tgaaacctat 780
gccattgcca gcgccatcat tggcggcacc agtttcttcg gcggcaaggg gcgcattttc 840
tctgtggtga ttggcgggtt gatcatcggc accatcaaca acggtctgaa tattttgcag 900
gtacaaacct attaccaact ggtggtgatg ggcggattaa ttatcgcggc tgtcgccctt 960
gaccgtctta tcagtaagta a 981
<210> 18
<211> 696
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 18
atgaaaatct ccccctcgtt aatgtgtatg gatctgctga aatttaaaga acagatcgaa 60
tttatcgaca gccatgccga ttacttccac atcgatatca tggacggtca ctttgtcccc 120
aatctgacac tctcaccgtt cttcgtaagt caggttaaaa aactggcaac taaaccgctc 180
gactgtcatc tgatggtgac gcggccgcag gattacattg ctcaactggc gcgtgcggga 240
gcagatttca tcactctgca tccggaaacc atcaacggcc aggcgttccg cctgattgat 300
gaaatccgcc gtcatgacat gaaagtgggg ctgatcctta acccggagac gccagttgag 360
gccatgaaat actatatcca taaggccgat aaaattacgg tcatgactgt cgatcccggc 420
tttgccggac aaccgttcat tcctgaaatg ctggataaac ttgccgaact gaaggcatgg 480
cgtgaacgag aaggtctgga gtacgaaatt gaggtggacg gttcctgcaa ccaggcaact 540
tacgaaaaac tgatggcggc aggggcggat gtctttatcg tcggcacttc cggcctgttt 600
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<210> 19
<211> 930
<212> DNA
<213> escherichia coli
<400> 19
atgcaaaaac agcataacgt cgtagcgggc gtggatatgg gggcaacgca tatccgcttt 60
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tcctgggacg tagtagaaaa ccgccttacg caacaactgg ttctggcggc ctatctcggt 420
acggggatgg ggttcgcagt gtggatgaac ggtgcgccgt ggacgggtgc acacggtgtg 480
gcaggcgaac tgggtcatat ccccctggga gatatgaccc aacactgcgc gtgtggcaat 540
cctgggtgcc tggaaaccaa ttgctctgga atggcgctaa gacgctggta cgaacaacag 600
ccccgaaatt acccattgcg cgatcttttc gtccatgcgg aaaacgcccc tttcgtccag 660
agtctgcttg aaaacgcggc acgggccatt gccaccagca ttaatctgtt cgatcccgat 720
gcggtgatcc tgggcggtgg cgtgatggat atgcccgcct tcccacgcga gactctcgtt 780
gccatgaccc aaaagtacct gcgccgtcca ctgccgcatc aggtcgtgcg ctttattgcc 840
gcctcatctt ctgactttaa tggcgctcag ggtgcagcaa tattggcgca tcaacgtttt 900
ttgccacagt tctgtgctaa agccccatga 930
<210> 20
<211> 149
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 20
Met Lys Lys Ile Ala Phe Gly Cys Asp His Val Gly Phe Ile Leu Lys
1 5 10 15
His Glu Ile Val Ala His Leu Val Glu Arg Gly Val Glu Val Ile Asp
20 25 30
Lys Gly Thr Trp Ser Ser Glu Arg Thr Asp Tyr Pro His Tyr Ala Ser
35 40 45
Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Gly Gly Glu Val Asp Gly Gly Ile Leu
50 55 60
Ile Cys Gly Thr Gly Val Gly Ile Ser Ile Ala Ala Asn Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gly Ile Arg Ala Val Val Cys Ser Glu Pro Tyr Ser Ala Gln Leu Ser
85 90 95
Arg Gln His Asn Asp Thr Asn Val Leu Ala Phe Gly Ser Arg Val Val
100 105 110
Gly Leu Glu Leu Ala Lys Met Ile Val Asp Ala Trp Leu Gly Ala Gln
115 120 125
Tyr Glu Gly Gly Arg His Gln Gln Arg Val Glu Ala Ile Thr Ala Ile
130 135 140
Glu Gln Arg Arg Asn
145
<210> 21
<211> 296
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 21
Met Ser Gln Ser Glu Phe Asp Ser Ala Leu Pro Asn Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Leu Arg Met Lys Gln Glu Gly Met Thr Glu Asn Glu Ser
20 25 30
Arg Ile Val Glu Trp Leu Leu Lys Pro Gly Asn Leu Ser Cys Ala Pro
35 40 45
