KR101841267B1 - 라이보스-5-인산 이성화효소, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알로스의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens)에서 유래하고, 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환시킬 수 있는 신규 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 제공한다. 본 발명에 따른 신규한 라이보스-5-인산 이성화효는 상대적으로 마일드한 온도 조건과 중성에 가까운 pH에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 열 안정성이 우수하고, 짧은 시간 동안에 높은 수율로 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)의 대량 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 라이보스-5-인산 이성화효소는 알로스를 산업적으로 제조하는데에 유리하고, 이렇게 생산된 알로스는 기능성 당 산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품 소재, 의약용, 화장품용 소재 등 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

라이보스-5-인산 이성화효소, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알로스의 제조방법{Ribose-5-phosphate isomerase, manufacturing method thereof and manufacturing method of allose using the same}

본 발명은 알룰로스를 알로스로 전환시킬 수 있는 신규 라이보스-5-인산 이성화효소, 재조합 균주로부터 이를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 알룰로스로부터 알로스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

알로스 (allose)는 포도당 (D-glucose)의 3번 탄소 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psocose)로도 불리우는 알룰로스(allulose)의 이성질체인 희소성 단당류로 알려져 있다. 이러한 알로스는 암세포의 증식의 저해하는 특성을 가지기 때문에 항암물질로 사용되고, 허혈작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 기능도 가지기 때문에 장기보존액으로도 사용될 수 있다. 또한, 알로스는 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판의 감소도 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 알로스는 현재 의학적으로 매우 주목을 받는 희소성 당류 중 하나이다 (Hossain, M. A., Izuishi, K., and H., Maeta. 2003, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 10: 218225.; Hossain, M. A., Izuishi, K., Tokuda, M., Izumori, K., and H. Maeta. 2004, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 11: 181189.; Hossain, M. A., Wakabayashi, H., Izuishi, K., Okano, K., Yachida, S., Tokuda, M., Izumori, K., and H., Maeta. 2006, J. Biosci. Bioeng., 101: 369371.)

이와 같이 알로스는 의약 산업 분야에서 높은 이용 가치가 있음에도 불구하고,자연계에는 극히 미량만이 존재하기 때문에 효과적으로 의약적 응용 분야에 공급되기 위해서는 알로스를 충분한 양으로 확보하는 것이 필요하다. 또한, 지금까지 알로스는 주로 화학적인 합성 방법에 의해서만 생산되어 왔다. 그러나 알로스의 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학적 반응 후 부가적인 당류의 생성, 이로 인한 복잡한 알로스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경 오염 문제 등이 유발되고 있다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 특정 당류를 환경 친화적이고 특이성은 높게 대량 생산할 수 있는 방법으로서 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 생물학적으로 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법이 최근에 주목을 받으며 시도되어 왔다. 구체적으로, 일본 카가와 대학의 이즈모리 그룹에서 알로스의 생물학적인 생산 방법을 연구한 바 있었다. 여기서는 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 유래한 람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)를 사용하여 알룰로스로부터 처음 알로스를 생산하여 보고하였다. 그러나 이 람노스 이성화효소는 알로스 생산 시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose)도 함께 생성시키므로, 이 과정에서 금속 이온을 첨가해야 하는 단점이 있었다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1217670호에는 알트로스와 같은 부산물이 생성되지 않고 금속 이온의 첨가도 요구하지 않으면서 알로스를 생산할 수 있는 효소로 라이보스-5-인산 이성화효소가 개시되어 있다. 상기 라이보스-5-인산 이성화효소의 유전자는 인산 5탄당 대사 회로에 있어 라이보스(ribose)를 라이불로스(ribulose)로 전환하는 효소로 이미 알려져 있고, 여러 미생물들에서도 알로스 대사에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 한편, 대한민국 등록특허공보 제10-1217670호에 개시되어 있는 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)는 크로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)으로부터 유래하거나 이들의 돌연변이 효소로서, 알룰로스로의 알로스의 최대 전환율은 높으나, 단위시간당 알룰로스로의 알로스의 전환 활성은 상대적으로 높지 않다. 따라서, 상기 크로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)으로부터 유래된 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 또는 이의 돌연변이 효소를 이용하여 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 경우 산업적인 관점에서 한계가 있다.

