JPH09191894A - 耐酸性グルコースイソメラーゼによるグルコースからフラクトースへの変換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】pH４〜６の酸性下で、グルコースからフラクト
ースを酵素的に製造する方法を提供する。 【構成】耐酸性グルコースイソメラーゼを酸性下で、か
つ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存在下でグルコース
に作用させる。即ち、pH４〜６の酸性下で可逆的に失活
するストレプトマイセス属耐酸性グルコースイソメラー
ゼを、pH４〜６の酸性下、かつ嫌気的条件下及び／又は
還元剤の存在下でグルコースと接触させることを特徴と
するグルコースをフラクトースに異性化する方法に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、pH４〜６の酸性下で、
グルコースからフラクトースを酵素的に製造する方法を
提供する。より詳細には、耐酸性グルコースイソメラー
ゼを酸性下で、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存
在下でグルコースに作用させることを特徴とする、グル
コースをフラクトースに変換する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フラクトースは天然に存在する糖の中で
最も甘味の強い糖であり、甘味料として使用されてい
る。フラクトースは、現在、澱粉を原料として製造され
るグルコースをグルコースイソメラーゼで異性化して製
造されており、一般に、異性化糖と呼ばれ、フラクトー
ス42〜45％を含む液糖として市販されている。

【０００３】澱粉から異性化糖の製造において、α-ア
ミラーゼによる澱粉の液化はpH６〜７で行われ、 グルコ
アミラーゼによる液化澱粉の糖化はpH4.5付近で行われ、
そして、 グルコースイソメラーゼによるグルコースの
異性化はpH７〜８で行われている。糖はアルカリ性側で
不安定で、分解して、 着色物質を生成したり、プシコー
ス、ダイフラクトース、有機酸などの副産物を生成す
る。このため、酸性下、少なくともグルコアミラーゼの
反応pH（pH４〜５）で使用できるグルコースイソメラー
ゼの開発が要望されてきた。

【０００４】しかしながら、これまでに知られている殆
どのグルコースイソメラーゼは、最適pHが７〜８にあ
り、pH６以下では不安定で、pH５の酸性下では殆ど作用
しない酵素であった［図１および図２の−●−は、市販
されているストレプトマイセス・ルビジノサス（Strept
omyces rubiginosus)のグルコースイソメラーゼのpH安
定性と作用pHを示している］。

【０００５】一方、W. D. Cotterらは、USP-3,623,9538
において、グルコースイソメラーゼによるグルコースの
異性化反応を、pH6.5〜7.5で、亜硫酸イオンまたは亜硫
酸水素イオンを存在させて行うことにより、反応時の着
色が防止され、酵素も安定化されると記述している。

【０００６】しかしながら、ここで用いられているグル
コースイソメラーゼは前記のストレプトマイセス・ルビ
ジノサスの生産する酵素であり、上述したようにこの酵
素はpH５では殆ど作用しない酵素である。

【０００７】また、酵素の有効利用と異性化糖生産を能
率的に行うため、グルコースイソメラーゼを固定化酵素
として、これをカラムに詰め、連続的に異性化糖を製造
することも行われているが、これまでの異性化糖の製造
はpH７〜８で反応が行われている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】発明者は、澱粉から異
性化糖の製造をより経済的、かつ効率的に行うため、グ
ルコアミラーゼと同じpHで作用するグルコースイソメラ
ーゼを求めて自然界から微生物の検索を行ってきた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】その結果、本発明者は新
たに土壌中より分離し、ストレプトマイセス・エスピー
Ｇ−27（Streptomyces sp. G-27）と同定した微生物が
pH５付近においても効率的にグルコースをフラクトース
に異性化する耐酸性のグルコースイソメラーゼを生産す
ることを認め、特許を出願した（特願平3-59344）。

【００１０】しかし、更に鋭意研究を重ねた結果、前述
したようなpH４〜６で安定な耐酸性のグルコースイソメ
ラーゼは、酸性下、特にpH６以下で酸化失活しやすいこ
と、その失活は可逆的であり、嫌気的条件に保つことに
より、活性が回復することを認めた。そして、これらの
酵素を嫌気下で使用すれば、pH５においても、これまで
の異性化糖製造の反応pH（pH７〜８）の活性と大差ない
活性（80％程度）でグルコースをフラクトースに異性化
できることを認め、本発明を完成した。更に、ストレプ
トマイセス・エスピー Ｇ−27（Streptomyces sp. G-2
7）以外の菌株について酸性域での活性を示すことを指
標として、土壌からスクリーニングすることにより、上
記したような性質を示す耐酸性のグルコースイソメラー
ゼを得ることができる。本発明には、このようにして得
られ、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可
逆的に酸化失活する性質を有する酵素であれば使用する
ことができる。