Ala Ile Lys Asp Val Ala Glu Ala Leu Ala Val Ser Glu Ala Met Ile
50 55 60
Val Lys Val Ser Lys Leu Leu Gly Phe Ser Gly Phe Arg Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ser Ala Leu Glu Asp Tyr Phe Ser Gln Ser Glu Gln Val Leu Pro Ser
85 90 95
Glu Leu Ala Phe Asp Glu Ala Pro Gln Asp Val Val Asn Lys Val Phe
100 105 110
Asn Ile Thr Leu Arg Thr Ile Met Glu Gly Gln Ser Ile Val Asn Val
115 120 125
Asp Glu Ile His Arg Ala Ala Arg Phe Phe Tyr Gln Ala Arg Gln Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gly Ala Gly Gly Ser Asn Ala Ile Cys Ala Asp Val Gln
145 150 155 160
His Lys Phe Leu Arg Ile Gly Val Arg Cys Gln Ala Tyr Pro Asp Ala
165 170 175
His Ile Met Met Met Ser Ala Ser Leu Leu Gln Glu Gly Asp Val Val
180 185 190
Leu Val Val Thr His Ser Gly Arg Thr Ser Asp Val Lys Ala Ala Val
195 200 205
Glu Leu Ala Lys Lys Asn Gly Ala Lys Ile Ile Cys Ile Thr His Ser
210 215 220
Tyr His Ser Pro Ile Ala Lys Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Cys Ser Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Thr Pro Leu Leu Gly Arg Asn Ala Ser Ala Arg Ile Leu
245 250 255
Gln Leu Thr Leu Leu Asp Ala Phe Phe Val Ser Val Ala Gln Leu Asn
260 265 270
Ile Glu Gln Ala Asn Ile Asn Met Gln Lys Thr Gly Ala Ile Val Asp
275 280 285
Phe Phe Ser Pro Gly Ala Leu Lys
290 295
<210> 22
<211> 311
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 22
Met Asn Lys Tyr Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Thr Leu Val Gly Leu Met
1 5 10 15
Leu Ser Thr Ser Ala Phe Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Val Val Leu Lys
20 25 30
Thr Leu Ser Asn Pro Phe Trp Val Asp Met Lys Lys Gly Ile Glu Asp
35 40 45
Glu Ala Lys Thr Leu Gly Val Ser Val Asp Ile Phe Ala Ser Pro Ser
50 55 60
Glu Gly Asp Phe Gln Ser Gln Leu Gln Leu Phe Glu Asp Leu Ser Asn
65 70 75 80
Lys Asn Tyr Lys Gly Ile Ala Phe Ala Pro Leu Ser Ser Val Asn Leu
85 90 95
Val Met Pro Val Ala Arg Ala Trp Lys Lys Gly Ile Tyr Leu Val Asn
100 105 110
Leu Asp Glu Lys Ile Asp Met Asp Asn Leu Lys Lys Ala Gly Gly Asn
115 120 125
Val Glu Ala Phe Val Thr Thr Asp Asn Val Ala Val Gly Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Ser Phe Ile Ile Asp Lys Leu Gly Ala Glu Gly Gly Glu Val Ala
145 150 155 160
Ile Ile Glu Gly Lys Ala Gly Asn Ala Ser Gly Glu Ala Arg Arg Asn
165 170 175
Gly Ala Thr Glu Ala Phe Lys Lys Ala Ser Gln Ile Lys Leu Val Ala
180 185 190
Ser Gln Pro Ala Asp Trp Asp Arg Ile Lys Ala Leu Asp Val Ala Thr
195 200 205
Asn Val Leu Gln Arg Asn Pro Asn Ile Lys Ala Ile Tyr Cys Ala Asn
210 215 220
Asp Thr Met Ala Met Gly Val Ala Gln Ala Val Ala Asn Ala Gly Lys
225 230 235 240
Thr Gly Lys Val Leu Val Val Gly Thr Asp Gly Ile Pro Glu Ala Arg
245 250 255
Lys Met Val Glu Ala Gly Gln Met Thr Ala Thr Val Ala Gln Asn Pro
260 265 270
Ala Asp Ile Gly Ala Thr Gly Leu Lys Leu Met Val Asp Ala Glu Lys
275 280 285
Ser Gly Lys Val Ile Pro Leu Asp Lys Ala Pro Glu Phe Lys Leu Val
290 295 300
Asp Ser Ile Leu Val Thr Gln
305 310
<210> 23
<211> 326
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 23
Met Gly Phe Thr Thr Arg Val Lys Ser Glu Ala Ser Glu Lys Lys Pro
