WO2021221418A1 - 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법 - Google Patents

알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법 Download PDF

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amino acid
acid sequence
seq
epimerase
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윤형섭
최은석
이지하
김석수
조승우
김태용
김학준
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    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03003—Aldose 1-epimerase (5.1.3.3)

Definitions

  • the present invention relates to allulose epimerase variants and the like, and more particularly, Flavonifractor plautii- derived D-allulose 3-epimerase-derived D-allulose 3-epimerase Conversion rate and thermal stability of fructose to allulose This improved allulose epimerase variant and various inventions derived therefrom.
  • the present invention was derived under the background of the prior art, and the first object of the present invention is the conversion rate and heat of fructose to allulose compared to wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii.
  • An object of the present invention is to provide a novel D-allulose 3-epimerase variant with improved stability.
  • the applicant of the present invention has applied for and registered a patent for a wild-type D- allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii and an invention for producing allulose from fructose using the same [ Republic of Korea Patent Registration No. 10-1473918 (2014.12.11)].
  • the Flavonifractor plautii- derived wild-type D-allulose 3-epimerase has a maximum for the conversion of fructose to allulose in a pH range of about 6.5 to 7.0 and a temperature condition of about 62 to 66 ° C.
  • wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii was used for industrialization. For its application, it is necessary to greatly improve the thermal stability.
  • the inventors of the present invention recognize the inherent problems of wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii and utilize the protein structure prediction technology to determine the amino acid of wild-type D-allulose 3-epimerase.
  • the present invention provides an allulose epimerase variant or allulose epimerase variant comprising any one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 for fructose. It provides a method for producing allulose comprising the step of reacting with a composition comprising a.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 contains a sequence with The substantial identity is obtained by aligning any one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 and any other sequence to the maximum correspondence, and analyzing the sequence, The any other sequence has 70% or more, 90% or more, or 98% or more sequence homology with any one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24, or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26.
  • the cloning vector may further include a polyadenylation signal, a transcription termination sequence, and a multiple cloning site.
  • the multiple cloning site includes at least one endonuclease restriction enzyme restriction site.
  • the cloning vector may further include a promoter.
  • the polynucleotide encoding the allulose epimerase variant may be located upstream of a polyadenylation signal and a transcription termination sequence.
  • expression vector is defined as a DNA sequence necessary for transcription and translation of cloned DNA in an appropriate host.
  • Methods for preparing a transformant by introducing the expression vector into a host cell include transient transfection, micro-injection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection ( liposemmediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, electroinjection, PEG, etc.
  • a chemical treatment method, a method using a gene gun, or the like, a heat shock method, etc. are included, but are not limited thereto.
  • Host cells that can be transformed with the expression vector in the present invention are not particularly limited as long as they are known in the art, such as prokaryotic cells, plant cells, insect cells, and animal cells.
  • the DNA introduction efficiency is high.
  • the concentration of fructose is not particularly limited, but is preferably 1 to 75% (w/w) based on the total reactants, and 4 to 35% based on productivity and economic feasibility. (w/w) is more preferable.
  • the concentration of the enzyme variant used in the method for preparing allulose from fructose is 0.001 to 0.1 mg/ml, preferably 0.01 to 0.1 mg/ml, more preferably 0.02 to 0.05 mg/ml, based on the total reactant. can be
  • the host strain of the recombinant strain is preferably a food-safe strain.
  • the D-allulose 3-epimerase derived from the Flavonifractor plautii has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and has the maximum activity for the conversion of fructose to allulose under neutral pH conditions. Although it is possible to mass-produce allulose from fructose in a short time with high yield, there is a problem in that the activity rapidly decreases when the enzymatic reaction is carried out under high temperature conditions to prevent contamination.
  • D79 represents aspartic acid (Asp) present at position 79 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • V109 represents valine (Val) present at position 109 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • M199 represents methionine (Met) at position 199 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • N218 represents asparagine (Asn) at position 218 in the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • M234" represents methionine (Met) present at position 234 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • glycine (Gly) present at position 216 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from the results of previous studies was named "G216" and selected as a substitution candidate.