【００１１】例えば、本発明に使用できる酵素の１例と
して、上述したストレプトマイセス・エスピー Ｇ−27
（Streptomyces sp. G-27）由来のグルコースイソメー
ゼについてその詳細を記載する。本酵素は、pH４〜12の
範囲で安定であるが、最適pHは７〜８にあり、pH５での
活性は、pH７での活性の20％程度である（図２参照）。

【００１２】しかし、この活性の差の要因としては、特
に酸性下で加速される可逆的酸化失活が含まれており、
実際は、pH5.0においても、pH7.0での活性の70〜80％も
あることがわかった。

【００１３】このような酸性下での可逆的失活は、pH６
以下、特に、pH5.5以下の酸性側で著しく、pH６以上、
特にpH７付近では殆どおこらないことを認めた（表１を
参照）。

【００１４】また、この酸性下でおこる酸化失活は、該
酵素を空気との接触を断つような嫌気的条件、例えば、
反応液を、トルエンのような水に不溶の有機溶媒で重層
し、空気との接触を断つと、基質であるグルコースある
いはこれから生成するフラクトースの還元力により次第
に還元され活性を回復する。更に、適当な還元剤を存在
させ、より嫌気的条件を保てば、より短時間に活性が回
復する。従って、これを考慮して、グルコースの異性化
反応を行えば、pH４〜６の酸性下でも効果的にグルコー
スをフラクトースに異性化できることがわかった。本発
明はこの知見に基づいてなされたものである。

【００１５】即ち、本発明は、耐酸性グルコースイソメ
ラーゼを酸性下で、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤
の存在下でグルコースに作用させることを特徴とする、
グルコースをフラクトースに変換する方法である。更に
詳細には、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６
で可逆的に酸化失活する性質を有する耐酸性グルコース
イソメラーゼを、pH４〜６の酸性下、かつ嫌気的条件下
及び／又は還元剤の存在下でグルコースと接触させるこ
とを特徴とするグルコースをフラクトースに変換する方
法である。

【００１６】本発明でいう、pH４〜６の酸性下で安定な
酵素とは、 図１および後述するように、本発明で使用
できる酵素の一例として挙げたストレプトマイセス・エ
スピー Ｇ−27（Streptomyces sp. G-27）由来のグルコ
ースイソメーゼの性質「ｆ）pH安定性」に記載している
ように、グルコースイソメラーゼ液を室温（約25℃）で
３時間インキュベート後、pH７に戻して活性を測定した
とき、pH４〜７で活性の低下が殆ど認められない酵素を
いう。

【００１７】そして、pH４〜６で可逆的に酸化失活する
酵素とは、空気と接触するような好気的条件では、pH４
〜６の酸性下で急速に活性が低下するが、嫌気的条件に
保てば活性が可逆的に回復する酵素をいう。

【００１８】以下、本発明の内容を更に詳細に説明す
る。例えば、本発明に使用できる、pH４〜６の酸性下で
安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活する性質を
有する耐酸性グルコースイソメラーゼの一例として、ス
トレプトマイセス・エスピー Ｇ−27（FERM P-12036）
より生産されるグルコースイソメラーゼが挙げられる。
次いで、本酵素の主な酵素化学的性質について記載す
る。

【００１９】ａ）作用：酸性下でＤ−グルコースをＤ−
フラクトースに変換する。

【００２０】ｂ）基質特異性：Ｄ−グルコースとＤ−フ
ラクトースの相互変換を行う他、Ｄ−キシロース、Ｌ−
アラビノースとＤ−リボースをそれぞれ対応するケトー
スに異性化する。しかしＤ−マンノース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−アラビノースなどには実質的に作用しない。

【００２１】ｃ）作用pH：４〜８である。

【００２２】ｄ）最適pH：７付近に認められるが、pH５
付近でもよく作用し、約３０％の活性を示す。

【００２３】ｅ）最適温度：0.1Ｍグルコースを基質と
しpH８、10分反応での最適温度は85〜87℃である。

【００２４】ｆ）安定pH：0.1Ｍ緩衝液（酢酸又はリン
酸緩衝液）の下で、室温（約25℃）で時間放置後、残存
活性を測定した。その結果、pH４〜12の範囲で安定であ
った。

【００２５】ｇ）熱安定性：酵素水溶液を各温度で加熱
した結果、80℃、85℃では、30分間加熱しても失活は認
められず、むしろ活性の増加が認められた。又、90℃、
10分間の加熱では約30％失活した。

【００２６】ｈ）Km値：グルコースに対するKmは約0.08
3Ｍ、Ｄ−キシロースに対するKmは約0.13Ｍで、本酵素
はＤ−キシロースよりもＤ−グルコースに対してより親
和性が大きい。

【００２７】ｉ）賦活剤：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺などにより
賦活される。その活性の強さは、５×10^-3ＭにおいてCo
Cl₂を100％としたとき、MgSO₄約42％、MnSO₄約17％であ
った。

