KR20180055736A

KR20180055736A - 신규한 d-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법

Info

Publication number: KR20180055736A
Application number: KR1020170152620A
Authority: KR
Inventors: 김수진; 이영미; 김양희; 김성보; 박승원; 조성준
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2018-05-25
Also published as: EP3543336A4; CN110462036A; CN110462036B; RU2727903C1; AR110093A1; EP3543336A1; WO2018093153A1; UA126473C2; US11174475B2; JP2019535320A; US20200063117A1; KR101919713B1; JP6967599B2; TWI666323B; TW201823456A

Abstract

본 출원은 신규한 D-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 D-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 D-사이코스의 제조 방법{A Novel D-Psicose 3-Epimerase and Methods for Preparing D-Psicose Using The Same}

본 출원은 D-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 D-사이코스의 제조 방법에 관한 것이다.

D-사이코스(D-psicose, 이하 '사이코스'로 기재함)는 자연계에 극소량 존재하는 희소당(rare sugar)으로 알려진 단당류이다. 설탕의 약 70% 감미도를 가지면서도 거의 제로 칼로리에 가깝고, 혈당억제 및 지방합성 억제 등의 기능성으로 새로운 식품원료로서 많은 관심을 받고 있다.

이러한 특징으로 인하여 사이코스는 설탕을 대체할 수 있는 감미료로서 다양한 식품에 사용이 고려되고 있으나, 자연계에 극히 소량 존재하기 때문에 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 필요성이 높아지고 있다.

종래 알려진 사이코스의 생산 방법은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하거나(Bilik V, Tihlarik K, 1973, Reaction of saccharides catalyzed by molybdate ions. IX. Epimerization of ketohexoses. Chem Zvesti 28:106-109), 에탄올과 트라이에틸아민(triethyamine)과 함께 가열하여 D-프럭토스에서 사이코스를 생산하는 화학적 방법(Doner LW, 1979, Isomerization of d-fructose by base: liquid-chromatographic evaluation and the isolation of d-psicose. Carbohydr Res. 70:209-216)과 D-사이코스 3-에피머화 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 D-프럭토스에서 사이코스를 생산하는 생물학적 방법(대한민국 특허공개 제10-2011-0035805호)이 있다. 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 부산물이 많이 생성되어 복잡한 정제 과정이 필요하고, 생물학적인 방법 역시 수율이 매우 낮고 생산비용이 높다는 문제점이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 사이코스 생산 수율을 개선할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 출원의 신규한 D-사이코스-3-에피머화 효소(이하, 이를 "사이코스 에피머화 효소"라 한다)를 이용하는 경우 D-프럭토스에서 사이코스로의 전환 속도를 높여 사이코스 생산 수율을 현저하게 상승시킬 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 목적은, 신규한 사이코스 에피머화 효소, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터가 도입된 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 D-사이코스 제조용 조성물 및 상기 효소를 이용한 D-사이코스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원은 일 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소를 제공한다.

일 구현예로, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. D-프럭토스를 사이코스로 전환하는 활성을 가지며 상기 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부가 치환, 삽입, 변형 및/또는 결실된 경우를 포함할 수 있음은 자명하다. 또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 사이코스 에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체 (monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체 (polymer)로 비개질된 또는 개질된 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 말한다.

본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.

본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

또한, 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.

나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열 범위에 포함될 수 있음은 자명하다. 당업자는 공지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 서열번호 2의 염기 서열 중 하나 이상을 치환, 부가 및/또는 결실하여 실질적으로 동등 활성을 갖는 범위의 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있음을 이해할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 카이스티아 속(the genus of Kaistia) 미생물로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 카이스티아 그래뉼리(Kaistia granuli)로부터 유래된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 카이스티아 그래뉼리 KCTC 12575로부터 유래된 것일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 소디움도데실설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)를 통하여 측정된 분자량이 25 kDa 내지 37 kDa, 27 kDa 내지 35 kDa 또는 30 kDa 내지 35 kDa일 수 있다.

본 출원은 다른 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열과 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 본 출원에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.