본 발명은 종래의 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명은 첫 번째 목적은 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환하는 활성을 보유하고, 열 안정성이 우수하며, 단위시간당 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환활성이 높은 신규 라이보스-5-인산 이성화효소를 제공하는데에 있다.

본 발명의 두 번째 목적은 신규 신규 라이보스-5-인산 이성화효소를 제조하는 방법 또는 신규 신규 라이보스-5-인산 이성화효소를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.

본 발명의 세 번째 목적은 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법 또는 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.

본 발명의 발명자들은 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens)에서 클로닝한 특정 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소가 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 높은 활성을 나타내고, 열 안정성이 우수하고, 단위시간당 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환활성이 공지의 라이보스-5-인산 이성화효소에 비해 높다는 점을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

상기 첫 번째 목적을 해결하기 위하여 본 발명은서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 제공한다.

상기 두 번째 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 프라이머 쌍을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 라이보스-5-인산 이성화효소를 발현시키는 단계; 및 상기 라이보스-5-인산 이성화효소가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 라이보스-5-인산 이성화효소를 분리하는 단계를 포함하는 라이보스-5-인산 이성화효소의 제조방법을 제공한다.

상기 세 번째 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 포함하는 알로스(allose) 생산용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함하는 알로스(allose) 생산용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 알룰로스(allulose)를 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 또는 상기 라이보스-5-인산 이성화효소를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알로스(allose)의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 알룰로스(allulose)를 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알로스(allose)의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)는 상대적으로 마일드한 온도 조건과 중성에 가까운 pH에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 열 안정성이 우수하고, 짧은 시간 동안에 높은 수율로 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)의 대량 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 라이보스-5-인산 이성화효소는 알로스를 산업적으로 제조하는데에 유리하고, 이렇게 생산된 알로스는 기능성 당 산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품 소재, 의약용, 화장품용 소재 등 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens) KCTC 5716의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 증폭되고 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 유전자에 해당하는 PCR 산물을 Southern blot으로 분석한 결과이다.
도 2는 재조합 발현벡터인 pET28aCPRPI의 개열 지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 His 태그 어피니티 크로마토그래피를 통해 정제된 라이보스-5-인산 이성화효소에 대해 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 4는 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 활성을 반응 온도별로 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 활성을 반응 pH별로 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 기질별 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소를 사용하여 최적 조건에서 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환하는 반응을 진행할 때 반응 시간별 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환율을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 열 안정성을 보관 시간(X 축) 및 보관 온도별로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 측면은 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환시킬 수 있는 신규 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase; 이하, 라이보스-인산 이성화효소라 한다)에 관한 것이다. 상기 라이보스-인산 이성화효소는 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens)에서 유래한 것으로서, 상대적으로 마일드한 온도와 중성에 가까운 pH에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 열 안정성이 우수하고, 짧은 시간 동안에 높은 수율로 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)의 대량 생산이 가능하다. 상기 라이보스-인산 이성화효소는 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens) 유전체 DNA에 존재하는 무수한 DNA 중 특정 DNA을 중합효소반응에 의해 증폭시키고, 증폭된 특정 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소는 바람직하게는 분자량이 10 내지 20 kDa이고 최적 활성 온도가 60~75℃의 범위이고, 최적 활성 pH가 6.5~8의 범위이다. 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지나, 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소의 균등 범위는 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소의 균등 범위는 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 4의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소의 균등 범위는 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 하기 표 1은 보존적 아미노산 치환에 의해 단백질 내 아미노산을 대체할 수 있는 아미노산들을 보여준다.

펩티드 내 아미노산 잔기	보존적 치환기
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Gln	Asn
Cys	Ser
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr, Gly
Thr	Ser, Val
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

본 발명의 다른 측면은 신규 라이보스-인산 이성화효소를 제조하는 방법 또는 신규 라이보스-인산 이성화효소를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 신규 라이보스-인산 이성화효소를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 폴리뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 재조합 벡터, 재조합 균주 등이 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 바람직하게는 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어진다. 본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일-및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA 또는 이들의 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 균등 범위는 서열번호 1의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 1의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

또한, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 것으로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열을 가진 순방향 프라이머와 서열번호 3의 염기 서열을 가진 역방향 프라이머로 구성된다.