【００２８】ｊ）阻害剤：５×10^-3ＭのHgCl₂、AgNO₃、
CuSO₄、CaCl₂などにより阻害された。

【００２９】ｋ）精製法：硫酸アンモニウムによる分
画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー
及びセファデックスＧ−150ゲルろ過などにより電気泳
動的に単一まで精製することができる。

【００３０】ｌ）活性測定法：0.1Ｍのリン酸緩衝液（p
H7.0）、0.01Ｍ MgSO₄及び0.2Ｍのグルコースを含む溶
液0.5mlに、適量の酵素を加え、水で全量を1.0mlとし、
60℃で反応させる。そして生成したフラクトースをシス
テイン−カルバゾール法で定量する。この条件で、１分
間に１マイクロモルのフラクトースを生成する酵素量を
１単位とした。

【００３１】本酵素は、現在、工業的に広く使用されて
いるストレプトマイセス・ルビジノサス（Streptomyces
rubiginosus）のグルコースイソメラーゼ（以下、酵素
Ａという）〔Y. Takasaki, アグリカルチャル・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），33
巻，1523頁（1969）〕及びストレプトマイセス・フェオ
クロモゲネス（Streptomyces phaeochromogenes）のグ
ルコースイソメラーゼ（以下、酵素Ｂという）〔N.Tsum
uraら，アグリカルチャル・バイオロジカル・ケミスト
リー（Agric. Biol. Chem.），29巻，1192頁（1965）〕
に比べ、以下に記載する酵素的性質の差異が認められ
た。

【００３２】すなわち、 (1) 本酵素の最適pHは７付近にあるが、図１に示す通
り、pH５以下でもよく作用する。一方、酵素Ａの最適pH
は8.5付近にあり、pH６における活性はpH8.5のときの約
30％である。そして、pH５以下では不安定で実質的に作
用しない。又、酵素Ｂの最適pHはよりアルカリ側のpH9.
3〜9.5に認められており、そして同様にpH５以下では実
質的に作用しない。

【００３３】(2) 本酵素の最適温度は85〜87℃にあり、
酵素Ａ及び酵素Ｂに比べ５〜７℃高い。

【００３４】(3) 本酵素は85℃で30分加熱しても失活が
認められないが、酵素Ａは80℃、10分の加熱で約30％失
活し、酵素Ｂは70℃、10分の加熱で80〜85％失活する。

【００３５】(4) 本酵素は、Ｄ−グルコースの他、Ｄ−
キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノースなどにも
作用し、それぞれ対応するケトースに異性化する。すな
わち、本酵素は巾広い基質特異性を示すのに対し、酵素
ＡはＤ−グルコースとＤ−キシロースのみに作用し、酵
素ＢはＤ−グルコース、Ｄ−キシロースとＬ−アラビノ
ースに作用する。

【００３６】(5) 酵素Ａ及び酵素Ｂは、Ｄ−グルコース
に対するKm値がＤ−キシロースに対するKmより大きく、
Ｄ−グルコースよりもＤ−キシロースに対する親和性の
方が大きいのに対し、本酵素は、Ｄ−グルコースに対す
るKmは約0.083Ｍ、Ｄ−キシロースに対するKmは約0.13
Ｍであり、Ｄ−キシロースよりもＤ−グルコースに対し
てより親和性が大きい。

【００３７】(6) 酵素Ａ及び酵素ＢはMg²⁺により最も強
く賦活されるのに対し、本酵素はMg²⁺よりCo²⁺によって
強く賦活される。

【００３８】本酵素の理化学的性質のうち、主な性質に
ついて、公知のグルコースイソメラーゼと比較した結果
を表１に示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】以上のとおり、本酵素は作用pH、熱安定性
などの性質において、公知のグルコースイソメラーゼに
比べ重要な差異が認められ、耐酸性と耐熱性に優れた新
規なグルコースイソメラーゼと考えられる。

【００４１】本酵素はストレプトマイセス・エスピー
G-27より生産されうる。本菌株の菌学的性質は下記の通
りである。尚、本菌株は通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に第12036号（FERM P-12036）として寄
託されている。

【００４２】Ａ．形態 (1) 基生菌糸は樹枝状に分岐し発育、液体・固体をとわ
ず、いかなる培地においても、断裂しない。 (2) 気菌糸は単純分枝で、直状の長い胞子連鎖を形成す
る。培養が長期となると先端部でゆるく波状になるが、
らせん状は稀である。 (3) 胞子柄は基生菌糸から形成されるが、認められるほ
ど長くない（10μm以下）。分枝は菌糸の主軸に対し20
〜40℃、分枝数は通常１〜３本。 (4) 胞子嚢、菌核、球状体は形成しない。 (5) 胞子は気菌糸上にのみ生じ、出来る方向は求心的。
胞子の表面は平滑で、卵円形又は円筒系、1.0×1.5〜2.
0μm、通常50個以上の直状の連鎖となる。 (6) 基生菌糸、気菌糸の幅はそれぞれ1.0〜1.5μm。