본 출원은 또 다른 양태로서, 본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 출원의 재조합 벡터는 사이코스 에피머화 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지의 표준 방법을 사용하여 클로닝 벡터나 발현 벡터 내로 삽입한 형태일 수 있다. 본원에서 "클로닝 벡터"는 숙주 세포 내로 DNA 단편을 운반하고 이를 재생산할 수 있는 벡터를 말한다. 클로닝 벡터는 폴리아데닐레이션 시그널, 전사 종결 서열, 및/또는 다중 클로닝 사이트를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 다중 클로닝 사이트는 엔도뉴클레아제, 제한효소 부위 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예에서, 사이코스 에피머화 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐레이션 시그널과 전사 종결 서열의 업스트림에 위치할 수 있다. 본원에서 "발현 벡터"는 적절한 숙주 안에서 클로닝된 DNA의 전사와 번역을 위해 필요한 DNA 서열을 말한다. 또한, 본원에서 "발현 벡터"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 "작동가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오티드 상의 폴리뉴클레오티드 서열 연관성으로 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절되는 것을 말한다. 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 사이코스 에피머화 효소를 인코딩하는 유전자 및 종결코돈 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 출원은 또 다른 양태로서, 본 출원의 재조합 벡터가 도입된 미생물을 제공한다

일 구현예로, 본 출원의 재조합 벡터가 도입된 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 사이코스 에피머화 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미의미하며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다. 본 출원의 형질전환 방법으로는 일시적 형질전환, 미세 주사, 형질 도입, 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포솜 매개 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질 감염, 전기천공, 전기주입, 화학 처리 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포로는, 원핵 세포, 식물 세포, 동물 세포 등을 들 수 있으나, DNA 도입효율이 좋고, 도입된 DNA의 발현율이 높은 숙주세포가 이용될 수 있다. 예컨데, 숙주세포는 대장균, 바실러스속 균주, 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라속 균주 등 일 수 있으며, 예컨대, W3110, BL21, JM109, K-12, LE392, RR1 및 DH5a 등과 같은 대장균일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 미생물은 KCCM11918P로 기탁된 E. coli BL21(DE3)/KGDPE일 수 있다.

본 출원은 또 다른 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 사이코스 에피머화 효소, 상기 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물을 포함하는 D-사이코스 제조용 조성물을 제공한다.

일 구현예로, 본 출원의 미생물은 균주 자체, 이의 배양물 또는 상기 미생물의 파쇄물일 수 있다. 본 출원의 배양물 또는 파쇄물은 본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 미생물의 배양물은 상기 미생물을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 더불어, 본 출원의 미생물의 파쇄물은 미생물 또는 이의 배양물을 파쇄한 파쇄물, 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 D-사이코스 생산용 조성물은 사이코스 에피머화 효소의 기질이 되는 D-프럭토스를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 미생물은 담체에 고정화시켜 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용될 수 있는 담체의 예로는, 아가(agar), 아가로스(agarose), k-카라기난, 알지네이트 또는 키토산이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 출원의 D-사이코스 생산용 조성물은 사이코스 생산을 보조할 수 있는 임의의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 D-사이코스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 망간, 칼슘, 마그네슘, 철, 리튬 및 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속일 수 있다. 또한, 본 출원의 금속은 금속 이온 또는 금속염일 수 있다. 본 출원의 금속은 0.1 mM 내지 10 mM, 0.1 mM 내지 7 mM, 0.1 mM 내지 4 mM, 0.5 mM 내지 10 mM, 0.5 mM 내지 7 mM, 0.5 mM 내지 4 mM, 1 mM 내지 10 mM, 1 mM 내지 7 mM, 1 mM 내지 4 mM, 2 mM 내지 10 mM, 2 mM 내지 7 mM 또는 2 mM 내지 4 mM로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속염은 LiCl, Na₂SO₄, MgCl₂, NaCl, FeSO₄, MgSO₄, MnCl₂, MnSO₄및 CaCl₂로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 금속염일 수 있다.

본 출원은 또 다른 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 D-프럭토스를 접촉시키는 단계를 포함하는, D-사이코스 제조 방법을 제공한다.