또한, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지의 표준 방법을 사용하여 클로닝 벡터나 발현 벡터 내로 삽입한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 용어 "클로닝 벡터"는 숙주 세포 내로 DNA 단편을 운반하고 이를 재생산할 수 있는 물질로 정의된다. 본 발명에서 클로닝 벡터는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal), 전사 종결 서열(transcription termination sequence) 및 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)를 포함한다. 또한, 클로닝 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명에서 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있고, 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)가 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 적절한 숙주 안에서 클로닝된 DNA의 전사와 번역을 위해 필요한 DNA 서열로 정의된다. 또한, 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 추가적 발현 조절 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 단일 폴리뉴클레오티드 상의 폴리뉴클레오티드 서열 연관성으로 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 연결되어 작동되거나, 리보좀 결합 자리가 번역을 촉진시킬 수 있도록 위치하고 있다면, 리보좀 결합 자리는 코딩 서열에 연결되어 작동되는 것이다. 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 조절 서열에 연결되어 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이고, 상기 발현 벡터는 바람직하게는 도 2의 개열 지도를 갖는다.

또한, 상기 재조합 균주는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것이다. 본 발명에서 용어, "재조합 균주"는 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 갖는 발현 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포로는 원핵 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 등 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등을 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다.

또한, 상기 라이보스-인산 이성화효소의 제조방법은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 사이코스 에피머화 효소를 발현시키는 단계; 및 상기 라이보스-인산 이성화효소가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 라이보스-인산 이성화효소를 분리하는 단계를 포함한다. 숙주 세포에 의한 단백질의 발현은 유도 인자인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 사용하여 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서 라이보스-인산 이성화효소는 재조합 균주의 파쇄물로부터 회수될 수 있다. 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 또는 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 예를 들어, 숙주 세포에 의해 발현된 단백질의 분리 또는 정제 방법으로는 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 또는 복합 방법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 재조합 균주의 파쇄물로부터 라이보스-인산 이성화효소를 분리하는 단계는 바람직하게는 펩티드 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드 태그로는 HA 태그, FLAG 태그, His 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc 태그, V5 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 MBP(maltose binding protein) 등과 같이 공지의 다양한 태그를 사용할 수 있으며, 이중 His 태그인 것이 바람직하다. His-태깅된 단백질은 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 수지의 칼럼 상에 특이적으로 트랩핑되며, EDTA 또는 이미다졸에 의해 용출될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법 또는 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 알로스(allose) 생산용 조성물이 있다.

상기 알로스(allose) 생산용 조성물의 일 예는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 포함한다. 또한, 상기 알로스(allose) 생산용 조성물의 다른 예는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함한다.

또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법의 일 예는 알룰로스(allulose)를 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법의 다른 예는 알룰로스(allulose)를 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 상기 라이보스-인산 이성화효소 또는 상기 재조합 균주는 바람직하게는 담체에 고정화된다. 상기 담체는 고정된 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 담체로 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되며, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 알로스(allose) 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. 일 예로, 알로스(allose)의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 바람직하게는 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 재조합 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 반응 온도는 60~75℃, 효소의 활성을 고려할 때 바람직하게는 65~73℃의 범위이고, 반응 pH는 6.5~8, 효소의 활성을 고려할 때 바람직하게는 7~8의 범위이다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 효소 기질인 알룰로스(allulose)의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 생산성 내지 경제성을 고려할 때 전체 반응물을 기준으로 0.5~20%(w/w)인 것이 바람직하고, 1~10%(w/w)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 제조하는 방법에서 사용되는 효소의 양은 전체 반응물 기준으로 0.01~0.5 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.05~0.2 ㎎/㎖일 수 있다. 또한, 재조합 균주를 이용하여 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 경우 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe) 균주를 의미하며, 예를 들어 코리네박테리움속 균주일 수 있다. 상기 코리네박테리움속 균주는 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네박테리움속 균주는 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이고, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 보유하고 있다. 또한, 코리네박테리움속 균주는 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 코리네박테리움속 균주의 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 : 라이보스 -5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase )를 생산하는 재조합 균주의 제조