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ala Leu Phe Trp Asp Lys Tyr Gly Thr Phe Phe Ile Leu
20 25 30
Ala Ile Ile Val Ala Ile Phe Gly Ser Leu Ser Pro Glu Tyr Phe Leu
35 40 45
Thr Thr Asn Asn Ile Thr Gln Ile Phe Val Gln Ser Ser Val Thr Val
50 55 60
Leu Ile Gly Met Gly Glu Phe Phe Ala Ile Leu Val Ala Gly Ile Asp
65 70 75 80
Leu Ser Val Gly Ala Ile Leu Ala Leu Ser Gly Met Val Thr Ala Lys
85 90 95
Leu Met Leu Ala Gly Val Asp Pro Phe Leu Ala Ala Met Ile Gly Gly
100 105 110
Val Leu Val Gly Gly Ala Leu Gly Ala Ile Asn Gly Cys Leu Val Asn
115 120 125
Trp Thr Gly Leu His Pro Phe Ile Ile Thr Leu Gly Thr Asn Ala Ile
130 135 140
Phe Arg Gly Ile Thr Leu Val Ile Ser Asp Ala Asn Ser Val Tyr Gly
145 150 155 160
Phe Ser Phe Asp Phe Val Asn Phe Phe Ala Ala Ser Val Ile Gly Ile
165 170 175
Pro Val Pro Val Ile Phe Ser Leu Ile Val Ala Leu Ile Leu Trp Phe
180 185 190
Leu Thr Thr Arg Met Arg Leu Gly Arg Asn Ile Tyr Ala Leu Gly Gly
195 200 205
Asn Lys Asn Ser Ala Phe Tyr Ser Gly Ile Asp Val Lys Phe His Ile
210 215 220
Leu Val Val Phe Ile Ile Ser Gly Val Cys Ala Gly Leu Ala Gly Val
225 230 235 240
Val Ser Thr Ala Arg Leu Gly Ala Ala Glu Pro Leu Ala Gly Met Gly
245 250 255
Phe Glu Thr Tyr Ala Ile Ala Ser Ala Ile Ile Gly Gly Thr Ser Phe
260 265 270
Phe Gly Gly Lys Gly Arg Ile Phe Ser Val Val Ile Gly Gly Leu Ile
275 280 285
Ile Gly Thr Ile Asn Asn Gly Leu Asn Ile Leu Gln Val Gln Thr Tyr
290 295 300
Tyr Gln Leu Val Val Met Gly Gly Leu Ile Ile Ala Ala Val Ala Leu
305 310 315 320
Asp Arg Leu Ile Ser Lys
325
<210> 24
<211> 326
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 24
Met Gly Phe Thr Thr Arg Val Lys Ser Glu Ala Ser Glu Lys Lys Pro
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ala Leu Phe Trp Asp Lys Tyr Gly Thr Phe Phe Ile Leu
20 25 30
Ala Ile Ile Val Ala Ile Phe Gly Ser Leu Ser Pro Glu Tyr Phe Leu
35 40 45
Thr Thr Asn Asn Ile Thr Gln Ile Phe Val Gln Ser Ser Val Thr Val
50 55 60
Leu Ile Gly Met Gly Glu Phe Phe Ala Ile Leu Val Ala Gly Ile Asp
65 70 75 80
Leu Ser Val Gly Ala Ile Leu Ala Leu Ser Gly Met Val Thr Ala Lys
85 90 95
Leu Met Leu Ala Gly Val Asp Pro Phe Leu Ala Ala Met Ile Gly Gly
100 105 110
Val Leu Val Gly Gly Ala Leu Gly Ala Ile Asn Gly Cys Leu Val Asn
115 120 125
Trp Thr Gly Leu His Pro Phe Ile Ile Thr Leu Gly Thr Asn Ala Ile
130 135 140
Phe Arg Gly Ile Thr Leu Val Ile Ser Asp Ala Asn Ser Val Tyr Gly
145 150 155 160
Phe Ser Phe Asp Phe Val Asn Phe Phe Ala Ala Ser Val Ile Gly Ile
165 170 175
Pro Val Pro Val Ile Phe Ser Leu Ile Val Ala Leu Ile Leu Trp Phe
180 185 190
Leu Thr Thr Arg Met Arg Leu Gly Arg Asn Ile Tyr Ala Leu Gly Gly
195 200 205
Asn Lys Asn Ser Ala Phe Tyr Ser Gly Ile Asp Val Lys Phe His Ile
210 215 220
Leu Val Val Phe Ile Ile Ser Gly Val Cys Ala Gly Leu Ala Gly Val
225 230 235 240
Val Ser Thr Ala Arg Leu Gly Ala Ala Glu Pro Leu Ala Gly Met Gly
245 250 255
Phe Glu Thr Tyr Ala Ile Ala Ser Ala Ile Ile Gly Gly Thr Ser Phe
260 265 270
Phe Gly Gly Lys Gly Arg Ile Phe Ser Val Val Ile Gly Gly Leu Ile
275 280 285
Ile Gly Thr Ile Asn Asn Gly Leu Asn Ile Leu Gln Val Gln Thr Tyr
290 295 300
