CN108588149B

CN108588149B - 一种阿果糖浆及其制备方法

Info

Publication number: CN108588149B
Application number: CN201711037688.0A
Authority: CN
Inventors: 杨建刚; 孙媛霞; 门燕; 曾艳; 朱玥明; 田朝玉
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-10-29
Filing date: 2017-10-29
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2037-10-29
Also published as: CN108588149A

Abstract

本发明公开了一种阿果糖浆的制备方法，通过发酵转化法，以来源于玉米、木薯淀粉糖及果葡糖浆、或果糖基菊芋及菊粉、或甘蔗糖及甘蔗糖蜜、或大豆榨油后得到糖蜜、甜菜蔗糖及甜菜糖蜜、红枣提取后得到混合糖浆等为原料，制备富含阿洛酮糖的阿果糖浆，该方法具有原料来源丰富、成本低廉等优势，所得到的阿果糖浆可用于烘焙食品、饮料等食品加工领域，对于提升玉米、甘蔗、大豆产业的附加值具有潜在应用价值。

Description

一种阿果糖浆及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种阿果糖浆及其制备方法。

背景技术

代谢综合症征已成为近年来全世界一个急需解决的问题，美国流行病学研究表明，肥胖和糖尿病等代谢综合征人群随着高果糖浆消费量的增加而增加，同时喝含有大量果糖的果汁会增加患直肠癌的几率，容易导致血管的收缩扩张异常而对血压产生严重影响，同时果糖加重肝脏负担，引发肝损伤并转换成脂肪肝，引发高血脂，加大患心血管疾病的风险，长期食用高果糖浆会导致体内脂肪非正常增长，尤其集中在腹部，增加了中风和患心脏病的风险，所以非常有必要开发可高果糖浆的替代品。

D-阿洛酮糖是一种重要零热量的填充型功能甜味剂，具有调节血糖值和胰岛素水平、低GI、低甘油三酯、抑制脂肪堆积等作用，作为功能性甜味剂是糖尿病、肥胖症病人的理想蔗糖替代品，美国食品与药品管理局(FDA)和日本厚生省已将阿洛酮糖列为安全食品(generally recognized as safe，GRAS)添加剂，D-阿洛酮糖可通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化D-果糖异构获得。2010年，日本松谷化学工业株式会社和香川大学的稀少糖研究中心合作研发了新一代含有稀少糖D-阿洛酮糖的高果糖浆。该糖浆是在高果糖浆的基础上，进一步异构化，使部分果糖转变为D-阿洛酮糖、D-阿洛糖等稀少糖，与传统的高果糖浆相比，新型高果糖浆具有抑制血糖上升，减少内脏脂肪积累，改善体内糖代谢和脂肪代谢，预防肥胖等积极效果，这种新型的含有稀少糖的高果糖浆已经作为一种甜味剂，应用于烘焙食品、饮料等食品加工过程中。

自然界中很多原料如玉米、甘蔗、大豆、菊芋、甜菜、红枣等可通过物理、化学或者生物法制备成富含葡萄糖、果糖或蔗糖的糖浆、糖蜜等原料，与目前采用的直接催化果糖转化生产阿洛酮糖相比，这些原料来源丰富、成本低廉，非常适合用于D-阿洛酮糖以及富含阿洛酮糖糖浆的生产。目前，生产含有阿洛酮糖和其他糖的糖浆的方法主要是用阿洛酮糖和其他糖的纯品混合进行生产，其成本非常高，因此急需一种廉价的、简易的生产含有阿洛酮糖糖浆的方法。

发明内容

本发明目的之一是提供一种阿果糖浆的制备方法，其特征为，包括如下步骤；

(a)取富含果糖的糖浆或果汁，调节pH为6至9；

(b)在步骤(a)得到的液体中加入表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，并进行催化。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)调节pH至7.0，步骤(b)中加入重组菌后的初始OD600为0.5-10，优选的OD600为10，催化温度为30-60℃，优选的温度为55℃，催化时间为4-24h，优选的反应时间为4h。。