일 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 D-프럭토스를 접촉시키는 단계 이전, 이후 또는 동시에 금속을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 본 출원의 D-프럭토스를 접촉시키는 단계 또는 본 출원의 금속을 첨가하는 단계 이후, 사이코스를 포함하는 접촉 결과물을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등의 공지된 방법 중 1 이상의 방법을 선택하여 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원의 제조 방법은 각각, 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 수행함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 사이코스를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 본 출원의 D-프럭토스를 접촉시키는 단계, 금속을 첨가하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염 단계 이후 D-사이코스를 결정화하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 본 출원의 결정화하는 단계 이전에 사이코스를 농축시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 D-프럭토스를 사이코스 에피머화 효소와 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가 단계를 통해 사이코스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 D-프럭토스의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0 조건에서, 40℃ 내지 90℃ 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 8.5, pH 6.0 내지 8.0 또는 pH 7.0 내지 8.0에서 수행할 수 있다.

또한, 본 출원의 접촉은 40℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 75℃, 40℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 90℃, 55℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 75℃, 55℃ 내지 65℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 75℃, 60℃ 내지 65℃, 65℃ 내지 90℃, 65℃ 내지 80℃ 또는 65℃ 내지 75℃의 온도에서 수행할 수 있다.

더불어, 본 출원의 접촉은 0.5 시간 이상, 1 시간 이상, 3 시간 이상, 5 시간 이상 또는 6 시간 이상, 및/또는 48시간 이하, 36시간 이하, 24시간 이하, 12 시간 이하, 9 시간 이하의 시간 동안 수행할 수 있다.

본 출원의 D-사이코스 제조 방법에 기재된 사이코스 에피머화 효소, 금속 및 담체 등은 전술한 양태에서 기재한 바와 같다.

본 출원은 또 다른 양태로서, 사이코스 제조에 있어서 D-프럭토스의 전환을 위한, 본원에 기술된 사이코스 에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물의 용도를 제공한다.

본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 D-프럭토스에서 사이코스를 전환하는 활성이 우수하고, 산업적으로 이용 가능할 정도의 고온 안정성을 가지며, 전환반응 속도가 빠른 효과가 있다. 따라서 본 출원의 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 경우, 고효율 및 고수득율로 사이코스 생산이 가능한 이점이 있다.

도 1은 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소(KGDPE)를 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열도이다.
도 2은 본 출원의 KGDPE를 이용하여 D-프럭토스를 기질로 하여 사이코스를 생산한 결과에 대한 HPLC 분석 데이터이다.
도 3은 사이코스 에피머화 효소의 온도에 따른 상대적 효소 활성을 나타낸 그래프이다. 도 3a는 종래의 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래 D-사이코스 3-에피머화 효소(ATPE)의 활성이고, 도 3b는 본 출원의 KGDPE의 활성을 나타낸다.
도 4는 pH 변화에 따른 본 출원의 KGDPE의 상대적 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 다양한 금속 첨가에 따른 본 출원의 KGDPE의 상대적 효소 활성을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 출원을 구체적인 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 출원이 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니며, 본 출원의 취지 및 내용의 범위 내에서 당업자에 의해 다양한 변형 내지 수정이 가능함이 인식되어야 한다.

본 출원의 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예

실시예 1. 카이스티아 속 미생물 유래 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 형질전환 균주의 제조

카이스티아 속 미생물로부터 D-프럭토스를 사이코스로 전환하는 사이코스 에피머화 효소 활성을 가질 것으로 예상되는 유전자를 선발하고, 상기 유전자를 포함한 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, Genbank에 등록된 카이스티아 속 미생물의 유전자 서열들을 대상으로 사이코스 에피머화 효소로 예상되는 카이스티아 그래뉼리(Kaistia granuli) KCTC 12575의 유전자 kgdpe를 선발하고, 상기 유전자의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 뉴클레오티드 서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(서열번호 3) 및 역방향 프라이머(서열번호 4)를 고안하여 합성하였다. 상기 합성된 프라이머를 이용하여 카이스티아 그래뉼리 KCTC 12575의 게노믹 DNA를 주형으로 PCR 반응(94℃에서 1분, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 반응시키는 조건을 하나의 사이클로 하여 33 사이클)을 실시하여 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 PCR 정제 키트(PCR purification kit, Quiagen)를 이용하여 정제하고, 제한효소 NdeI와 notI을 사용하여 pET24a(+)(novagen, USA)에 삽입하여 재조합 벡터 pET24a(+)-KGDPE를 제조하였다(도 1).