한국 미생물자원센터에서 분양받은 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens) KCTC 5716으로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 이를 주형으로 이용하고, 라이보스-5-인산 이성화효소((ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 유전자(서열번호 1의 폴리뉴클레오티드)를 클로닝하기 위한 프라이머 및 Ex-Taq(TAKARA) 중합효소를 이용하여 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 하기 표 2는 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens)의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 사용된 프라이머를 나타낸 것이다. 하기 표 2에 나타난 프라이머는 Bioneer co.,KR에 의뢰하여 제작하였다.

서열번호	프라이머 종류	염기서열(5'→3')	제한효소 인식부위
2	라이보스-5-인산 이성화효소 클로닝용 forward primer	TTGGAGGACATATGATTGCAATAGG	Nde I
3	라이보스-5-인산 이성화효소 클로닝용 reverse primer	ATTTTTGCGGCCGCTCACTTTGTAA	Not I

이후, 겔 추출 키트(gel extraction kit; Qiagen)를 이용하여 PCR 산물로터 원하는 목적 DNA만을 분리한 후 Easy T-벡터(promega)에 결합하고, 분리한 목적 DNA의 염기서열 분석을 Bioneer co.,KR에 위탁하여 측정하였다. 도 1은 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens) KCTC 5716의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 증폭되고 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 유전자에 해당하는 PCR 산물을 Southern blot으로 분석한 결과이다. 그 결과, PCR을 통해 증폭된 목적 DNA가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 해당하는 것을 확인하였다. 이후, PCR 반응에 의해 증폭된 목적 DNA를 제한효소인 Nde I과 Not I을 이용하여 발현벡터인 pET28a 벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 인식부위에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pET28aCPRPI를 제작하였다. 도 2는 재조합 발현벡터인 pET28aCPRPI의 개열 지도이다. 이후, 컴피턴트 세포인 BL21(제조사 : RBC, Taipei, Taiwan) 대장균을 전기천공을 이용하여 재조합 발현벡터인 pET28aCPRPI로 형질전환시켜 재조합 균주를 제조하였다.

실시예 2 : 라이보스 -5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase )의 발현 및 정제

형질전환된 재조합 균주의 단일 콜로니를 15㎖의 LB-kanamycin 배지(Difco)에 접종한 후 37℃ 및 200rpm의 조건에서 약 6시간 동안 전 배양(pre culture) 하였다. 이후 전 배양액을 500㎖의 LB-카나마이신(kanamycin) 배지에 접종하고 37 ℃ 및 200rpm의 조건에서 진탕배양하였다. 이후, 배양액의 흡광도(at 600㎚)가 0.5일 때 IPTG를 0.1mM의 농도가 되도록 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 이때 과발현 유도 시점부터 배양은 16℃ 및 150rpm의 조건으로 전환하여 약 16시간 동안 유지하였다. 이후, 재조합 균주의 배양액을 13000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 재조합 균주의 균체를 회수하였다.

회수된 재조합 균주의 균체를 용해 완충액(lysis buffer; 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 10 mM imidazol)에 현탁시킨 후 초음파로 처리하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 13000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA 칼럼(Bio-Rad, Profinia)에 적용시킨 다음 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0에 20 mM 이미다졸(imidazol)과 200 mM 이미다졸(imidazol)이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 마지막으로 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 200 mM 이미다졸(imidazol)을 흘려주어 목적 단백질을 용출하였다. 이후 용출된 단백질을 효소 활성 측정용 버퍼 용액(PIPES, pH 7.5)에 보관하여 다음 실험에 사용하였다. 또한, 용출된 단백질에 대해 SDS-PAGE를 실시하였고, 용출된 단백질의 크기가 16 kDa인 것을 확인하였다. 도 3은 본 발명의 실시예 2에서 His 태그 어피니티 크로마토그래피를 통해 정제된 라이보스-5-인산 이성화효소에 대해 SDS-PAGE를 실시한 결과이다. 또한, 용출된 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었다.