在更优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)还包括对富含果糖的糖浆或果汁的稀释，所述稀释体积倍数为1-10倍。

在最优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)稀释倍数为4-5倍，调节pH至7.0，步骤(b)中的初始OD600为0.5，催化条件为30℃，反应时间24h。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的富含果糖的果汁为红枣枣汁母液。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的富含果糖的糖浆为果葡糖浆，或经菊粉外切酶处理的甘蔗糖蜜，或经菊粉外切酶处理的大豆糖蜜，或经菊粉外切酶处理的甜菜糖蜜，或经菊粉外切酶处理的菊粉基果糖浆，，或经蔗糖酶处理的甘蔗糖蜜，或经蔗糖酶处理的大豆糖蜜，或经蔗糖酶处理的甜菜糖蜜，或经蔗糖酶处理的菊粉基果糖浆。

在更优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，经菊粉外切酶处理的甘蔗糖蜜或经菊粉外切酶处理的大豆糖蜜的制备方法，包括如下步骤；

(1)取甘蔗糖蜜或大豆糖蜜或甜菜糖蜜，稀释体积倍数为0.1-2倍，优选的1倍；

(2)调节步骤(1)得到的液体的pH为6至9，优选的pH为7；

(3)在步骤(2)得到的液体中加入0.1U-100U/mL的菊粉外切酶，优选的为5U/mL，并在30-50摄氏度，优选的40摄氏度，条件下催化2-5h，优选的4h。

在本发明上述所述的任一方法，其特征在于，所述的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌为选自大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳酸菌，和酵母菌中的一种，优选的所述重组菌为谷氨酸棒状杆菌，更优选的，所述重组菌为表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的谷氨酸棒状杆菌，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4，最优选为DPE3。

本发明目的之二是提供一种阿果糖浆，其特征在于，是由本发明目的之一所述的任一方法生产的。

本发明采用谷氨酸棒杆菌发酵转化果葡糖浆制备阿果糖浆，所采用菌株为谷氨酸棒杆菌DPE3，谷氨酸棒杆菌DPE3培养过程中无需添加抗生素和诱导剂，而且具有较高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产能力，可用于高效转化D-果糖生成D-阿洛酮糖，

阿果糖浆：阿果糖浆是指含有阿洛酮糖以及，果糖、和/或葡萄糖，和/或蔗糖等糖分的糖浆。

红枣枣汁母液：红枣枣汁母液是指红枣经去核，提取并浓缩形成的液体。

富含果糖的糖浆或果汁：富含果糖的糖浆或果汁可以是，果葡糖浆，经菊粉外切酶处理的甘蔗糖蜜，经菊粉外切酶处理的大豆糖蜜，经菊粉外切酶处理的甜菜糖蜜，经菊粉外切酶处理的果糖基菊粉。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶：该酶可催化D-果糖生成阿洛酮糖。

果葡糖浆：果葡糖浆是由淀粉水解和异构化制成的淀粉糖晶，是一种重要的甜味剂，生产果葡糖浆的淀粉可以是玉米淀粉、红薯淀粉、土豆淀粉等。

经菊粉外切酶处理的甘蔗糖蜜是指甘蔗糖蜜经菊粉外切酶催化生成的液体。

经菊粉外切酶处理的大豆糖蜜，是指大豆糖蜜经菊粉外切酶催化生成的液体。

经菊粉外切酶处理的甜菜糖蜜，是指甜菜糖蜜经菊粉外切酶催化生成的液体。

菊粉基果糖浆，是指菊粉经菊粉外切酶催化生成的液体。

菊粉外切酶酶活力单位(U)的定义：一个酶单位的定义是在乙酸钠缓冲液中(100mM)，在pH 4.5和40℃，条件下，催化蔗果三糖(5mg/mL)生成1umol的β-D-果糖所需要的酶量。

