KR20100053294A - 신규 ｌ-아라비노스 이성화효소 및 이를 이용한 ｌ-리불로스의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아라비노스 이성화효소 활성을 갖는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 균주로부터 유래한 신규 L-아라비노스 이성화효소의 유전자로부터 발현되는 L-아라비노스 이성화효소, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질 전환된 균주로부터 L-아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용한 L-리불로스의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 L-아라비노스 이성화효소는 현재까지 보고된 해당 효소 중 가장 높은 기질 전환속도를 나타내었으며, 특이적으로 L-아라비노스만을 전환시키며, 넓은 pH 영역에서도 안정적으로 효소반응을 촉매 할 수 있다. 바실러스 리체니포미스 유래 L-아라비노스 이성화효소 및 이를 이용한 L-리불로스의 생산방법은 L-리불로스의 대량 생산에 효율적으로 사용될 수 있다.

L-리불로스, 바실러스 리체니포미스, 아라비노스 이성화효소, 기질특이성

Description

신규 Ｌ-아라비노스 이성화효소 및 이를 이용한 Ｌ-리불로스의 생산방법 {A novel L-arabinose isomerase and L-ribulose production using the said enzyme}

본 발명은 신규 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 L-리불로스의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 내열성을 나타내는 아라비노스 이성화효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 아라비노스 이성화효소를 이용한 L-리불로스의 제조방법에 관한 것이다.

최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 특히, 몇 가지의 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-리보오스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 중요한 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때, 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사 용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-리보오스가 항바이러스제 및 항암제 등 의약품의 기본이 되는 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목이 집중되고 있어 L-리보오스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다.

상기와 같은 중요성 및 유용성에도 불구하고, D-리보오스와 달리 L-리보오스는 자연계에 소량 존재할 뿐만 아니라, L-리보오스를 생산할 수 있는 방법이 알려져 있으나 상대적으로 높은 비용($1,000/kg)이 소요된다. 따라서, 저비용으로 상업적으로 L-리보오스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

L-아라비노스, D-글루코스, L-자일로즈, D-갈락토스 및 D-리보오스를 L-리보오스 유도체로 전환하는 몇몇 화학적 방법이 보고되어 있다 (Matteson, D. S. and Peterson, M. L. (1987) J.Org. Chem., 52(23), 5116-5121; Yamaguchi, M. and Mukaiyama, T. (1981) Chem. Lett., 7, 1005-1008). 그러나 이런 방법들은 낮은 수율, 고가의 출발물질에 대한 요구성, 많은 반응 단계 및 대량 합성의 어려움 등 단점을 가지고 있다. 또한, 상기의 방법들은 일련의 화학반응으로서, 장시간을 요구하며, 상대적으로 고비용의 화학물질을 필요로 하고 불필요한 부산물이 생성되며, 많은 노동력을 필요로 한다. 따라서, 미생물 및 그의 효소를 사용하여 L-리불로스로부터 L-리보오스를 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있으며 (Shimonishi, T., Izumori, K., J. (1996) J. Ferment. Bioeng. 81, 493-497), 이와 같이 생촉매를 사용하여 L-리보오스를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

본 발명에서는 L-아라비노스로부터 L-리불로스를 생산할 수 있는 아라비노스 이성화효소 및 그와 같은 효소를 이용하여 L-리불로스를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시함으로써, L-리불로스를 높은 수율로 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 바실러스 리체니포미스로부터 유래된 아라비노스 이성화효소의 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 아라비노스 이성화효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 아리비노스의 이성화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 아라비노스 이성화효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 L-아라비노스로부터 L-리불로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또 는 그 기능적 단편을 가지는 아라비노스 이성화효소를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 아라비노스 이성화효소는 바실러스 리체니포미스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서 상기 아라비노스 이성화효소는 L-아라비노스에 특이적인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 53 kDa인 것을 특징으로 하며, 상기 효소의 최적 효소반응 pH는 5.0∼9.0이고, 최적 반응온도가 40∼60℃인 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 상기 효소는 Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 아라비노스 이성화효소 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 3에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 아라비노스 이성화효소를 이용하여 L-아라비노스로부터 L-리불로스를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소는 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 4의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 아라비노스 이성화효소 활성이 손상되지 않는 범

위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 아라비노스 이성화효소도 본 발명에 관한 아라비노스 이성화효소에 포함된다.