Tyr Gln Leu Val Val Met Gly Gly Leu Ile Ile Ala Ala Val Ala Leu
305 310 315 320
Asp Arg Leu Ile Ser Lys
325
<210> 25
<211> 309
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 25
Met Gln Lys Gln His Asn Val Val Ala Gly Val Asp Met Gly Ala Thr
1 5 10 15
His Ile Arg Phe Cys Leu Arg Thr Ala Glu Gly Glu Thr Leu His Cys
20 25 30
Glu Lys Lys Arg Thr Ala Glu Val Ile Ala Pro Gly Leu Val Ser Gly
35 40 45
Ile Gly Glu Met Ile Asp Glu Gln Leu Arg Arg Phe Asn Ala Arg Cys
50 55 60
His Gly Leu Val Met Gly Phe Pro Ala Leu Val Ser Lys Asp Lys Arg
65 70 75 80
Thr Ile Ile Ser Thr Pro Asn Leu Pro Leu Thr Ala Ala Asp Leu Tyr
85 90 95
Asp Leu Ala Asp Lys Leu Glu Asn Thr Leu Asn Cys Pro Val Glu Phe
100 105 110
Ser Arg Asp Val Asn Leu Gln Leu Ser Trp Asp Val Val Glu Asn Arg
115 120 125
Leu Thr Gln Gln Leu Val Leu Ala Ala Tyr Leu Gly Thr Gly Met Gly
130 135 140
Phe Ala Val Trp Met Asn Gly Ala Pro Trp Thr Gly Ala His Gly Val
145 150 155 160
Ala Gly Glu Leu Gly His Ile Pro Leu Gly Asp Met Thr Gln His Cys
165 170 175
Ala Cys Gly Asn Pro Gly Cys Leu Glu Thr Asn Cys Ser Gly Met Ala
180 185 190
Leu Arg Arg Trp Tyr Glu Gln Gln Pro Arg Asn Tyr Pro Leu Arg Asp
195 200 205
Leu Phe Val His Ala Glu Asn Ala Pro Phe Val Gln Ser Leu Leu Glu
210 215 220
Asn Ala Ala Arg Ala Ile Ala Thr Ser Ile Asn Leu Phe Asp Pro Asp
225 230 235 240
Ala Val Ile Leu Gly Gly Gly Val Met Asp Met Pro Ala Phe Pro Arg
245 250 255
Glu Thr Leu Val Ala Met Thr Gln Lys Tyr Leu Arg Arg Pro Leu Pro
260 265 270
His Gln Val Val Arg Phe Ile Ala Ala Ser Ser Ser Asp Phe Asn Gly
275 280 285
Ala Gln Gly Ala Ala Ile Leu Ala His Gln Arg Phe Leu Pro Gln Phe
290 295 300
Cys Ala Lys Ala Pro
305
<210> 26
<211> 309
<212> PRT
<213> escherichia coli
<400> 26
Met Gln Lys Gln His Asn Val Val Ala Gly Val Asp Met Gly Ala Thr
1 5 10 15
His Ile Arg Phe Cys Leu Arg Thr Ala Glu Gly Glu Thr Leu His Cys
20 25 30
Glu Lys Lys Arg Thr Ala Glu Val Ile Ala Pro Gly Leu Val Ser Gly
35 40 45
Ile Gly Glu Met Ile Asp Glu Gln Leu Arg Arg Phe Asn Ala Arg Cys
50 55 60
His Gly Leu Val Met Gly Phe Pro Ala Leu Val Ser Lys Asp Lys Arg
65 70 75 80
Thr Ile Ile Ser Thr Pro Asn Leu Pro Leu Thr Ala Ala Asp Leu Tyr
85 90 95
Asp Leu Ala Asp Lys Leu Glu Asn Thr Leu Asn Cys Pro Val Glu Phe
100 105 110
Ser Arg Asp Val Asn Leu Gln Leu Ser Trp Asp Val Val Glu Asn Arg
115 120 125
Leu Thr Gln Gln Leu Val Leu Ala Ala Tyr Leu Gly Thr Gly Met Gly
130 135 140
Phe Ala Val Trp Met Asn Gly Ala Pro Trp Thr Gly Ala His Gly Val
145 150 155 160
Ala Gly Glu Leu Gly His Ile Pro Leu Gly Asp Met Thr Gln His Cys
165 170 175
Ala Cys Gly Asn Pro Gly Cys Leu Glu Thr Asn Cys Ser Gly Met Ala
180 185 190
Leu Arg Arg Trp Tyr Glu Gln Gln Pro Arg Asn Tyr Pro Leu Arg Asp
195 200 205
Leu Phe Val His Ala Glu Asn Ala Pro Phe Val Gln Ser Leu Leu Glu
210 215 220
Asn Ala Ala Arg Ala Ile Ala Thr Ser Ile Asn Leu Phe Asp Pro Asp
225 230 235 240
Ala Val Ile Leu Gly Gly Gly Val Met Asp Met Pro Ala Phe Pro Arg
245 250 255
Glu Thr Leu Val Ala Met Thr Gln Lys Tyr Leu Arg Arg Pro Leu Pro
260 265 270
His Gln Val Val Arg Phe Ile Ala Ala Ser Ser Ser Asp Phe Asn Gly
275 280 285