与现有富含阿洛酮糖的糖浆生产技术相比，本发明所用原料如玉米、甘蔗、大豆、菊芋、甜菜、红枣等来源丰富，尤其是糖蜜是多种食品加工产业的副产物，价格低廉，采用发酵转化法制备得到的阿果糖浆可应用于烘焙食品、饮料等食品加工过程中，实现变废为宝，有助于提升玉米、甘蔗、大豆、菊芋、甜菜、红枣等下游加工产业的附加值。另外，本发明的生产方法，所生产的糖浆，阿洛酮糖含量极高，催化成本低。

具体实施方式

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1.谷氨酸棒状杆菌DPE3的构建

首先，构建整合位点载体pK18-ldhA，拟将DPE组合操纵子整合至染色体的乳酸脱氢酶基因(ldhA)位点，根据谷氨酸棒杆菌中乳酸脱氢酶基因(ldhA)上下游序列信息，设计引物1，引物2，引物3和引物4，其中引物1和引物2用于扩增ldhA的上游基因片段，引物3和引物4用于扩增ldhA的下游基因片段，引物2和引物3有约40bp左右的同源区域，用于上下游片段的融合，引物1和引物4分别含有EcoRI和HindIII酶切位点。引物序列如下：

引物1：TACCGGAATTCCGGCGCATTTCATGAATGACAAG

引物2：CGCCAAAGATTTAGAAGCTCGAGCGGTTATTTCATTTTCGATCCCACTTCCTG

引物3：TGGGATCGAAAATGAAATAACCGCTCGAGCTTCTAAATCTTTGGCGCCTAGTTG

引物4：TACTCAAGCTTCGTAGGTGAGTTCTTCGTCGGT

用引物1和引物2以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增得到上游片段ldhA1，用引物3和引物4以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增得到上游片段ldhA2，以扩增得到的ldhA1和ldhA2片段为模板，采用引物1和引物4扩增得到融合基因片段“ldhA1-ldhA2”，采用限制性内切酶EcoRI和HindIII同时切割融合片段“ldhA1-ldhA2”和载体pK18mobsacB(

A.et al.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived fromthe Escherichia coli plasmids pK18 and pK19：selection of defined deletions inthe chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene.1994.145：69-73.)，采用T4连接酶进行连接，获得整合位点载体pK18-ldhA。

其次，构建重组表达载体pEC-RPCDPE根据来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子序列(SEQ ID NO：1)设计引物1和2，以来源于Paenibacillus senegalensis的DPE基因序列(SEQID NO：2)设计引物3和4，以来源于Ruminococcus sp.的DPE基因序列(SEQ ID NO：3)设计引物5和6，以来源于Clostridium cellulolyticum的DPE基因序列(SEQ ID NO：4)设计引物7和8，其中引物2与3，引物4和5，引物6和7分别含有约40bp的同源区域，用于PCR片段之间的融合，引物5中含有H34启动子序列，引物7中含有H36启动子序列，H34启动子用于启动来源于Ruminococcus sp.的DPE基因的转录，H36启动子用于启动来源于Clostridiumcellulolyticum的DPE基因的转录，其中引物1和8中分别含有PstI酶切位点，引物序列如下：