또, 본 발명에는 서열번호 4의 아미노산서열을 가진 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 아라비노스 이성화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 3으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 3의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 변이 아라비노스 이성화효소 유전자도 본 발명에 관한 아라비노스 이성화효소 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는, 상기 아라비노스 이성화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 아라비노스 이성화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 아라비노스 이성화효소의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소 유전자는 바실러스 리체니포미스의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 아라비노스 이성화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색 체 DNA를 취득한다. 염색체 DNA의 분리방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

예를 들면, 바실러스 리체니포미스 균주를 LB배지, 또는 M9배지에 적당한 탄소원을 첨가한 것 등에서 배양한 후, 예를 들면, 마머(Marmer)등의 방법(Journal of Molecular Biology, 3권, 208페이지, 1961년) 등에 의해 염색체 DNA를 조제한다. 이 방법에 의해 얻게 된 염색체 DNA를 적당한 제한효소(예를 들면 Sau3AI 등)를 사용해서 분해하고, 적당한 단편길이를 가진 분해물에 대해서, 이들을 연결가능한 제한효소(예를 들면 BamHI 등)로 절단한 벡터에 연결하여, 유전자 라이브러리를 제작한다. 여기서의 적당한 단편길이란, 통상의 플라스미드벡터를 사용할 때는 4000∼25000염기쌍 정도, 코스미드 또는 파지(phage)벡터를 사용할 때는 15000∼30000의 염기쌍정도이다. 적당한 길이의 DNA단편을 분리하여 취하는 방법으로서는, 자당밀도구배를 사용하는 방법이나 아가로즈겔을 사용하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판(1982년)) 등 공지의 방법을 사용하면 된다.

벡터는, 숙주미생물에 있어서 자율적으로 증식할 수 있는 파지벡터 또는 플라스미드벡터가 사용된다. 파지벡터 또는 코스미드벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A,

Charon21A 등을 들 수 있고, 플라스미드벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계 등을 들 수 있다. 그 외에, 대장균이나 슈도모나스속 등의 복수의 숙주미생물에서 자율적 증식이 가능한 벡터 등의 각종

셔틀벡터를 사용할 수도 있다. 이와 같은 벡터에 대해서도 상기와 마찬가지로 적당한 제한효소에 의해 절단함으로써 원하는 단편을 얻을 수 있다.

염색체 DNA단편과 벡터단편과의 연결은 DNA리가제를 사용하면 되고, 예를 들면 라이게이션 키트(타카라(주) 제품 등)를 사용해서 행할 수 있다. 이와 같이 해서 염색체 DNA단편과 벡터단편을 연결시켜, 여러 가지의 DNA단편을 함유하는 재조합 플라스미드의 혼합물(이하, "유전자 라이브러리"라 기재)을 제작한다. 여기서 유전자 라이브러리제작에 있어서는 적당한 길이의 염색체 DNA단편을 사용하는 방법 외에, 바실러스 리체니포미스 균주로부터 mRNA를 추출정제하여, 역전사효소를 이용해서 cDNA단편을 합성하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년)을 이용할 수도 있다. 또, 유전자 라이브러리를 대장균에 한번 형질전환 또는 형질도입한 후, 유전자 라이브러리를 대량으로 증폭하는 것도 가능하다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년).

숙주미생물에의 재조합벡터의 도입은, 공지의 방법에 의해 행한다. 예를 들면, 숙주미생물이 대장균인 경우, 염화칼슘법(Journal of Molecular Biology, 53권, 159페이지, 1970년), 염화루비듐법(Methods in Enzymology, 68권, 253페이지,

1979년)이나 일렉트로포레이션법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 184페이지, 1994년) 등을 이용할 수 있다. 또, 코스미드벡터나 파지벡터를 이용하는 경우의 형질도입에 대해서는 인비트로 패키징법(Current Protocols in

Molecular Biology, 1권, 571페이지, 1994년) 등을 사용할 수 있다. 그 외에, 접합전달에 의한 방법도 이용가능하다.