Ala Gln Gly Ala Ala Ile Leu Ala His Gln Arg Phe Leu Pro Gln Phe
290 295 300
Cys Ala Lys Ala Pro
305
<210> 27
<211> 2067
<212> DNA
<213> corynebacterium
<400> 27
atgaatagcg taaataattc ctcgcttgtc cggctggatg tcgatttcgg cgactccacc 60
acggatgtca tcaacaacct tgccactgtt attttcgacg ctggccgagc ttcctccgcc 120
gacgcccttg ccaaagacgc gctggatcgt gaagcaaagt ccggcaccgg cgttcctggt 180
caagttgcta tcccccactg ccgttccgaa gccgtatctg tccctacctt gggctttgct 240
cgcctgagca agggtgtgga cttcagcgga cctgatggcg atgccaactt ggtgttcctc 300
attgcagcac ctgctggcgg cggcaaagag cacctgaaga tcctgtccaa gcttgctcgc 360
tccttggtga agaaggattt catcaaggct ctgcaggaag ccaccaccga gcaggaaatc 420
gtcgacgttg tcgatgccgt gctcaaccca gcaccaaaaa ccaccgagcc agctgcagct 480
ccggctgcgg cggcggttgc tgagagtggg gcggcgtcga caagcgttac tcgtatcgtg 540
gcaatcaccg catgcccaac cggtatcgca cacacctaca tggctgcgga ttccctgacg 600
caaaacgcgg aaggccgcga tgatgtggaa ctcgttgtgg agactcaggg ctcttccgct 660
gtcaccccag tcgatccgaa gatcatcgaa gctgccgacg ccgtcatctt cgccaccgac 720
gtgggagtta aagaccgcga gcgtttcgct ggcaagccag tcattgaatc cggcgtcaag 780
cgcgcgatca atgagccagc caagatgatc gacgaggcca tcgcagcctc caagaaccca 840
aacgcccgca aggtttccgg ttccggtgtc gcggcatctg ctgaaaccac cggcgagaag 900
ctcggctggg gcaagcgcat ccagcaggca gtcatgaccg gcgtgtccta catggttcca 960
ttcgtagctg ccggcggcct cctgttggct ctcggcttcg cattcggtgg atacgacatg 1020
gcgaacggct ggcaagcaat cgccacccag ttctctctga ccaacctgcc aggcaacacc 1080
gtcgatgttg acggcgtggc catgaccttc gagcgttcag gcttcctgtt gtacttcggc 1140
gcagtcctgt tcgccaccgg ccaagcagcc atgggcttca tcgtggcagc cctgtctggc 1200
tacaccgcat acgcacttgc tggacgccca ggcatcgcgc cgggcttcgt cggtggcgcc 1260
atctccgtca ccatcggcgc tggcttcatt ggtggtctgg ttaccggtat cttggctggt 1320
ctcattgccc tgtggattgg ctcctggaag gtgccacgcg tggtgcagtc actgatgcct 1380
gtggtcatca tcccgctact tacctcagtg gttgttggtc tcgtcatgta cctcctgctg 1440
ggtcgcccac tcgcatccat catgactggt ttgcaggact ggctatcgtc aatgtccgga 1500
agctccgcca tcttgctggg tatcatcttg ggcctcatga tgtgtttcga cctcggcgga 1560
ccagtaaaca aggcagccta cctctttggt accgcaggcc tgtctaccgg cgaccaagct 1620
tccatggaaa tcatggccgc gatcatggca gctggcatgg tcccaccaat cgcgttgtcc 1680
attgctaccc tgctgcgcaa gaagctgttc accccagcag agcaagaaaa cggcaagtct 1740
tcctggctgc ttggcctggc attcgtctcc gaaggtgcca tcccattcgc cgcagctgac 1800
ccattccgtg tgatcccagc aatgatggct ggcggtgcaa ccactggtgc aatctccatg 1860
gcactgggcg tcggctctcg ggctccacac ggcggtatct tcgtggtctg ggcaatcgaa 1920
ccatggtggg gctggctcat cgcacttgca gcaggcacca tcgtgtccac catcgttgtc 1980
atcgcactga agcagttctg gccaaacaag gccgtcgctg cagaagtcgc gaagcaagaa 2040
gcacaacaag cagctgtaaa cgcataa 2067
<210> 28
<211> 688
<212> PRT
<213> corynebacterium
<400> 28
Met Asn Ser Val Asn Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe
1 5 10 15
Gly Asp Ser Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe
20 25 30
Asp Ala Gly Arg Ala Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu
35 40 45
Asp Arg Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile
50 55 60
Pro His Cys Arg Ser Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala
65 70 75 80
Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn
85 90 95
Leu Val Phe Leu Ile Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu
100 105 110
Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile
115 120 125
Lys Ala Leu Gln Glu Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val
130 135 140
Asp Ala Val Leu Asn Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ala Ala Ala Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val
165 170 175
Thr Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr
180 185 190
Tyr Met Ala Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp
195 200 205
Val Glu Leu Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val
210 215 220
Asp Pro Lys Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp
225 230 235 240
Val Gly Val Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu
245 250 255
Ser Gly Val Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu
260 265 270
Ala Ile Ala Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser
275 280 285
Gly Val Ala Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly
290 295 300
Lys Arg Ile Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro
305 310 315 320
Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly
325 330 335
Gly Tyr Asp Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser
340 345 350
Leu Thr Asn Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met
355 360 365
Thr Phe Glu Arg Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe
370 375 380
Ala Thr Gly Gln Ala Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe
405 410 415
Val Gly Gly Ala Ile Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly
420 425 430
Leu Val Thr Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser
435 440 445
Trp Lys Val Pro Arg Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile
450 455 460
Pro Leu Leu Thr Ser Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu
465 470 475 480
Gly Arg Pro Leu Ala Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser
485 490 495
Ser Met Ser Gly Ser Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu
500 505 510
Met Met Cys Phe Asp Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu
515 520 525
Phe Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile
530 535 540
Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser
545 550 555 560
Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu
565 570 575
Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly
580 585 590
Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met
595 600 605
Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val
610 615 620
Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu
625 630 635 640
Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser
645 650 655
Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val
660 665 670
Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala
675 680 685
<210> 29
<211> 1512
<212> DNA
<213> corynebacterium
<400> 29
atgaacaccc cactccagct caacactgaa aacctgcagg aaatcgcttc gacttccgga 60
gtgcagatcc cagcgttcaa ccgcgctgac gtcgccccgg gcattgtcca cttcggtgtt 120