引物1：GACAACTGCAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG

引物2：AGTAAGTACCGAATTTCATTGTATGTCCTCCTGGACTTCG

引物3：CGAAGTCCAGGAGGACATACAATGAAATTCGGTACTTACT

引物4：TTGCCTTGCAGGGTACCTTACGGGGTAGATTTCAGGAAGG

引物5：

CCTTCCTGAAATCTACCCCGTAAGGTACCCTGCAAGGCAATGTTCGATGTTGGGCTTCATTTTGAGGGTTTGGTTGAGTTTCAAGGGTCGTAGGATAATAATGGGATCC

引物6：GGGCACCAGATAGAGGTACCTTAGACTTCAAATACATGTT

引物7：

AACATGTATTTGAAGTCTAAGGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCC

引物8：GACAACTGCAGTCAGGAGTGTTTATGACATTCT

用引物1和2以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增tuf启动子，用引物3和4以由江苏金唯智生物技术有限公司提供的重组质粒pUC57-PDPE为模板PCR扩增PDPE基因，以瘤胃菌Ruminococcus sp的基因组为模板PCR扩增RDPE基因，以梭菌Clostridiumcellulolyticum的基因组为模板PCR扩增CDPE基因，采用融合PCR技术，将上述所得的四个PCR片段进行融合，得到融合片段“tuf-PDPE-H34RDPE-H36CDPE”(SEQ ID N0：5)，用限制性内切酶PstI同时酶切融合片段和表达载体pEC-XK99E，并进行连接，得到重组表达载体pEC-RPCDPE。

再次，用引物1和引物8以pEC-RPCDPE为模板扩增DPE组合操纵子RPCDPE，并用限制性内切酶PstI同时酶切RPCDPE片段和整合位点载体pK18-ldhA，采用T4连接酶进行连接，获得DPE基因整合载体pK18-ldhA-RPCDPE。

最后，采用电转化方法将载体pK18-ldhA-RPCDPE转至谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，挑选阳性克隆并进行PCR验证，获得染色体整合有DPE组合操纵子的谷氨酸棒杆菌DPE3。

实施例2.发酵转化果葡糖浆制备阿果糖浆

1、谷氨酸棒杆菌DPE3的培养

选用100mL脑心浸粉BHI培养基，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌DPE3进行培养12-24h，4℃、8000rmp离心15min收集菌体。

2、阿果糖浆的制备

采用两种方案制备阿果糖浆，采用的果葡糖浆为F55型，即含有55％的果糖。

方案一：将果葡糖浆母液稀释5倍，调节溶液pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝0.5左右，控制反应温度30℃，摇床转速为200rmp，发酵24h。

方案二：调节果葡糖浆母液pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝10左右，控制反应温度为55℃，摇床转速150rmp，转化4h。

发酵终止时，样品离心取上清，并进行液相色谱检测。

由表1可知，发酵终止时，与果葡糖浆原液相比，方案一所获得的阿果糖浆中葡萄糖浓度降低31％，果糖浓度降低了21％，阿洛酮糖浓度提高了20.8％，其中阿洛酮糖浓度为23g/L，运用此方法发酵后的阿果糖浆可经浓缩5倍，制备成浓度更高的阿果糖浆。方案二制备的阿果糖浆，葡萄糖浓度基本没有降低，果糖浓度降低29％，阿洛酮糖浓度提高29％，其中阿洛酮糖浓度质量体积比为160g/L。

表1：果葡糖浆制备阿果糖浆发酵前后糖分变化

实施例3.发酵转化红枣枣汁提取物制备阿果糖浆

1、菌株DPE3的制备方法同实施例2相同。

2、阿果糖浆的制备

采用两种方案制备阿果糖浆，红枣枣汁为浓缩后的枣汁。

方案一：将浓缩枣汁母液稀释5倍，调节溶液pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝0.5左右，控制反应温度30℃，摇床转速为200rmp，发酵24h。

方案二：将浓缩枣汁母液pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝10左右，控制反应温度为55℃，摇床转速150rmp，转化4h。

发酵终止时，样品离心取上清，并进行液相色谱检测。

表2：红枣枣汁制备阿果糖浆发酵前后糖分变化

由表2可知，发酵终止时，与浓缩枣汁原液相比，方案一所获得的阿果糖浆中葡萄糖浓度降低61％，果糖浓度降低了20.2％，阿洛酮糖浓度提高了19.8％，其中阿洛酮糖浓度为14g/L，运用此方法发酵后的阿果糖浆可经浓缩8倍，制备成浓度更高富含阿果糖浆的红枣枣汁。方案二制备的阿果糖浆，葡萄糖浓度基本没有降低，果糖浓度降低29％，阿洛酮糖浓度提高29％，其中阿洛酮糖浓度质量体积比为102g/L。