다음에, 바실러스 리체니포미스 균주의 아라비노스 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브를 조제한다. 아라비노스 이성화효소 유전자의 염기서열은 서열번호 3에 기재된 것과 같은 염기서열로부터 올리고뉴클레오타이드를 설계한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 아마샴-파머시아 바이오테크의 커스텀 합성 서비스 등을 이용해서 합성이 가능하다.

다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 바실러스 리체니포미스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(이하, "PCR"이라 기재)을 행하여, 아라비노스 이성화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR증폭단편은 바실러스 리체니포미스 균주의 아라비노스 이성화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이한 것으로 하는 것이 가능하다. 상기의 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하

이브리디제이션을 행하여, 아라비노스 이성화효소 유전자를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 아라비노스 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 상기 DNA단편의 염기서열의 결정은 예를 들면 생거법(Sanger's sequencing method)(Molecular Cloning, 2권, 133페이지,1989년) 등에 의해서 행하는 것이 가능하고, 염기서열 자동분석장치, 예를 들면 DNA시퀀서 377A(퍼킨 엘머) 등을 사용

해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다.

또한, 상기 방법에 의해 전체 염기서열을 결정한 후에는, 화학합성법, 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법, 또는 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해 등의 임의의 방법에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이

즈함으로써, 본 발명의 유전자를 얻는 것이 가능하다.

서열번호 3에는 본 발명의 아라비노스 이성화효소 유전자의 염기서열은 서열번호 4에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 아라비노스 이성화효소 활성을 가지는 한 몇 가지의 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또 본 발명의 유전자는 서열번호 4로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중코돈에 있어서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주로서는, 에셰리키아( Esherichia)속, 슈도모나스( Pseudomonas)속, 랄스토니아

( Ralstonia)속, 알칼리게네스( Alcaligenes)속, 코마모나스( Comamonas)속, 버크홀데리아( Burkholderia)속, 아그로박테리움( Agrobacterium)속, 플라보박테리움( Flabobacterium)속, 비브리오( Vibrio)속, 엔테로박터( Enterobacter)속, 리조

비움( Rhizobium)속, 글루코노박터( Gluconobacter)속,아시네토박터 (Acinetobacter)속, 모라셀라( Moraxella)속, 니트로조모나스( Nitrosomonas)속, 아에로모나스( Aeromonas)속, 파라코커스( Paracoccus)속, 바실루스( Bacillus)속, 클로스트리디움( Clostridium)속, 락토바실루스( Lactobacillus)속, 코리네박테리움( Corynebacterium)속, 아르트로박터( Arthrobacter)속, 아크로모박터( Achromobacter)속, 미크로코커스( Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)

속, 스트렙토코커스( Streptococcus)속, 스트렙토마이세스( Streptomyces)속, 악티노마이세스( Actinomyces)속, 노카르디아( Nocardia)속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스( Saccharomyces)속, 칸디다( Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.

예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제가능한 동시에, 프로모터, 아라비노스 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pQE80L를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

프로모터는 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는 예를 들면 GAL 프로모터, AOD 프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서

는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명에 관한 아라비노스 이성화효소의 제조는 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 아라비노스 이성화효소를 생성축적시켜, 배양물로부터 아라비노스 이성화효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 아라비노스 이성화효소를 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

아라비노스 이성화효소의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행 할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 아라비노스 이성화효소의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 아라비노스 이성화효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자는 높은 수율로 L-리불로스를 제조할 수 있는 효소를 개발하고자 바실러스 리체니포미스로부터 L-아라비노스 이성화효소의 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 L-아라비노스로부터 높은 수율로 L-리불로스를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 부산물의 생성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 산업적으로 유용한 호열성 또는 내열성 L-아라비노스 이성화 효소를 제조하기 위하여 바실러스 리체니포미스의 유전자로부터 L-아라비노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다.