실시예 3 : 라이보스 -5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase )의 특성 확인

(1) 라이보스-5-인산 이성화효소의 온도 변화에 따른 활성 분석

버퍼 용액(PIPES, pH 7.5)에 상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소 및 기질인 알룰로스(allulose)를 첨가하여 pH가 7.5이고 효소 농도가 0.1 ㎎/㎖이고 기질 농도가 100 mM인 시험 용액을 만들었다. 이후, 시험 용액을 다양한 온도에서 10분 동안 반응시킨 후, 염산 수용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, 생산된 알로스(allose) 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 효소 양과 반응시간으로 나누어 효소 활성을 계산하였다. 도 4는 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 활성을 반응 온도별로 나타낸 그래프이다. 도 4에서 X축은 온도(℃)를 나타낸다. 도 4에서 효소 활성은 최대 활성을 100으로 하여 상대적으로 나타내었다. 도 4에서 보이는 바와 같이 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소는 60~75℃의 온도에서 높은 활성을 나타냈고, 70℃에서 최대 활성을 보였다.

(2) 라이보스-5-인산 이성화효소의 pH 변화에 따른 활성 분석

상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 최적 pH를 알아보기 위해 MC 버퍼, PIPES 버퍼, HEPES 버퍼, Tris 버퍼를 이용하여 다양한 pH의 시험 용액을 만들었다. 구체적으로 다양한 pH 범위를 갖는 버퍼 용액에 상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소 및 기질인 알룰로스(allulose)를 첨가하여 효소 농도가 0.1 ㎎/㎖이고 기질 농도가 100 mM인 시험 용액을 만들었다. 이후, 시험 용액을 70℃의 온도 조건에서 10분 동안 반응시킨 후, 염산 수용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, 생산된 알로스(allose) 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 효소 양과 반응시간으로 나누어 효소 활성을 계산하였다. 도 5는 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 활성을 반응 pH별로 나타낸 그래프이다. 도 5에서 효소 활성은 최대 활성을 100으로 하여 상대적으로 나타내었다. 도 5에서 보이는 바와 같이 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소는 MC 버퍼의 경우 6.5의 pH, PIPES 버퍼의 경우 7~7.5의 pH, HEPES 버퍼의 경우 7.5~8의 pH에서 높은 활성을 나타내었고, PIPES 버퍼 및 pH 7.5에서 최대 활성을 보였다.

(3) 라이보스-5-인산 이성화효소의 기질 특이성 분석

상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 라이불로스-인산(ribulose-phosphste), 알룰로스(allulose), 알로스(allulose), 과당(fructose), 포도당(glulose)와 같은 다양한 기질에 대한 반응 활성을 분석하였다. 구체적으로 버퍼 용액(PIPES, pH 7.5)에 라이보스-5-인산 이성화효소 및 각각의 기질을 첨가하여 pH가 7.5이고 효소 농도가 0.1 ㎎/㎖이며 기질 농도가 100 mM인 시험 용액을 만들었다. 이후, 시험 용액을 70℃의 온도 조건에서 10분 동안 반응시킨 후, 염산 수용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, 생산된 알로스(allose) 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 효소 양과 반응시간으로 나누어 효소 활성을 계산하였다. 이후, 기질의 대응하는 이성화물의 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 효소 양과 반응시간으로 나누어 효소 활성을 계산하였다. 라이불로스-인산(ribulose-phosphste)에 대응되는 이성화물은 라이보스-인산(ribose-phosphate)이고, 알룰로스(allulose)에 대응되는 이성화물은 알로스(allose)이고, 알로스(allose)에 대응되는 이성화물은 알룰로스(allulose)이고 과당(fructose)에 대응되는 이성화물은 포도당(glulose)이며, 포도당(glulose)에 대응되는 이성화물은 과당(fructose)이다. 도 6은 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 기질별 활성을 나타낸 그래프이다. 도 6에서 X축은 반응 기질을 나타낸다. 도 6에서 효소 활성은 라이불로스-인산(ribulose-phosphste)을 기질로 하는 반응의 효소 활성을 100으로 하여 상대적으로 나타내었다. 도 6에서 보이는 바와 같이 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소는 라이불로스-인산(ribulose-phosphste)을 라이보스-인산(ribose-phosphate)으로 전환시키는 반응에 대해 가장 높은 기질 특이성을 보였고, 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환시키는 반응에 대해서도 라이불로스-인산(ribulose-phosphste)을 라이보스-인산(ribose-phosphate)으로 전환시키는 반응 대비 약 25%의 기질 특이성을 보였다. 따라서, 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소를 사용하여 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 높은 수율로 제조할 수 있다.