实施例4.酶法催化和发酵转化相结合转化甘蔗糖蜜制备阿果糖浆

1、酶法降解甘蔗糖蜜

蔗糖糖蜜中富含蔗糖，含量约30％-40％，还原糖仅含有9％-12％，所以蔗糖的高效利用对于生产高浓度阿果糖浆的生产至关重要，为此，采用商业化的蔗糖酶或者菊粉外切酶水解蔗糖为葡萄糖和果糖，并建立如下反应体系：

蔗糖糖蜜稀释1倍，调节pH至7.0，加入菊粉外切酶5U/mL，40℃，反应4h。

2、阿果糖浆的制备

采用两种方案制备阿果糖浆。

方案一：将酶解后的蔗糖糖蜜稀释4倍，调节溶液pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝0.5左右，控制反应温度30℃，摇床转速为200rmp，发酵24h。

方案二：将酶解后的蔗糖糖蜜pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝10左右，控制反应温度为55℃，摇床转速150rmp，转化4h。

发酵终止时，样品离心取上清，并进行液相色谱检测。

表3：甘蔗糖蜜制备阿果糖浆发酵前后糖分变化

由表3可知，蔗糖糖蜜原液经菊粉外切酶水解后，97％的蔗糖均被水解为葡萄糖和果糖。采用方案一，与发酵初始相比，葡萄糖降低71％，果糖含量降低21％，阿洛酮糖含量提高21％，采用方案二，与发酵初始相比，葡萄糖基本无变化，果糖含量降低30％，阿洛酮糖浓度达到51g/L，由上述两种方案制备的阿果糖浆均可以经过浓缩方法制备成阿洛酮糖含量更高的阿果糖浆。

实施例5.酶法催化和发酵转化相结合转化大豆糖蜜制备阿果糖浆

1、酶法降解大豆糖蜜

与蔗糖糖蜜类似，大豆糖蜜中同样含有高浓度的蔗糖，含量约20％-30％，为此，采用商业化的蔗糖酶或者菊粉外切酶水解蔗糖为葡萄糖和果糖，并建立如下反应体系：

蔗糖糖蜜未稀释，调节pH至7.0，加入菊粉外切酶5U/mL，40℃，反应4h。

2、阿果糖浆的制备

采用两种方案制备阿果糖浆。

方案一：将酶解后的大豆糖蜜稀释4倍，调节溶液pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝0.5左右，控制反应温度30℃，摇床转速为200rmp，发酵24h。

方案二：将酶解后的大豆糖蜜pH至7.0，加入收集后的菌株DPE3菌体，控制初始菌体浓度OD600＝10左右，控制反应温度为55℃，摇床转速150rmp，转化4h。

发酵终止时，样品离心取上清，并进行液相色谱检测。

表4：大豆糖蜜制备阿果糖浆发酵前后糖分变化

由表4可知，大豆糖蜜原液经菊粉外切酶水解后，98％的蔗糖均被水解为葡萄糖和果糖。采用方案一，与发酵初始相比，葡萄糖降低83％，果糖含量降低27％，阿洛酮糖含量提高27％，采用方案二，与发酵初始相比，葡萄糖基本无变化，果糖含量降低30％，阿洛酮糖浓度达到45g/L，由上述两种方案制备的阿果糖浆均可以经过浓缩方法制备成阿洛酮糖含量更高的阿果糖浆。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所你

<120> 一种阿果糖浆及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180

gaagtccagg aggacataca 200

<210> 2

<211> 879

<212> DNA

<213> Paenibacillus senegalensis

<400> 2

atgaaattcg gtacttactt cgcttactgg gaacagtctt gggacaccga ctacctgaaa 60

tacgttaaaa aagttgctga cctgggtttc gacgttctgg aagttggtgc tgctggtatc 120

gttaacatgt ctgacgacgc tctgtctgct ctgaaatctg aagctgaaaa ctacgctatc 180

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gctcagtacg acatcaccct gctggttgaa tctctgaacc gtttcgaaca gttcctggtt 480

aacgacgcta aagaagctgt tgactacgtt aaagctgtta acaaaccgaa cgttaaagtt 540

atgctggact ctttccacat gaacatcgaa gaagactacc tgggtgacgc tatccgttac 600

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gaattcgtta aacagacctt cctgaaatct accccgtaa 879