ggcggattcc atcgcgctca ccaagcgatg tacctcaatg aattgatgaa tgagggcaag 180
gccttggatt ggggcatcat cggcatgggt gtcatgcctt ccgatgtgcg catgcgcgat 240
gccctggcca gccaagatca cctttatacc ctgaccacta aagctcctga tggaactctt 300
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gccgttgcaa ccctcgcgca ggactccatc cgcattgttt ccctcacggt gactgaaggc 420
ggatacaaca tcgatccggc gacagaagat ttcgaccaca ccaaccctcg aatcgttgct 480
gaccgcgaag ccctgcaggc gggcgatact tccactttgc agaccttctt tgggttgatc 540
actgccgcat tgatttcccg aaaagaatca ggatctacgc catttaccat catgagctgc 600
gataacatcc aaggcaacgg cgatctggct aagcgtttct tcctcgcctt cgcacattcc 660
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acccagggcc gccccgcgta cgaggaggtt ggcgtgcagg tcgtctccga cgtggagcct 900
tatgaattaa tgaagctgcg cctgctcaac gcctcccacc agggactttg ctacttcggc 960
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ctcctggctt acatggagcg cgaagccacc cctaccctca aggaacttcc aggtgtcgat 1080
ctagatgctt atcgacgcca actcatcgcg cgattcggca acgccgcagt caaagacacc 1140
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acactgtcct cccttcatga ccgtggcgcg gaagcaacca tcgatgcact tcttacgcag 1500
gtaactgtct aa 1512
<210> 30
<211> 503
<212> PRT
<213> corynebacterium
<400> 30
Met Asn Thr Pro Leu Gln Leu Asn Thr Glu Asn Leu Gln Glu Ile Ala
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Val Gln Ile Pro Ala Phe Asn Arg Ala Asp Val Ala
20 25 30
Pro Gly Ile Val His Phe Gly Val Gly Gly Phe His Arg Ala His Gln
35 40 45
Ala Met Tyr Leu Asn Glu Leu Met Asn Glu Gly Lys Ala Leu Asp Trp
50 55 60
Gly Ile Ile Gly Met Gly Val Met Pro Ser Asp Val Arg Met Arg Asp
65 70 75 80
Ala Leu Ala Ser Gln Asp His Leu Tyr Thr Leu Thr Thr Lys Ala Pro
85 90 95
Asp Gly Thr Leu Asp Gln Lys Ile Ile Gly Ser Ile Ile Asp Tyr Val
100 105 110
Phe Ala Pro Glu Asp Pro Ala Arg Ala Val Ala Thr Leu Ala Gln Asp
115 120 125
Ser Ile Arg Ile Val Ser Leu Thr Val Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Ile
130 135 140
Asp Pro Ala Thr Glu Asp Phe Asp His Thr Asn Pro Arg Ile Val Ala
145 150 155 160
Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ser Thr Leu Gln Thr Phe
165 170 175
Phe Gly Leu Ile Thr Ala Ala Leu Ile Ser Arg Lys Glu Ser Gly Ser
180 185 190
Thr Pro Phe Thr Ile Met Ser Cys Asp Asn Ile Gln Gly Asn Gly Asp
195 200 205
Leu Ala Lys Arg Phe Phe Leu Ala Phe Ala His Ser Val Ser Ser Glu
210 215 220
Leu Gly Glu Trp Val Glu Asn Asn Val Ala Phe Pro Asn Ser Met Val
225 230 235 240
Asp Arg Ile Thr Pro Glu Thr Thr Asp Gly Asp Arg Asp Asp Ile Lys
245 250 255
Glu Ile Gly Tyr Ile Asp Ala Trp Pro Val Val Ser Glu Asp Phe Thr
260 265 270
Gln Trp Val Leu Glu Asp Ala Phe Thr Gln Gly Arg Pro Ala Tyr Glu
275 280 285
Glu Val Gly Val Gln Val Val Ser Asp Val Glu Pro Tyr Glu Leu Met
290 295 300
Lys Leu Arg Leu Leu Asn Ala Ser His Gln Gly Leu Cys Tyr Phe Gly
305 310 315 320
His Leu Ala Gly His His Met Val His Asp Val Met Ala Asp Thr Arg
325 330 335
Phe Gln Asp Phe Leu Leu Ala Tyr Met Glu Arg Glu Ala Thr Pro Thr
340 345 350
Leu Lys Glu Leu Pro Gly Val Asp Leu Asp Ala Tyr Arg Arg Gln Leu
355 360 365
Ile Ala Arg Phe Gly Asn Ala Ala Val Lys Asp Thr Val Pro Arg Leu
370 375 380