【００４３】 Ｂ．各培地における生育状態 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 培 地 発 育 気菌糸 裏面の 溶解性 色調 色素 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− イースト・麦芽 良好 拡散性 盛上り 豊富 絨毯状 黄褐色 なし 寒天培地 皺 淡黄白色 淡桃→灰色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− オートミール 良好 拡散性 平坦 中庸 絨毯状 黄 色 なし 寒天培地 黄色 淡桃→灰色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− スターチ・無機 良好 拡散性 平坦 中庸 絨毯状 黄白色 なし 塩寒天培地 淡黄白色 淡桃→灰色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グリセリン・ア 良好 拡散性 盛上り 中庸 粉状 黄 色 なし スパラギン寒天 黄色 灰白色 培地 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− チロシン寒天 良好 拡散性 平坦 豊富 線状 黒褐色 なし 培地 皺 淡黄白色 白色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− シュクロース・ 弱い 拡散性 平坦 なし 黒 色 なし 硝酸塩培地 無色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グルコース・ア 良好 拡散性 平坦 中庸 線状 黄 色 なし スパラギン寒天 黄白色 淡桃→灰色 培地 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 栄養寒天培地 中庸 局限性 平坦 なし 黄白色 なし 黄白色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ベネット寒天 良好 拡散性 盛上り 中庸 粉状 黄 色 なし 培地 皺 黄白色 淡桃→灰白色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ペプトン・イー 中庸 局限性 平坦 なし 黄 色 なし スト・鉄寒天 皺 黄白色 培地 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− スターチ合成寒 微 拡散性 無色 なし 無 色 なし −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００４４】Ｃ．生理学的性質 (1) リトマスミルク：凝固なく消化、リトマス還元なし (2) ゼラチン液化：なし (3) 抗酸性：陰性 (4) グルコース酸化（Hugh-Leifson）：陽性 (5) 温度生育性：至適温度39℃、生育温度範囲15〜45℃ (6) pH生育性：最適pH7.2、生育pH範囲4.8〜9.5 (7) 耐塩性：７％ (8) 硝酸塩の還元：陽性 (9) 硫化水素の生成：陽性 (10)カゼイン分解（Fraizer法）：陽性 (11)デンプンの加水分解：陽性 (12)エスクリン加水分解：陽性 (13)リンゴ酸石灰の溶解：陽性 (14)アデニン分解：陽性 (15)キサンチン分解：陰性 (16)チロシン分解：陰性 (17)フェニールアラニン脱アミノ：陰性 (18)ウレアーゼ：陽性 (19)カタラーゼ：陽性 (20)細胞壁タイプ： LL−ジアミノピメリン酸 ＋ meso−ジアミノピメリン酸 − グリシン ＋ リジン − アラビノース − ガラクトース − (21)窒素源の利用性：アスパラギン酸ナトリウム、カゼ
ミノ酸、β−アラニン、ペプトン、グルタミン酸ナトリ
ウムを良く利用する（+++） Ｌ−アルギニン、硫安、塩安、DL−メチオニン、Ｌ−バ
リンを利用する（++） 硝酸カリ、硝酸ナトリウム、尿素を弱く利用する（＋）
(22)炭素源の利用性：Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ラフィノース、Ｄ−マン
ニット、i−イノシトール、シュクロースを良く利用す
る（+++） サリシンを利用する（＋）

【００４５】以上の菌学的諸性質についてバージェイス
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオ
ロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriol
ogy）（第７版）及びThe Actinomycetes（２巻、152〜2
92頁）を参照し、本菌をストレプトマイセス・エスピー
G-27（Streptomyces sp. G-27）と同定した。

【００４６】本菌を培養して耐酸性グルコースイソメラ
ーゼを生産するには、窒素源として、コーンスティープ
リカー、肉エキス、ペプトン、ブイヨン、カゼイン、大
豆粕、酵母、酵母エキスなど、通常、微生物の培養に使
用される有機窒素源、あるいは塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素
源を単独又は有機窒素源に補足して使用される。

【００４７】炭素源としては、キシロース、又はその原
料であるキシラン及びその派生物が使用される。この
他、ソルビトール、グリセリン、マンノース、グルコー
ス、シュークロースなども有効である。