본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 L-아라비노스를 기질로 하여 이성화반응을 촉매하여 L-리불로스를 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 입체이성질체에 대한 특이성을 갖고 L-아라비노스를 L-리불로스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 L-아라비노스 이성화효소를 의미한다.

본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 다음의 특징을 갖는다: (ⅰ) 최적 온 도가 40-60℃; (ⅱ) 최적 pH가 5.0-9.0; (ⅲ) 분자량이 약 53kDa; (ⅳ) Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성의 증가; 그리고 (ⅴ) Cu²⁺, Fe²⁺ 또는 Hg²⁺ 존재 시 활성의 감소

바람직하게는, 본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 최적 온도가 45-55℃, 최적 pH가 7.0-8.0이고, 보다 바람직하게는 최적 온도가 50℃이고, 최적 pH가 약 7.5이다.

본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 1mM Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성이 각각 497%, 443% 증가하며, 1mM Hg²⁺ 존재 시 활성을 완전히 상실한다. 본 발명에서 얻어진 바실러스 리체니포미스 유래 L-아라비노스 이성화효소의 K_m 값은 약 369mM, k _cat 값은 약 12,455min^-1, k _cat/K_m 값은 34min^-1mM^-1이다.

기존에 알려진 L-아라비노스 이성화효소는 L-아라비노스 이외에도 다른 알도스 및 케토스, 즉 D-알로오스(allose)가 D-싸이코스(psicose)로, D-갈락토스(galactose)가 D-타가토스(tagatose)로, D-자일로스(xylose)가 D-자일룰로스(xylulose)로, L-푸코스(fucose)가 L-푸쿨로스(fuculose)로 변환되는 것을 촉매한다. 그러나 본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 L-아라비노스만을 특이적으로 L-리불로스로 전환시킨다. 따라서 L-아라비노스에만 특이적인 활성을 나타내는 본 발명의 효소는 매우 특이하다 할 것이며, 당 혼합물로부터 L-리불로스의 생산에 유용하게 적용될 것이다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소에 의해 생산된 L-리불로스는 L-리보오스 합성의 중간체이고, L-리보오스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 중요한 핵심 오탄당이다. 여기서 유도된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. 따라서 L-아라비노스로부터 L-리불로스의 전환은 L-리보오스의 생산을 위한 기본 단계로서 중요하게 작용할 것이다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: L-아라비노스 이성화효소의 유전자 클로닝

바실러스 리체니포미스(ATCC 14580)을 대한민국 한국생명공학연구원으로 부터 수득어서 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 바실러스 리체니포미스 이성화효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 BLAI F-5'GCA TGG ATC CAT GTT AAC AAC AGG GAA AAA AG -3'(서열번호 1)와 BLAI R-5'GGC CCC GGG TTA CTT AAT CAC TAC ATA TTC C -3'(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 바실러스 리체니포미스에서 증폭된 L-아라비노스 이성화효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다(서열번호 3).

실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조

실시예 1에 따른 L-아라비노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 내열성 L-아라비노스 이성화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pQE80L(Qiagen, 미국)의 BamHⅠ과 SmaⅠ 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 1).

실시예 3: 재조합 L-아라비노스 이성화효소의 발현 및 순수 분리

상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 2).

상기 실시예3의 방법으로 발현시킨 재조합 L-아라비노스 이성화효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리 하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 이어, 상기 상등액을 70℃에서 15분간 열처리하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA 컬럼 (Qiagen, USA)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 재조합 L-아라비노스 이성화효소를 순수 분리하였다 (도 2).

실시예 4: L-아라비노스 이성화효소의 특성 실험

상기 실시예 4에서 분리된 L-아라비노스 이성화효소의 물리 화학적 특성을 조사하였으며, 기질로서 L-아라비노스를 사용하였다.

