CN114231578A - 一种双酶法制备阿洛酮糖的方法 - Google Patents

一种双酶法制备阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双酶法制备阿洛酮糖的方法，具体以葡萄糖液为底物，加入硫酸镁、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂，调节pH7.3‑7.6，加入固定化双酶（葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶）进行异构化反应，异构化温度50‑60℃，80‑100r/min搅拌反应8‑24h，反应液进行过滤分离，滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖。本发明以固定化双酶催化底物连续异构生成阿洛酮糖，降低了原料成本，且固定化酶可重复利用，色谱提纯阿洛酮糖后副产物可循环利用，提高了副产物和酶的利用率，是一种高效率阿洛酮糖生成方法。

Description

一种双酶法制备阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明属于阿洛酮糖制备技术领域，具体涉及一种双酶法制备阿洛酮糖的方法。
背景技术
阿洛酮糖又名D-核糖-2-己酮糖，是一种自然界中存在但含量极少的稀有糖类，D-阿洛酮糖为D-果糖C-3位的差向异构体。D-阿洛酮糖相当于蔗糖70％的甜度，却仅提供相当于蔗糖0.3％的热量，具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，是食品中蔗糖的最佳替代品，被称作“低卡路里蔗糖”，因此阿洛酮糖是糖尿病人、肥胖人群、儿童食品的理想甜味剂。
D-阿洛酮糖的制备过程可分为化学制备和生物制备。化学制备法由于纯化产物步骤复杂，化学污染严重以及一些副产物杂多等一系列的原因，在实际中没有取得相应的成果。生物制备法反应单一，纯化步骤简单，是阿洛酮糖制备研究的主要方向。当前可以实现将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖，有两种异构化酶，D-阿洛酮糖3-差向异构酶和D-塔格糖3-差向异构酶，前者底物为D-果糖，后者为塔格糖。目前对于这两种酶的研究较多，且很多机构对不同微生物来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其性质进行了研究，但对于反应底物的研究较少，且均以D-果糖为主要反应底物制备阿洛酮糖。本发明突破果糖为底物的束缚，以葡萄糖为底物，对阿洛酮糖3-差向异构酶和葡萄糖异构酶进行共同固定化，使葡萄糖连续异构成阿洛酮糖。在反应进行过程中，打破了果糖和阿洛酮糖的反应体系，使3种单糖形成一种新的关联体系，增加阿洛酮糖的转化率。
发明内容
针对现有技术中D-阿洛酮糖转化率低的问题，本发明提供了一种双酶法制备阿洛酮糖的方法，该法以葡萄糖为底物，以固定化双酶葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化底物连续异构生成阿洛酮糖，降低了原料成本，且固定化酶可重复利用，色谱提纯阿洛酮糖后副产物加入可循环利用，提高了副产物和酶的利用率，是一种高效率阿洛酮糖生成方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种双酶法制备阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：
（1）葡萄糖液为底物，加入硫酸镁、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂，调节pH7.3-7.6，加入固定化双酶进行异构化反应，异构化温度50-60℃，80-100r/min搅拌反应8-24h，所述的固定化双酶为葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的混合酶；
（2）对步骤（1）中得到的反应液进行过滤分离，滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖。
进一步地，所述的固定化双酶的载体为大孔树脂，固定化双酶中葡萄糖异构酶酶活为2800-3000U/g载体，D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为800-1000U/g载体。
进一步地，所述的葡萄糖液的质量浓度为35~40%，固定化双酶的加入量为底物干物质的10-20%。
进一步地，所述的硫酸镁的加量为1.0～1.5kg/ m3料液，硫代硫酸钠的加量为0.5～1.0kg/ m3料液，亚硫酸氢钠的加量为0.3-0.8kg/m3。
进一步地，步骤（2）中过滤分离后的固定化酶可重复利用。
进一步地，步骤（2）中色谱分离后的副产物加入葡萄糖后作为步骤（1）中的底物制备阿洛酮糖；所述的副产物为葡萄糖和果糖的混合糖液。
进一步地，步骤（2）中色谱分离后的混合糖液加入葡萄糖的量为混合糖液干物质质量的50~60%。
进一步地，步骤（2）中色谱分离后的副产物用来制备果葡糖浆。
本发明以葡萄糖为原料，减少了常规以果糖为原料时生产成本，免去了果糖或果葡糖浆的生产；所用的异构酶为固定化双酶（葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶），异构化效果好且可重复利用，同时，色谱提纯阿洛酮糖后副产物可精制后做果葡糖浆成品，也可按比例加入葡萄糖做反应底物循环利用，提高了副产物和酶的利用率。本发明为激活葡萄糖异构酶作用，添加了硫酸镁硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂，三者之间协同作用，促进葡萄糖转变为果糖，而且镁离子除对葡萄糖异构酶有激活作用外，还对D-阿洛酮糖3-差向异构酶有促进催化作用，减少了D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化阿洛酮糖时必需金属催化剂的添加。
另外，本发明通过对色谱提纯阿洛酮糖后副产物的重复利用，反应过程形成葡萄糖、果糖和阿洛酮糖连续转化的反应体系，葡萄糖在反应体系中对阿洛酮糖生成有促进作用，而阿洛酮糖对葡萄糖转化果糖有促进作用，连续的异构化打破了果糖为底物时形成的果糖和阿洛酮糖平衡体系，使阿洛酮糖转化率提高。
有益效果
