KR20190046779A - 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 비활성이 특정 레벨 이상인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 효소액을 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지로 접촉시킴으로써 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 얻을 수 있다.

Description

고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법
본 발명은 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 비활성이 높고 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
프럭토스에 D-케토핵소오스·3-에피머라아제(특허문헌 1)를 작용시켜서 생성되는 알룰로스는, 별명을 사이코스로 칭하는 희소당의 일종이며, 에너지 값이 제로(비특허문헌 1), 식후 혈당상승 억제효과(비특허문헌 2), 항비만효과(비특허문헌3) 등의 유효성이 보고되고 있으며, 생활습관병 예방소재로서 주목을 받고 있다.
이처럼 알룰로스는 다이어트 감미료로서 각광을 받고 있으며, 식품산업 분야에서 알룰로스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법의 개발에 대한 필요성이 높아지고 있다.
종래, 알룰로스의 생산방법으로서는, 예를 들어 프럭토스를 기질로 이용하고, 미생물 유래의 D-케토핵소오스-3-에피머라아제(이하, '알룰로스 에피메라제'라고도 한다)를 작용시켜서 알룰로스를 효소적으로 생산하는 방법이 알려져 있다.
알룰로스 에피메라제로서는, 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) 또는 아그로박테리움·튜미펙션즈(Agrobacterium tumefaciens) 유래인 알룰로스 에피메라제, 및 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) 또는 로도박터 스페로이드스(Rhodobacter sphaeroides) 유래인 타가토오스 에피머라아제 등이 알려져 있다.
또한, 알룰로스 에피메라제를 이용하여 알룰로스를 공업적으로 제조하는 경우에는, 제조효율을 높이기 위하여, 고정화 알룰로스 에피메라제가 사용되고 있다. 종래, 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법으로는, 알긴산 나트륨(특허문헌 2), 스티렌계 다공질형 약염기성 이온 교환수지(특허문헌 3), 및 페놀계 다공질형 약염기성 이온 교환수지(특허문헌 4)를 고정화 담체로 사용하는 방법이 알려져 있다.
그러나 종래의 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법으로는, 상업적 생산에 요구되는 경제성(제조비용)이나 안정성(활성유지) 등의 성능이 불충분하거나 연속생산에 견디기 어려운 단점이 있다. 그래서 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조하는 방법의 개발이 요망되고 있다.
특개평 6-125776 호 공보 특표 2013-501519 호 공보 특개 2014-140361 호 공보 특표 2015-530105 호 공보
J. Nutri. Sci. Vitaminol., 48, 77-80, 2002. J. Nutri. Sci. Vitaminol., 54, 511-514, 2008. Int. J. food Sci. Nutri., 65, 245-250, 2014.
본 발명은, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하는 것을 목적으로, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조할 수 있는 방법에 대해서 예의연구를 하였다. 그 결과, 비활성이 특정 레벨 이상인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 효소액을 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지에 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R이 되도록 접촉시킴으로써, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 얻을 수 있다는 것을 찾아냈다. 본 발명은 이러한 지견을 기초로 하여 더욱 검토를 거듭함으로써 완성한 것이다.
즉, 본 발명은 아래에 나타내는 형태의 발명을 제공한다.
제 1 항. 비활성이 50U/mg 이상인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 효소액을, 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R이 되도록, 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지와 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법.
제 2 항. 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환의 이온 교환기가 3급 아민인 제 1 항에 기재된 제조방법.
제 3 항. 상기 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지의 이온 교환기가 -N(CH3)2인, 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 제조방법.
제 4 항. 이온 교환수지와 접촉시키는 상기 효소액의 알룰로스 에피메라제 단위수가 이온 교환수지 1ml 당 270U 이상인, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기제된 제조방법.
본 발명에 의하면, 종래의 고정화 알룰로스 에피메라제와 비교하여, 알룰로스 에피메라제 활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 방법으로 얻어지는 고정화 알룰로스 에피메라제를 충전한 칼럼에 프럭토스 용액을 통액(通液)하는 간편한 방법으로 알룰로스를 생산하는 것이 가능하게 된다. 게다가 본 발명의 고정화 알룰로스 에피메라제와 기존의 고정화 글루코오스 이소메라아제를 조합한 칼럼을 이용하면 글루코오스로부터 이성화당을 포함하는 알룰로스를 효율적으로 제조할 수도 있다.
도 1은 실시예 3에 있어서 고정화 알룰로스 에피메라제를 이용하여 프럭토스에서 알룰로스의 연속효소반응을 실시하여 고정화 알룰로스 에피메라제의 반감기를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법에 관한 것이며, 비활성이 50U/mg 이상인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 효소액을, 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R이 되도록 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지, 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지와 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이하, 본 발명의 제조방법에 대하여 상술한다.