실시예 4-1: 열안정성 및 최적 온도

L-아라비노스 이성화효소의 이성화 활성에 대한 열안정성을 측정하기 위하여, 효소를 20mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.5)에서 0-2 시간 동안 40, 50, 60, 70 또는 80℃에서 1mM Mn²⁺ 존재 또는 부재 하에서 반응시키면서, 일정간격으로 시료를 채취하여 잔존 활성을 측정하였다. 효소의 잔존 활성은 시료를 채취하여 시스테인-카바졸-황산 분석법으로 측정하였다. 바실러스 리체니포미스로부터 얻어진 본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 50℃에서 Mn²⁺의 존재 하에 5시간 이상 50% 이상의 활성을 보이는 안정성을 나타내었다. 50 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.5)에서 60℃까지 안정하였으나 Mn²⁺ 이온이 존재하지 않는 경우 활성이 나타나지 않았다. 한편, 본 발명의 L-아라비노스 이성화효소는 50℃에서 최적온도가 형성되었다 (도 3a).

실시예 4-2: 최적 pH

최적 pH의 측정은 50℃에서 다음의 완충액 (20mM)을 사용하여 실시하였다: 소듐 아세테이트/아세트산 완충액 (pH 4.0-6.0), 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 6.0-8.0) 및 Tris-HCl 완충액 (pH 8.0-10.0). 시료를 채취하여 실시예 2의 방법으로 효소 활성을 측정하였다. 도3에서 확인할 수 있듯이, L-아라비노스 이성화효소의 최적 pH는 50 ℃에서 7.5이었으며, 최고 수준 활성의 50% 이상이 pH 5.0~10.0에서 유지되었다 (도3 b).

실시예 4-3: 금속이온의 효과

순수 정제된 효소에 최종농도 10mM의 EDTA를 처리하여 24시간 이상 방치 후에 20mM 포스페이트 완충액으로 투석한 후 본 실험을 위한 효소 용액으로 사용하였다. 최종농도 1mM의 MgCl₂, MnCl₂, CoCl₂, ZnCl₂, CaCl₂, FeSO₄, CuSO₄, KCl, HgCl₂, 또는 BaCl₂와 함께 5분 동안 20 mM 포스페이트 완충액에서 효소를 전 배양한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 1mM 농도에서 다양한 금속의 L-아라비노스 이성화효소 활성에 대한 영향은 표 1에 나타내었다. Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 첨가는 대조군에 대하여 각각 497% 및 443% 활성을 증가시켰으나, 1mM의 Hg²⁺, Fe²⁺ 또는 Cu²⁺ 존재 시 활성이 0-82%로 감소하였다.

금속이온 1 mM	상대적 활성(%)	비활성 (U/ mg-1-단백질)
None	100	21
MgCl2	240	51
MnCl2	497	105
CoCl2	443	95
ZnCl2	307	75
CaCl2	106	25
FeSO4	79	17
CuSO4	82	18
KCl	74	16
HgCl2	0	0
BaCl2	89	19

실시예 4-4: L-아라비노스 이성화효소의 동역학적 매개변수

다양한 농도의 L-아라비노스 (5∼1200mM)를 기질로 하여 50℃, pH 7.5 (20mM 포스페이트 완충액)에서 5분 동안 1mM Mn²⁺의 존재 하에서 효소를 반응시킨 후, 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측정하였다 (도 4). 바실러스 리체니포미스로부터 유래된 L-아라비노스 이성화효소의 L-아라비노스에 대한 K_m 값은 369mM, k _cat 값은 약 12,455min^-1, k _cat/K_m 값은 34min^-1mM^-1로 결정되었다. 이는 현재까지 보고된 해당 효소 중 가장 높은 L-아라비노스의 전환속도 및 촉매 활성에 해당한다.

실시예 5: 신규 L-아라비노스 이성화효소를 이용한 L-리불로스 생산방법

실시예 5-1: L-리불로스 생산을 위한 최적 온도

상기 실시예 3에서 순수 분리한 L-아라비노스 이성화효소를 이용하여 L-리불로스의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. L-아라비노스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 L-리불로스 생산방법에서, 온도를 변화시키면서 L-아라비노스와 L-리불로스의 비율을 확인하였다.