本发明以葡萄糖为底物，固定化双酶（葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶）为异构化酶，可重复利用，且色谱分离后的副产物加入葡萄糖后可循环利用，提高了副产物和酶的利用率，阿洛酮糖转化率高，反应成本降低。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例和对比例中固定化双酶（葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶）的载体为大孔树脂，固定化双酶分别测葡萄糖异构酶酶活为2900U/g载体，D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为900U/g载体。
实施例1
（1）以质量浓度为38%的葡萄糖液为底物，并向糖液中按体积加入1.3kg/ m3硫酸镁、1.0kg/ m3硫代硫酸钠、0.5kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂，调节pH7.3-7.6，加入底物干物质15%的固定化双酶进行异构化反应，异构化温度50℃，90/min搅拌反应24h，分别测定反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量；
（2）步骤（1）中的反应液过滤分离，滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖；过滤出的固体固定化双酶清洗后保存待用，色谱分离后的副产物回收待用。
实施例2
（1）向质量浓度为35%的葡萄糖液为底物，并向糖液中按体积加入1.0kg/ m3硫酸镁、0.5kg/ m3硫代硫酸钠、0.5kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂，调节pH7.3-7.6，加入底物干物质10%的固定化双酶进行异构化反应，异构化温度60℃，90r/min搅拌反应18h，分别测定反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量；
（2）步骤（1）中的反应液过滤分离，滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖；过滤出的固体固定化双酶清洗后保存待用，色谱分离后的副产物回收待用。
实施例3
（1）向质量浓度为40%的葡萄糖液为底物，并向糖液中按体积加入1.5kg/ m3硫酸镁、0.8kg/ m3硫代硫酸钠、0.8kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂，调节pH7.3-7.6，加入底物干物质20%的固定化双酶进行异构化反应，异构化温度60℃，90/min搅拌反应18h，分别测定反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量；
（2）步骤（1）中的反应液过滤分离，滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖；过滤出的固体固定化双酶清洗后保存待用，色谱分离后的副产物回收待用。
实施例4
实施例1步骤（2）中过滤出的固定化双酶用清水洗涤3次，回收重复使用。
使用回收后的固定化双酶，其余步骤与实施例1相同。
实施例5
以实施例1步骤（2）中色谱分离阿洛酮糖后副产物糖液（含葡萄糖和果糖），加入糖液干物质55%的葡萄糖干物质作为底物，其余步骤和方法同实施例1。
对比例1
将实施例1中的酶激活剂替换为“向糖液中按体积加入1.0kg/ m3氯化钴、1.3kg/m3硫酸镁、1.3kg/ m3、0.5kg/ m3硫代硫酸钠、0.5kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂”，其余步骤和方法同实施例1，反应结束后对反应液成分进行分析，对阿洛酮糖的转化率没有影响。
对比例2
将实施例1中的酶激活剂替换为“向糖液中按体积加入2.0kg/ m3硫酸镁”，其余步骤和方法同实施例1。
对比例3
以实施例1步骤（2）中色谱分离阿洛酮糖后副产物糖液（含葡萄糖和果糖）、加入糖液干物质25%的葡萄糖干物质作为底物，其余步骤和方法同实施例1。
对实施例1~5和对比例1~3中反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量，结果如下表1所示：
表1 葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量分析
Figure 589764DEST_PATH_IMAGE001
。

Claims (8)

1.一种双酶法制备阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）葡萄糖液为底物，加入硫酸镁、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂，调节pH7.3-7.6，加入固定化双酶进行异构化反应，异构化温度50-60℃，80-100r/min搅拌反应8-24h，所述的固定化双酶为葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶；
（2）对步骤（1）中得到的反应液进行过滤分离，滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的固定化双酶的载体为大孔树脂，固定化双酶中葡萄糖异构酶酶活为2800-3000U/g载体，D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为800-1000U/g载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的葡萄糖液的质量浓度为35~40%，固定化双酶的加入量为底物干物质的10-20%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的硫酸镁的加量为1.0～1.5kg/m3料液，硫代硫酸钠的加量为0.5～1.0kg/ m3料液，亚硫酸氢钠的加量为0.3-0.8kg/m3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中过滤分离后的固定化酶可重复利用。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中色谱分离后的副产物加入葡萄糖后作为步骤（1）中的底物制备阿洛酮糖；所述的副产物为葡萄糖和果糖的混合糖液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中色谱分离后的混合糖液加入葡萄糖的量为混合糖液干物质质量的50~60%。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中色谱分离后的副产物用来制备果葡糖浆。
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