상기 재조합 벡터를 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/KGDPE로 명명하고, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture of Microorganisms, KCCM)에 2016년 10월 20일자로 기탁하여 수탁번호 및 KCCM11918P를 부여 받았다.

실시예 2. 사이코스 에피머화 효소의 생산 및 정제

상기 실시예 1에서 제조한 E. coli BL21(DE3)/KGDPE로부터 사이코스 에피머화 효소를 생산하기 위하여 E. coli BL21(DE3)/KGDPE를 5 ml LB-카나마이신(kanamuycin) 배지에 접종한 후, 600 nm에서 측정한 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200 rpm에서 진탕배양하였다. 이후, 상기 진탕배양한 배양액을 500 ml LB-카나마이신 배지에 접종하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.7이 되었을 때 0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후, 16℃, 150 rpm 조건에서 16시간 동안 본배양하였다.

상기 본배양한 배양액을 8000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하고, 0.85 %(w/v) NaCl로 2회 세척한 다음, 용해 완충액(lysis buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0 300 mM NaCl)에 혼탁시킨 후, 음파진동기를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 미리 상기 용해 완충액으로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용하고, 250 mM 이미다졸(imidazole)이 함유된 완충용액(50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.0)을 순차적으로 흘려주어 정제된 사이코스 에피머화 효소(이하, KGDPE로 기재)를 획득하였다. 상기 KGDPE는 SDS-PAGE 결과, 단량체의 크기가 약 32 kDa임을 확인하였다.

실시예 3. KGDPE의 활성 확인

3-1. D-프럭토스에서 사이코스로의 전환 활성 확인

KGDPE가 D-프럭토스를 기질로 사이코스를 생산하는지 여부를 확인하기 위하여, 50 wt% D-프럭토스 및 3 mM MnSO₄이 포함된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)에 실시예 2에서 생산한 KGDPE(50 mM Tris-HCl, pH 7.0)를 첨가하고 55에서 6시간 동안 반응시켰다. 이후, 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시킨 후, HPLC 분석을 통하여 사이코스 생성을 확인하였다. 상기 HPLC 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector(Agilent 1260 RID)를 이용하였고, 이동상 용매는 물을 사용하였으며，온도는 80℃, 유속은 0.6 ml/min으로 수행하였다.

그 결과, KGDPE를 이용하여 D-프럭토스로부터 사이코스를 생산할 수 있음을 확인하였다(도 2).

3-2. D-프럭토스에서 사이코스로의 전환 속도 확인

KGDPE의 사이코스 생산능이 종래 사이코스 생산에 이용되고 있는 사이코스 에피머화 효소(ATPE, 서열번호 5, 대한민국 공개 특허 제10-2011-0035805호) 보다 우수한지 여부를 확인하기 위하여 D-프럭토스에서 사이코스로의 전환 속도를 확인하였다.

구체적으로, 재조합 발현 벡터 pET24a-ATPE로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)를 10 ㎍/ml 농도의 카나마이신을 포함한 LB 배지에 접종한 후 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 효소를 발현하고 정제하였다. 획득한 효소를 50 중량% D-프럭토스 및 3 mM MnSO₄이 포함된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)에 첨가하고 55℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이후, 100에서 5분간 가열하여 반응을 정지시킨 후, HPLC 분석을 통하여 사이코스 생성을 확인하였다. HPLC 분석은 상기 실시예 3-1과 동일한 조건에서 수행하였다. 사이코스로의 전환 속도는 효소가 분당 생성하는 사이코스 양(mg/분)으로 계산하였으며, ATPE의 반응 속도 값을 100%로 하여 KGDPE의 반응 속도를 상대적인 수치로 나타내었다.

그 결과, KGDPE를 이용한 경우의 분당 생성되는 사이코스 양은 ATPE를 이용한 경우 대비 117.6%로, KGDPE를 이용하는 경우 D-프럭토스에서 사이코스로의 전환 속도가 현저하게 증가함을 확인하였다(표 1).