(4) 라이보스-5-인산 이성화효소의 최대 전환율 분석

버퍼 용액(PIPES, pH 7.5)에 상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소 및 기질인 알룰로스(allulose)를 첨가하여 pH가 7.5이고 효소 농도가 0.1 ㎎/㎖이고 기질 농도가 100 mM인 시험 용액을 만들었다. 이후, 시험 용액을 70℃의 온도 조건에서 반응시켰다. 반응 시간별로 반응 생성물을 10㎕씩 취하고, 25배로 희석하고 염산 수용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, 생산된 알로스(allose) 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 기질로 사용한 알룰로스(allulose)의 양으로 나누어 전환율을 계산하였다. 도 7은 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소를 사용하여 최적 조건에서 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환하는 반응을 진행할 때 반응 시간별 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환율을 나타낸 것이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소를 사용하여 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환시 약 60분 만에 약 33%의 최대 전환율에 도달하였다.

(5) 라이보스-5-인산 이성화효소의 열 안정성 분석

상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소를 버퍼 용액(PIPES, pH 7.5)에 0.5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 준비한 후, 이를 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 및 75℃ 온도로 각각 설정된 수욕(water bath)에 담가두고 보관하여 열 처리를 하였다. 보관 시간별로 효소의 버퍼 용액을 꺼내고, PIPES 버퍼(pH 7.5)를 사용하여 효소의 농도가 0.1 ㎎/㎖가 되도록 희석하고, 여기에 기질인 알룰로스(allulose)를 100 mM의 농도가 되도록 첨가하여 시험 용액을 만들었다. 이후, 시험 용액을 70℃의 온도 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, 염산 수용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, 생산된 알로스(allose) 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 기질로 사용한 알룰로스(allulose)의 양으로 나누어 전환율을 계산하였다. 도 8은 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 열 안정성을 보관 시간(X 축) 및 보관 온도별로 나타낸 것이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소의 버퍼 용액을 70℃에서 약 4시간 동안 열 처리 하는 경우에도 효소 활성은 안정적으로 유지되었고, 75℃에서 열 처리하는 경우 3시간 동안은 효소 활성이 안정적으로 유지되었다.

(6) 공지된 라이보스-5-인산 이성화효소와의 비교

상기 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소를 공지된 라이보스-5-인산 이성화효소와 다양한 공정 조건을 중심으로 비교하였다. 공지된 라이보스-5-인산 이성화효소로 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 균주로부터 유래한 라이보스-5-인산 이성화 효소의 돌연변이 효소인 R132E(대한민국 등록특허공보 제10-1217670호 참조)를 사용하였다. 버퍼 용액(PIPES, pH 7.5)에 라이보스-5-인산 이성화효소 및 기질인 알룰로스(allulose)를 첨가하여 pH가 7.5이고 효소 농도가 0.1 ㎎/㎖이고 기질 농도가 100 mM인 시험 용액을 만들었다. 이후 시험 용액을 사용한 라이보스-5-인산 이성화효소 각각의 최적 조건에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 생산된 알로스(allose) 양(mM)을 HPLC로 분석하여 측정하고, 이를 기질로 사용한 알룰로스(allulose)의 양 및 반응 시간으로 나누어 단위시간당 알로스로의 전환활성을 계산하였다. 하기 표 3에 라이보스-5-인산 이성화효소 종류별 최적 온도, 최적 pH 및 단위시간당 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환활성을 나타내었다. 하기 표 3에서 보이는 바와 같이 실시예 2에서 얻은 라이보스-5-인산 이성화효소는 공지된 라이보스-5-인산 이성화효소 R132E에 비해 최적 온도가 마일드하고 반면 단위시간당 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환활성은 약 1.5배 높은 것으로 나타났다.

