KR101318422B1

KR101318422B1 - D-사이코스 에피머화 효소, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법

Info

Publication number: KR101318422B1
Application number: KR20130038592A
Authority: KR
Inventors: 김민정; 최정윤; 허진솔; 김혜정; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2013-10-15
Also published as: WO2014168302A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 제조용 조성물, 및 상기 효소를 이용한 사이코스 생산 방법에 관한 것이다.

Description

D-사이코스 에피머화 효소, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법{D-psicose epimerase and method for producing psicose using the same}

본 발명은 사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 제조용 조성물, 및 상기 효소에 의한 사이코스 생산 방법에 관한 것이다.

사이코스(psicose)는 과당(D-fructose)의 3번 탄소 에피머로, 과당과 비교할 때 감미의 강도(70%)와 종류에 있어서 유사한 수준이다. 그러나 사이코스는 과당과 달리 체내 흡수 시 거의 대사되지 않아서 다이어트용 저 칼로리 감미료로서 유용하다. 또한, 사이코스는 체내에서 혈당을 억제하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식 또는 수신용 음식품 등에 사용할 수 있으며, 간에서 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부비만을 감소시킬 수 있으므로 다양한 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.

이와 같은 이유로 사이코스는 다이어트 감미료로서 각광을 받고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 대량 생산하는 기술의 개발이 필요하다.

종래의 사이코스 제조 방법은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 방법이 대부분이었다. 그러나 이 방법은 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 과정 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 단점이 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 과당을 기질로 하는 효소적 방법에 의한 사이코스 생산 방법이 활발이 연구 되고 있다. 그러나 기존의 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 효소들이 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타내는 경우가 많은데, 알칼리 조건 하에서의 반응은 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않았다. 또한 기존의 효소들은 느린 반응 속도로 인해 사이코스 수율이 저조하여 제조원가가 상승된다는 문제가 있었다.

그러므로 사이코스의 생산 수율, 및 온도, pH 및 반응 속도 등의 반응 조건이 산업적으로 적용되기에 적합한 새로운 D-사이코스 3-에피머화 효소 개발이 요구된다.

본 발명의 일 예는 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 과당을 사이코스로 전환시키는 효소 활성을 가지는 단백질을 제공한다.

다른 예는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 예는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 재조합 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 과당으로부터 사이코스를 제조하는 사이코스 제조용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 사이코스 제조용 조성물을 과당과 반응시켜 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 비 병원성인 크로스트리디움 속, 루미노코코스 속, 트레포네마 속, 파라코코스 속, 시트레이셀라 속, 및 시노리조비움 속에 포함되는 미생물의 유전정보 중에서 그 기능이 밝혀지지 않은 폴리뉴클레오타이드에 대하여 연구를 거듭하던 중, 아그로박테리움 투메패시엔스 또는 로도박터 스페로이데스 유래 케토오스 3-에피머화 효소와 촉매활성 잔기는 일치하며 전체 아미노산 서열은 40 내지 60% 정도의 상동성이 있는 케토오스 효소를 스크리닝 하였다

그 결과 크로스트리디움 신댄스가 가지고 있는 전체 유전자 중에서 과당을 사이코스로 전환할 수 있는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 최초로 밝힐 수 있었다.

또한 이에 따라 단백질의 효과적인 발현을 위하여 최적화한 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성하고 이를 재조합 벡터에 삽입하고 발현시켜 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 갖는 효소를 확보함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 종래에 기능이 밝혀지지 않은 단백질이 D-사이코스 3-에피머화 효소 활성을 가지며 고수율로 사이코스를 제조할 수 있음을 확인하여, 상기 단백질의 D-사이코스 3-에피머화 효소로서의 용도를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

우선, 본 발명의 일 예에서, 크로스트리디움 신댄스 (Clostridiun scidens)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이 제공된다.

예컨대, 상기 단백질은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 단백질은 미생물에서 실제 이를 코딩하는 유전자 염기서열 및 생화학적 기능 특성이 알려진바 없으나, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 효소를 스크리닝 하는 과정에서, 상기 단백질이 과당의 3번째 탄소 위치에서 에피머화 반응을 일으켜 과당으로부터 사이코스를 전환 할 수 있는 활성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 상기 단백질은 과당의 3번 탄소 위치를 에피머화함으로써 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 갖는 효소 단백질(예컨대, D-사이코스 3-에피머화 효소)일 수 있다.

