KR20160048789A

KR20160048789A - D-사이코스 3-에피머라제의 개선된 변이체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20160048789A
Application number: KR1020167005156A
Authority: KR
Inventors: 피에르 라노; 리우밍 조우; 민 지아; 웬리 장; 보 지앙; 완멩 무; 타오 장
Original assignee: 로께뜨프레르
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2016-05-04
Also published as: KR102189458B1; US9790481B2; WO2015032761A1; CN105637089B; EP3041932A1; EP3041932B1; CN105637089A; US20180179510A1; JP6774875B2; US20160281076A1; US10612016B2; JP2016528925A

Abstract

본 발명은 D-사이코스 3-에피머라제의 개선된 변이체 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

D-사이코스 3-에피머라제의 개선된 변이체 및 그의 용도{IMPROVED VARIANT OF D-PSICOSE 3-EPIMERASE AND USES THEREOF}

본 발명은 프룩토스로부터 사이코스를 제조하기 위한 개선된 이성질화효소, 특히 D-사이코스-3-에피머라제 및 그의 용도에 관한 것이다.

D-알룰로스로도 지칭되는 D-사이코스는 프룩토스의 드문 당 이성질체이다. 그것은 자연에서 관찰될 수 있으나, 먹을 수 있는 버섯 또는 잭푸르트(jackfruit)에서, 밀 및 이테아(Itea) 나무에서와 같이 매우 낮은 농도로 관찰될 수 있다.

인간에서의 사이코스의 대사는 프룩토스와 반대로, 부분적으로 흡수되고 에너지로 대사되며, 부분적으로 소변 및 대변에서 변하지 않고 배설된다.

D-사이코스의 칼로리가 없는 성질, 혈당 반응의 감소에 대한 긍정적인 효과, 항비만 효과 등을 포함하는, 생활방식-관련 질병을 예방하기 위한 물질로서의 D-사이코스의 특징이 개시되어 있다. 또한, D-사이코스의 단맛은 수크로스의 단맛의 약 70%이나(문헌[Oshima, et al. (2006) Psicose contents in various food products and its origin. Food Sci Technol Res 12:137-143]), 수크로스의 에너지의 0.3%이고, 이상적인 식품용 수크로스 대용물로서 제안된다. 또한, 그것은 체지방 축적을 감소시키기 위해 간의 지방생성 효소 및 장의 α-글리코시다제의 억제제로 사용될 수 있다. 그것은 추가로 중요한 생리학적 기능, 예를 들어, 반응성 산소 화학종 제거 활성 및 신경보호 효과를 보인다. 또한, 그것은 겔화 거동을 개선시키고, 식품 가공 동안 우수한 향미를 생성한다.

D-사이코스는 상용의 탄수화물 또는 농산물에 극소량이 존재하며, 화학적으로 합성하기 어렵다. 따라서, 매력적인 D-사이코스 생성 방식으로서 D-타가토스 3-에피머라제(DTEase) 과 효소를 사용한 에피머화에 의한 D-프룩토스와 D-사이코스 간의 상호전환은 혼란을 주고 있다.

지금까지, 9가지 종류의 DTEase 과 효소 공급원이 보고되었다. DTEase는 20년 전에 Izumori 등에 의해 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)로부터 처음 특성화되어 D-타가토스의 최적의 기질을 사용한 케토헥소스의 C-3 에피머화 활성을 보여주었다(문헌[Izumori et al. 1993, Biosci. Biotechnol. Biochem. 57, 1037-1039]). 2006년까지, 케토헥소스의 C-3 에피머화 활성을 갖는 두번째 효소가 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터 확인되었으며, 그것은 D-사이코스에 대한 그의 높은 기질 특이성 때문에 D-사이코스 3-에피머라제(DPEase)로 명명되었다(문헌[Kim et al. 2006, Applied and environmental microbiology 72, 981-985]; US 2010/0190225호, WO2011/040708호). 최근에, 다른 6개의 DTEase 과 효소가 각각 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) SK011(DTEase)(문헌[Zhang et al. 2009, Biotechnology letters 31, 857-862]), 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰(Clostridium cellulolyticum) H10(DPEase)(문헌[Mu et al. 2011, Journal of agricultural and food chemistry 59, 7785-7792], CN102373230호), 루미노코커스(Ruminococcus) 종 5_1_39BFAA(DPEase)(문헌[Zhu et al. 2012, Biotechnology letters 34, 1901-1906]), 클로스트리듐 볼테아에(Clostridium bolteae) ATCC BAA-613(문헌[Jia et al. 2013, Applied Microbiology and Biotechnology DOI 10.1007/s00253-013-4924-8]), 클로스트리듐 신덴스(Clostridium scindens) ATCC 35704(문헌[Zhang et al. 2013, PLoS ONE 8, e62987]) 및 클로스트리듐(Clostridium) 종 BNL1100(문헌[Mu et al. 2013, Biotechnology Letter DOI 10.1007/s10529-013-1230-6])으로부터 특성화되었다. 또한, Maruta 등은 리조비움(Rhizobium)에서 DTEase 생성 공급원을 개시하였다(US 2011/0275138호).

단백질 조작 기술에 의한 DTEase 과 효소의 효소 변형을 보고하기 위한 참고문헌이 오직 하나 있다. 무작위 및 위치-지정 돌연변이유발 기술을 사용하여, Choi 등(문헌[2011, Applied and environmental microbiology 77, 7316-7320])은 아그로박테리움 투메파시엔스 DPEase의 I33L S213C 이중-위치 변이체를 작제하였으며, 변이체 효소는 야생형 효소와 비교하여, 최적의 온도, 반감기, 융점 및 촉매 효율의 증가를 보였다. 그의 최적의 pH는 8.00에서 변경되지 않고 유지되었다.

그러나 효소는 8.0 내지 9.5에서 활성을 위한 최적의 pH를 가지며, pH 안정성은 8.0 내지 10.0이고, 이는 산업 응용에 적절하지 않다.

따라서, 사이코스의 사용에 대한 주요 관심사는 그것이 부족하다는 것과 그의 생성 비용에 있고, 개선된 산업적 D-사이코스 생성이 여전히 필요하다.

발명의 요약

산업적 D-사이코스 생성법을 개발하고, 생성 비용을 줄이기 위하여, 최적화된 DTEase 과 효소는 약산 안정성이고, 열안정성이어야 하며, 기질 D-프룩토스에 대하여 보다 높은 촉매 효율 및 턴오버를 갖는다.

본 발명은 모체 D-사이코스 3-에피머라제의 변이체에 관한 것이며, 여기서, 변이체는 모체 D-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 SEQ ID No 2의 위치 211에 상응하는 위치에 세린 잔기에 의한 글리신 잔기의 치환을 포함하며; 변이체는 D-사이코스 3-에피머라제 활성을 갖는다. 바람직하게는 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 60% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

바람직한 구현예에서, 변이체는 하나의 또는 몇몇의 하기의 특징을 갖는다:

a. 모체 D-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 더 낮은, 바람직하게는 6 내지 7 범위의 최적의 pH; 및/또는

b. 모체-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 기질 D-프룩토스에 대한 더 높은, 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 촉매 효율; 및/또는

c. 60℃에서 모체-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 더 긴 반감기.

바람직하게는, 변이체는 SEQ ID No 2와 35% 이상의 동일성, 바람직하게는 60% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

바람직하게는, 변이체는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 60% 이상의 동일성, 바람직하게는, 더욱 바람직하게는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

바람직한 구현예에서, 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 슈도모나스 치코리이 유래의 D-타가토스 3-에피머라제, 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 종 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 신덴스 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 볼테아에 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 루미노코커스 종 유래의 D-사이코스 3-에피머라제 및 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 D-사이코스 3-에피머라제로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 D-사이코스 3-에피머라제이다.

가장 바람직한 구현예에서, 변이체는 SEQ ID No 4의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 4와 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 211에 잔기 세린을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 변이체는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:

- G211S 치환을 갖는 SE ID No 5의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 5와 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열; 또는

- G210S 치환을 갖는 SE ID No 6의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 6과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 210에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열; 또는

- G211S 치환을 갖는 SE ID No 7의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 7과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열; 또는

- G213S 치환을 갖는 SE ID No 8의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 8과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 213에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열; 또는

- G223S 치환을 갖는 SE ID No 9의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 7과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 223에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열; 또는

- G213S 치환을 갖는 SE ID No 10의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 10과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 213에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산이다. 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변이체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다. 일부 구현예에서, 재조합 숙주 세포는 바실로펩티다제 F를 인코딩하는 유전자가 불활성화된 바실러스 서브틸리스 균주이다.

본 발명은 본 발명에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 임의로, 생성된 배양물로부터 생성된 D-사이코스 3-에피머라제 변이체를 회수하거나 정제하는 단계를 포함하는 D-사이코스 3-에피머라제 변이체의 생성 방법에 관한 것이다. 다시 말하면, 본 발명은 본 발명에 따른 D-사이코스 3-에피머라제 변이체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 변이체를 D-사이코스 3-에피머라제 활성에 적합한 조건에서 D-프룩토스와 접촉시키는 단계 및 임의로, 생성된 D-사이코스를 회수하는 단계를 포함하는 D-사이코스의 생성 방법에 관한 것이다. 임의로, D-프룩토스는 글루코스 이성질화효소에 의해 D-글루코스로부터 이전에 또는 동시에 생성된다. 그 다음, 본 발명은 D-사이코스를 생성하기 위한, 본 발명에 따른 D-사이코스 3-에피머라제 변이체 또는 본 발명에 따른 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 본 발명에 따른 D-사이코스 3-에피머라제 변이체 및 추가의 효소, 특히 글루코스 이성질화효소를 포함하는 효소 조성물이다.