  • tryptophan (Trp) present at the 29th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was substituted with lysine (Lys) to prepare an enzyme mutant W29K consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the enzyme mutant C35L consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was prepared by substituting cysteine (Cys) at position 35 in the amino acid sequence with leucine (Leu), and the amino acid sequence at position 79 among the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Partic acid (Asp) was substituted with proline (Pro) to prepare an enzyme variant D79P consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and valine (Val) at position 109 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was replaced with alanine (Asp)
  • the purified enzyme solution heat-treated in 50 mM PIPES buffer (pH 7.0) containing metal ions of 4% (w/w) fructose and 1 mM nickel sulfate (NiSO 4 ) was added so that the enzyme concentration was 25 ⁇ g/ml, and Using a shaking constant temperature water bath (VS-1205SW1, Vision Science), the reaction was carried out for 25 minutes under a temperature condition of 65° C. and agitation condition of 120 rpm. Thereafter, the reaction was stopped by lowering the temperature of the reaction product solution to 4° C., and centrifuged at 16,600 ⁇ g and 4° C. to recover the supernatant.

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Abstract

본 발명은 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체 및 이의 다양한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 높고, 특히 60℃ 이상의 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수하기 때문에 알룰로스의 대량 생산을 위한 산업화 수준의 효소 전환 반응시 오염을 방지할 수 있고 생산 시간을 단축시킬 수 있으며 생산 비용을 절감시킬 수 있다.

Description

알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
본 발명은 알룰로스 에피머화 효소 변이체 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii) 유래의 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성이 향상된 알룰로스 에피머화 효소 변이체 및 이로부터 파생된 다양한 발명들에 관한 것이다.
D-알룰로스(D-allulose)는 과당(fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)로서 D-사이코스(D-psicose)로도 불리운다. D-알룰로스(D-allulose)는 설탕과 비교했을 때 70% 감미도를 갖지만(Oshima 2006) 에너지는 0.3% 밖에 없으므로 다이어트 식품의 저칼로리 감미료로 적용 가능한 기능성 단당류이다(Matsuo et al. 2002). 또한, D-알룰로스(D-allulose)는 포도당 흡수 및 혈당을 억제하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식품, 수신용 음식품 등에 응용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성의 억제를 통해 복부 지방 축적을 억제 할 수 있으므로 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다(Matsuo et al. 2001; Iida et al. 2008; Hayashi et al. 2010; Hossain et al. 2011).
위와 같은 특징으로 알룰로스는 설탕을 대체 할 수 있는 좋은 소스이나 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에 식품산업에 적용하기 위해서는 알룰로스를 효율적으로 생산하는 방법이 필요하다. 기존의 알룰로스 생산 방법으로는 주로 화학적 과정을 거쳐 생산되었다. 빌릭(Bilik) 등은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당을 알룰로스로 전환하는 방법을 제안하였다. 맥도날드(McDonald)는 1,2:4,5-디-δ-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노스(1,2:4,5-di-δ-isopropylidene-beta-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 알룰로스를 생산하였다. 또한, 도너 (Doner)는 에탄올과 트리메틸아민과 함께 과당을 가열하여 알룰로스를 생산하였다. 그러나 이들 화학적 생산방법은 비용이 많이 소모되는 반면 그 효율은 낮고 또한 부산물들이 상당량으로 발생한다는 단점이 있다.
생물학적 알룰로스 생산방법으로는 미생물의 세포반응을 이용하여 갈락티톨 (galactitol), D-타가토스 또는 D-탈리톨 등으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 제안되었다(Ken Izumori). 그러나 이 방법은 기질이 희소당에 속하기 때문에 산업적 생산에 응용하기 힘들다. 산업화에 가장 효율적인 방법은 D-케토오스 3-에피머화 효소군 중 과당을 알룰로스로 전환하는 효소를 찾는 방법이다. 기존에 발표된 내용은 크로스트리디움 셀루로리티쿰 H(10)(Mu et al. 2011), 아그로박테리움 투메패시언스(Kim et al. 2006), 슈도모나스 치코리(Itoh at al. 1994), 리조비움 스페로이데스 (Zhang et al. 2009) 유래의 D-타가토스 3-에피머화 효소를 대장균에 삽입하여 형질전환 시킨 후 형질전환 된 대장균에서 발현된 D-타가토스 3-에피머화 효소를 사용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하였다.