상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 앞서 설명한 바와 같이 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 단백질은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 30 내지 37 kDa, 예컨대 30 내지 35 kDa인 것일 수 있다. 상기 단백질의 최적 온도는 40 내지 65℃, 구체적으로 50 내지 65℃ 일 수 있다 (도 3 참조). 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 7.0, 1mM Co² ⁺ 존재 하에서 5분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 단백질의 최적 pH는 pH 6 내지 9, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다 (도 4 및 도 5 참조). 상기 최적 pH는 예컨대, 60℃, 1mM Co² ⁺ 존재 하에서 5분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 다음과 같은 특성을 보유하는 것일 수 있다:

(a) 분자량: 30 내지 37 kDa, 또는 30 내지 35 kDa;

(b) 최적 활성 온도: 40 내지 65℃, 또는 50 내지 65℃; 및

(c) 최적 활성 pH: pH 6 내지 9, pH 6.8 내지 9.0, pH 7 내지 9, pH 6.8 내지 8.5, pH 7 내지 8.5, pH 6.8 내지 8.0, 또는 pH 7 내지 8.

본 발명의 다른 예는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 예는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.

상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예컨대, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열, 또는 상기 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 염기서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴린뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론, T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터로 형질전환 시킬 수 있는 숙주 세포는 상기 효소 단백질을 발현(과발현)시킬 수 있는 발현 시스템을 갖는 모든 미생물중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등을 예시할 수 있으며, 예컨대, BL21(DE3) 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다.

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.

일 예에서 상기 재조합 균주는 Escherichia coli-pETCDPE-SYG321(기탁번호: KCCM11406P)일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 효소 단백질이다. 따라서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이를 발현하는 재조합 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 예는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 제조용 조성물을 제공한다. 상기 사이코스 제조용 조성물은 과당을 기질로 하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것으로, 상기 재조합 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 재조합 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

다른 예는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물 (이하, '효소 단백질 등')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담 체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.005mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.05mg/ml 내지 0.1mg/ml일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 효소 단백질의 최적 조건을 고려할 때, 상기 반응은 pH 6 내지 9, pH 6.8 내지 9.0, pH 7 내지 9, pH 6.8 내지 8.5, pH 7 내지 8.5, pH 6.8 내지 8.0, 또는 pH 7 내지 8의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃을 넘으면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 30 내지 80℃, 40 내지 75℃, 30 내지 70℃, 40 내지 65℃, 또는 50 내지 65℃의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 효소 농도에 따라서 달라지지만, 대체적으로 반응시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 효소의 열안정성(예컨대, 50 ℃에서의 열안정성)을 고려하여, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 8 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 8시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 8시간, 1 내지 6시간, 1 내지 4시간, 1 내지 2시간, 2 내지 8시간, 또는 2 내지 6시간으로 할 수 있다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 0.1 내지 100mg(dcw)/ml, 0.1 내지 50mg(dcw)/ml, 0.1 내지 10mg(dcw)/ml, 1 내지 100mg(dcw)/ml, 1 내지 50mg(dcw)/ml, 1 내지 10mg(dcw)/ml, 2 내지 100 mg(dcw)/ml, 2 내지 50mg(dcw)/ml, 2 내지 10 mg(dcw)/ml, 3 내지 100mg(dcw)/ml 3 내지 50mg(dcw)/ml, 또는 내지 3 내지 10mg(dcw)/ml 일 수 있다.

상기 사이코스 전환효소 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효소 단백질에 의한 반응을 금속 이온 존재 하에서 수행함으로써 사이코스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 사이코스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 망간 이온, 철 이온, 및 코발트 이온로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 금속 이온의 첨가량이 0.1mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 내지 5mM, 예컨대, 0.1 내지 2mM, 또는 0.5 mM 내지 1.5mM 범위로 할 수 있다.

따라서, 상기 사이코스 제조용 조성물은 첨가량은 상기한 금속 이온을 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류와 함량은 상기한 바와 같다. 또한, 상기 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류와 함량은 상기한 바와 같다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 상기 효소 단백질 등과 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온이 배양물에 첨가되거나 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수 있다.

상기 담체는 고정된 효소 단백질의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. 일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다.