미생물 생산배지로는 LB를 사용하였고 효소 생산배지로는 글리세롤 10g L^-1, 펩톤 1g L^-1, 효모 추출물 30g L^-1, 이인산칼륨 0.14g L^-1, 일인산나트륨 1g L^-1로 구성된 배지를 사용하였다. 600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM ITPG를 첨가하여 효소 생산을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 유지하였다.

균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 1g L^-1의 기질 용액, 1mM Mn²⁺의 존재 하에서 25, 40, 55, 70, 75℃의 온도 하에서 효소와 기질을 반응시켰다. 표2에 나타난 바와 같이, 반응 온도를 55-75℃로 유지하였을 때 우수한 수율을 나타냈으며, 특히 70℃에서 L-리불로스의 생산이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 L-리불로스 생산 방법에서 L-아라비노스 이성화효소와 기질의 반응 시 최적 온도는 55-75℃ 사이임을 알 수 있다.

온도(℃)	L-아라비노스 : L-리불로스
25	88.8 : 11.2
40	84.1 : 15.9
55	80.0 : 19.0
70	78.0 : 22.0
75	78.7 : 21.3

실시예 5-2: L-리불로스 생산을 위한 최적 효소 농도

바실러스 리체니포미스 유래 신규 L-아라비노스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 L-리불로스 생산방법에서, L-아라비노스 이성화효소의 적정 효소 농도를 확인하였으며, 그 결과는 도 5(a)에 나타내었다.

도 5(a)에 나타난 바와 같이, L-리불로스 생산에서 L-아라비노스 이성화효소의 적정 효소 농도는 10 units ml^-1이었다.

실시예 5-3: L-리불로스 생산을 위한 최적 초기 기질 농도

L-아라비노스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 L-리불로스 생산방법에서, 초기 기질의 농도를 변화시키면서 L-리불로스의 생산량을 확인하였다. 균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 1mM Mn²⁺의 존재 하에서 기질인 L-아라비노스의 농도를 10-500g L^-1로 하여 L-리불로스 생성량을 측정하였다. 그 결과는 도 5(b)에 나타내었다.

도 5(b)에 나타난 바와 같이, L-리불로스 생산에서 기질인 L-아라비노스를 10g L^-1로 하였을 때, L-아라비노스에서 L-리불로스로의 변환 비율은 40%였고, 기질인 L-아라비노스를 500g L^-1로 하였을 때, L-아라비노스에서 L-리불로스로의 변환 비율은 36%였다. 따라서, 최종 농도를 고려하여 본 발명의 L-리불로스 생산 방법에서 초기 기질의 농도는 500g L^-1로 하였다.

실시예 5-4: 바실러스 리체니포미스 유래 신규 L-아라비노스 이성화효소를 이용한 최적 조건에서의 L-리불로스 생산

신규 L-아라비노스 이성화효소를 이용한 최대 L-리불로스 생산을 위하여 하기의 최적 조건에서 이성화 반응을 수행하였다. 500g L^-1의 기질 용액, L-아라비노스 이성화효소 10 units ml^-1, 75℃, 1mM Mn²⁺의 존재 하에서 L-리불로스의 생산실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 5(c)에 나타내었다.

도 5(c)에 나타난 바와 같이, L-리불로스의 생산성은 180g L^-1 h^-1, L-아라비노스로부터 L- 리불로스의 전환율은 38%, 생산농도는 191g L^-1 이었다. 이러한 수율 및 최종 농도는 L-아라비노스로부터 L-리불로스 생산에서 매우 우수한 수치이다. 따라서 본 발명의 L-리불로스 생산 방법은 기존의 방법에 비해 우수한 수율 및 고농도로 L-리불로스의 생산이 가능하도록 한다.

도 1은 바실러스 리체니포미스 균주로부터 유래된 L-아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.

도 2는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 유래된 L-아라비노스 이성화효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다.