효소를 사용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 기술과 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-0744479호에는 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 알룰로스 에피머화 효소에 의한 알룰로스의 생산 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0832339호에는 과당을 알룰로스로 전환하는 활성을 지닌 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP와 이를 이용하여 과당을 알룰로스로 전환하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1106253호에는 과당의 알룰로스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 아그로박테리움 투메패시엔스 C58의 알룰로스 3-에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1339443호에는 리조븀속(genus Rhizobium)에 속하는 미생물로부터 유래하는 케토오스 3-에피머라아제(ketose 3-epimerase) 및 이를 이용하여 과당을 알룰로스로 전환하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1318422호에는 크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens)로부터 유래된 D-알룰로스 3-에피머화 효소 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1473918호에는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래하는 D-알룰로스 3-에피머화 효소 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 미생물로부터 유래한 야생형(Wild type)의 D-알룰로스 3-에피머화 효소는 과당의 알룰로스로의 전환율이 높지 않고, 열 안정성이 낮아 최적 활성 온도에서 실활되는 속도가 빨라 산업화에 적당하지 않다. 따라서, 미생물로부터 유래한 야생형(Wild type)의 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환율 또는 열 안정성이 향상된 신규한 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 개발이 필요하다. D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체와 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0021974호에는 유전자 수준에서 돌연변이를 유도하여 높은 온도에서의 빠른 알룰로스 전환속도와 안정성을 보이는 트레포네마 프리미티아 ZAS-1 유래의 D-알룰로스 3-에피머화 효소가 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1203856호에는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 알룰로스 에피머화 효소의 변이를 통해 수득한 열 안정성이 향상된 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명은 첫 번째 목적은 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii) 유래 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성이 향상된 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 제공하는데에 있다.
본 발명의 두 번째 목적은 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 제조하는 방법 또는 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.
본 발명의 세 번째 목적은 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법 또는 과당으로부터 알룰로스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.
본 발명의 출원인은 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 발명에 대해 특허출원하여 등록받은 바 있다[대한민국 등록특허 제10-1473918호(2014.12.11)]. 상기 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii) 유래 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소는 약 6.5~7.0의 pH 범위 및 약 62~66℃의 온도 조건에서 과당의 알룰로스로의 전환에 대한 최대 활성을 보이나, 최적 온도 조건에서 반응 시간이 지남에 따라 효소 활성이 급격하게 떨어지기 때문에 알룰로스의 대량 생산을 위한 산업화 단계에서 그 활용도에 한계를 가진다. 또한, 일반적으로 알룰로스의 대량 생산을 위한 효소 전환 반응은 오염 방지를 위해 고온에서 실시되기 때문에 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소를 산업화에 적용하기 위해서는 열 안정성을 크게 향상시킬 필요가 있다. 본 발명의 발명자는 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소가 가지는 내재적 문제점을 인식하고 단백질 구조 예측 기술을 활용하여 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열에서 화학 결합의 변화시 전환율 및 열 안정성 향상과 관련될 것으로 예상되는 아미노산 잔기 위치 후보들을 도출하고, 이 중 특정 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키는 경우 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성이 향상된다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 첫 번째 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 제공한다.
상기 두 번째 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 발현시키는 단계; 및 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 분리하는 단계를 포함하는 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 제조방법을 제공한다.
상기 세 번째 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 과당을 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 과당을 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 높고, 특히 60℃ 이상의 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수하기 때문에 알룰로스의 대량 생산을 위한 산업화 수준의 효소 전환 반응시 오염을 방지할 수 있고 생산 시간을 단축시킬 수 있으며 생산 비용을 절감시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 발명자들이 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상시키기 위해 치환 후보로 선정한 7개의 아미노산 잔기 위치를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 과당을 알룰로스로 전환시킬 수 있는 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체(이하, '알룰로스 에피머화 효소 변이체'라 한다)에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환된 것이다. 또한, 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/M234I는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 것이다. 또한, 본 발명의 더 바람직한 일 예에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 것이다. 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K, W29K/M234I 및 W29K/G216S/M234I는 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 높고, 특히 60℃ 이상의 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수하다. 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 14의 염기서열로 이루어짐)를 주형으로 하고 소정의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 PCR을 수행하고, 이후 증폭된 변이체 단편의 쌍을 주형으로 하고 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 overlap extentention PCR을 수행하고, 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지나, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 균등 범위가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 균등 범위는 과당을 알룰로스로 전환하는 활성 및 60℃ 이상의 고온에서 열 안정성이 유지되는 한, 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 과당의 알룰로스로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 균등 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 제조하는 방법 또는 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 폴리뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 재조합 벡터, 재조합 균주 등이 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 바람직하게는 서열번호 15의 염기 서열, 서열번호 24의 염기 서열 또는 서열번호 26의 염기 서열에서 선택된 어느 하나의 염기 서열로 이루어진다. 본 발명에서 사용하는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일-및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA 또는 이들의 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 균등 범위는 서열번호 15의 염기 서열, 서열번호 24의 염기 서열 또는 서열번호 26의 염기 서열에서 선택된 어느 하나의 염기 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 15의 염기 서열, 서열번호 24의 염기 서열 또는 서열번호 26의 염기 서열에서 선택된 어느 하나의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 15의 염기 서열, 서열번호 24의 염기 서열 또는 서열번호 26의 염기 서열에서 선택된 어느 하나의 염기 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 것으로서, 바람직하게는 아미노산 잔기 치환 위치 및 종류에 따라 다음과 같은 염기서열을 가진 순방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된다.