마지막으로, 본 발명은 식품을 제조하기 위한 본 발명에 따른 GRAS 숙주 세포의 용도 및 그러한 GRAS 숙주 세포를 포함하는 식품에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 D-사이코스 3-에피머라제의 개선된 변이체에 관한 것이다.

정의

본 명세서에서, 용어 "DPEase" 및 "DTEase"는 각각 "D-사이코스 3-에피머라제" 및 "D-타가토스 3-에피머라제" 대신에 사용될 수 있다. 그리고 "DPEase" 및 "DTEase"는 각각 D-사이코스 및 D-타가토스로서 최적의 기질을 사용하는 케토스 3-에피머라제를 의미한다.

용어 "모체"는 본 발명의 변이체를 생성하기 위하여 변경이 이루어지는 효소를 의미한다. 모체는 천연 발생(야생형) 폴리펩티드 또는 그의 단편의 변이체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10에 나타낸 것들에서 선택된 것이다.

또한, 용어 "DPEase 변이체"는 본 발명에 교시된 바와 같은 D-타가토스 3-에피머라제의 변이체로 지칭될 수도 있다. 동일성 백분율: 2개의 아미노산 서열 (A) 및 (B) 간의 "동일성 백분율"은 비교창을 통해 최적의 방식으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정된다. 상기 서열의 정렬은 널리 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch)의 전체 정렬을 위한 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 부여된 유사성의 척도를 사용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 일단 전체 정렬이 수득되면, 정렬된 동일한 아미노산 잔기의 총 개수를 서열 (A)와 (B) 중 가장 긴 서열에 함유된 잔기의 총 개수로 나누어 동일성 백분율을 수득할 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 결정된다. 2개의 아미노산 서열을 비교하기 위하여, 예를 들어, 하기의 디폴트 설정을 사용하여 EMBL-EBI에 의해 제공되고 www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein에서 이용가능한 단백질의 쌍별 서열 정렬을 위한 툴 "엠보스 니들(Emboss needle)"을 사용할 수 있다: (I) 매트릭스: BLOSUM62, (ii) 갭 오픈: 10, (iii) 갭 연장: 0.5, (iv) 출력 형식: 쌍, (v) 엔드 갭 페널티: 거짓, (vi) 엔드 갭 오픈: 10, (vii) 엔드 갭 연장: 0.5.

"약"은 소정의 값보다 10% 더 많거나 더 적은 값으로 의도된다. 바람직하게는, 그것은 소정의 값보다 5% 더 많거나 더 적은 값으로 의도된다. 예를 들어, "약 100"은 90 내지 110, 바람직하게는 95 내지 105를 의미한다.

"D-사이코스 3-에피머라제 활성"은 D-프룩토스를 D-사이코스로 변형시키는 효소의 능력을 지칭한다. 이러한 활성은 D-프룩토스로부터 형성된 D-사이코스의 양을 측정함으로써 분석할 수 있다. 특히, 그것을 실시예 섹션에 상세화된 바와 같이 또는 문헌[Mu et al. (2011, Journal of agricultural and food chemistry 59, 7785-7792; in "Enzyme Assay" section page 7787)]에 개시된 바와 같이 측정할 수 있다.

D- 사이코스 3- 에피머라제의 변이체

본 발명은 모체 D-사이코스 3-에피머라제의 변이체에 관한 것이며, 여기서, 변이체는 모체 D-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 SEQ ID No 2의 위치 211에 상응하는 위치에서 세린 잔기에 의한 글리신 잔기의 치환을 포함하며; 변이체는 D-사이코스 3-에피머라제 활성을 갖는다.

바람직하게는, 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 모체는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 개선된 변이체로서 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 DPEase의 G211S 변이체를 확인하였다. 실제로, 이러한 변이체는 하기의 이점을 나타낸다(표 1 및 2 참조):

- 보다 낮은 최적의 pH, 즉, 야생형 DPEase에 대한 8.0 대신에 6.5;

- 60℃에서 보다 긴 반감기, 즉, 6.8 대신에 7.2시간; 및

- D-프룩토스에 대한 보다 높은 k_cat/K_m, 즉, 62.7 대신에 150.6.

본 발명자들의 지식에 따르면, 7.0 미만의 최적의 pH를 갖는 DPEase가 보고된 것은 처음이다. 또한, 최적의 pH의 저하는 개선된 안정성 및 강력한 촉매 효율의 증가가 뒤따른다.

따라서, DPEase 변이체는 하나의 또는 몇몇의 하기의 특징을 갖는다:

b. 모체-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 기질 D-프룩토스에 대한 더 높은, 바람직하게는 적어도 50, 75, 100, 120% 더 높은, 더욱 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 촉매 효율; 및/또는

c. 60℃에서 바람직하게는 적어도 5, 10, 15 또는 20분 이상 더 긴 반감기.

제1 구현예에서, DPEase 변이체는 항목 a) 및 b), 항목 a) 및 c), 항목 b) 및 c), 또는 항목 a), b) 및 c)의 요건을 충족시킨다. 바람직하게는 DPEase 변이체는 모체 D-사이코스 3-에피머라제에 비하여 더 낮은, 바람직하게는 6 내지 7 범위의 최적의 pH를 갖는다. 따라서, DPEase 변이체는 항목 a) 및 b), 항목 a) 및 c), 또는 항목 a), b) 및 c)의 요건을 충족시킨다.

또한, 변이체는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모체 D-사이코스 3-에피머라제의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 변이체는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

특정 구현예에서, 변이체는 모체 D-사이코스 3-에피머라제의 SEQ ID No 2의 위치 211에 상응하는 위치에 세린 잔기에 의한 글리신 잔기의 치환을 포함하며, D-사이코스 3-에피머라제 활성을 갖고, SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 이상의 동일성을 갖는다. 또한, 변이체는 상기 개시된 바와 같은 항목 a) 및 b), 항목 a) 및 c), 항목 b) 및 c), 또는 항목 a), b) 및 c)의 요건을 충족시킬 수 있다.

본 발명자들은 슈도모나스 치코리이 유래의 D-타가토스 3-에피머라제, 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 D-사이코스 3-에피머라제 및 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 D-사이코스 3-에피머라제 간의 꽤 낮은 아미노산(aa) 서열 동일성에도 불구하고(즉, 슈도모나스 치코리이의 DTEase는 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase와 41% 아미노산 동일성을 갖고; 아그로박테리움 투메파시엔스의 DPEase는 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase와 60% 아미노산 동일성을 갖는다), 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase의 잔기 G211은 보존된다고 추가로 언급한다. 추가로, 도 1에 나타낸 바와 같이, G211은 8가지 효소 중 7가지에서 보존된다(도 1 참조).

그 다음, 본 발명은 SEQ ID No 2와 35% 이상의 동일성, 바람직하게는 60% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 DPEase 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 모든 DPEase 변이체가 SEQ ID No 2의 잔기 211에 상응하는 위치에서 Ser에 의한 Gly의 치환을 나타내는 것이 명백하게 이해된다.

더욱 특별히, 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 슈도모나스 치코리이 유래의 D-타가토스 3-에피머라제, 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 종 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 신덴스 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 볼테아에 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 루미노코커스 종 유래의 D-사이코스 3-에피머라제 및 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 D-사이코스 3-에피머라제로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 모체 D-사이코스 3-에피머라제는 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰, 더욱 특별히는 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 균주 H10(ATCC 35319) 유래의 D-사이코스 3-에피머라제이다.

따라서, 본 발명은 G211S 치환을 갖는 SE ID No 2의 아미노산 서열(즉, SEQ ID No 4의 아미노산 서열), 또는 SEQ ID No 4와 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DPEase 변이체에 관한 것이다.

대안적으로, 또한, 본 발명은 G211S 치환을 갖는 SE ID No 5의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No 5와 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DPEase 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 G210S 치환을 갖는 SE ID No 6의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No 6과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 210에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DPEase 변이체에 관한 것이다.

대안적으로, 또한, 본 발명은 G211S 치환을 갖는 SE ID No 7의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No 7과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DPEase 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 G213S 치환을 갖는 SE ID No 8의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No 8과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 213에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DPEase 변이체에 관한 것이다.

대안적으로, 또한, 본 발명은 G223S 치환을 갖는 SE ID No 9의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No 7과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 223에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DPEase 변이체에 관한 것이다.

마지막으로, 또한, 본 발명은 G213S 치환을 갖는 SE ID No 10의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No 10과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고 위치 213에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 갖거나 그를 포함하는 DTEase 변이체에 관한 것이다.