효소	KGDPE	ATPE
상대 전환속도(%)	117.6	100

실시예 4. KGDPE의 특성 분석

4-1. 온도에 따른 효소의 활성 분석

다양한 온도 조건 하(40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 및 75℃)에서 KGDPE와 D-프럭토스 기질을 2시간 동안 반응시켜 온도에 따른 효소 활성을 비교하였다. 상기 반응은 온도 및 반응 시간을 제외하고 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 효소 활성은 D-프럭토스에서 사이코스로의 전환율로 측정하였다. 전환율은 반응 전 기질(D-프럭토스)의 중량 대비 반응 후 생성된 사이코스의 중량의 백분율로 계산하였다.

그 결과, KGDPE는 모든 측정 온도 범위에서 25% 이상의 높은 전환 활성을 나타내었으며, 온도가 증가할수록 활성도 증가하여 측정 최고 온도인 75℃에서 최대 전환율을 보임을 확인하였다(표 2).

온도(℃)	KGDPE(전환율, %)
40	26.7
45	27.8
50	28.8
55	29.7
60	30.5
65	31.2
70	32.1
75	32.8

4-2. 효소의 열 안정성 분석

KGDPE의 열 안정성을 종래 효소인 ATPE와 비교하기 위하여, 상기 각 효소에 다양한 온도(55℃, 60℃ 및 65℃)의 열처리를 한 후, 열처리 시간 별(0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 및 6시간)로 효소 처리 용액을 샘플링하여 각각의 효소의 잔류활성을 측정하였다. 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 반응 시간만을 변경하여 30분 동안 반응을 실시하였으며, D-프럭토스로부터 사이코스로의 전환율로 효소의 잔류활성을 측정하였다.

그 결과, 온도 상승에 따른 KGDPE의 반감기 저하가 ATPE에 비하여 현저히 적은바, KGDPE는 높은 열 안전성을 가지는 것을 확인하였다(도 3a 및 3b).

4-3. pH에 따른 효소의 활성 분석

pH에 따른 효소 활성을 측정하기 위하여, D-프럭토스 기질을 KGDPE와 다양한 pH에서 각각 반응시켰다. 이때 반응은 반응 시간 및 pH를 제외하고 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시하였다.

구체적으로, 50 mM 인산칼륨(potassium phosphate)을 사용하여 pH 5.0, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5 및 pH 8.0 조건 하, 그리고 50 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하여 pH 8.0, pH 8.5 및 pH 9.0 조건 하, 55℃에서 30분 동안 효소 반응을 수행한 후, D-프럭토스로부터 사이코스로의 전환율로 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, KGDPE는 pH 6 내지 pH 8.5에서 최대 활성 대비 70% 이상의 활성을 보이고, pH 8.0에서 가장 높은 활성을 나타냄을 확인하였다(표 3, 도 4).

pH		상대 전환율(%)
50 mM 인산칼륨	5	63
	6	91
	6.5	93
	7	95
	7.5	100
	8	99
50 mM Tris-HCl	8	76
	8.5	71
	9	73

4-4. 금속 첨가에 따른 효소의 활성 분석

KGDPE의 금속 첨가에 따른 활성을 확인하기 위해, 실시예 3-1의 반응 조건에서 MnSO₄를 다양한 금속염(LiCl, Na₂SO₄, MgCl₂, NaCl, FeSO₄ 및 CaCl₂)으로 대체하여 각각 최종농도가 3 mM이 되도록 첨가하고 효소 활성을 측정하였다. 대조군은 금속염을 처리하지 않았다.

그 결과, Mn 뿐만 아니라 Li, Na, Mg, Fe 및 Ca첨가 시 대조군에 비하여 KGDPE의 활성이 증가됨을 확인하였으며, 이 중 Mn이 효소 활성을 가장 증가시킴을 확인할 수 있었다(표 4 및 도 5).

금속염	상대 효소활성(%)
LiCl	91
Na₂SO₄	88
MgCl₂	88
NaCl	88
FeSO₄	95
MgSO₄	90
MnSO₄	100
CaCl₂	96
no metal	79