일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은, 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 반응 단계 이전에 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 준비 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 발현하는 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 반응 단계 이전에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양 및 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양 단계는 사용되는 균주(숙주세포)의 특성에 따라 관련 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 회분식 배양일 수 있지만 이 방법들에 한정된 것은 아니다. 상기 배지로서는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 예컨대, 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지, TB 배지 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양물은 일반적으로 숙주 세포(예컨대, 대장균)을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 재조합 균주를 35℃ 내지 37℃ 및 150 내지 250rpm 조건 하에서 진탕 배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한, 상기 효소 단백질의 과발현을 유도하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용하는 유도 물질을 첨가할 수 있다. 예를 들면, 상기 유도 요소가 lac 오페론 또는 trc 포로모터인 경우, Lactose 나 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토티오피라노시드)일 수 있으며, 상기 유도 시기는 당업자에 의하여 배양의 적절한 시기에 이루어질 수 있다.

상기 재조합 균주는 상기 얻어진 배양물을 원심분리 및/또는 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균주를 균질화시키고 원심 분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다. 예컨대, 회수된 균주를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 니켈-NTA 컬럼(Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 250mM 이미다졸의 농도로 효소 단백질을 회수할 수 있다.

상기 과당과 반응시키는 단계는 상기 효소 단백질의 최적 활성화 조건 하에 이루어질 수 있다. 예컨대 pH 6 내지 9, pH 6.8 내지 9.0, pH 7 내지 9, pH 6.8 내지 8.5, pH 7 내지 8.5, pH 6.8 내지 8.0, 또는 pH 7 내지 8, 및/또는 40℃ 내지 65℃ 또는 50℃ 내지 65℃의 온도 조건하에 이루어지는 것일 수 있다. 상기 과당은 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대 50 내지 75%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다.

상기 범위로 과당을 사용함으로써 보다 경제적이며 효율적으로 사이코스를 생산할 수 있다.

또한 재조합 균주를 사용할 경우 바람직하게는 과당과 반응시키기 전에 상기 회수된 균체를 예컨대, 0.85%(w/v) NaCl 등을 사용하여 2회 이상 세척하여 사용할 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 과당과 반응시키는 단계는 망간 및 코발트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속의 이온을 더욱 첨가하여 이루어질 수 있다. 상기 금속 이온은 0.1mM 내지 5mM, 예컨대, 0.1 내지 2mM, 또는 0.5 mM 내지 1.5mM 범위로 첨가할 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우 활성 증가 효과를 충분히 얻을 수 없으며, 상기 범위를 초과할 경우 사용되는 양에 비해 얻게 되는 활성 증대 효과가 미미하여 바람직하지 않다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 사이코스 에피머화 효소는 과당의 3번째 탄소 위치를 에피머화하여 사이코스를 생산하는 활성을 보유한 효소로써, 열안정성이 우수하고 반감기가 길며 산업적으로 적용 가능한 조건에서 높은 수율로 과당으로부터 사이코스의 대량 생산이 가능하므로, 사이코스 제조를 위한 산업적 이용에 유용하다. 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소와 이를 이용한 사이코스 생산방법은 기능성당 산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품소재, 의약용, 화장품용 소재 등 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 2는 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 첨가된 금속 이온 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 3은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 온도에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 pH에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 PIPES 버퍼에서의 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 pH에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 50℃에서의 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 시간별로 보여주는 그래프이다.
도 7은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 고농도 과당으로부터의 사이코스 생산 효율 (사이코스 전환률)을 보여주는 그래프이다.
도 8은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 고농도 과당으로부터의 사이코스 생산성을 HPLC에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 함유하는 재조합 균주를 이용한 고농도 과당으로부터의 사이코스 생산 효율 (사이코스 전환률)을 보여주는 그래프이다.
도 10은 크로스트리디움 신댄스(Clostridium scindens)에서 유래된 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 1)을 보여준다.

이하 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시 예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주의 제조

크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 원래의 암호화 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)의 염기서열에 변형이 가해진 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였다.

상기 합성된 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pET21a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a/사이코스 에피머화 효소(pET-CDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터 pET-CDPE를 도 1에 개시하였다.

heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 상기 제조된 재조합 벡터 pET-CDPE로 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다.

상기 제조된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37℃의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 상기 과발현 유도 시점부터 배양조건을 16℃ 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.

상기 과발현이 유도된 배양액을 원심분리기 4000rpm에서 20분간 원심 분리하여 균체만을 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 하기하는 효소 정제에 사용하였다.

상기 제조된 재조합 균주는 Escherichia coli-pETCDPE-SYG321로 명명하고, 2013년 3월 29일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM11406P를 부여받았다.