임의로, 변이체는 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산에서 변경을 가지며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 태그를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 DPEase 변이체에 관한 것이다. 예를 들어, DPEase 변이체는 DPEase 변이체 정제 또는 고정화를 용이하게 하기에 적합한 태그, 예를 들어, His 태그(His₆), FLAG 태그, HA 태그(인플루엔자 단백질 헤마글루티닌으로부터 유래된 에피토프), MYC 태그(인간 원암유전자 MYC로부터 유래된 에피토프) 또는 GST 태그(작은 글루타티온-S-트랜스퍼라제)를 포함할 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 고체 지지체 또는 캐리어 상에 고정화된 본 발명에 따른 DPEase 변이체에 관한 것이다. DPEase는 임의의 적합한 지지체 또는 캐리어, 예를 들어, 알지네이트, 앰버라이트 수지, 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 듀올라이트(Duolite) 수지, 예를 들어, 비드 상에 고정화될 수 있다. 고정화 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기 문헌[Choi et al]; 문헌[Lim et al. (2009, Porcess Biochemistry 44, 822-828)] 및 WO2011/040708호를 참조하며, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.

핵산, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산 또는 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산의 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이다. 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 핵산의 발현 카세트 또는 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산은 에피솜 서열로서 숙주 세포에 존재할 수 있거나 그의 염색체 내로 혼입될 수 있다. 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산은 하나의 카피 또는 몇몇의 카피가 숙주 세포에 존재할 수 있다.

핵산은 DNA(cDNA 또는 gDNA), RNA 또는 2개의 혼합물일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 형태 또는 듀플렉스 형태 또는 2개의 혼합물로 존재할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 변형된 결합, 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 화학적 합성, 재조합, 돌연변이유발 등을 포함하는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

발현 카세트는 본 발명에 따른 DPEase 변이체의 발현에 필요한 모든 요소, 특히, 숙주 세포, 특히 고려된 숙주 세포에서의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다.

숙주 세포는 원핵 또는 진핵, 바람직하게는 원핵 또는 하등 진핵, 더욱 바람직하게는 원핵일 수 있다. 특히, 발현 카세트는 프로모터 및 터미네이터, 임의로 인핸서를 포함한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에 따라, 원핵 또는 진핵일 수 있다. 바람직한 원핵 프로모터의 예는 Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, 박테리오파지 T3 또는 T7의 RNA 중합효소 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 람다 파지의 PR 또는 PL 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 적합한 프로모터를 선택하기 위하여, 당업자는 유리하게 문헌[Sambrook et al. work (1989)] 또는 문헌[Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology)]에 의해 설명된 기술을 참고할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 강력한 프로모터는 DPEase 변이체의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

본 발명은 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산 또는 발현 카세트를 함유하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이며, 다시 말해서, 벡터는 숙주 세포에서의 변이체의 발현에 필요한 요소를 포함한다. 벡터는 자가-복제가능한 벡터이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(E. coli) 또는 진핵생물일 수 있다. 진핵생물은 하등 진핵생물, 예를 들어, 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)) 또는 진균류(예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 악티노마이세스(Actinomyces) 속 유래) 또는 고등 진핵생물, 예를 들어, 곤충, 포유류 또는 식물 세포일 수 있다. 세포는 포유류 세포, 예를 들어, COS, CHO(US 4,889,803호; US 5,047,335호)일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 비-인간 및 비-배아이다.

벡터는 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 바이러스, YAC, BAC, 아그로박테리움 유래의 pTi 플라스미드 등일 수 있다. 벡터는 바람직하게는 복제 원점, 다중 클로닝 위치 및 선택 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 벡터는 자가-복제가능한 벡터이다. 원핵 벡터의 예에는 하기의 것이 포함되나 이들에 한정되지 않는다: pER322, pQE70, pMA5, pUC18, pQE60, pUB110, pQE-9(퀴아젠(Qiagen)), pbs, pTZ4, pC194, pD10, pHV14, Yep7, 파지스크립트(phagescript), psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A(스트라타진(Stratagene)); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322 및 pRIT5(파마시아(Pharmacia)), pET(노바젠(Novagen)). 진핵 벡터의 예에는 하기의 것이 포함되나 이들에 한정되지 않는다: pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg(인비트로겐(Invitrogen)), pOG44, pXT1, pSG(스트라타진); pSVK3, pBPV, pCI-neo(스트라타진), pMSG, pSVL(파마시아); 및 pQE-30(QLAexpress). 바람직하게는, 발현 벡터는 플라스미드 벡터이다.

더욱 특별히, 에스케리키아 콜라이에서 발현시키기 위하여, pBR322, pUC18, pBluescript II SK(+), λgt.λC 및 λgt.λB가 바람직하게 사용될 수 있다. 한편, 바실러스 서브틸리스에서 발현시키기 위하여, pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, Φ1 및 Φ105가 바람직하게 사용될 수 있다. 플라스미드, pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7이 2가지 이상의 종류의 숙주에서 재조합 핵산을 복제시키는 경우에 유용하다. 인코딩 핵산 서열을 이들 벡터로 삽입하기 위하여, 당업계에 통상적인 방법이 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 벡터는 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 서열을 숙주 세포의 염색체로 혼입시키는데 적합한 통합 벡터이다. 구매가능한 통합 벡터의 비배타적인 예는 바실러스 지네틱 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center)로부터의 바실러스 서브틸리스에 대한 pMUTIN4이다.

따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산이 숙주 세포의 염색체 내로 통합된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포의 염색체는 DPEase 변이체를 인코딩하는 하나 또는 몇몇의 카피(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개 카피)의 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 당업계에 알려져 있는 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 상동성 재조합 또는 무작위 통합에 의해 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산은 Cre-loxP 방법(문헌[Yan et al, Appl. Environm. Microbiol., 2008, 74, 5556-5562] 참조) 또는 임의의 유사 방법, 예를 들어, mazF-기반의 시스템에 의해 도입된다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 임의의 이종 선택 유전자, 예를 들어, 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, DPEase 변이체를 인코딩하는 핵산은 먼저 이종 선택 유전자와 함께 숙주 세포의 염색체로 도입될 수 있으며, 이어서 이종 선택 유전자가 숙주 세포의 염색체로부터 결실된다.

숙주 세포는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 및 GRAS 균주로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, GRAS 균주는 무해한 박테리아, 특히 무해한 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 무해한 바실러스 종, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 매우 구체적인 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스의 세포이다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 하나의 또는 몇몇의 유전자가 불활성화되거나 활성화되어, 상기 균주에 의한 활성 DPEase의 생성을 증가시킨 GRAS 균주일 수 있다.

실제로, 본 발명자들은 바실로펩티다제 F, 바실러스 서브틸리스 균주에서 천연적으로 생성되는 프로테아제 중 하나가 DPEase에 대하여 가수분해 활성을 나타낼 수 있는 것을 보여주었으며, 이는 숙주 세포에 의한 활성 DPEase의 생성 수율을 제한할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 숙주 세포는 DPEase를 가수분해시키기 쉬운 프로테아제를 인코딩하는 유전자 중 적어도 하나가 약화되거나 불활성화된 GRAS 균주이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "약화된 유전자"를 나타내는 균주는 상응하는 야생형 균주에 비하여, 상기 유전자의 발현의 감소 또는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성의 감소를 나타내는 돌연변이된 균주를 말한다. 유전자를 약화시키거나 불활성화시키는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 유전자의 약화는 예를 들어, 다음에 의해 수득될 수 있다:

- 유전자의 발현 수준을 감소시키거나, 인코딩된 단백질의 생물학적 활성을 변경시키기 위한, 하나의 또는 몇몇의 돌연변이의 유전자로의 도입, 예를 들어, 삽입, 결실 또는 무작위 또는 지정 돌연변이, 예를 들어, 프레임쉬프트 돌연변이, 점 돌연변이 또는 정지 코돈의 삽입. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 돌연변이는 DPEase를 향한 매우 낮은 가수분해 활성을 갖는 프로테아제의 생성을 야기할 수 있다.

- 보다 낮은 단백질의 생성으로부터 야기되는, 세기가 낮은 프로모터에 의한 유전자의 천연 프로모터의 대체,

- 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소의 이용,

- 유전자 또는 그의 부분의 결실, 특히 낙-아웃.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 약화된 유전자가 DPEase를 가수분해시키기 쉬운 세린 엔도펩티다제를 인코딩하는 유전자인 GRAS 균주이다.

일부 추가의 구현예에서, 숙주 세포는 바실로펩티다제 F를 인코딩하는 유전자가 약화되거나 불활성화된 바실러스 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 균주이다. 일부 추가의 구현예에서, 숙주 세포는 바실로펩티다제 F를 인코딩하는 유전자가 낙아웃된 바실러스 서브틸리스 균주이다. 그러한 낙아웃은 상기 균주의 게놈에서 상응하는 게놈 DNA를 결실시킴으로써 수득될 수 있다. 예시를 위하여, 바실러스 서브틸리스 내의 바실로펩티다제 F 유전자(brp)에 대한 유전자 ID는 문헌[Sloma et al (1990, J. Bacteriol., 172, 1470-1477)]에 설명되어 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 DPEase 변이체를 생성하기 위한 상기 개시된 바와 같은 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 임의로, 생성된 배양물로부터 생성된 D-사이코스 3-에피머라제 변이체를 회수 및/또는 정제하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 DPEase 변이체의 생성 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이 및 GRAS 균주, 특히 바실러스 서브틸리스로부터 선택된다.

임의로, 숙주 세포는 추가로 글루코스 이성질화효소를 생성한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 DPEase 변이체를 생성하고 분비하는 본 발명에 따른 고정화된 숙주 세포에 관한 것이다.