【００４８】以上の窒素源と炭素源の他に、補足する培
地成分としてリン酸塩、マグネシウム塩、コバルト塩、
マンガン塩などが添加される。

【００４９】培養は、pH５〜９、好ましくはpH5.5〜
８、温度25〜50℃、好ましくは30℃で１〜４日間程度行
われる。グルコースイソメラーゼは菌体内に生産される
酵素であるので、培養後、ろ過又は遠心分離により菌体
を回収し、そのまま、又は適当な固定化処理を行なって
使用するか、超音波又は自己消化法により該酵素を抽出
し使用される。抽出された酵素は必要により、濃縮し、
硫酸アンモニウム、アセトン、メタノール、エタノール
などで沈殿し、乾燥保存する。

【００５０】本酵素を用い、グルコースからフラクトー
スを生成する反応は、20〜60％のグルコース溶液又はグ
ルコース含有液、例えば、澱粉糖化液が使用され、pH4.
5〜８、温度50〜90℃で行うことができる。すなわちア
スペルギルス・ニガー又はリゾープス属のグルコアミラ
ーゼを用い、pH4.5〜5.5で糖化された糖化液を、実質的
にpHを調整することなく、そのまま異性化原料として使
用するか、又は、澱粉液化液又はデキストリン含有液を
原料とし、グルコアミラーゼが作用する条件（pH4.5〜
5.5、温度55〜60℃）で、グルコアミラーゼによる糖化
と本発明の酵素による異性化を同時に行うことができ
る。

【００５１】又、澱粉を原料とし、α−アミラーゼによ
る液化、グルコアミラーゼによる糖化と本発明の酵素に
よる異性化の、３つの反応を、pH５〜６、温度55〜60℃
で同時に行い、澱粉から直接、異性化糖を製造すること
も可能である。

【００５２】上記したストレプトマイセス・エスピー
Ｇ−27（Streptomyces sp. G-27）より得られるよう
な、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆
的に酸化失活する性質を有する耐酸性グルコースイソメ
ラーゼを用いて、上記のような方法でグルコースからフ
ラクトースを生成する反応を行うことができるが、本発
明に使用する酵素としてはストレプトマイセス・エスピ
ー Ｇ−27（Streptomycessp. G-27）由来の耐酸性グル
コースイソメラーゼに限定されない。即ち、pH４〜６の
酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活す
る性質を有する酵素であれば本発明を適用することがで
きる。これらの酵素のように、pH４〜６で可逆的に酸化
失活するグルコースイソメラーゼの活性を回復する為に
は、嫌気的条件下／及び又は還元剤の存在下での反応が
効果的である。

【００５３】嫌気的条件としては、簡単には、反応液
を、水に溶解しない有機溶媒、例えば、トルエンを重層
して、空気との接触を断つだけでも達成できる。このこ
とにより、基質であるグルコースあるいは生成フラクト
ースの還元力により、次第に活性が回復される。

【００５４】また、基質溶液を脱気したり、基質溶液に
窒素ガスのような不活性ガスを注入したり、基質溶液を
減圧下で貯蔵したり、基質溶液を加温するなどして、溶
存酸素を除去したり、酸素が入り込まないようにすれば
より効果的である。

【００５５】更に、固定化酵素バイオリアクターを用い
て連続的に異性化反応を行う場合には、基質の貯槽から
固定化酵素床までの配管とポンプに空気層がないように
するか、或いはできるだけ少なくして、基質溶液が酵素
と接触するまでの間に酸素が溶け込まないよう配慮す
る。

【００５６】これらの嫌気的条件をつくる方法を、単独
または適宜組み合わせて行えば、基質グルコースによ
り、同酵素の活性は次第に回復し、活性が長時間にわた
り維持される。

【００５７】また、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸
水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、２−メルカプト
エタノール、システイン、グルタチオンなどの還元剤を
添加することにより短時間に活性が回復し、保持され
る。より好ましくは亜硫酸水素ナトリウムが使用でき
る。

【００５８】これらの還元剤の添加量は通常0.1〜２mM
程度であり、更に基質溶液をできるだけ脱気し、溶存酸
素を少なくし、減圧下で貯蔵するのが望ましい。 反応
系への還元剤の添加時期としては特に限定されないが、
基質溶液に含有させることも可能であり、更に基質溶液
がグルコースイソメラーゼと接触する直前に添加するよ
うにすれば、還元剤の添加量を少なくし、効果も大き
い。

【００５９】従って、本発明をより効果的に実施するに
は、これらの条件を適宜組み合わせ、できるだけ空気を
遮断し嫌気的状態を保てるよう装置上の工夫を行うこと
により、効率的に本発明を実施することができる。

【００６０】尚、特に記載しない限り、異性化した反応
物の糖組成の分析は高速液体クロマトグラフィーによる
か、又は、フラクトースはシステインーカルバゾール法
による比色定量により、グルコースはグルコースオキシ
ダーゼを用いる酵素法により、そして全糖量はアンスロ
ン法又はフェノール−硫酸法による比色定量法により行
なった。

【００６１】次に、実施例により本発明の内容を説明す
るが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定される
ものでない。