도 3(a)는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 유래된 L-아라비노스 이성화효소의 pH에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이고, 도 3(b)는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 유래된 L-아라비노스 이성화효소의 온도에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 유래된 L-아라비노스 이성화효소의 L-아라비노스 기질 농도에 따른 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5(a)는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 얻은 조효소액을 이용하여 L-리불로스를 생산하는 방법에서의, L-아라비노스 이성화효소의 적정 효소 농도를 나타낸 도면이고, 도 5(b)는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 얻은 조효소액을 이용하여 L-리불로스를 합성한 결과를 나타낸 도면이며, 도 5(c)는 바실러스 리체니포미스 균주로부터 얻은 조효소액을 이용하여 L-리불로스의 생산량을 나타낸 도이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A novel L-arabinose isomerase and L-ribulose production using the said enzyme <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BLAI F <400> 1 gcatggatcc atgttaacaa cagggaaaaa ag 32 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BLAI R <400> 2 ggccccgggt tacttaatca ctacatattc c 31 <210> 3 <211> 1424 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis, L-arabinose isomerase <400> 3 atgttaacaa cagggaaaaa agaattttgg tttgtcgtag gttcacagca tctttatggg 60 gaagaaacgt tagcggaagt cagagcgcac gcgcaagcca tgaccgatgc attaaatgaa 120 agcgctgttt tgccatatcc gcttgtattg caagatttgg ctgttaatgc agataaaatc 180 actagcatca tgaaagaagt aaattatcgt gacgaagtcg ccggtgttat cacttggatg 240 catactttct cgcctgcgaa aatgtggatt cgcggaacaa aattattgca aaaaccatta 300 cttcatttag cgacacaatt taatgaaagt attccatggc caacgattga catggacttt 360 atgaacctca accaatctgc tcatggcgac cgtgaatacg gttttatcaa tgcccgtttg 420 aaaaaacaaa ataaagttgt cgtaggttat tgggagcgac ctgaagtgca acagcaaatt 480 gcagaatgga tggacgtagc ggttgcttat aacgaaagct tcaacatcaa ggtcgctcgg 540 tttggtgaca acatgcgtaa cgttgctgtt actgaagggg ataagattga agcgcaaatt 600 caatttggct ggacagttga ttactttggc atcggtgatc ttgttcaata cgtgaatgcg 660 gttacagatg aagagattaa tcgtttgttt gcagaatacg cagaccttta tgaatttgat 720 tatggcactt acagtcggga agattgggag aagagtgtaa aagtacaagc aagctatgaa 780 atcgctatta aacgtttcct tgatgatggt ggttacaatg ctttcacaac taactttgaa 840 gatttatatg gaatgaaaca gcttccgggt cttgccgtcc aacgtttgat ggcgcaagga 900 tatggctttg ccggtgaagg agattggaaa actgcagcgc tcgaccgctt gctcaaagtg 960 atgagccgta accaatcaac tggttttatg gaagattaca catatgaatt ggctgccggt 1020 caagaatcaa ttcttcaatc gcatatgctt gaagttgacc catctttagc aagcaataaa 1080 ccaaaaatta tcgtctctcc attaggtatt ggtgatcgtg aagacccggc acgcctagtg 1140 ttcgacggaa aagcaggaga tggcgtggtt gtttcaatgg cagactttgg tacgcactac 1200 aaattgttga ttaacgaagt ttctgcattt gaaccaactg ttccagcacc aaaccttcca 1260 gttgcacggg tgctttggga agtgaagcct aacttccaag atggagtgaa agcatggctt 1320 gagaatggcg gcggccacca tacagttgtt tcattgtttt taacaacaga ccaaatgata 1380 cttatgcaaa gctcgttgac ttggaatatg tagtgattaa gtaa 1424 <210> 4 <211> 474 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis L-arabinose isomerase <400> 4 Met Leu Thr Thr Gly Lys Lys Glu Phe Trp Phe Val Val Gly Ser Gln 1 5 10 15 His Leu Tyr Gly Glu Glu Thr Leu Ala Glu Val Arg Ala His Ala Gln 20 25 30 Ala Met Thr Asp Ala Leu Asn Glu Ser Ala Val