W29K
* 순방향 프라이머 염기서열(5'→3')
CCCTGATGGAGAAGCTGGCCAAACTGGGCTTTGACATCTGCGA
* 역방향 프라이머 염기서열(5'→3')
TCGCAGATGTCAAAGCCCAGTTTGGCCAGCTTCTCCATCAGGG
G216S
* 순방향 프라이머 염기서열(5'→3')
GGCTGGGGCATTTCCACGTGAGCGAGAACAACCGCCGCCCCGC
* 역방향 프라이머 염기서열(5'→3')
GCGGGGCGGCGGTTGTTCTCGCTCACGTGGAAATGCCCCAGCC
M234I
* 순방향 프라이머 염기서열(5'→3')
ACCGCCTGCCCTGGAAGGACATTGCCGCCGCCCTCAAGCAGGT
* 역방향 프라이머 염기서열(5'→3')
ACCTGCTTGAGGGCGGCGGCAATGTCCTTCCAGGGCAGGCGGT
또한, 상기 재조합 벡터는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지의 표준 방법을 사용하여 클로닝 벡터나 발현 벡터 내로 삽입한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "클로닝 벡터"는 숙주 세포 내로 DNA 단편을 운반하고 이를 재생산할 수 있는 물질로 정의된다. 본 발명에서 클로닝 벡터는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal), 전사 종결 서열(transcription termination sequence) 및 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)를 포함한다. 또한, 클로닝 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명에서 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "발현 벡터"는 적절한 숙주 안에서 클로닝된 DNA의 전사와 번역을 위해 필요한 DNA 서열로 정의된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "발현 벡터"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 추가적 발현 조절 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 상기 프로모터에는 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는데에 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 상기 프로모터에는 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "작동가능하게 연결된"은 단일 폴리뉴클레오티드 상의 폴리뉴클레오티드 서열 연관성으로 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 연결되어 작동되거나, 리보좀 결합 자리가 번역을 촉진시킬 수 있도록 위치하고 있다면, 리보좀 결합 자리는 코딩 서열에 연결되어 작동되는 것이다. 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 조절 서열에 연결되어 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다.
또한, 상기 재조합 균주는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것이다. 본 발명에서 사용하는 용어, "재조합 균주"는 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 갖는 발현 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation) , 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법, 열충격(heat shock) 방법 등이 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포로는 원핵 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 등 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다.
또한, 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 제조방법은 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 발현시키는 단계; 및 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 사이코스 에피머화 효소를 분리하는 단계를 포함한다. 숙주 세포에 의한 단백질의 발현은 락토스(Lactose), 유도 인자인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 등을 사용하여 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 재조합 균주의 파쇄물로부터 회수될 수 있다. 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학적 분리 기술에 의해서 분리 또는 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 예를 들어, 숙주 세포에 의해 발현된 단백질의 분리 또는 정제 방법으로는 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 또는 복합 방법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 분리하는 단계는 바람직하게는 펩티드 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드 태그로는 HA 태그, FLAG 태그, His 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc 태그, V5 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 MBP(maltose binding protein) 등과 같이 공지의 다양한 태그를 사용할 수 있으며, 이중 His 태그인 것이 바람직하다. His-태깅된 단백질은 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 수지의 칼럼 상에 특이적으로 트랩핑되며, EDTA 또는 이미다졸에 의해 용출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법 또는 과당으로부터 알룰로스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 과당으로부터 알루로스스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 알룰로스 생산용 조성물이 있다.
