CN114262703A - 一种利用膜富集d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及应用 - Google Patents
一种利用膜富集d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用膜富集D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法及应用，其方法为将未灭酶的糖化液利用陶瓷膜进行除菌操作，压力控制为0.2~0.4MPa，过滤完成后，用水冲洗陶瓷膜；陶瓷膜处理后的透过液采用超滤膜进行超滤，压力为0.4~0.8MPa，超滤后用水冲洗陶瓷膜，收集浓相，即为回收得到的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶。本发明中未灭酶的糖化液经陶瓷膜和超滤膜处理，富集方法工艺简单、生产成本低，对未利用的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶进行了回收再利用，为功能糖制造企业提供了便利，节约了成本，具有广阔的经济效益、社会效益和较大的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物酶回收技术领域，具体涉及一种利用膜富集D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及应用。
背景技术
随着国民经济的不断发展，人们的膳食结构发生变化，肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂等慢性病在全球范围内大流行。因此，人们对健康饮食越来越重视， 尤其是含糖食物的摄取，促使低热量甜味剂展示了广阔的应用前景
D-阿洛酮糖作为一种六碳稀少酮糖，是果糖的差向异构体，在自然界中存在但含量极少的一种稀有单糖。主要来源于少部分植物和少数细菌，其口感接近蔗糖，甜度相当于蔗糖的 70%，热量相当于蔗糖的 0.3%，可作为食品中蔗糖理想的替代品，与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，可改变产品品质，又具有低热量、调节血糖、抑制癌变、抗炎等有益人体健康的特殊功能。
目前，D-阿洛酮糖的制备方法主要分成两类。分别是化学制备法和生物制备法。其中化学制备法可利用钼酸离子作为催化剂，催化D-果糖合成D-阿洛酮糖，也可以加热乙醇和三乙胺的混合溶液，从而合成得到D-阿洛酮糖。但化学制备法产物复杂多样，不易纯化、并且化学污染严重。因此，尚未在工业生产中取得突破性进展。1990 年，日本香川大学(Kagawa University) Izumori 团队发现，产碱杆菌属细菌A1caligenes sp．可以生产 D-阿洛酮糖，开辟了生物法制备 D-阿洛酮糖的先河。生物制备方法相较于化学制备方法来说，具有高度的专一性，反应简单、产物不复杂，易于纯化，逐渐成为国内外工业生产D-阿洛酮糖的主要办法。
研究表明，生物制备方法主要通过D-阿洛酮糖 3-差向异构酶催化 D-果糖转化为D-阿洛酮糖。不同来源的酮糖 3-差向异构酶对D-果糖的转化率不尽相同。来源于根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 中的 DTEase对 D-阿洛酮糖具有较强的特异性，因此被命名为DPEase，转化率高达32.9%，是目前转化率较高的酶。D-阿洛酮糖3-差向异构酶制备成本高，并且对果糖的转化率较低。因此，酶的重复利用就变得尤为重要。
发明内容
针对现有技术中阿洛酮糖制备成本高、D-阿洛酮糖3-差向异构酶利用率低的问题，本发明公开了一种利用膜富集D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及应用
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用膜富集D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，包括以下步骤：
（1）菌体去除：将未灭酶的糖化液陶瓷膜进行除菌操作，压力控制为0.2~0.4MPa，过滤完成后，用水冲洗陶瓷膜；
（2）超滤富集酶：步骤（1）陶瓷膜处理后的透过液采用超滤膜进行超滤，压力控制为0.4~0.8MPa，超滤后用水冲洗陶瓷膜，收集浓相，即为回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
进一步地，步骤（1）中所述的陶瓷膜的孔径为0.1μm，步骤（2）中所述的超滤膜截留分子量为10000道尔顿。
进一步地，步骤（1）中所述的糖化液糖浓为40~50%，为果糖经D-阿洛酮糖3-差向异构酶异构化后的糖化液。
进一步地，步骤（1）和（2）中糖化液和透过液的温度为15~25℃。
进一步地，步骤（1）中冲洗水用量为0.2~0.5倍糖化液，步骤（2）中洗水用量为0.3~0.8倍透过液。
本发明中，所述的利用膜富集D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在制备D-阿洛酮糖中的应用。
进一步地，所述的制备D-阿洛酮糖的方法为：配制40~50%的果糖溶液，调节pH至6.0~7.0，加入D-阿洛酮糖3-差向异构酶35~40U/g果糖干基，于60~65℃反应15~20 h，得含D-阿洛酮糖的糖化液。
D-阿洛酮糖 3-差向异构酶催化 D-果糖转化为D-阿洛酮糖过程中，原发酵液不经过破碎直接加入糖化液，通过试验发现，酶可以自己缓慢释放放出来，并且随着时间延长，细胞也会自己破碎一部分；原始糖化液中的菌体仅对糖化液的澄清程度有轻微影响，但后续重复利用空壳的菌体或破碎的菌体会明显影响糖化液的澄清程度，浊度高，后续后处理成本大。
本发明创造性的发现D-阿洛酮糖3-差向异构酶经糖化反应，释放出D-阿洛酮糖3-差向异构酶的空壳菌体是影响其进一步回收利用的重要因素。空壳菌体的存在不仅会影响超滤膜的过滤效果，粘度大，堵塞超滤膜，而且在后续再利用时造成糖化液的浑浊程度加重，增加了后续精制的成本。
本申请对过对糖化液中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行陶瓷膜的过滤和超滤处理，省略了灭酶步骤，而且富集得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以进一步应用于果糖转化D-阿洛酮糖，使酶得到了有效利用，节约了成本，具有广阔的经济效益。