Cys Ala Glu Ser Ser Asp Arg Ile Pro Lys Trp Leu Leu Pro Val Val
385 390 395 400
Arg Glu Asn Leu Ala Ala Gly Arg Asp Val Thr Leu Ser Ala Ala Ile
405 410 415
Val Ala Ser Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Asp Glu Gln Gly Asn
420 425 430
Pro Ile Lys Ile Val Asp Arg Leu Ser Glu Arg Val Gln Glu Asn Ala
435 440 445
Ser Gly Asn Arg Thr Asp Ile Leu Ser Phe Ile Arg Asp Arg Gly Ile
450 455 460
Phe Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Pro Phe Thr Lys Ala Tyr Ser Glu
465 470 475 480
Thr Leu Ser Ser Leu His Asp Arg Gly Ala Glu Ala Thr Ile Asp Ala
485 490 495
Leu Leu Thr Gln Val Thr Val
500
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
gcaggtacca ggaggtaata aatatgaaac acggcatcta ttattcttac tgg 53
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
gctggatcct tagccaccaa gaacgaagcg gg 32
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
ccacggaact ttcggctgtt ttg 23
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
cttccgtagg tgccacaata tc 22
<210> 35
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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cgaggatcca ggaggtaata atatgaaaaa taaattcgga gttg 44
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
gtctagatta tatctcagca gcgatggc 28
<210> 37
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
cggtaccagg aggtaataat atgaaatatg gtatttattt tgcttattgg acg 53
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
ctctagatta gataccaaac acatgcctgc ag 32
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 39
cggactatct gaacgaactg acgg 24
<210> 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 40
ctccataagc atcctcctca tcc 23
<210> 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 41
cgaggatcca ggaggtaata atatgaaaca tggtatctat tatgc 45
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 42
gtctagatta cttccactcc agcatat 27
Claims (14)
- 기질인 과당과 그 에피머라제를 미생물 내에서 40℃ 이상의 온도로 반응시키는 단계를 포함하고,
상기 미생물은 서열번호 1의 아그로박테리움 튜메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 32번째 아미노산이 류신으로 치환되거나, 196번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 클로스트리디움 볼테애(Clostridium bolteae) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 8의 클로스트리디움 힐레모내(Clostridium hylemonae) 유래 사이코스-3-에피머라제를 코딩하는 유전자로 형질 전환된 코리네박테리움 속이며,
상기 과당은 무기염과 과당만 포함된 배지로부터 제공되는 것인, 사이코스의 생산 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 상기 에피머라제를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것인, 사이코스의 생산 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 반응 이전에, 상기 미생물을 상기 과당이 포함되지 않은 배지에서 배양하여 상기 미생물이 휴면 세포를 갖도록 유도하는 단계를 더 포함하는, 사이코스의 생산 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 반응 이후에, 상기 미생물을 회수하여 과당의 사이코스로의 전환에 재사용하는 단계를 더 포함하는, 사이코스의 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 무기염은 망간염 또는 코발트염인, 사이코스의 생산 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 반응 온도는 40℃ 내지 90℃인, 사이코스의 생산 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 사이코스의 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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2014
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