【実施例】

実施例１ コーン・スティ−プ・リカー 1.2％（固形分換算）、魚
肉エキス0.1％、CoCl₂ １×10^-3Ｍ、Ｄ−キシロース
0.6％、グリセリン 0.4％からなる培地（pH6.5）50mlを
200ml容三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、スト
レプトマイセス・エスピー Ｇ−27（FERM P-12036）を
接種し、30℃で３日間振盪培養した。

【００６２】培養後、遠心分離して菌体区分を集め、水
洗滌後、20KC超音波細胞破砕機で破砕し、抽出液を得
た。該抽出液の一定量を採り、生産されたグルコースイ
ソメラーゼを測定した結果、培地１ml当たり約1.5単位
生産された。

【００６３】該抽出液に硫安を70％飽和になるよう加
え、生成する沈殿を集め、セロファンチューブに入れ、
蒸溜水で透析してのち、膜濃縮し、セファデックＧ−15
0カラムクロマトグラフィーにより精製した酵素液を使
用し、以下の実験を行った。

【００６４】(1) pH安定性 ストレプトマイセス・エスピー Ｇ−27（FERM P-1203
6）由来のグルコースイソメラーゼと市販のストレプト
マイセス・ルビジノサス（Streptomyces rubiginosus)
由来のグルコースイソメラーゼ［Y. Takasaki他, Agric
ulture BiologicalChemistry, vol.33, 1527-1534 (196
9)及び同誌, Vol.30, 1247-1253(1966)記載のストレプ
トマイセス・エスピー ＹＴ−No.５（Streptomyces sp.
YT-5）と同じ菌株］を、それぞれ0.05単位と、各pHの50
mM酢酸またはリン酸緩衝液を全量0.4mlで、室温（約25
℃）で３時間放置後、0.4Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を加
えて、pH7.0に戻し、残存活性を測定した。その結果を
図１に示す。

【００６５】図１から明らかなように、市販酵素は、pH
６以下で不安定であったのに対し、本発明で使用する酵
素は、pH４〜11の幅広いpHで安定であり、特に、pH４〜
６の酸性域での安定性が顕著であった。

【００６６】(2) グルコース異性化反応に対するpHの影
響 ストレプトマイセス・エスピー Ｇ−27由来の耐酸性グ
ルコースイソメラーゼと(1)記載の市販グルコースイソ
メーラーゼの活性に対するpHの影響を測定した。

【００６７】反応は、各pHの0.1Ｍ酢酸またはリン酸緩
衝液、各グルコースイソメラーゼ 0.05単位、グルコー
ス 0.1Ｍ、MgSO₄ ５mMの下、全量0.4mlを、内径14mm、
長さ100mmの試験管に入れ、60℃で30分間反応を行っ
た。

【００６８】図２から明らかなように、ストレプトマイ
セス・エスピー Ｇ−27由来の酵素の最適pHは７付近に
あり、pH５では、pH７での活性の20％程度の活性であっ
た。一方、前記市販の酵素はpH5.0において殆ど活性は
示さなかった。

【００６９】実施例２ ストレプトマイセス属由来の耐酸性グルコースイソメラ
ーゼの固定化酵素を用いた連続反応を詳細に検討した結
果、上記(2)で記載した、pH７と比較したpH５での活性
値（約20％）は、この酵素のこのpHでの実際の活性値を
示すものでなく、酸性下で促進される可逆的酸化失活が
含まれていることを見い出した。

【００７０】そこで、本実験では、酸性下で失活した活
性を回復し、保持するため、試験管に入れた反応液の液
面をトルエンで重層した上、還元剤を添加して反応を行
った。

【００７１】実施例１の(2)の実験において、反応時のp
Hを5.0、5.5、6.0、6.5及び7.0とし、通常の反応（対
照）と空気との接触を断つため液面をトルエンで重層
し、更に、還元剤として、亜硫酸水素ナトリウムを１mM
添加して反応を行った。得られた結果を表２に示す。

【００７２】

【表２】

【００７３】表２から明らかなように、特に、pH６以下
において、嫌気的条件下の反応の効果が顕著に認められ
た。

【００７４】表中において酸化による失活率は以下のよ
うにして求めた。

【００７５】

【式１】

【００７６】実施例３ 嫌気性を高めるため、各種還元剤を添加して異性化反応
を行った。反応は、グルコース40％、マレイン酸緩衝液
（pH５またはpH７）50mM、MgSO₄ ５mM、グルコースイソ
メラーゼ 0.086単位、各種還元剤 １mM、全量 2.0 ml
を、内径13mm、長さ100mmの試験管に入れ、トルエン0.5
mlを重層し、60℃て行った。経時的に一定量を採り、生
成フラクトースを定量した。