有益效果
本发明中未灭酶的糖化液经陶瓷膜和超滤膜处理，富集方法工艺简单、生产成本低，对未利用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行了回收再利用，为功能糖制造企业提供了便利，节约了成本，具有广阔的经济效益、社会效益和较大的推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
（1）菌体去除：将未灭酶的糖浓为42%的糖化液利用孔径为0.1um的陶瓷膜进行除菌操作，运行过程中控制陶瓷膜内料温18℃，压力控制为0.2MPa，过滤完成后，用0.3倍水（V/V）冲洗陶瓷膜，至透过相糖浓为零；
（2）超滤富集酶：步骤（1）陶瓷膜处理后的透过液采用超滤膜进行超滤，超滤膜的截留分子量为10000道尔顿，控制超滤膜内料温20℃，压力控制在0.4Mpa，用0.4倍水（V/V）冲洗超滤膜，至透过相糖浓为零，收集浓相，即为回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶；
步骤（1）中糖化液的组分为：多糖0.08%、二糖0.06%、葡萄糖0.12%、甘露糖0.17、果糖73.35%、阿洛酮糖26.21%。
实施例2
（1）菌体去除：将未灭酶的糖浓为50%的糖化液利用孔径为0.1um的陶瓷膜进行除菌操作，运行过程中控制陶瓷膜内料温20℃，压力控制为0.4MPa，过滤完成后，用0.5倍水（V/V）冲洗陶瓷膜，至透过相糖浓为零；
（2）超滤富集酶：步骤（1）陶瓷膜处理后的透过液采用超滤膜进行超滤，超滤膜的截留分子量为10000道尔顿，控制超滤膜内料温18℃，压力控制在0.6Mpa，用0.4倍水（V/V）冲洗超滤膜，至透过相糖浓为零，收集浓相，即为回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶；
步骤（1）中糖化液的组分为：多糖0.08%、二糖0.05%、葡萄糖0.51%、甘露糖0.21、果糖72.72%、阿洛酮糖26.30%。
实施例3
对实施例1中回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行再利用：
配制糖浓为45%的果糖溶液，调节pH值为6.2，加入实施例1中回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，酶的加入量为35U/g果糖干基，于60℃下反应20 h，测定糖化液组分为：多糖 0.27%、二糖0.73%、葡萄糖0.99%、甘露糖1.21%、果糖70.45%、阿洛酮糖26.18%；与实施例2步骤（1）中糖化液的组成相比，果糖转化为阿洛酮糖的转化率大致相同（酶的加入量相等），故经本发明回收后的D-阿洛酮糖3-差向异构酶仍具有较强的转化能力。
实施例4
对实施例1中回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行再利用：
配制糖浓为42%的果糖溶液，调节pH值为6.5，加入实施例1中回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，酶的加入量为38U/g果糖干基，于62℃下反应18 h，测定糖化液组分为：多糖 0.33%、二糖0.54%、葡萄糖1.33%、甘露糖1.04%、果糖70.09%、阿洛酮糖26.35%，与实施例1步骤（1）中糖化液的组成相比，果糖转化为阿洛酮糖的转化率大致相同（酶的加入量相等），故经本发明回收后的D-阿洛酮糖3-差向异构酶仍具有较强的转化能力。
对比例1
（1）使用如实施例1相同的糖浓为42%的糖化液，采用超滤膜进行超滤，超滤膜的截留分子量为10000道尔顿，控制超滤膜内料温（22）℃，压力控制在（0.8）Mpa，用（1.5）倍水（V/V）冲洗超滤膜，直至透过相糖浓为零，收集浓相，即为回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（含菌体）；该过程糖化液粘度大，容易堵塞超滤膜，所需压力大，且耗水量大；
（2）步骤（1）中收集的浓相D-阿洛酮糖3-差向异构酶，再利用后制备的D-阿洛酮糖糖化液浑浊，精制成本大大提高，回收获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶不适合再利用。
Claims (7)
1.一种利用膜富集D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌体去除：将未灭酶的糖化液陶瓷膜进行除菌操作，压力控制为0.2~0.4MPa，过滤完成后，用水冲洗陶瓷膜；
（2）超滤富集酶：步骤（1）陶瓷膜处理后的透过液采用超滤膜进行超滤，压力控制为0.4~0.8MPa，超滤后用水冲洗陶瓷膜，收集浓相，即为回收得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的陶瓷膜的孔径为0.1μm，步骤（2）中所述的超滤膜截留分子量为10000道尔顿。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的糖化液糖浓为40~50%，为果糖经D-阿洛酮糖3-差向异构酶异构化后的糖化液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）和（2）中糖化液和透过液的温度为15~25℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中冲洗水用量为0.2~0.5倍糖化液，步骤（2）中冲洗水用量为0.3~0.8倍透过液。
6.权利要求1~5任一项所述的利用膜富集D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在制备D-阿洛酮糖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制备D-阿洛酮糖的方法为：配制40~50%的果糖溶液，调节pH至6.0~7.0，加入D-阿洛酮糖3-差向异构酶35~40U/g果糖干基，于60~65℃反应15~20 h，得含D-阿洛酮糖的糖化液。
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