실시예 2. D- 사이코스 3- 에피머화 효소 정제 및 특성 확인

2-1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 정제

상기 실시예 1에서 회수된 균체를 lysis buffer(50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 10 mM imidazol)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 파쇄액을 13,000rpm에서 20분 동안 원심 분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni- NTA컬럼(Ni-NTA Superflow. Qiagen)에 적용시킨 다음, 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0에 20 mM imidazol과 250 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려 주었다. 상기 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 250 mM imidazol을 흘려주는 과정에 의하여 목적 단백질을 분리 정제하였다.

상기 분리 정제된 목적 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50mM PIPES pH7.5)으로 전환한 다음 실험에 사용하였다. 또한 상기 분리 (부분) 정제된 목적단백질인 사이코스 에피머화 효소는 SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 32.8 kDa인 것으로 확인되었다.

2-2. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 금속이온 요구성 분석

기존에 알려진 타가토스 또는 사이코스 3-에피머화 효소는 금속이온 요구성이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 실시예 2-1에서 얻어진 D-사이코스 에피머화 효소에 대해서도 금속이온이 영향을 미치는지 알아보았다.

상기 실시예 2-1에서 정제된 단백질(효소)에 금속이온 CuCl₂, MnCl₂, CaCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, NiSO₄, 또는 CoCl₂를 각각 1 mM씩 처리하여 효소 활성을 측정하였다. 상기 효소 활성 측정은 상기 금속 이온 존재 하에서 50 mM 과당과 효소 0.3 unit/ml 이 50mM PIPES 완충용액 (pH7.0)에서 60℃, 5분간 반응한 것을 측정한 것이다. 상기 반응 후 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지시켰다. 상기 효소 활성은 기질인 50 mM 과당과 1mM Co² ⁺ 을 함유한 50mM PIPES 완충용액 pH7.0을 60℃에서 효소와 반응시켜 분당 1μmol(micromole)의 사이코스를 생산하는 양을 1unit으로 정의하였다. 대조군(Non)으로 금속이온을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

상기 효소 활성은 생산된 사이코스 양(mM)을 사용된 효소양과 반응시간으로 나누어서 계산하였으며, 사이코스 양은 HPLC로 분석하였다. 상기 HPLC 분석은 87C(BIO-RAD) 컬럼을 사용하여 80℃에서, 이동상으로 물 100%(v/v)를 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector(Agilent 1260 TID)로 사이코스를 검출하여 사이코스 생산성을 분석하였다.

상기 측정된 각 금속 이온을 처리한 경우의 효소 활성을 대조군에서의 효소 활성과 비교하여 도 2에 나타냈다. 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2-1의 효소는 망간이온, 철이온 및 코발트이온 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 금속 이온 요구성이 있음을 알 수 있다.

2-3. 사이코스 에피머화 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성 분석

상기 실시예 2-1에서 정제된 효소의 pH 및 온도변화에 따른 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 과당 기질을 반응시키고 효소 활성을 확인하였다. 이 때 활성측정은, 상기 실시예 2.2에 기재된 방법을 참조하여, 50 mM 과당과 효소 0.3 unit/ml을 사용하여 pH 4 내지 9 및 온도 30 내지 80℃ 범위에서 5분간 이루어졌으며, 그 후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 중지시켰다.

먼저 pH를 7로 하고 온도를 30 내지 80℃ 범위에서 변화시키며 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 효소 활성을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 Y축의 상대적 활성은 가장 좋게 나온 효소 활성을 100으로 하였을 때의 상대값을 의미한다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 효소는 40 내지 65℃, 구체적으로 50 내지 65℃ 범위에서 높은 활성을 나타냈으며, 특히 60℃에서 최대 활성을 보임을 알 수 있다.

또한, pH 변화에 따른 활성을 알아보기 위해, 상기 실시예 2.2에 기재된 방법을 참조하여, 60℃에서, 50mM 소듐 아세테이트 pH 4-6, 50 mM 소듐 시트레이트 pH 5-7, 50mM PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) pH 7, 50 mM Tris-HCl pH 7-9, 및 50 mM 글라이신 NaOH pH 9-10의 완충용액을 각각 사용하여 효소 활성을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, pH 7.0-9.0 범위, 그 중 pH7.0에서 효소 활성이 특히 높게 나타났다. 또한 pH 7.0에 해당되는 완충용액 중에서도 PIPES 완충용액에서 효소 활성이 보다 우수한 것으로 나타났다.

상기 시험에서 효소 활성이 우수한 것으로 나타난 PIPES 완충 용액에 대해 pH 별로 활성을 측정하여 도 5에 나타내었다.