【００７７】図３から明らかなように、pH5.0の反応に
おいて、トルエンを重層して空気を遮断し、更に、各種
の還元剤を添加して行った結果、いずれの還元剤を使用
した場合も、反応初期から顕著な効果が認められた。な
かでも亜硫酸水素ナトリウムが良好であった。しかし、
還元剤無添加の場合でも、時間の経過とともに活性の回
復が認められた。一方、pH7.0の反応では、図４から明
らかなように、いずれの還元剤も添加効果は認められな
かった。

【００７８】比較的良好であった亜硫酸水素ナトリウム
について、濃度を変えて試験した。反応は、グルコース
40％、マレイン酸緩衝液（pH５及びpH７）50mM、MgSO₄
５mM、グルコースイソメラーゼ 0.086単位、亜硫酸水素
ナトリウムを0.5、１、２又は４mM、全量2.0mlを、内径
13mm、長さ100mmの試験管に入れ、トルエン0.5mlで重層
し、60℃で行った。得られた結果を図５に示す。

【００７９】図から明らかなように、最適濃度は１〜２
mMであった。

【００８０】実施例４ ストレプトマイセス属由来のグルコースイソメラーゼ
（実施例１で使用の酵素）について、空気酸化の影響に
ついて検討した。酢酸緩衝液（pH5.0）またはリン酸緩
衝液（pH7.0）50mMとグルコースイソメラーゼ 4.3×10
^-3単位、全量0.2mlを内径13mm、長さ100mmの試験管に入
れ、室温（25℃）で、静置または振盪（200rpm）した。
０時間目と１時間目で、それぞれ、0.4Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）を0.3ml加えて、pH７に調整後、残存活性を測
定した。得られた結果を表３に示す。

【００８１】

【表３】

【００８２】表３から明らかなように、pH7.0では、静
置、振盪とも１時間後、殆ど活性の低下が認められなか
ったが、pH5.0では、静置でも１時間後、約10％の活性
低下があり、振盪した場合は、約32％の活性が低下し
た。このことから、空気中の酸素が活性低下に関与して
いるものと考えられた。しかし、この低下した活性は、
同酵素を嫌気下で保つことにより回復した。

【００８３】実施例５ 耐酸性グルコースイソメラーゼ固定化酵素を用いて実験
した。実施例１により調製された耐酸性グルコースイソ
メラーゼを含むストレプトマイセス属菌体を凍結乾燥
し、乾燥菌体当たり、10％量のゼラチンを加え、少量の
水とともに、60℃で加温して、ペースト状とした後、注
射器で0.5％グルタルアルデヒド／アセトン溶液に滴下
し、10分放置後、固定化菌体を集め、30℃で１夜風乾し
た。このようにして得られた固定化酵素約24.6単位を、
内径13mm、長さ80mmのカラムに詰めた。

【００８４】基質としては、グルコース40％、MgSO₄ 50
mMとマレイン酸緩衝液（pH５またはpH７）50mMからなる
組成のものを用いた。基質の貯槽からポンプ（チューブ
ポンプを使用）を経て固定化酵素床までの間をビニール
チューブで接続し、途中空気層がないようすべて基質溶
液で満たし、60℃で反応を行った。流量は、各pHとも異
性化率が45％前後となるよう調節した。

【００８５】その結果、pH7.0での反応の流量は約0.62m
l／時であり、pH5.0での反応の流量は約0.41ml／時であ
った。約１ケ月間運転後の結果を図６に示す。この結果
から、異性化率が半減する期間は、pH7.0の場合で約６
ケ月、pH5.0の場合で約２ケ月と算出された。

【００８６】図７は、カラムの操作日数に対して、生成
したフラクトースの積算量を図示したものである。この
結果から、pH5での活性は、pH7.0の約60％と計算され
た。

【００８７】実施例６ 実施例５において、より嫌気的状態を維持するため、基
質液に１mMの亜硫酸水素ナトリウムを添加して使用して
異性化反応を行った。カラムには、約19.6単位の固定化
グルコースイソメラーゼを充填し、反応は60℃で行っ
た。流量は異性化率が約45％になるよう調整した。

【００８８】その結果、流量は、pH5.0の場合で0.24ml
／時、pH7.0の場合で0.32ml／時であった。図８は、カ
ラムの操作日数に対して、生成したフラクトースの積算
量を図示したものである。

【００８９】この結果から、pH５での同酵素の活性は、
pH7.0の場合の約75％と計算され、還元剤を添加するこ
とにより嫌気性が向上したことにより、pH5.0での活性
を顕著に向上させることができた。

【００９０】実施例７ 実施例６において、基質液のpHをpH4.5、5.0、6.0、6.5
と7.0に変え、異性化率約10％となるよう流量を調整
し、60℃で反応を行った。流量から算出したそれぞれの
pHでの活性値を表４と図９に示す。