D- 사이코스의 생성

본 발명은 D-사이코스를 생성하기 위한 본 발명에 따른 DPEase 변이체의 용도 및 본 발명에 따른 DPEase 변이체의 사용에 의한 D-사이코스의 생성 방법에 관한 것이다.

제1 구현예에서, DPEase 변이체는 D-사이코스 3-에피머라제 활성에 적합한 조건에서 D-프룩토스와 접촉된다. D-프룩토스는 고 프룩토스 시럽, 특히 고 프룩토스 옥수수 시럽으로 제공될 수 있다. 그러한 고 프룩토스 옥수수 시럽은 HI-SWEET® 참조명 하에 로케트 프레르(Roquette Freres)로부터 구매가능하다.

다른 특정 구현예에서, D-글루코스는 본 발명에 따른 DPEase 변이체 및 글루코스 이성질화효소를 포함하는 효소 혼합물과 접촉된다. 또한, 글루코스 이성질화효소는 자일로스 이성질화효소로도 지칭되며, EC. 5.3.1.5에 상응한다. 바람직하게는, 글루코스는 글루코스 시럽, 특히 옥수수 시럽으로 제공된다.

다른 대안에서, 출발 물질은 글루코스 또는 프룩토스 대신에 전분일 수 있으며, 효소 혼합물은 추가로 알파-아밀라제 및/또는 글루코아밀라제를 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 DPEase 변이체 및 추가의 효소를 포함하는 효소 믹스에 관한 것이다. 바람직하게는, 효소 믹스는 본 발명에 따른 DPEase 변이체 및 글루코스 이성질화효소를 포함한다. 임의로, 효소 믹스는 알파-아밀라제 및/또는 글루코아밀라제를 추가로 포함할 수 있다.

D-사이코스를 생성하기에 적합한 조건은 당업자에 의해 규정될 수 있다. 바람직하게는, 그들은 하기의 특성을 포함한다:

- 온도: 50 내지 60℃, 바람직하게는 약 55℃; 및/또는

- pH: 5.5 내지 7.5, 바람직하게는 6 내지 7, 더욱 바람직하게는 약 6.5; 및/또는

- 바람직하게는 Co² ⁺, Mn² ⁺, Fe² ⁺, Ni² ⁺ 및 Mg² ⁺로 이루어진 군으로부터, 더욱 바람직하게는 Co² ⁺, Mn² ⁺, Fe² ⁺ 및 Ni² ⁺로부터, 더더욱 바람직하게는 Co² ⁺ 및 Mn² ⁺로부터, 가장 바람직하게는 Co²⁺로부터 선택되는 2가 금속 이온의 존재; 및/또는

- 고정화된 TDEase가 사용되는 경우 붕산염, 예를 들어, 40 내지 80 mM, 바람직하게는 약 60 mM의 붕산염의 존재.

특정 구현예에서, 상기 방법에 사용될 효소는 고정화된다. 더욱 특별히, 본 발명의 DPEase 변이체가 고정화된다. 임의로, 글루코스 이성질화효소 및 본 발명의 DPEase 변이체 둘 모두 또는 단지 DPEase 변이체만이 고정화될 수 있다. 다른 대안에서, 효소를 고정화시키는 것 대신에, 효소를 생성하는 미생물이 고정화된다. 효소(들) 또는 미생물은 예를 들어, 임의의 적합한 지지체, 예를 들어, 알지네이트, 앰버라이트 수지, 세파덱스 수지 또는 듀올라이트 수지, 예를 들어, 비드 상에 고정화될 수 있다.

고정화된 효소(들) 또는 미생물은 적합한 컬럼에 팩킹될 수 있으며, 글루코스 또는 프룩토스 액체 또는 시럽은 지속적으로 컬럼으로 도입된다.

지지체 상의 고정화된 DPEase를 위한 방법 및 D-사이코스를 생성하기 위한 방법은 예를 들어, WO2011/040708호에 당업자에게 잘 알려져 있다.

생성된 생성물은 D-프룩토스 및 D-사이코스의 혼합물, 심지어는 D-글루코스, D-프룩토스 및 D-사이코스의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 양태는 식품을 제조하기 위한 본 발명에 따른 GRAS 숙주 세포의 용도 및 그러한 GRAS 숙주 세포를 포함하는 식품에 관한 것이다. 식품은 인간을 위한 것 또는 동물 사료용이다. 예를 들어, 식품은 건강 식품, 환자용 식품, 식재료, 건강 식재료, 환자용 식재료, 식품 첨가물, 건강 식품 첨가물, 환자용 식품 첨가물, 음료, 건강 음료, 환자용 음료, 음료수, 건강 음료수, 환자용 음료수, 약물, 약물 원료, 사료 및 이환된 가축 및/또는 이환된 동물용 사료일 수 있다. 식재료 또는 식품 첨가물로서 사용되는 경우, 그것은 비정상 탄수화물 대사 및/또는 비정상 지질 대사를 완화시키기 위해 사용될 수 있다. 그것은 고체 제제, 예를 들어, 정제, 캡슐 또는 음료에 용해될 산제 또는 과립 등; 반고체 제제, 예를 들어, 젤리; 액체, 예를 들어, 음료수; 사용 전에 희석될 고농도 용액; 등의 형태로 존재할 수 있다.

도 1. DTEase 과 효소 및 그들의 동족체의 다중의 서열 정렬. 아미노산 서열은 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 DPEase(Clce-DPEase; 진뱅크(GeneBank) 수탁 번호: ACL75304), 클로스트리듐 종(Clsp-DPEase; YP_005149214.1), 클로스트리듐 신덴스 DPEase(Clsc-DPEase; EDS06411.1), 아그로박테리움 투메파시엔스 DPEase(Agtu-DPEase; AAL45544), 클로스트리듐 볼테아에 DPEase(Clbo-DPEase; EDP19602), 루미노코커스 종 DPEase(Rusp-DPEase; ZP_04858451), 슈도모나스 치코리이 DTEase(Psci-DTEase; BAA24429) 및 로도박터 스파에로이데스 DTEase(Rhsp-DTEase; ACO59490) 유래의 것이었다. ClustalW2 프로그램(www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)을 사용하여 정렬을 수행하였다. 모든 나타낸 서열에서 동일한 아미노산 잔기는 별표(*)로 표시되어 있으며, 강력하게 보존되거나 약하게 보존된 잔기는 각각 콜론(:) 또는 점(.)으로 표시되어 있다.
도 2. 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 DPEase의 야생형 및 G211S 돌연변이체 간의 pH 프로파일의 비교.
도 3. 쿠마시 블루로 염색된, 정제된 G211S DTEase 변이체 및 단백질 마커의 SDS-PAGE 분석. 레인 1, DPEase를 생성하는 바실러스 서브틸리스; 레인 2, 단백질 마커.
도 4는 실시예 2에 기재된 방법 1(Cre/Lox 재조합 시스템)에 따른 바실러스 서브틸리스 균주에 DPEase 유전자를 삽입하기 위해 사용되는 플라스미드 pDGI-7S6-DPE의 작제를 보여준다.
도 5는 DPEase-발현 바실러스 서브틸리스 균주를 생성하기 위한, 실시예 2에 기재된 방법 1의 주요 단계를 보여준다.
도 6은 실시예 2에 기재된 방법 2(mazF-기반의 시스템)에 따른 바실러스 서브틸리스 균주에 DPEase 유전자를 삽입하기 위해 사용된 플라스미드 pDGI-DP의 작제를 보여준다.
도 7은 DPEase-발현 바실러스 서브틸리스 균주를 생성하기 위한, 실시예 2에 기재된 방법 2의 주요 단계를 보여준다.
실시예 1
본 발명자들은 위치 211(SEQ ID No 1)에서 Gly을 인코딩하는 코돈 GGC를 각각 치환 G211S, G211A, G211D, G211T, G211W 및 G211L을 인코딩하는 코돈 AGC, GCC, GAC, CGC, TGG 및 CTC로 대체함으로써 위치-지정 돌연변이유발에 의해 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase 변이체를 제조하였다.
DPEase 변이체를 바실러스 서브틸리스에서 발현시키고, 발현시키고, 정제하였다(도 3).
기질 D-사이코스에 대한 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 DPEase의 야생형 및 변이체의 효소 특성 및 역학적 파라미터를 결정하였으며, 결과는 표 1에 제공되어 있다.
G211S 변이체는 야생형 DPEase(표 1)뿐 아니라 다른 알려져 있는 효소(표 2)와 비교하여 개선된 특성을 보였다. 특히, G211S 변이체는 6 내지 8의 pH 범위에서 80% 초과의 활성을 갖는 약산 안정성 효소이며(도 2), 대략 150.6의 촉매 효율 및 55℃에서 적어도 10시간의 반감기 및/또는 60℃에서 적어도 6.5시간의 반감기를 갖는다. 또한, 숙주는 식품 등급 미생물이다. 이들 속성은 더욱 효율적인 생성 사이클과 더 낮은 생성 비용으로의 식품-등급 D-사이코스의 생물생성에 중요하다.
재료 및 방법
화학물질 및 시약
Taq DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), PCR을 위한 화학물질, T4 DNA 리가제(ligase) 및 플라스미드 미니프렙 키트를 타카라(Takara)(Dalian, China)로부터 수득하였다. 단백질 정제용 수지, 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우(Chelating Sepharose Fast Flow)를 GE(Uppsala, Sweden)로부터 수득하였다. 전기영동 시약을 바이오-라드(Bio-Rad)로부터 구입하였다. 효소 분석 및 특성화를 위해 사용된 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 및 모든 화학물질은 시그마(Sigma)(St Louis, MO, USA) 및 시노팜 케미컬 리젠트(Sinopharm Chemical Reagent)(Shanghai, China)로부터 수득되는 적어도 분석 등급의 것이었다. 상온 바이올로지컬 엔지니어링 테크놀로지 앤드 서비시즈(Sangon Biological Engineering Technology and Services)(Shanghai, China)에 의해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
플라스미드, 박테리아 균주 및 배양 조건
플라스미드 pET-22b(+)를 노바젠(Novagen)(Darmstadt, Germany)으로부터 수득하였다. 에스케리키아 콜라이 DH5α 및 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3)을 티안젠 바이오테크놀로지(Tiangen Biotechnology)(Beijing, China)로부터 수득하였다. 바실러스 서브틸리스 WB600 및 플라스미드 pMA5를 인비트로겐(Carlsbad, CA, USA)으로부터 수득하였다. 박테리아 균주를 37℃에서 회전식 진탕기(200 rpm)에서 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지에서 성장시켰다.
에스케리키아 콜라이에서의 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase 변이체의 제조
(1) 단백질 변형을 위한 프라이머 설계는 하기와 같았다:
정방향 돌연변이유발 프라이머:
G211S 정방향 프라이머1 :CATTTACACACTAGCGAATGTAATCGT (SEQ ID No 12)
G211A 정방향 프라이머2 :CATTTACACACTGCCGAATGTAATCGT (SEQ ID No 13)
G211D 정방향 프라이머3 :CATTTACACACTGACGAATGTAATCGT (SEQ ID No 14)
G211R 정방향 프라이머4 :CATTTACACACTCGCGAATGTAATCGT (SEQ ID No 15)
G211W 정방향 프라이머5 :CATTTACACACTTGGGAATGTAATCGT (SEQ ID No 16)
G211L 정방향 프라이머6 :CATTTACACACTCTCGAATGTAATCGT (SEQ ID No 17)
역방향 프라이머: 5'-AGTGTGTAAATGTCCCAAGTAAGAGCCCGC-3' (SEQ ID No 18)
(2) PCR 기술에 의해 상기 프라이머를 사용하여 플라스미드를 증폭시킨다.
주형: pET-Cc-dpe
DNA 중합효소: Pfu
PCR 프로그램: 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃ 및 5분 동안 72℃로 이루어진 20 사이클에 이어서 72℃에서 10분의 연장 단계 동안 Pfu DNA 중합효소에 의해 PCR 증폭을 수행하였다.
(3) PCR 후에, 1 ㎕의 DpnI 제한 효소(10 U/㎕)를 200 ㎕의 PCR 생성물에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켜, 주형 DNA를 분해하고 제거한다.
(4) DNA를 겔 익스트랙션 키트(Gel Extraction Kit)에 의해 정제하였다.
(5) 돌연변이 단편의 5'-인산화 및 라이게이션 반응을 16℃에서 12시간 동안 함께 수행하였으며, 반응 시스템은 다음과 같았다:

(6) DNA를 에스케리키아 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. 형질전환체를 37℃에서 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
(7) 플라스미드를 추출하고, 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 확인하였다.
(8) 재작제된 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 BL21에 형질전환시켰다.
형질전환체를 37℃에서, 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
바실러스 서브틸리스에서의 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase 변이체의 제조
(1) PCR
바실러스 서브틸리스 발현 플라스미드로 상이한 변이체 유전자를 서브클로닝하기 위하여, 정방향(5'-CGCCATATGAAACATGGTATATACTACGC-3' - SEQ ID No 19) 및 역방향 프라이머(5'-CGCGGATCCTTGTTAGCCGGATCTC-3' - SEQ ID No 20)를 설계하여, NdeI 및 BamHI 제한 부위를 도입하였다. 상이한 DPEase 변이체 유전자를 지니는 재작제된 pET-22b(+) 플라스미드를 사용하여, 1분 동안 94℃, 1분 동안 60℃ 및 1분 동안 72℃로 이루어진 35 사이클에 이어서 72℃에서 10분의 최종 연장 단계 동안 택 플러스(Taq Plus) DNA 중합효소에 의해 PCR 증폭을 개별적으로 수행하였다.
(2) 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 PCR 생성물을 개별적으로 정제한다.
(3) 정제된 PCR 생성물 및 바실러스 서브틸리스 발현 플라스미드, pMA5를 제한 효소 NdeI 및 BamHI으로 분해하였다.
(4) DNA 단편 및 pMA5를 T4 DNA 리가제에 의해 라이게이션시킨 다음, 혼합물을 에스케리키아 콜라이 DH5α에 형질전환시켰다.
(5) 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트에서, 형질전환체를 37℃에서 선택하였다.
(6) 재작제된 플라스미드를 추출하고, 제한 효소 분해 및 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 확인하였다.
(7) 야생형 또는 변이체 DPEase 유전자를 지니는 재작제된 pMA5 플라스미드를 전기천공법에 의해 바실러스 서브틸리스 WB600으로 개별적으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에서 37℃에서 선택하였다.
클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰의 DPEase 변이체의 정제
재조합 DPEase 변이체를 정제하기 위하여, 원심분리된 세포 펠렛을 용해 완충제(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.5)에 재현탁화시키고, 비브라-셀(Vibra-Cell) 72405 초음파분해기를 사용하여, 4℃에서 6분 동안 초음파분해에 의해 파괴하고(3초의 맥동, 90 증폭), 세포 데브리스를 원심분리(20000 g, 20분, 4℃)에 의해 제거하였다. 무세포 추출물을 이전에 Ni² ⁺를 킬레이트시킨 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우(Chelating Sepharose Fast Flow) 수지 컬럼(1.0 ㎝ × 10.0 ㎝)에 적용하고, 결합 완충제(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.5)로 평형화시켰다. 미결합 단백질을 세척 완충제(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 50 mM 이미다졸, pH 7.5)를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 그 다음, DPEase 변이체를 용리 완충제(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.5)를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 활성 분획을 풀링하고, 4℃에서 48시간 동안 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충제(pH 7.5)에 대하여 하룻밤 투석시켰다.
DPEase 분석
D-프룩토스로부터 생성된 D-사이코스의 양의 결정에 의해 활성을 측정하였다. 1 ㎖의 반응 혼합물은 D-프룩토스(50 g/ℓ), Tris-HCl 완충제(50 mM, pH 8.0), 0.1 mM Co² ⁺ 및 0.5 μM 효소를 함유하였다. 반응 혼합물을 55℃에서 2분 동안 인큐베이션시키고, 10분 후에 비등에 의해 반응을 중단시켰다. 생성된 D-사이코스를 HPLC 방법에 의해 결정하였다. 1 유닛의 효소 활성은 pH 8.0 및 55℃에서 1 μmol의 D-사이코스/분의 형성을 촉매작용시키는 효소의 양으로 정의하였다.
온도 및 pH의 영향
2분 동안 35 내지 70℃의 범위에 걸쳐 효소 시료를 분석함으로써 효소 활성의 최적의 온도를 측정하였다. 효소 활성의 최적의 pH를 측정하기 위하여 2가지 완충 시스템, 인산나트륨(50 mM, pH 6.0-7.0) 및 Tris-HCl(50 mM, pH 7.5-9.0)을 사용하였다. 다양한 온도에서 Tris-HCl 완충제(50 mM, pH 8.0) 중에 효소를 인큐베이션시킴으로써 효소의 열 안정성을 연구하였다. 주어진 시간 간격에서, 시료를 빼내고, 표준 분석 조건하에 잔류 활성을 측정하였다. pH 안정성을 결정하기 위하여, 효소를 최대 2시간 동안 4℃에서 pH 6.0-9.0에서 인큐베이션시키고, 잔류 효소 활성을 표준 분석 조건하에 시간 간격에서 측정하였다.
역학적 파라미터의 결정
DPEase 변이체의 역학적 파라미터를 55℃에서의 반응을 위해 0.1 mM Co² ⁺ 및 5 내지 200 mM 기질을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충제(pH 8.0)에서 결정하였다. 10분 후에 효소 반응을 비등에 의해 중단시키고, D-사이코스의 양을 HPLC 분석에 의해 결정하였다. 역학적 파라미터, 예를 들어, 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수(K_m) 및 기질에 대한 턴오버수(k_cat) 값을 라인웨버-버크(Lineweaver-Burk) 식 및 효소 농도의 정량화를 사용하여 수득하였다.
분석 방법
D-프룩토스 및 D-사이코스의 농도를 굴절률 검출기 및 Ca² ⁺-탄수화물 컬럼(워터스 슈가-팩(Waters Sugar-Pak) 1, 워터스 코포레이션(Waters Corp.), Milford, MA)이 장착된 HPLC에 의해 분석하고, 이를 85℃ 및 0.4 ㎖/분에서 물로 용리시켰다. 단백질 농도를 표준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하여 브래드포드(Bradford)의 방법에 따라 결정하였다. SDS-PAGE를 라엠리(Laemmli)의 방법에 따라 수행하였다. 겔(12% w/v 폴리아크릴아미드)을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하고, 10%(v/v) 메탄올/10%(v/v) 아세트산의 수성 혼합물로 탈색시켰다.
[표 1]