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11918P

20161020

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A Novel D-Psicose 3-Epimerase and Methods for Preparing D-Psicose Using The Same <130> P17-6172 <150> KR 16/0152947 <151> 2016-11-16 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Amino acid sequences of KGDPE <400> 1 Met Lys Asn Lys Leu Gly Val His Ala Gln Val Trp Val Gly Gly Trp 1 5 10 15 Ser His Ala Glu Ala Glu Arg Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ser Leu Gly 20 25 30 Tyr Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Leu Asp Pro Ser Leu Ile Asp Ile 35 40 45 Asp Phe Thr Arg Lys Ala Leu Glu Lys His Gly Leu Gly Ile Thr Thr 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Asp Asp Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Asp Pro Asp 65 70 75 80 Lys Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Leu Met Lys Val Val Ser Thr Thr 85 90 95 Arg Asp Leu Gly Gly Thr His Ile Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Phe 100 105 110 Gln Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Thr Pro Glu Gly Val Ala Gly Ala Val 115 120 125 Glu Val Leu His His Val Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Asn Ile Thr 130 135 140 Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Ile Asn Thr 145 150 155 160 Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Cys Lys Arg Val Gly Met Pro Asn Val 165 170 175 Lys Val His Leu Asp Cys Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ala Asp Ala 180 185 190 Glu Arg Ala Ile Ile Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Gly Tyr Phe His Thr 195 200 205 Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Ile Asp Phe Thr 210 215 220 Arg Ile Phe Arg Gly Leu Val Lys Ala Asn Tyr Gln Gly Pro Ile Cys 225 230 235 240 Phe Glu Ser Phe Ser Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Leu Ser Gly Ile 245 250 255 Leu Gly Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Ser Thr Asp Leu Cys Arg 260 265 270 His Ala Met Gln Phe Thr Gln Ala Gln Met Gln Ala Ala Glu Gln Ala 275 280 285 Gln Ser Ile Arg Thr Gly Ala Asp Trp 290 295 <210> 2 <211> 894 <212> DNA <213> Nucleotide sequences of KGDPE <400> 2 atgaagaaca agctgggtgt gcacgcacag gtctgggtcg gcggctggag ccatgcggag 60 gcggagcgcg ccatcgccag caccgcctcg ctcggctacg actatatcga ggcgccggcg 120 ctcgacccgt cgctgatcga catcgacttc acccgcaaag cgctggaaaa gcatggtctc 180 ggcatcacga cgtcgctcgg cctcgacgac agctgcgaca tctcctcggg cgatcccgac 240 aagaaggcgc gcggccaggc gcacctgatg aaggtggtct ccaccacccg tgatctcggc 300 ggcacccaca tcaccggtat cctctattcc ggcttccaga aatacttcac gcccgcaacg 360 ccggagggcg tcgccggcgc cgtcgaggta ttgcaccacg tcgccgagga agcggcgaag 420 agcaacatca cgctcggcct cgaggtggtg aaccgctacg agaccaacgt gatcaacacc 480 gccgcccagg gcgtcgagct ctgcaagcgg gtcggcatgc cgaacgtcaa ggtgcacctc 540 gactgctacc acatgaacat cgaggaagcc gacgccgagc gcgccatcat cgataccggc 600 gactatctgg gttatttcca taccggtgaa tcgcatcgcg gctatctcgg caccggctcg 660 atcgacttca cccgcatctt ccgcggcctg gtgaaggcca actaccaggg tccgatctgc 720 ttcgaatcct tctcgtccgc cgtcgccggc gagccgctct ccggcattct cggcatctgg 780 cgcaatctct ggacggattc gaccgatctc tgccgccacg ccatgcagtt cacgcaggca 840 cagatgcagg cggccgagca ggcccagtcg atccgcaccg gcgcggactg gtag 894 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> A forward primer of KGDPE <400> 3 atgaagaaca agctgggtgt gc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> A reverse primer of KGDPE <400> 4 tcaccagtcc gcgccggtgc 20 <210> 5 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of ATPE <400> 5 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase).
제1항에 있어서, 상기 D-사이코스 3-에피머화 효소는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는, D-사이코스 3-에피머화 효소.
제1항의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터가 도입된 미생물.
제1항의 D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 D-사이코스 제조용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 D-프럭토스를 추가적으로 포함하는, D-사이코스 제조용 조성물.
제1항의 D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 D-프럭토스를 접촉시키는 단계를 포함하는, D-사이코스 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 9.0 조건에서, 40℃ 내지 90℃ 온도 조건에서, 또는 0.5시간 내지 48 시간 동안 수행하는, D-사이코스 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 제조방법은 상기 D-프럭토스를 접촉시키는 단계 이전, 이후 또는 동시에 제1항의 D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 금속을 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는, D-사이코스 제조방법.