<210> 3

<211> 876

<212> DNA

<213> Ruminococcus

<400> 3

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<211> 882

<212> DNA

<213> Clostridium cellulolyticum

<400> 4

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tatattgaga aggttgcaaa gcttggtttt gatattctag agattgcagc ttcaccgcta 120

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gaagcctgtg gagtggattt ctgcctagag gttcttaata gatttgagaa ttatttaatt 480

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gatttctcca gatatgtatt agaatgtcat aaacactcct ga 882

<210> 5

<211> 3009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

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gaagtccagg aggacataca atgaaattcg gtacttactt cgcttactgg gaacagtctt 240

gggacaccga ctacctgaaa tacgttaaaa aagttgctga cctgggtttc gacgttctgg 300

aagttggtgc tgctggtatc gttaacatgt ctgacgacgc tctgtctgct ctgaaatctg 360

aagctgaaaa ctacgctatc accctgaccg ctggtatcgg tctgccgaaa cagttcgacg 420

tttcttctga aaacgaatct gttcgtcagg acggtatcgc tttcatgaaa aaaatcctgg 480

acgctctgca caaagctggt atcaaagcta tcggtggtac tatctactct tactggccgg 540

ttgactactc tgctccgatc aacaaaccgg ctgttcgtaa acagtctatc aaatctatgc 600

aggaactggc tgactacgct gctcagtacg acatcaccct gctggttgaa tctctgaacc 660

gtttcgaaca gttcctggtt aacgacgcta aagaagctgt tgactacgtt aaagctgtta 720

acaaaccgaa cgttaaagtt atgctggact ctttccacat gaacatcgaa gaagactacc 780

tgggtgacgc tatccgttac accggtgact acctgggtca cttccacatc ggtgaatgca 840

accgtaaagt tccgggtaaa ggtcacatgc cgtggtctga aatcggtcag gctctgcgtg 900

acatccagta cgacggttgc gttgttatgg aaccgttcgt tcgtccgggt ggtatcgttg 960

gttctgacat caaagtttgg cgtgacctgt ctgacaacgc tgacgaagct aaactggacg 1020

ctgacatcaa agaatctctg gaattcgtta aacagacctt cctgaaatct accccgtaag 1080

gtaccctgca aggcaatgtt cgatgttggg cttcattttg agggtttggt tgagtttcaa 1140

gggtcgtagg ataataatgg gatccatgaa atatggtatt tattacgctt attgggaaaa 1200

ggaatggaat ggagattaca aatattatat agataaaatt tcaaaattag gttttgatat 1260

tctggaaatt tcttgcggcg ctttttctga ctattacacg aaagatcagg agttaattga 1320

tattggaaaa tatgcgaaag aaaaaggcgt aacattgaca gcagggtatg gacctcattt 1380

taatgaaagc ctgtcatctt cagaacccaa tacgcagaaa caagcaatca gtttttggaa 1440

agagacgctc cggaaattga agttaatgga tattcatatt gttggaggcg cactctatgg 1500

ttattggcct gtagattatt ccaaaccttt tgataagaaa agggatttag agaattccat 1560

taaaaacatg aaaattatta gtcagtatgc tgaagaatat gacataatga tggggatgga 1620

agttcttaac cgttttgaag gctatatgtt gaatacatgc gatgaagcgt tggcatacgt 1680

tgaagaggtt ggctcttcta atgttggtgt tatgttagat acttttcaca tgaatataga 1740

ggaagataat atagcagcag ccattcgtaa agcaggagat aggctttatc acttccatat 1800