【００９１】

【表４】

【００９２】実施例１の(2)の結果（図２）のように試
験管を用い、液面が空気と接触しているこれまでの活性
測定では、pH7.0、6.0、5.5、5.0及び4.5での活性は、
それぞれ、約100％、約81％、約42％、約20％と約６％
であったのに対し、固定化酵素を用い嫌気的状態で反応
を行うと、それぞれのpHで、100％、93％、86％、72％
及び67％と高い活性が得られた。

【００９３】

【発明の効果】本発明は、pH４〜６の酸性域で可逆的に
酸化失活するストレプトマイセス属耐酸性グルコースイ
ソメラーゼを、pH４〜６の酸性下、かつ嫌気的条件下及
び／又は還元剤の存在下で反応することにより、活性を
回復、保持して，pH４〜６の酸性下でグルコースをフラ
クトースに効果的に変換する方法に関し、これにより、
グルコアミラーゼによる液化澱粉の糖化と同じpHでグル
コースをフラクトースに異性化を行うことを可能にす
る。また、酸性下での反応により、従来、異性化糖の製
造において問題となっていた糖液の着色を少なくし、プ
シコース、ダイフラクトース、有機酸などの副産物の生
成も抑制し、商業的に有利に異性化糖を製造することを
可能とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の(1)の各グルコースイソメラーゼのp
H安定性を示す。

【符号の説明】

図中で−○−は耐酸性グルコースイソメラーゼを示し、
−●−はストレプトマイセス・ルビジノサス由来のグル
コースイソメラーゼを示す。

【図２】実施例１の(2)の各グルコースイソメラーゼの
活性に対するpHの影響を示す。

【符号の説明】

図中で−○−は耐酸性グルコースイソメラーゼを示し、
−●−はストレプトマイセス・ルビジノサス由来のグル
コースイソメラーゼを示す。

【図３】実施例３の耐酸性グルコースイソメラーゼを用
いたpH5.0での反応において、各種還元剤の影響を示
す。

【符号の説明】

図中で−△−は亜硫酸水素ナトリウム、−＋−は亜硫酸
ナトリウム、−○−は２−メルカプトエタノール、−×
−はグルタチオン、−●−はチオ硫酸ナトリウム、−◇
−はシステイン、−□−は無添加の場合を示す。

【図４】実施例３の耐酸性グルコースイソメラーゼを用
いたpH7.0での反応において、各種還元剤の影響を示
す。

【符号の説明】

図中で−△−は亜硫酸水素ナトリウム、−＋−は亜硫酸
ナトリウム、−○−は２−メルカプトエタノール、−×
−はグルタチオン、−●−はチオ硫酸ナトリウム、−◇
−はシステイン、−□−は無添加の場合を示す。

【図５】実施例３の耐酸性グルコースイソメラーゼを用
いたpH5.0での反応における亜硫酸水素ナトリウム添加
の影響を示す。

【符号の説明】

図中で−●−は無添加でpH7.0で反応した場合を示し、
−○−は無添加でpH5.0で反応した場合を示している。
−×−は２mM、−△−は１mM、−＋−は４mM、そして、
−□−は0.5mMの亜硫酸水素ナトリウムを添加した場合
を示す。

【図６】実施例５の固定化耐酸性グルコースイソメラー
ゼを用いた連続異性化反応の操作日数と異性化率の結果
を示す。

【符号の説明】

図中で、−○−はpH5.0の結果を、−●−はpH7.0の結果
を示す。

【図７】実施例５の固定化耐酸性グルコースイソメラー
ゼを用いた連続異性化反応の操作日数と生成したフラク
トースの積算量の結果を示す。

【符号の説明】

図中で、−○−はpH5.0の結果を、−●−はpH7.0の結果
を示す。

【図８】実施例６の固定化耐酸性グルコースイソメラー
ゼを用い、亜硫酸水素ナトリウム存在下で行った連続異
性化反応の操作日数と異性化率の結果を示す。

【符号の説明】

図中で、−○−はpH5.0の結果を、−●−はpH7.0の結果
を示す。

【図９】実施例７の基質液のpHと活性の結果を示す。

【符号の説明】

図中で、−○−は実施例１の(2)に示した液面が空気と
接触している場合の結果であり、−●−は固定化酵素を
用いた嫌気性条件下での結果を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】耐酸性グルコースイソメラーゼを酸性下
   で、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存在下でグル
   コースに作用させることを特徴とする、グルコースをフ
   ラクトースに変換する方法。
2. 【請求項２】耐酸性グルコースイソメラーゼがpH４〜６
   の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活
   する性質を有する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】耐酸性グルコースイソメラーゼがストレプ
   トマイセス属由来である請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】還元剤が亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナ
   トリウム、チオ硫酸ナトリウム、２−メルカプトエタノ
   ール、システイン、グルタチオンより選ばれる１種以上
   である請求項１乃至３記載の方法。