상기 알룰로스 생산용 조성물의 일 예는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함한다. 또한, 상기 알룰로스 생산용 조성물의 다른 예는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함한다. 이때, 상기 알룰로스 생산용 조성물은 바람직하게는 망간 이온, 니켈 이온 및 코발트 이온으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 니켈 이온 또는 코발트 이온을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 나타내며, 상기 효소에 의한 반응을 니켈 이온 또는 코발트 이온과 같은 특정 금속 이온의 존재 하에서 수행함으로써 알룰로스의 생산 수율을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법의 일 예는 과당을 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환 되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류는 전술한 바와 같다. 일 예로, 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 효소 변이체와 과당의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또한, 다른 예로 상기 금속 이온은 효소 변이체가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 효소 변이체가 고정화된 담체와 과당의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온이 배양물에 첨가되거나 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수도 있다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 재조합 균주는 바람직하게는 담체에 고정화된다. 상기 담체는 고정된 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 담체로 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소를 안정적으로 고정시킬 수 있고 알룰로스 수율 측면에서 유리할 수 있다. 일 예로, 알룰로스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 바람직하게는 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 재조합 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 반응 온도는 60~70℃, 바람직하게는 60~67℃, 효소 변이체의 안정성 및 최대 활성을 고려할 때 더 바람직하게는 62~65℃의 범위이고, 반응 pH는 6.5~8, 바람직하게는 6.5~7.5, 더 바람직하게는 6.5~7의 범위이다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 과당의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 생산성 내지 경제성을 고려할 때 전체 반응물을 기준으로 1~75%(w/w)인 것이 바람직하고, 4~35%(w/w)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 사용되는 효소 변이체의 농도는 전체 반응물 기준으로 0.001~0.1 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.01~0.1 ㎎/㎖, 더 바람직하게는 0.02~0.05 ㎎/㎖일 수 있다. 또한, 재조합 균주를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 경우 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe)급 균주를 의미하며, 예를 들어 사카로마이세스속 균주( Saccharomyces sp.), 바실러스속 균주( Bacillus sp.), 코리네박테리움속 균주( Corynebacterium sp.) 등에서 선택될 수 있다. 상기 균주들은 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 균주들은 유전자 조작 및 대량 배양에 용이하거나, 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이다. 또한, 이러한 균주들은 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 보유하고 있기 때문에 높은 당 농도 등에 의한 삼투압의 영향 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 GRAS(generally accepted as safe)급 균주의 구체적인 예로는 사카로마이세스 세레비지애( Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum) 등이 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1 : D-알룰로스 3-에피머화 효소의 전환율 및 열 안정성 향상을 위한 아미노산 치환 위치 탐색
플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)로부터 유래한 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상을 위해 단백질 구조 예측에 기반하여 아미노산 치환 위치를 선정하였다. 상기 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)로부터 유래한 D-알룰로스 3-에피머화 효소(또는 D-사이코스 3-에피머화 효소)는 본원발명의 출원인이 이전에 출원하여 등록받은 대한민국 등록특허 제10-1473918호(2014.12.11)에 개시되어 있다. 상기 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)로부터 유래한 D-알룰로스 3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고 중성 이하의 pH 조건에서 과당의 알룰로스로의 전환에 대해 최대 활성을 가지며 짧은 시간에 높은 수율로 과당으로부터 알룰로스의 대량 생산이 가능하나 오염 방지 등을 위해 고온 조건에서 효소 반응을 진행하는 경우 활성이 급격이 감소하는 문제가 있다. 본 발명의 발명자들은 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii)로부터 유래한 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성을 향상시키기 위해 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열을 기반으로 호몰로지 모델링 기법을 이용하여 단백질 구조를 예측하고, 아미노산 치환 위치를 탐색하였다. 상기 호몰로지 모델링은 Robetta 서버를 이용하여 수행되었고, 단백질 구조 예측 및 분석은 Coot, PyMol, UCSF Chimera와 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행되었다. D-알룰로스 3-에피머화 효소의 3차원 구조 모델 분석을 통해 화학 결합의 변화시 전환율 및 열 안정성 향상과 관련될 것으로 예상되는 총 7개의 아미노산 잔기 위치 및 상기 위치로 치환될 아미노산 잔기를 선정하였다. 도 1은 본 발명의 발명자들이 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상시키기 위해 치환 후보로 선정한 총 7개의 아미노산 잔기 위치를 나타낸 것이다. 