[표 2]

실시예 2: 염색체 통합 및 D- 사이코스 에피머라제를 생성하는 미생물 균주의 생성
본 발명자들은 D-사이코스 에피머라제의 염색체 통합으로 5개의 균주를 작제하였다. 항생제 첨가 및 균주 내의 항생제-내성 유전자(ARG)를 피하기 위하여, 2가지 방법, 즉, Cre/Lox 및 mazF-기반의 시스템에 의해 ARG의 삽입 없이 염색체 통합에 의해 균주를 작제하였다. Cre/Lox 시스템은 ARG와 함께 염색체 통합을 사용하여 균주를 작제하고, Cre 재조합효소에 의해 그를 낙아웃시키는 것이다(방법 1). 다른 것은 mazF 유전자와 함께 염색체 통합을 사용하여 균주를 작제하고, p43-DPE 유전자에 의해 그를 낙아웃시키는 것이다(방법 2). 3가지의 바실러스 서브틸리스의 균주, 즉, 1A751, WB600 및 WB800을 숙주 균주로서 사용하였다.
방법 1. 바실러스 서브틸리스에서의 Cre /Lox 시스템 기반의 게놈 조작
1.1 도입
Cre/Lox 재조합 시스템은 현재 강력한 DNA 재조합 도구로 인식되어 있는 간단한 2-성분 시스템이다. Cre/Lox 시스템을 뒷받침하는 일반 원리는 2개의 loxP 부위 사이에서 DNA를 확인하고, 그에 결합하고, 그를 재조합시키는 Cre 재조합효소의 능력에 의존하며; 이들 34 bp 표적 DNA 서열의 각각은 중심의 8 bp의 방향성 코어를 플랭킹하는 2개의 13 bp의 역위된 반복 서열로 이루어진다. Cre/Lox 재조합 시스템을 사용함으로써 항생제-내성 유전자(ARG)를 낙아웃시켰다.
1.2 방법
Cre/Lox 재조합 시스템에 기초하여, ARG 없이 염색체 통합으로 균주를 작제하기 위하여, 하기와 같은 몇몇 단계를 포함한다(도 4도 또한 참조):
a. 중첩 연장 PCR에 의한 프로모터 p43이 있는 DPEase -코딩 유전자의 스플라이스
프로모터 p43 및 DPEase-코딩 유전자를 중첩 연장 PCR에 의해 스플라이싱시켰다. 그 다음, PCR-생성된 p43-DPE 카세트를 pMD19-T로 클로닝하여 pP43DPE를 생성하였다.
b. p43- DPE 유전자(p43- DPE ) 및 스펙티노마이신 -내성 유전자( lox71 -spc-lox66)를 셔틀 플라스미드 벡터 pDGIEF로 삽입하여, 재작제된 플라스미드 pDGI -7S6-DPE를 구축한다 .
플라스미드 pDGI-7S6-DPE를 다음과 같이 작제하였다. lox71-spc-lox66 카세트를 함유하는 SalI- 및 XmaI-플랭킹된 단편을 p7S6으로부터 pDGIEF의 상응하는 위치로 전달하여, pDGI-7S6를 제공한 다음; NheI/SalI 분해된 pP43DPE를 pDGI-7S6의 상응하는 부위로 클로닝하여, pDGI-7S6-DPE를 제공하였다(도 4).
c. 염색체 통합을 위해 재작제된 플라스미드를 바실러스 서브틸리스로 형질전환시킨다.
pDGI-7S6-DPE 플라스미드를 XhoI으로 선형화시키고, 화학적 형질전환에 의하여 바실러스 서브틸리스 균주(1A751, WB600 및 WB800)로 형질전환시켰다(문헌[Keith et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97:6803-6811(host 1A751)]; 문헌[Zhang et al., Bioresource Technology, 2013, 146:543-548(host WB600)]; 문헌[Nguyen et al. Microbial Cell Factories 2013, 12:79(host WB800)]). 바실러스 서브틸리스 아밀라제 유전자 상동성 암을 사용하여, 통합 벡터와 염색체 DNA 간을 상동성 재조합시켰다. 염색체 통합을 통하여, p43-DPE 카세트 및 lox71-spc-lox66 카세트를 염색체 DNA로 삽입하였다.
d. 스펙티노마이신에 의해 통합된 바실러스 서브틸리스를 스크리닝한다.
100 ㎍/㎖의 스펙티노마이신이 있는 LB 플레이트에서 재조합 균주를 스크리닝하였다.
e. pTSC 플라스미드를 바실러스 서브틸리스(7S6-DPE)로 형질전환시킨 다음, 에리트로마이신에 의해 스크리닝한다.
Cre 재조합효소 유전자를 지니는 pTSC 플라스미드를 바실러스 서브틸리스(pDGI-7S6-DPE) 컴피턴트 세포로 형질전환시켰다. 바실러스 서브틸리스(7S6-DPE, pTSC) 균주를 200 ㎍/㎖의 에리트로마이신이 있는 LB 플레이트에서 스크리닝하였다.
f. 에리트로마이신 및 스펙티노마이신에 의해 바실러스 서브틸리스 (lox- DPE , pTSC) 균주를 스크리닝한다.
스펙티노마이신-내성 유전자가 낙아웃되면, 균주는 200 ㎍/㎖의 에리트로마이신 및 100 ㎍/㎖의 스펙티노마이신이 있는 LB 플레이트에서 성장할 수 없으나, 200 ㎍/㎖의 에리트로마이신이 있는 LB 플레이트에서는 성장할 수 있다. 이에 기초하여, 바실러스 서브틸리스(lox-DPE, pTSC) 균주를 스크리닝하고 선택하였다.
g. 에리트로마이신에 의해 바실러스 서브틸리스 (lox- DPE ) 균주를 스크리닝한다.
pTSC는 플레이트가 42℃에서 인큐베이션되는 경우, 복제할 수 없는 온도 감수성 플라스미드였다. pTSC 플라스미드가 바실러스 서브틸리스 균주에서 소실되면, 균주는 200 ㎍/㎖의 에리트로마이신이 있는 LB 플레이트에서 성장할 수 없었다. 42℃에서 2일 동안의 인큐베이션 후에, 바실러스 서브틸리스(lox-DPE) 균주를 스크리닝하고, LB 플레이트 및 200 ㎍/㎖의 에리트로마이신이 있는 LB 플레이트에서 선택하였다.
h. 항생제 내성 유전자의 낙-아웃을 입증한다.
2가지 시험 방법, PCR 및 항생제 플레이트에서의 스크리닝을 사용하여, 항생제 내성 유전자의 낙-아웃을 입증하였다. 바실러스 서브틸리스 아밀라제 상동성 암 유전자의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. DNA 단편을 시퀀싱하고, 항생제 내성 유전자 서열과 정렬하여, 항생제 내성 유전자가 낙아웃된 것을 확인하였다. 한편, 항생제 내성 유전자의 프라이머도 또한 사용하였다. PCR 증폭이 실패하면, 항생제 내성 유전자는 작제된 균주에 존재하지 않았다. 다른 시험 방법을 항생제 플레이트에서 스크리닝하였다. 균주가 항생제 플레이트에서 성장할 수 없다면, 항생제 내성 유전자가 낙아웃된 것이다.
방법 2. 바실러스 서브틸리스에서의 mazF -기반의 게놈 조작
2.1 도입
mazF는 바실러스 서브틸리스에서 미표시 염색체 조작을 위한 신규한 반대-선택가능한 마커로서 사용될 수 있는 에스케리키아 콜라이 독소 유전자이다. mazF를 자일로스-유도가능한 발현 시스템의 조절하에 배치하였다. mazF 카세트를 지니는 바실러스 서브틸리스 균주는 자일로스-함유 배지에서 성장할 수 없다. mazF 카세트가 p43-DPE 카세트로 대체되면, 균주는 자일로스-함유 배지에서 성장할 수 있다.
2.2 방법
이에 기초하여, 바실러스 서브틸리스에서의 미표시 염색체 통합은 하기와 같은 몇몇 단계를 포함한다(도 7도 또한 참조):
a. p43- DPE 유전자(p43- DPE )를 셔틀 플라스미드 벡터 pDGIEF로 삽입하여, 재 작제된 플라스미드 pDGI-DPE를 구축한다.
플라스미드 pDGI-DPE를 하기와 같이 작제하였다. p43-DPE 카세트를 함유하는 Xma I- 및 Sal I-플랭킹된 단편을 pP43DPE로부터 pDGIEF의 상응하는 부위로 전달하여, pDGI-DPE를 제공하였다(도 6).
b. 염색체 통합을 위하여, 재작제된 플라스미드 pDGREF를 바실러스 서브틸리 스로 형질전환시킨다.
pDGREF 플라스미드를 Cla I으로 선형화시키고, 화학적 형질전환에 의해 바실러스 서브틸리스 균주(1A751, WB600, WB800)로 형질전환시켰다. 바실러스 서브틸리스 아밀라제 유전자 상동성 암을 사용하여 통합 벡터와 염색체 DNA 간을 상동성 재조합시켰다. 염색체 통합을 통하여, mazF 카세트를 염색체 DNA로 삽입하였다.
c. 스펙티노마이신 및 자일로스에 의해 통합된 바실러스 서브틸리스를 스크리닝한다.
재조합 균주를 100 ㎍/㎖의 스펙티노마이신이 있는 LB 플레이트에서 스크리닝하였다. 그 다음, 양성 클론을 각각 스펙티노마이신(100 ㎍/㎖)-자일로스(2%)-함유 LB 플레이트 및 스펙티노마이신(100 ㎍/㎖)-함유 LB 플레이트에서 스트리킹(streaked)하였다. 자일로스-함유 플레이트에서 성장할 수 없던 양성 클론을 다음 단계를 위해 사용하였다.
d. pDGI - DPE 플라스미드를 바실러스 서브틸리스(REF)로 형질전환시킨 다음 자일로스에 의해 스크리닝한다.
p43-DPE 유전자를 지니는 pDGI-DPE 플라스미드를 Xho I으로 선형화시키고, 바실러스 서브틸리스(REF) 컴피턴트 세포로 형질전환시켰다. 바실러스 서브틸리스(DPE) 균주를 2% 자일로스가 있는 LB 플레이트에서 스크리닝하였다.
결과
5가지 균주를 이들 2가지 방법에 의해 선택하였다. 바실러스 서브틸리스 균주를 선택한 후에, 균주를 실험실-배지에서 발효시켰다. 효소 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하여, DPEase-코딩 유전자가 염색체 DNA로 삽입된 것을 보장하였다. 효소 활성을 모든 선택된 균주에 대하여 결정하였다. 가장 높은 효소 활성을 1A751 균주에 대하여 검출하였다. 효소 활성은 03.45 U/㎖에 도달하였으며, 이는 플라스미드-의존적 바실러스 서브틸리스에 대하여 검출된 초기 활성과 가까웠다.