[정의］
본 발명에 있어서, '알룰로스 에피메라제의 효소활성(U)'은, 알룰로스를 기질로 하여 반응온도 50℃로 반응시키고, 1분 동안 1μmol 프럭토스를 생성하는 효소력을 1단위(U)로 한 것이다. 구체적으로는 2mM의 황산 마그네슘을 포함하는 50mM의 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M의 알룰로스 용액 2500μl, 2mM의 황산 마그네슘을 포함하는 50mM의 인산 완충액(pH8.0) 2167μl 및 알룰로스 에피메라제 333μl를 나사 캡이 부착된 시험관에 투입하여, 온수욕에 담그고 50℃로 15분 동안 반응시킨다. 5질량%의 염산 수용액을 첨가하여 pH2.5 ~ 3.0로 조정하여 효소를 불활성화시키고 이온 교환수지에 의한 탈염, 필터 여과를 한 후, HPLC 분석을 한다. 생성한 프럭토스의 피크 면적비를 이용하여 효소활성을 산출한다.
본 발명에 있어서, '알룰로스 에피메라제의 비활성(U/mg)'은, 단백질 1mg이 가진 알룰로스 에피메라제의 효소활성(U)이다. 구체적으로는 (1) 알룰로스 에피메라제를 용해시킨 효소액을 준비한다, (2) 당해 효소액의 단백질 농도(mg/ml)를 브래드포드법으로 측정한다, (3) 당해 효소액의 알룰로스 에피메라제의 효소활성(U/ml)을 전술한 방법으로 측정한다, (4) 얻어진 알룰로스 에피메라제의 효소활성(U/ml)을 담백질 농도(mg/ml)로 나누고, 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/mg)을 산출하는 것으로 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, '고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/ml-R)'은 고정화수지 1ml 당의 활성이며, 이하 측정방법에 기초하여 측정되는 값이다. 구체적으로는 50mM의 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M의 알룰로스 용액 2500μl, 50mM의 인산 완충액(pH8.0) 2480μl, 및 불필요한 수분을 제거한 팽윤 상태인 고정화 알룰로스 에피메라제 20mg을 10ml인 나사 캡이 부착된 시험관에 투입하여, 온수욕에 가로로 눕혀서 침지시키고, 50℃로 15분 동안 진탕 반응을 시킨다. 그 후 5질량%의 염산 수용액을 첨가하여 pH3.0 ~ 2.5로 조정하여 효소를 불활성화시켜서 반응액을 회수하여, 이온 교환수지에 의해서 탈염하고, 필터 여과한 후에, HPLC 분석을 행하고, 생성한 프럭토스의 피크 면적비로부터 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/ml-R)을 얻는다.
본 발명에 있어서, '부하 단백질 총량(mg/ml-R)'이란, 접촉시키는 효소액의 총량에 포함되는 단백질의 질량(mg)을, 당해 효소액에 접촉시킨 이온 교환수지의 팽윤 시의 용량(1ml-R)으로 나누는 것으로 얻어지는 값이다.
본 발명에 있어서, '공간속도(SV)'란, 용액을 칼럼에 통액하는 속도의 단위이고, 「공간속도(SV) = 통액량(ml)/칼럼 부피(ml)/시간(h)」으로 산출된다.
[알룰로스 에피메라제]
알룰로스 에피메라제란, 프럭토스와 알룰로스와의 상호 변환을 촉매할 수 있는 효소이다. 본 발명에 사용되는 알룰로스 에피메라제의 유래에 대해서는 특별히 제한되지 않으며, 미생물, 동물 및 식물 등의 생물 중 어느 것에 유래하든 무방하다. 예들 들어서, 알룰로스 에피메라제는, 아르드로박터 글로비포르미스 M30(Arthrobacter globiformis M30) 주(株)(수탁번호 : NITE BP-1111), Pseudmonas cichorii, 아그로박테리움·튜미펙션즈(Agrobacterium tumefaciens), 클로스트리데움 에스피.(Clostrideum sp.), 클로스트리디움 신뎀스(Clostridium scindens), 클로스트리데움 볼테에(Clostrideum bolteae), 클로스트리움 셀룰롤리티숨(Clostridium cellulolyticum), 루미노코쿠스 에스피.(Ruminococcus sp.) 등의 미생물에 의하여 생산되는 것이 알려져 있다.
또한, 본 발명에 있어서 고정화되는 알룰로스 에피메라제는, 상기 생물을 이용해서 제조한 것이어도 좋고, 또한 유전자 공학적 수법으로 제조된 재조합 알룰로스 에피메라제이어도 좋다. 나아가, 본 발명에 사용되는 알룰로스 에피메라제는, 상기 생물 유래인 알룰로스 에피메라제에 이변을 실시한 변이체이어도 좋다.
또한, 본 발명에 있어서 고정화되는 알룰로스 에피메라제는, 정제품(精製品) 또는 조정제품(粗精製品) 중 어느 것이어도 좋다.