도 1에서 "W29"는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 나타내고, "C35"는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 위치에 존재하는 시스테인(Cys)을 나타내고, "D79"는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 79번째 위치에 존재하는 아스파트산(Asp)을 나타내고, "V109"는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 109번째 위치에 존재하는 발린(Val)을 나타내고, "M199"는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 199번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 나타내고, "N218"은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 218번째 위치에 존재하는 아스파라진(Asn)을 나타내고, "M234"는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 나타낸다. 또한, 도 1에 도시되어 있지는 않으나, 선행연구 결과로부터 서열번호 1의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)을 "G216"으로 명명하고 치환 후보로 선정하였다. 또한, 후술하는 바와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 라이신(Lys)으로 치환하여 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 35번째 위치에 존재하는 시스테인(Cys)을 류신(Leu)으로 치환하여 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 C35L을 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 79번째 위치에 존재하는 아스파트산(Asp)을 프롤린(Pro)으로 치환하여 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 D79P를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 109번째 위치에 존재하는 발린(Val)을 알라닌(Ala)으로 치환하여 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 V109A를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 199번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 페닐알라닌(Phe)으로 치환하여 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 M199F를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)을 세린(Ser)으로 치환하여 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 G216S를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 218번째 위치에 존재하는 아스파라진(Asn)을 시스테인(Cys)으로 치환하여 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 N218C를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 이소류신(Ile)으로 치환하여 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 M234I를 제작하였다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 라이신(Lys)으로 치환하고 동시에 서열번호 1의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)을 세린(Ser)으로 치환하여 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/G216S를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 라이신(Lys)으로 치환하고 동시에 서열번호 1의 아미노산 서열 중 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 이소류신(Ile)으로 치환하여 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/M234I를 제작하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)을 세린(Ser)으로 치환하고 동시에 서열번호 1의 아미노산 서열 중 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 이소류신(Ile)으로 치환하여 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 G216S/M234I를 제작하였다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 라이신(Lys)으로 치환하고 서열번호 1의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)을 세린(Ser)으로 치환하고 동시에 서열번호 1의 아미노산 서열 중 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)을 이소류신(Ile)으로 치환하여 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/G216/M234I를 제작하였다.
실시예 2 : 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii ) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체의 과발현을 위한 재조합 벡터 및 재조합 균주 제작
플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소의 야생형 폴리뉴클레오티드를 기반으로 overlap extension polymerase chain reaction 방법을 이용하여 효소 변이체 12종(W29K, C35L, D79P, V109A, M199F, G216S, N218C, M234I, W29K/G216S, W29K/M234I, G216S/M234I, W29K/G216S/M234I)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하였다.
먼저, 플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제작하기 위해 하기 표 1에 보이는 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 구체적으로, 100μM의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)가 첨가된 반응액에 표 1의 프라이머인 올리고뉴클레오티드 1pM, 템플레이트(주형)로 이용되는 플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소의 야생형 폴리뉴클레오티드(서열번호 14) 100ng을 혼합하고 Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc., JAPAN)를 이용하여 pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(Bioneer) 1 유니트의 존재 하에 25~30주기로 PCR 반응을 수행하였다.
프라이머 설명 프라이머 염기서열(5'→3')
W29K 순방향 프라이머 CCCTGATGGAGAAGCTGGCCAAACTGGGCTTTGACATCTGCGA
W29K 역방향 프라이머 TCGCAGATGTCAAAGCCCAGTTTGGCCAGCTTCTCCATCAGGG