SEQUENCE LISTING <110> ROQUETTE FRERES <120> Improved variant of D-psicose 3-epimerase and uses thereof <130> B1628PC <160> 20 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 879 <212> DNA <213> Clostridium cellulolyticum <220> <221> CDS <222> (1)..(879) <400> 1 atg aaa cat ggt ata tac tac gca tat tgg gaa caa gaa tgg gaa gct 48 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala 1 5 10 15 gat tac aaa tac tat att gag aag gtt gca aag ctt ggt ttt gat att 96 Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 cta gag att gca gct tca ccg cta cct ttt tac agt gac att cag att 144 Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile 35 40 45 aat gag ctc aag gca tgt gcc cat ggc aat gga att aca ctt acg gta 192 Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val 50 55 60 ggc cat ggg cct agt gca gaa caa aac ctg tct tct ccc gac ccc gat 240 Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp 65 70 75 80 att cgc aaa aat gct aaa gct ttt tat 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210 215 220 Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser 225 230 235 240 Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu 260 265 270 Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu 275 280 285 Cys His Lys His Ser 290 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CC-DPEase variant <220> <221> CDS <222> (1)..(879) <400> 3 atg aaa cat ggt ata tac tac gca tat tgg gaa caa gaa tgg gaa gct 48 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala 1 5 10 15 gat tac aaa tac tat att gag aag gtt gca aag ctt ggt ttt gat att 96 Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 cta gag att gca gct tca ccg cta cct ttt tac agt gac att cag att 144 Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile 35 40 45 aat gag ctc aag gca tgt gcc cat ggc aat gga att aca ctt acg gta 192 Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val 50 55 60 ggc cat ggg cct agt gca gaa caa aac ctg tct tct ccc gac ccc gat 240 Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp 65 70 75 80 att cgc aaa aat gct aaa gct ttt tat acc gat tta ctc aaa cga ctt 288 Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu 85 90 95 tac aag ctg gat gta cat ttg ata ggt ggg gct tta tat tct tat tgg 336 Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 ccg ata gat tac aca aag aca att gat aaa aaa ggc gat tgg gaa cgc 384 Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg 115 120 125 agc gtt gaa agt gtt cga gaa gtt gct aag gtg gcc gaa gcc tgt gga 432 Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly 130 135 140 gtg gat ttc tgc cta gag gtt ctt aat aga ttt gag aat tat tta att 480 Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile 145 150 155 160 aac aca gca caa gag ggt gta gat ttt gta aaa cag gtt gac cat aac 528 Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn 165 170 175 aat gta aag gta atg ctt gat acc ttc cac atg aat att gag gaa gat 576 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 agt atc gga ggt gca atc agg act gcg ggc tct tac ttg gga cat tta 624 Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu 195 200 205 cac act agc gaa tgt aat cgt aaa gtt ccc ggc aga gga aga att cca 672 His Thr Ser Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro 210 215 220 tgg gta gaa att ggt gag gct ctt gct gac ata ggt tat aac ggt agt 720 Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser 225 230 235 240 gtt gtt atg gaa cct ttt gtt aga atg ggc gga act gtc gga tct aat 768 Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn 245 250 255 att aag gtt tgg cgt gac att agt aac ggt gca gat gag aaa atg ctg 816 Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu 260 265 270 gat aga gaa gca cag gcc gca ctt gat ttc tcc aga tat gta tta gaa 864 Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu 275 280 285 tgt cat aaa cac tcc 879 Cys His Lys His Ser 290 <210> 4 <211> 293 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile 35 40 45 Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val 50 55 60 Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp 65 70 75 80 Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu 85 90 95 Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg 115 120 125 Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly 130 135 140 Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile 145 150 155 160 Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu 195 200 205 His Thr Ser Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro 210 215 220 Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser 225 230 235 240 Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu 260 265 270 Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu 275 280 285 Cys His Lys His Ser 290 <210> 5 <211> 292 <212> PRT <213> Clostridium sp. <400> 5 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Asn Gln Ile 35 40 45 Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala Arg Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val 50 55 60 Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Tyr 65 70 75 80 Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu 85 90 95 Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Ile Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg 115 120 125 Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Gln Val Ala Glu Ala Cys Gly 130 135 140 Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile 145 150 155 160 Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Gly His Asp 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Arg Ile Pro 210 215 220 Trp Ile Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser 225 230 235 240 Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Glu Lys Leu 260 265 270 Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asn Phe Ser Arg Tyr Val Leu Gly 275 280 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Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys <210> 7 <211> 288 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 7 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 <210> 8 <211> 291 <212> PRT <213> Ruminococcus sp. <400> 8 Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Asn Gly 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Asp Lys Ile Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Gly Ala Phe Ser Asp Tyr Tyr Thr Lys Asp Gln 35 40 45 Glu Leu Ile Asp Ile Gly Lys Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro His Phe Asn Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu 65 70 75 80 Pro Asn Thr Gln Lys Gln Ala Ile Ser Phe Trp Lys Glu Thr Leu Arg 85 90 95 Lys Leu Lys Leu Met Asp Ile His Ile Val Gly Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Lys Pro Phe Asp Lys Lys Arg Asp Leu 115 120 125 Glu Asn Ser Ile Lys Asn Met Lys Ile Ile Ser Gln Tyr Ala Glu Glu 130 135 140 Tyr Asp Ile Met Met Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Met Leu Asn Thr Cys Asp Glu Ala Leu Ala Tyr Val Glu Glu Val Gly 165 170 175 Ser Ser Asn Val Gly Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Ile Ala Ala Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Tyr 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gly Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Met 210 215 220 Leu Pro Trp Asn Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln 225 230 235 240 His Ala Ala Val Met Glu Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Val Gly 245 250 255 His Asp Ile Lys Ile Trp Arg Asp Ile Ile Gly Asn Cys Ser Glu Val 260 265 270 Thr Leu Asp Met Asp Ala Gln Ser Ala Leu His Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Glu Val 290 <210> 9 <211> 301 <212> PRT <213> Clostridium bolteae <400> 9 Met Arg Tyr Phe Lys Glu Glu Val Ala Gly Met Lys Tyr Gly Ile Tyr 1 5 10 15 Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Phe Ala Asp Tyr Lys Lys Tyr Met 20 25 30 Asp Lys Val Ser Ala Leu Gly Phe Asp Val Leu Glu Ile Ser Cys Ala 35 40 45 Ala Leu Arg Asp Val Tyr Thr Thr Lys Glu Gln Leu Ile Glu Leu Arg 50 55 60 Glu Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Val Leu Thr Ala Gly Tyr Gly Pro 65 70 75 80 Thr Lys Ala Glu Asn Leu Cys Ser Glu Asp Pro Glu Ala Val Arg Arg 85 90 95 Ala Met Thr Phe Phe Lys Asp Leu Leu Pro Lys Leu Gln Leu Met Asp 100 105 110 Ile His Ile Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser Tyr Trp Pro Val Asp Phe 115 120 125 Thr Ile Asn Asn Asp Lys Gln Gly Asp Arg Ala Arg Ala Val Arg Asn 130 135 140 Leu Arg Glu Leu Ser Lys Thr Ala Glu Glu Cys Asp Val Val Leu Gly 145 150 155 160 Met Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Gly Tyr Ile Leu Asn Thr Cys Glu 165 170 175 Glu Ala Ile Asp Phe Val Asp Glu Ile Gly Ser Ser His Val Lys Ile 180 185 190 Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Thr Asn Met Ala Asp 195 200 205 Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Gly His Leu His Leu Gly Glu 210 215 220 Gln Asn Arg Leu Val Pro Gly Lys Gly Ser Leu Pro Trp Ala Glu Ile 225 230 235 240 Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln Gly Ala Ala Val Met Glu 245 250 255 Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Ile Gly Ser Glu Ile Lys Val Trp 260 265 270 Arg Asp Met Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Asp Arg Asp Ala 275 280 285 Lys Gly Ala Leu Glu Phe Cys Arg His Val Phe Gly Ile 290 295 300 <210> 10 <211> 290 <212> PRT <213> Pseudomonas cichorii <400> 10 Met Asn Lys Val Gly Met Phe Tyr Thr Tyr Trp Ser Thr Glu Trp Met 1 5 10 15 Val Asp Phe Pro Ala Thr Ala Lys Arg Ile Ala Gly Leu Gly Phe Asp 20 25 30 Leu Met Glu Ile Ser Leu Gly Glu Phe His Asn Leu Ser Asp Ala Lys 35 40 45 Lys Arg Glu Leu Lys Ala Val Ala Asp Asp Leu Gly Leu Thr Val Met 50 55 60 Cys Cys Ile Gly Leu Lys Ser Glu Tyr Asp Phe Ala Ser Pro Asp Lys 65 70 75 80 Ser Val Arg Asp Ala Gly Thr Glu Tyr Val Lys Arg Leu Leu Asp Asp 85 90 95 Cys His Leu Leu Gly Ala Pro Val Phe Ala Gly Leu Thr Phe Cys Ala 100 105 110 Trp Pro Gln Ser Pro Pro Leu Asp Met Lys Asp Lys Arg Pro Tyr Val 115 120 125 Asp Arg Ala Ile Glu Ser Val Arg Arg Val Ile Lys Val Ala Glu Asp 130 135 140 Tyr Gly Ile Ile Tyr Ala Leu Glu Val Val Asn Arg Phe Glu Gln Trp 145 150 155 160 Leu Cys Asn Asp Ala Lys Glu Ala Ile Ala Phe Ala Asp Ala Val Asp 165 170 175 Ser Pro Ala Cys Lys Val Gln Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Thr Ser Phe Arg Asp Ala Ile Leu Ala Cys Lys Gly Lys Met Gly 195 200 205 His Phe His Leu Gly Glu Ala Asn Arg Leu Pro Pro Gly Glu Gly Arg 210 215 220 Leu Pro Trp Asp Glu Ile Phe Gly Ala Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Asp 225 230 235 240 Gly Thr Ile Val Met Glu Pro Phe Met Arg Lys Gly Gly Ser Val Ser 245 250 255 Arg Ala Val Gly Val Trp Arg Asp Met Ser Asn Gly Ala Thr Asp Glu 260 265 270 Glu Met Asp Glu Arg Ala Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Arg Asp Lys 275 280 285 Leu Ala 290 <210> 11 <211> 295 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 11 Met Lys Asn Pro Val Gly Ile Ile Ser Met Gln Phe Ile Arg Pro Phe 1 5 10 15 Thr Ser Glu Ser Leu His Phe Leu Lys Lys Ser Arg Ala Leu Gly Phe 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Leu Leu Val Pro Glu Pro Glu Asp Gly Leu Asp Ala 35 40 45 Ala Glu Val Arg Arg Ile Cys Glu Gly Glu Gly Leu Gly Leu Val Leu 50 55 60 Ala Ala Arg Val Asn Leu Gln Arg Ser Ile Ala Ser Glu Glu Ala Ala 65 70 75 80 Ala Arg Ala Gly Gly Arg Asp Tyr Leu Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Ala 85 90 95 Glu Ala Leu Gly Ala Thr Ile Val Gly Gly Pro Leu Tyr Gly Glu Pro 100 105 110 Leu Val Phe Ala Gly Arg Pro Pro Phe Pro Trp Thr Ala Glu Gln Ile 115 120 125 Ala Thr Arg Ala Ala Arg Thr Val Glu Gly Leu Ala Glu Val Ala Pro 130 135 140 Leu Ala Ala Ser Ala Gly Lys Val Phe Gly Leu Glu Pro Leu Asn Arg 145 150 155 160 Phe Glu Thr Asp Ile Val Asn Thr Thr Ala Gln Ala Ile Glu Val Val 165 170 175 Asp Ala Val Gly Ser Pro Gly Leu Gly Val Met Leu Asp Thr Phe His 180 185 190 Met Asn Met Glu Glu Arg Ser Ile Pro Asp Ala Ile Arg Ala Thr Gly 195 200 205 Ala Arg Leu Val His Phe Gln Ala Asn Glu Asn His Arg Gly Phe Pro 210 215 220 Gly Thr Gly Thr Met Asp Trp Thr Ala Ile Ala Arg Ala Leu Gly Gln 225 230 235 240 Ala Gly Tyr Ala Gly Pro Val Ser Leu Glu Pro Phe Arg Arg Asp Asp 245 250 255 Glu Arg Val Ala Leu Pro Ile Ala His Trp Arg Ala Pro His Glu Asp 260 265 270 Glu Asp Glu Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Leu Ile Arg Ser Ala Ile 275 280 285 Thr Leu Ala Glu Val Thr His 290 295 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 12 catttacaca ctagcgaatg taatcgt 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 13 catttacaca ctgccgaatg taatcgt 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 14 catttacaca ctgacgaatg taatcgt 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 15 catttacaca ctcgcgaatg taatcgt 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 16 catttacaca cttgggaatg taatcgt 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 17 catttacaca ctctcgaatg taatcgt 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 18 agtgtgtaaa tgtcccaagt aagagcccgc 30 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 19 cgccatatga aacatggtat atactacgc 29 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 20 cgcggatcct tgttagccgg atctc 25