도 5와 같이 pH 7.0 이상, 예컨대 pH 7.5 정도에서 높은 활성을 나타내었다.

2-4. 사이코스 에피머화 효소의 기질 특이성 분석

50 mM 농도의 기질, 즉, 과당, 사이코스(Psicose), 타가토스, 만노스, 포도당, 또는 자일로스를 각각 기질로 하여 1 mM CoCl₂와 상기 실시예 2-1에서 정제된 효소 0.3 unit/ml을 포함하는 50 mM PIPES 완충용액에서 pH 7.5 및 60℃ 조건하에서 5분간 반응시켜 각각의 기질에 대한 활성 정도를 측정하였다. 효소활성은 100℃에서 5분간 가열하여 중지시켰다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 1에 나타내었다 (사이코스를 기질로 하는 반응의 효소 활성을 100으로 한 상대값으로 나타냄).

구분	사이코스 Psicose	과당 Fructose	타가토스 Tagatose	만노스 Mannose	포도당 Glucose	자일로스 Xylose
상대활성 (%)	100	68.2	-	-	-	-

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2-1에서 정제된 효소는 여러가지 기질 중에서 사이코스와 과당에서만 특이적으로 활성을 보였으며, 특히 사이코스의 기질 특이성이 과당과 비교했을 때 약 32% 높은 것으로 나타났다. 기존에 알려진 케토오스 3-에피머화 효소는 사이코스와 과당뿐만 아니라 타가토스와 솔보스에도 반응성이 있는 것에 비하여, 본 발명의 효소는 사이코스와 과당에만 특이적이게 반응하는 특징이 있어 기존에 알려진 효소와 기질 특이성이 상이함을 확인할 수 있다.

2-5. 사이코스 에피머화 효소의 열 안정성 분석

온도변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1에서 정제된 효소를 50℃에서 일정시간(9시간) 열처리 한 후, 50 mM의 과당을 기질로 하여 1 mM CoCl₂와 효소 0.3 unit/ml이 포함된 50 mM PIPES 완충용액에서 pH 7.5 및 50℃ 조건 하에서 5분 동안 반응시켜 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성은 100℃에서 5분간 가열하여 중지시켰다.

상기 열처리 시간에 따라서 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서와 같이, 실시예 2-1에서 정제된 효소는 9시간까지 활성이 크게 감소하지 않았으며, 반감기는 약 20 시간으로 계산 되었다. 기존에 보고된 사이코스 3-에피머화 효소들은 대부분 50℃에서 반감기가 대략 한 시간 정도인 것에 비해, 본 발명의 효소는 동일한 온도에서 열안정성이 우수함을 확인 할 수 있다.

2-6. 사이코스 에피머화 효소의 반응속도( Kinetic parameter ) 분석

실시예 2-1에서 정제한 크로스트리디움 신댄스(Clostridium scindens)유래의 사이코스 에피머화 효소의 효소 반응속도를 살펴보기 위해 kinetic parameter 분석을 실시하였다 (Zhu Y. et . al.(2012), Kim HJ. et . al.(2006), Mu W. et . al.(2011))

기질인 과당의 농도를 5 내지 250 mM 범위에서 변화시키면서, 실시예 2-1의 효소 0.3 unit/ml 및 1 mM CoCl₂이 첨가된 50 mM PIPES 완충용액 pH7.5 및 60℃ 조건 하에서 반응시켜 효소 활성을 측정하였다. 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지시켰다.

효소 반응속도를 단량체로 계산했을 경우 과당의 Km 값은 56 mM이고 kcat은 10128.6 min^-1이었다. 상기 효소 반응 속도는 michaelis-mentenequation에 근거하여 계산하였다.

즉 실시예 2-1의 사이코스 3-에피머화 효소의 과당에 대한 촉매효율(catalytic efficiency)은 286.28 로써, 기존에 발표된 사이코스 에피머화 효소 중 촉매효율이 가장 높은 것으로 보고된 아그로박테리움 투메패시언스 유래의 사이코스 3-에피머화 효소의 촉매효율인 85보다도 약 3.3배 이상 높은 것으로 나타났다.