aggagaagga aatcgtaaag taccaggaaa aggtatgctt ccttggaatg agataggaca 1860

ggcattgcga gatataaact accaacatgc agcagttatg gagccatttg taatgcaggg 1920

aggaacagta gggcatgaca ttaaaatatg gagagatatc attggaaact gttctgaagt 1980

tacattagat atggacgctc aaagtgcgtt gcactttgta aaacatgtat ttgaagtcta 2040

aggtacctct atctggtgcc ctaaacgggg gaatattaac gggcccaggg tggtcgcacc 2100

ttggttggta ggagtagcat gggatccatg aaacatggta tatactacgc atattgggaa 2160

caagaatggg aagctgatta caaatactat attgagaagg ttgcaaagct tggttttgat 2220

attctagaga ttgcagcttc accgctacct ttttacagtg acattcagat taatgagctc 2280

aaggcatgtg cccatggcaa tggaattaca cttacggtag gccatgggcc tagtgcagaa 2340

caaaacctgt cttctcccga ccccgatatt cgcaaaaatg ctaaagcttt ttataccgat 2400

ttactcaaac gactttacaa gctggatgta catttgatag gtggggcttt atattcttat 2460

tggccgatag attacacaaa gacaattgat aaaaaaggcg attgggaacg cagcgttgaa 2520

agtgttcgag aagttgctaa ggtggccgaa gcctgtggag tggatttctg cctagaggtt 2580

cttaatagat ttgagaatta tttaattaac acagcacaag agggtgtaga ttttgtaaaa 2640

caggttgacc ataacaatgt aaaggtaatg cttgatacct tccatatgaa tattgaggaa 2700

gatagtatcg gaggtgcaat caggactgcg ggctcttact tgggacattt acacactggc 2760

gaatgtaatc gtaaagttcc cggcagagga agaattccat gggtagaaat tggtgaggct 2820

cttgctgaca taggttataa cggtagtgtt gttatggaac cttttgttag aatgggcgga 2880

actgtcggat ctaatattaa ggtttggcgt gacattagta acggtgcaga tgagaaaatg 2940

ctggatagag aagcacaggc cgcacttgat ttctccagat atgtattaga atgtcataaa 3000

cactcctga 3009

Claims

1.一种阿果糖浆的制备方法，其特征为，包括如下步骤:

(a)取富含果糖的糖浆或果汁，调节pH为6至9；

(b)在步骤(a)得到的液体中加入表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，并进行催化；

所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)调节pH至7 .0，步骤(b)中加入重组菌后的初始OD600为0.5-10，催化温度为30-60℃,催化时间为4-24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)调节pH至7.0，步骤(b)中加入重组菌后的初始OD600为10，催化温度为55℃，催化时间为4h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)还包括对富含果糖的糖浆或果汁的稀释，所述稀释体积倍数为1-10倍。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)稀释倍数为4-5倍，调节pH至7.0，步骤(b)中的初始OD600为0.5，催化条件为30℃，反应时间24h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的富含果糖的果汁为红枣枣汁母液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的富含果糖的糖浆为果葡糖浆，或经菊粉外切酶处理的甘蔗糖蜜，或经菊粉外切酶处理的大豆糖蜜，或经菊粉外切酶处理的甜菜糖蜜，或经菊粉外切酶处理的菊粉基果糖浆，或经蔗糖酶处理的甘蔗糖蜜，或经蔗糖酶处理的大豆糖蜜，或经蔗糖酶处理的甜菜糖蜜，或经蔗糖酶处理的菊粉基果糖浆。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，经菊粉外切酶处理的甘蔗糖蜜或经菊粉外切酶处理的大豆糖蜜的制备方法，包括如下步骤；

(1)取甘蔗糖蜜或大豆糖蜜或甜菜糖蜜，稀释体积倍数0.1-2倍；

(2)调节步骤(1)得到的液体的pH为6至9；

(3)在步骤(2)得到的液体中加入0.1U-100U/mL的菊粉外切酶，并在30-50摄氏度，条件下催化2-5h。

9.根据权利要求1-8所述的任一方法，其特征在于，所述的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌为选自大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳酸菌，和酵母菌中的一种。