Claims

모체 D-사이코스 3-에피머라제의 변이체로서, 상기 변이체가 모체 D-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 SEQ ID No 2의 위치 211에 상응하는 위치에 세린 잔기에 의한 글리신 잔기의 치환을 포함하고; 상기 변이체가 D-사이코스 3-에피머라제 활성을 가지며, 상기 모체 D-사이코스 3-에피머라제가 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 모체 D-사이코스 3-에피머라제의 변이체.
제1항에 있어서, 상기 변이체가 하나의 또는 몇몇의 하기의 특징을 갖는 변이체:
a. 모체 D-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 더 낮은, 바람직하게는 6 내지 7 범위의 최적의 pH; 및/또는
b. 모체-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 기질 D-프룩토스에 대한 더 높은, 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 촉매 효율; 및/또는
c. 60℃에서 모체-사이코스 3-에피머라제와 비교하여 더 긴 반감기.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이체가 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 60% 이상의 동일성, 바람직하게는 더욱 바람직하게는 SEQ ID No 2 및 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모체 D-사이코스 3-에피머라제가 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) 유래의 D-타가토스 3-에피머라제, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐(Clostridium) 종 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 신덴스(Clostridium scindens) 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 클로스트리듐 볼테아에(Clostridium bolteae) 유래의 D-사이코스 3-에피머라제, 루미노코커스 종(Ruminococcus sp) 유래의 D-사이코스 3-에피머라제 및 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰(Clostridium cellulolyticum) 유래의 D-사이코스 3-에피머라제로부터 선택되는 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모체 D-사이코스 3-에피머라제가 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰 유래의 D-사이코스 3-에피머라제인 변이체.
제5항에 있어서, 상기 변이체가 SEQ ID No 4의 아미노산 서열 또는 위치 211에 잔기 Ser을 갖는, SEQ ID No 4와 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제4항에 있어서, 상기 변이체가 G211S 치환을 갖는 SE ID No 5의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 5와 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제4항에 있어서, 상기 변이체가 G210S 치환을 갖는 SE ID No 6의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 6과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 210에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제4항에 있어서, 상기 변이체가 G211S 치환을 갖는 SE ID No 7의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 7과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 211에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제4항에 있어서, 상기 변이체가 G213S 치환을 갖는 SE ID No 8의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 8과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 213에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제4항에 있어서, 상기 변이체가 G223S 치환을 갖는 SE ID No 9의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 7과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 223에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제4항에 있어서, 상기 변이체가 G213S 치환을 갖는 SE ID No 10의 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 10과 90 또는 95% 이상의 동일성을 갖고, 위치 213에 잔기 Ser을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 변이체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산.
제13항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제13항에 따른 핵산 또는 제14항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
제15항에 있어서, 상기 변이체를 인코딩하는 핵산이 상기 숙주 세포의 염색체로 통합되는 재조합 숙주 세포.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 숙주 세포가 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 재조합 숙주 세포.
제17항에 있어서, 상기 숙주 세포는 바실로펩티다제 F를 인코딩하는 유전자가 불활성화된 바실러스 서브틸리스 균주인 재조합 숙주 세포.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 임의로, 생성된 배양물로부터 생성된 D-사이코스 3-에피머라제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 D-사이코스 3-에피머라제 변이체의 생성 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 D-사이코스 3-에피머라제 활성에 적합한 조건에서 D-프룩토스와 접촉시키는 단계 및 임의로, 생성된 D-사이코스를 회수하는 단계를 포함하는 D-사이코스의 생성 방법.
제20항에 있어서, D-프룩토스가 이전에 또는 동시에 글루코스 이성질화효소에 의해 D-글루코스로부터 생성되는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 D-사이코스 3-에피머라제 변이체 및 추가의 효소, 특히 글루코스 이성질화효소를 포함하는 효소 조성물.
D-사이코스를 생성하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 D-사이코스 3-에피머라제 변이체 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 용도.
식품을 제조하기 위한, 제17항 또는 제18항에 따른 숙주 세포의 용도.
제17항 또는 제18항에 따른 숙주 세포를 포함하는 식품.