그러므로 본 발명의 효소는 산업적으로 반응이 용이한 온도 (약 50~60℃)에서 반응 속도가 매우 빨라 사이코스 생산 속도 측면에서 이점을 가지고 있어 사이코스 산업화에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

실시예 3. D- 사이코스 3- 에피머화 효소에 의한 사이코스 생산

3-1. 고농도 과당에서 생물전환에 의한 사이코스 생산

고농도의 사이코스를 생산하기 위하여, 실시예 2-1에서 정제한 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 상기 실시예 2-3에서 선정된 최적화 조건 하에서 반응을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 2-1에서 정제한 D-사이코스 3-에피머화 효소를 0.005 내지 0.1 mg/ml의 농도로 사용하여 50℃ 및 50 mM PIPES pH 7.5, 및 코발트 1 mM의 조건 하에서 고농도 (500 g/L)의 과당과 반응시켰다.

상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 상기 반응 결과 생산된 사이코스 생산량을 측정하여 과당에서 사이코스로의 전환율을 측정하였다. 사용된 과당이 고농도이기 때문에 각 시간별로 샘플링한 용액을 25배로 희석하여 HPLC 분석 진행하였으며, 분석된 결과 면적(AREA)값을 각각의 standard값에 대입하여 생산량을 계산 하였으며, 전환율은 생산된 사이코스양/과당 50%*100으로 계산하였다. 샘플링한 후, 계산하면 분석된 과당과 사이코스의 총량은 50%이다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 효소 농도가 높을수록 사이코스 전환률이 증가하는 것으로 나타났다. 예컨대, 효소 농도 0.1 mg/ml에서의 사이코스 최종 생산량이 152 g/L이며, 사이코스 전환률이 약 30.2% 정도이다. 즉, 본 발명의 효소를 사용하여 고농도의 과당에서 30% 이상의 전환률로 사이코스를 생산할 수 있다.

한편, 상기와 같이 고농도 과당에서의 생물 전환에 의한 사이코스 생산성을 HPLC로 측정하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 Y축은 굴절률을 나타낸다. 상기 HPLC 분석은 87C(BIO-RAD) 컬럼을 사용하여 80℃에서, 이동상으로 물 100%(v/v)를 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였고, Refractive Index Detector(Agilent 1260 TID)로 사이코스를 검출하여 사이코스 생산성을 분석하였다.

3-2. 효소가 포함된 재조합 균주 반응에 의한 사이코스 생산

상기 실시예 1에서 회수된 재조합 균주의 균체를 이용하여 사이코스를 생산 시험을 하였다. 실시예 2-1의 효소를 사용하는 대신 실시예 1에서 회수된 재조합 균주의 균체를 이용하는 것을 제외하고 상기 3-1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. 구체적으로, 50℃, 50 mM PIPES pH 7.5의 조건 하에서 상기 실시예 1의 재조합 균주 10.9, 5.4 또는 2.7 mg(균체건조중량)/ml(반응물 부피)과 500 g/L 과당을 각각 반응시켜 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 사이코스 생산량 및 사이코스 전환율을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보여지는 바와 같이, 과당 농도가 500 g/L 및 5.4 mg(균체건조중량)/ml(반응물 부피)의 조건에서 약 1시간 이후 반응이 거의 완료되었으며, 이 때 161.9 g/L의 사이코스를 생산하여, 전환율은 약 30.8%를 보였다. 상기 결과로부터 정제된 효소뿐 아니라 재조합 균주 역시 우수한 사이코스 전환 능력을 가짐을 확인할 수 있다.

한국미생물보존센터

KCCM11406P

20130329

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서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질.
제16항에 있어서, 다음의 특성을 갖는, D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질:
(a) 분자량: 30 내지 37 kDa;
(b) 최적 활성 온도: 40 내지 65℃; 및
(c) 최적 활성 pH: pH 6 내지 9.
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제16항의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드.
제19항에 있어서, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진, 폴리뉴클레오타이드.
제19항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제21항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열 지도를 갖는 것인, 재조합 벡터.
제21항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주.
제23항에 있어서, 상기 재조합 균주는 대장균이 형질전환된 것인, 재조합 균주.
제24항에 있어서, Escherichia coli-pETCDPE-SYG321(기탁번호: KCCM11406P)인, 재조합 균주.
제16항의 단백질, 제23항의 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함하는, 사이코스 생산용 조성물.
제26항에 있어서, 망간 이온, 철 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는, 사이코스 생산용 조성물.
제26항의 사이코스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 과당과 반응시키는 단계는 40 내지 65℃에서 수행되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 과당과 반응시키는 단계는 pH 6.0 내지 9.0에서 수행되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 과당의 농도는 40 내지 75%(w/v)인 사이코스를 생산하는 방법.