효소 특성	클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens) 유래 라이보스-5-인산 이성화효소	크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 유래 돌연변이 라이보스-5-인산 이성화효소 R132E
최적 온도(℃)	70	80
최적 pH	7.5	7.5
단위시간당 알룰로스의 알로스로의 전환활성(Unit)	4.8	3.26

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Ribose-5-phosphate isomerase, manufacturing method thereof and manufacturing method of allose using the same <130> DP-16-289 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> polynucleotide coding ribose-5-phosphate isomerase derived from Clostridium papyrosolvens <400> 1 atgattgcaa taggaagtga ccatgcggga tatctgttaa aagcagatat tataaagttt 60 ttggaaagca aggggcttga ggtaaaggac tttggtacaa actgtccgga ctcagttgat 120 tatcctgatt atggacgggc tgtagcagag gctgtagcca gtaaggaatg tgaaaaaggt 180 attttaatat gcggtaccgg gattggcata tcaatagctg ccaataaggt tccgggtgca 240 agagcagcat tgtgtaccga cagctatatg gcaaaaatgt gcagacagca caatgatgcc 300 aacataatcg ccataggcga aagagttgta ggaccgggac ttgctctcga tataattgaa 360 acatggctgg aaacagaatt tcttggtgga agacaccaga acaggcttga caaaatttca 420 gacattgaaa aaaaatattt tacaaagtga 450 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for cloning ribose-5-phosphate isomerase <400> 2 ttggaggaca tatgattgca atagg 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for cloning ribose-5-phosphate isomerase <400> 3 atttttgcgg ccgctcactt tgtaa 25 <210> 4 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ribose-5-phosphate isomerase derived from Clostridium papyrosolvens <400> 4 Met Ile Ala Ile Gly Ser Asp His Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ala Asp 1 5 10 15 Ile Ile Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Leu Glu Val Lys Asp Phe Gly 20 25 30 Thr Asn Cys Pro Asp Ser Val Asp Tyr Pro Asp Tyr Gly Arg Ala Val 35 40 45 Ala Glu Ala Val Ala Ser Lys Glu Cys Glu Lys Gly Ile Leu Ile Cys 50 55 60 Gly Thr Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ala Asn Lys Val Pro Gly Ala 65 70 75 80 Arg Ala Ala Leu Cys Thr Asp Ser Tyr Met Ala Lys Met Cys Arg Gln 85 90 95 His Asn Asp Ala Asn Ile Ile Ala Ile Gly Glu Arg Val Val Gly Pro 100 105 110 Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ile Glu Thr Trp Leu Glu Thr Glu Phe Leu 115 120 125 Gly Gly Arg His Gln Asn Arg Leu Asp Lys Ile Ser Asp Ile Glu Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Thr Lys 145

Claims (20)

1. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 포함하는 알로스(allose) 생산용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 라이보스-5-인산 이성화효소는 클로스트리디움 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens)에서 유래하는 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 생산용 조성물.
   
3. 재조합 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 조성물로서,
   상기 재조합 균주는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 생산용 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 생산용 조성물.
   
5. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 생산용 조성물.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 2의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 생산용 조성물.
   
7. 알룰로스(allulose)를 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 또는 상기 라이보스-5-인산 이성화효소를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알로스(allose)의 제조방법.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 6.5~8인 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
   
9. 제 7항에 있어서, 상기 알룰로스(allulose)의 농도는 0.5~20%(w/w)인 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
   
10. 알룰로스(allulose)를 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 제조방법으로서,
    상기 재조합 균주는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
    
11. 제 10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
    
12. 제 10항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
    
13. 제 12항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 2의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
    
14. 제 10항에 있어서, 상기 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 6.5~8인 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
    
15. 제 10항에 있어서, 상기 알룰로스(allulose)의 농도는 0.5~20%(w/w)인 것을 특징으로 하는 알로스(allose)의 제조방법.
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