Leu Pro Tyr Pro Leu 35 40 45 Val Leu Gln Asp Leu Ala Val Asn Ala Asp Lys Ile Thr Ser Ile Met 50 55 60 Lys Glu Val Asn Tyr Arg Asp Glu Val Ala Gly Val Ile Thr Trp Met 65 70 75 80 His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Arg Gly Thr Lys Leu Leu 85 90 95 Gln Lys Pro Leu Leu His Leu Ala Thr Gln Phe Asn Glu Ser Ile Pro 100 105 110 Trp Pro Thr Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His 115 120 125 Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Asn Ala Arg Leu Lys Lys Gln Asn 130 135 140 Lys Val Val Val Gly Tyr Trp Glu Arg Pro Glu Val Gln Gln Gln Ile 145 150 155 160 Ala Glu Trp Met Asp Val Ala Val Ala Tyr Asn Glu Ser Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Val Thr Glu 180 185 190 Gly Asp Lys Ile Glu Ala Gln Ile Gln Phe Gly Trp Thr Val Asp Tyr 195 200 205 Phe Gly Ile Gly Asp Leu Val Gln Tyr Val Asn Ala Val Thr Asp Glu 210 215 220 Glu Ile Asn Arg Leu Phe Ala Glu Tyr Ala Asp Leu Tyr Glu Phe Asp 225 230 235 240 Tyr Gly Thr Tyr Ser Arg Glu Asp Trp Glu Lys Ser Val Lys Val Gln 245 250 255 Ala Ser Tyr Glu Ile Ala Ile Lys Arg Phe Leu Asp Asp Gly Gly Tyr 260 265 270 Asn Ala Phe Thr Thr Asn Phe Glu Asp Leu Tyr Gly Met Lys Gln Leu 275 280 285 Pro Gly Leu Ala Val Gln Arg Leu Met Ala Gln Gly Tyr Gly Phe Ala 290 295 300 Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Leu Asp Arg Leu Leu Lys Val 305 310 315 320 Met Ser Arg Asn Gln Ser Thr Gly Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr Glu 325 330 335 Leu Ala Ala Gly Gln Glu Ser Ile Leu Gln Ser His Met Leu Glu Val 340 345 350 Asp Pro Ser Leu Ala Ser Asn Lys Pro Lys Ile Ile Val Ser Pro Leu 355 360 365 Gly Ile Gly Asp Arg Glu Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Lys 370 375 380 Ala Gly Asp Gly Val Val Val Ser Met Ala Asp Phe Gly Thr His Tyr 385 390 395 400 Lys Leu Leu Ile Asn Glu Val Ser Ala Phe Glu Pro Thr Val Pro Ala 405 410 415 Pro Asn Leu Pro Val Ala Arg Val Leu Trp Glu Val Lys Pro Asn Phe 420 425 430 Gln Asp Gly Val Lys Ala Trp Leu Glu Asn Gly Gly Gly His His Thr 435 440 445 Val Val Ser Leu Phe Leu Thr Thr Asp Gln Met Ile Thr Tyr Ala Lys 450 455 460 Leu Val Asp Leu Glu Tyr Val Val Ile Lys 465 470

Claims (11)

1. 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 아라비노스 이성화효소.
2. 제 1항에 있어서 상기 아라비노스 이성화효소는 바실러스 리체니포미스에서 유래한 것을 특징으로 하는 아라비노스 이성화효소.
3. 제 1항 또는 제2항에 있어서 상기 아라비노스 이성화효소는 L-아라비노스에 특이적인 것을 특징으로 하는 아라비노스 이성화효소.
4. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소의 분자량은 53 kDa인 것을 특징으로 하는 아라비노스 이성화효소.
5. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소의 최적 효소반응 pH는 5.0∼9.0이고, 최적 반응온도가 40∼60℃인 것을 특징으로 하는 아라비노스 이성화효소.
6. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소는 Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 아라비노스 이성화효소.
7. 제 1항 또는 제2항의 효소를 코딩하는 아라비노스 이성화효소 유전자.
8. 제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 아라비노스 이성화효소 유전자.
9. 제 7항의 아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 아라비노스 이성화효소 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법.
11. 제 1항의 아라비노스 이성화효소를 이용하여 L-아라비노스로부터 L-리불로스를 제조하는 방법.

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