C35L 순방향 프라이머 CCTGGCTGGGCTTTGACATCCTGGAGGTGGCCTCCGCCGAGTG
C35L 역방향 프라이머 CACTCGGCGGAGGCCACCTCCAGGATGTCAAAGCCCAGCCAGG
D79P 순방향 프라이머 CCAAATACGACCTGGCCAGCCCCGATCCGGCGGTGCGGGAGAA
D79P 역방향 프라이머 TTCTCCCGCACCGCCGGATCGGGGCTGGCCAGGTCGTATTTGG
V109A 순방향 프라이머 GGGCGGCCATCCTCAACGGCGCCTCCTACGCCGGGTGGCAGGC
V109A 역방향 프라이머 GCCTGCCACCCGGCGTAGGAGGCGCCGTTGAGGATGGCCGCCC
M199F 순방향 프라이머 TGAACATCGAGGAGGACAGCTTCGTGGACGCCATTCTGGAGGC
M199F 역방향 프라이머 GCCTCCAGAATGGCGTCCACGAAGCTGTCCTCCTCGATGTTCA
G216S 순방향 프라이머 GGCTGGGGCATTTCCACGTGAGCGAGAACAACCGCCGCCCCGC
G216S 역방향 프라이머 GCGGGGCGGCGGTTGTTCTCGCTCACGTGGAAATGCCCCAGCC
N218C 순방향 프라이머 GGCATTTCCACGTGGGGGAGTGCAACCGCCGCCCCGCCGGCTC
N218C 역방향 프라이머 GAGCCGGCGGGGCGGCGGTTGCACTCCCCCACGTGGAAATGCC
M234I 순방향 프라이머 ACCGCCTGCCCTGGAAGGACATTGCCGCCGCCCTCAAGCAGGT
M234I 역방향 프라이머 ACCTGCTTGAGGGCGGCGGCAATGTCCTTCCAGGGCAGGCGGT
프라이머 조합을 통해 변이체 단편을 증폭한 뒤, 각각의 쌍을 주형으로 하고 NdeI과 XhoI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 overlap extentention PCR을 통해 최종적으로 효소 변이체 12종(W29K, C35L, D79P, V109A, M199F, G216S, N218C, M234I, W29K/G216S, W29K/M234I, G216S/M234I, W29K/G216S/M234I)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하였다. 하기 표 2에 제한 효소 인식 부위의 서열을 도입하기 위해 사용된 프라이머의 염기서열을 나타내었다.
프라이머 설명 프라이머 염기서열(5'→3')
NdeI 순방향 프라이머 GCATGCCATATGAACCCGATTGGAATGCA
XhoI 역방향 프라이머 GCATGCCTCGAGCGCGGTCAGCTCCTTGAGGA
서열번호 15의 염기서열은 효소 변이체 W29K의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 16의 염기서열은 효소 변이체 C35L의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 17의 염기서열은 효소 변이체 D79P의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 18의 염기서열은 효소 변이체 V109A의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 19의 염기서열은 효소 변이체 M199F의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 20의 염기서열은 효소 변이체 G216S의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 21의 염기서열은 효소 변이체 N218C의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 22의 염기서열은 효소 변이체 M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 23의 염기서열은 효소 변이체 W29K/G216S의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 24의 염기서열은 효소 변이체 W29K/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 25의 염기서열은 효소 변이체 G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 26의 염기서열은 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타낸다. 서열번호 15 내지 26의 염기서열은 효소 변이체의 아미노산 서열에 직접 대응되는 염기서열로 구성되어 있고, 편의상 제한 효소 인식 부위의 서열을 생략하였다.
이후, 제작된 폴리뉴클레오티드 단편을 제한효소 NdeI과 XhoI을 사용하여 발현벡터인 pET28a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 발현 벡터 12종을 제작하였다. 또한, 열충격(heat shock) 방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning. 참조)을 사용하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)에 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질전환하고, 재조합 대장균 12종을 제작하였다. 제작한 재조합 대장균에 60% 글리세린 용액을 첨가하고, 효소 발현을 위한 배양을 실시하기 전에 -70℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 3 : 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii ) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체의 발현 및 정제
하기 표 3의 조성(배지 1L 기준)을 가진 단백질 발현용 배지 150㎖가 수용된 1L 용량의 플라스크에 실시예 2에서 제작한 재조합 대장균 1㎖를 접종하고 진탕 배양기로 32℃의 온도 조건 및 140 rpm의 진탕 조건을 유지하면서 24 hr 동안 배양하였다. 배지에 포함된 1% 락토스(Lactose)로 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 과발현을 유도하였다.
배지 성분 함량 배지 성분 함량
글리세롤(Glycerol) 9.0 중량% MgSO 4 0.1 중량%
락토스(Lactose) 1.0 중량% FeSO 4 10.0 ppm
(NH 4) 2SO 4 0.6 중량% MnSO 4 10.0 ppm
KH 2PO 4 0.5 중량% ZnSO 4 10.0 ppm
YPA 1.5 중량% 소포제(네오린) 1.0 drop
이후, 과발현된 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 다음과 같은 방법으로 분리하였다. 먼저, 재조합 대장균의 배양액을 4100×g 및 4℃의 조건에서 약 15분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 재조합 대장균의 균체를 회수하였다. 이후, 회수된 재조합 대장균의 균체를 lysis buffer(50mM 제1인산칼륨, 300mM 염화칼륨, 5mM 이미다졸 함유)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기(Sonicator)로 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이후, 세포 파쇄액을 15,814×g 및 4℃의 조건에서 약 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 제거하고 상등액만을 회수하였다. 이후, 히스티딘 태그(His-tag) 친화 크로마토그래피 컬럼 및 탈염(desalting) 컬럼을 이용해 회수한 상등액으로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 함유한 정제 효소액을 분리하였다.
실시예 4 : D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 확인
플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소의 야생형 및 변이체의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성을 확인하기 위해 효소를 고온에 일정 시간 동안 노출시킨 후 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 감소하는 정도를 분석하였다. 구체적으로 실시예 3에서 수득한 정제 효소액(효소 농도 1 ㎎/㎖)을 62℃의 항온 수조에서 0 hr, 1 hr 및 2 hr 동안 보관하여 열처리 하였다. 이후, 4%(w/w) 과당 및 1mM 황산니켈(NiSO 4)의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)에 열처리된 정제 효소액을 효소 농도가 25 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 진탕 항온 수조(VS-1205SW1, 비전과학)를 이용하여 65℃의 온도 조건 및 120 rpm의 진탕 조건에서 25분 동안 반응시켰다. 이후, 반응 생성액의 온도를 4℃로 낮추어 반응을 정지시키고 16,600×g 및 4℃의 조건에서 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이후, 당 분석 컬럼(Benson, 미국)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(SP930D pump, 영린기기; MIDAS 자동시료주입기, Spark Holland 社) 및 굴절지수 검출기(2414 refractive index detector, Waters 社)를 이용하여 상등액 내 알룰로스 농도 및 과당 농도를 측정하고, 측정된 결과로부터 과당의 알룰로스로의 전환율을 계산한 후, 전환율을 효소 활성의 지표로 사용하였다.
하기 표 4 및 표 5에 플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소의 야생형 및 변이체를 열처리 하였을 때 열처리 조건별 과당의 알룰로스로의 전환율을 나타내었다.
62℃에서의 열처리 시간 알룰로스 에피머화 효소 야생형 및 변이체의 열처리 시간별 과당의 알룰로스로의 전환율(%)
야생형 W29K C35L D79P V109A M199F G21GS
0 hr 17.8 20.9 16.3 18.1 1.0 16.4 17.6
1 hr 4.9 9.4 1.8 0.4 0.1 2.6 12.4
2 hr 2.4 5.3 0.0 0.3 0.0 0.7 7.7
62℃에서의 열처리 시간 알룰로스 에피머화 효소 야생형 및 변이체의 열처리 시간별 과당의 알룰로스로의 전환율(%)
N218C M234I W29K/G216S W29K/M234I G216S/M234I W29K/G216G/M234I
0 hr 14.3 19.5 21.6 22.3 20.7 23.9
1 hr 1.3 7.5 13.2 17.4 17.1 20.7
2 hr 0.2 3.8 7.9 13.3 12.2 14.9
상기 표 4에서 보이는 바와 같이 플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소 야생형의 아미노산 잔기 1개를 다른 아미노산 잔기로 치환한 알룰로스 에피머화 효소 변이체 중 W29K, G216S, M234I는 알룰로스 에피머화 효소 야생형(Wild type)과 비교했을 때 열처리와 상관없이 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 야생형과 거의 동일하거나 더 높았고, 특히 현저하게 향상된 열 안정성을 나타내었다. 또한, 플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소 야생형의 아미노산 잔기 2개를 다른 아미노산 잔기로 치환한 알룰로스 에피머화 효소 변이체 중 W29K/M234I는 열처리와 상관없이 과당의 알룰로스로의 전환 활성 및 열 안정성이 매우 우수하였다. 또한, 플라보니프랙터 플라우티 유래 알룰로스 에피머화 효소 야생형의 아미노산 잔기 3개를 다른 아미노산 잔기로 치환한 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I는 열처리와 상관없이 과당의 알룰로스로의 전환 활성 및 열 안정성이 가장 우수하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체.
  2. 제1항의 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 염기 서열, 서열번호 24의 염기 서열 또는 서열번호 26의 염기 서열에서 선택된 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터 중 어느 하나에 의해 형질전환된 재조합 균주.
  6. 제5항의 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 발현시키는 단계; 및
    상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 분리하는 단계를 포함하는 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 제조방법.
  7. 제1항의 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물.
  8. 제5항의 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물.
  9. 과당을 제1항의 알룰로스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법.
  10. 과당을 제5항의 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법.
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