［고정화에 제공되는 효소액］
본 발명에서는, 비활성이 ５０Ｕ／ｍｇ 이상인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 효소액을, 후술하는 고정화 담체에 대한 고정화에 제공한다. 이와 같이 특정한 비활성을 가지는 효소액과 후술하는 고정화 담체를 사용하여, 특정한 부하 단백질 총량으로 알룰로스 에피메라제의 고정화를 실시함으로써, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조할 수 있게 된다.
고정화 담체에 대한 고정화에 제공되는 효소액인 알룰로스 에피메라제의 비활성에 대해서는, 50U/mg 이상인 것을 한도로 하여 특별히 제한되지 않으나, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점에서, 바람직하게는 50U/mg ~ 200U/mg, 더 바람직하게는 50 ~ 160U/mg을 들 수 있다.
고정화 담체에 대한 고정화에 제공되는 효소액의 용매에 대해서는, 특별히 제한되지 않으며, 물, 완충액 등의 어느 것이든 좋다.
[고정화 담체]
본 발명에 사용되는 알룰로스 에피메라제의 고정화 담체는, 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지이다. 이러한 특정 음이온 교환수지를 허용함으로써, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조할 수 있게 된다.
스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지란, 폴리스티렌 디비닐벤젠의 공중합체인 겔상 수지 기체(基體)로 이루어지고, 물리적으로 구멍(마크로 포어)이 뚫린 다공질 약염기성 음이온 교환수지이다.
스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지의 형태에 대해서는, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 분체상(粉), 구상(球), 섬유상(維), 막상(膜) 등의 어느 것이든 좋다.
스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지에 있어서의 이온 교환기에 대해서는, 음이온 교환이 가능하며 약염기성을 나타내는 기(基)임을 한도로 하여 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 3급 아민, 4급 아민, 폴리아민 등의 아민을 들 수 있다. 이들 이온 교환기는, 1종 단독으로 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지에 포함되어 있어도 좋고, 2종 이상을 조합하여 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지에 포함되어 있어도 좋다. 이들 이온 교환기 중에서도, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점에서, 바람직하게는 3급 아민, 더 바람직하게는 기(基) -N(CH3)2를 들 수 있다.
스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지로써는, 예를 들어, 앰버라이트 EPA95, 앰버라이트 IRA904(이상, Oragano사제(社製)); 듀오라이트 A378D(Sumika Chemtex사제(社製)); 퓨로라이트 A111S, 퓨로라이트 A103S(이상, Purolite사제(社製)); 다이아 이온 WA20, 다이아 이온 WA30(이상, Mitsubishi Rayon Aqua Solutions사제(社製)) 등이 시판되고 있으며, 본 발명에서는 이들 시판품을 사용할 수도 있다.
스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지란, 폴리스티렌 디비닐벤젠의 공중합체인 겔상 수지 기체(基體)로 이루어진 약염기성 음이온 교환수지이다.
스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지의 형태의 대해서는, 특별히 제한 되지 않으며, 예들 들어서, 분체상, 구상, 섬유상, 막상 등의 어느 것이든 좋다.
스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지에 있어서의 이온 교환기에 대해서는, 음이온 교환이 가능하고 약염기성을 나타내는 기(基)임을 한도로 하여 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 3급 아민, 4급 아민, 폴리아민 등의 아민을 들 수 있다. 이들 이온 교환기는, 1종 단독으로 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지에 포함되어 있어도 좋고, 2종 이상을 조합하여 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지에 포함되어 있어도 좋다. 이들 이온 교한기 중에서도, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점으로, 바람직하게는 3급 아민을 들 수 있다.
스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지로서는, 예를 들어, 다이아 이온 HPA25L(Mitsubishi Rayon Aqua Solutions사제(社製)), 앰버라이트 IRA411S(Oragano사제(社製)) 등이 시판되고 있으며, 본 발명에서는 이들 시판품을 사용할 수도 있다.
스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 및 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지에 있어서, 총 교환 용량(이온 교환수지가 가지고 있는 최대 이온 교환량)에 대해서는, 특별히 제한되지 않으나, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점에서, 보통 1eq/l-R 이상, 바람직하게는 1 ~ 2eq/l-R, 더 바람직하게는 1.2 ~ 1.5eq/l-R을 들 수 있다.
본 발명에서는, 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지 중 어느 하나 만을 사용해도 좋고, 또한 이들 모두를 조합하여 사용해도 좋다.
이들 음이온 교환수지 중에서도, 비활성이 높고, 내구성이 우수한 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점에서, 바람직하게는 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지, 더 바람직하게는 이온 교환기로서 3급 아민을 가지는 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지를 들 수 있다.
[알룰로스 에피메라제의 고정화]
상기 효소액을 상기 고정화 담체에 대하여 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R이 되도록 접촉시킴으로써, 알룰로스 에피메라제의 비활성이 높고, 우수한 내구성을 구비한 고정화 알룰로스 에피메라제를 얻을 수 있다.
상기 효소액을 상기 고정화 담체에 접촉시킴에 앞서, 완충액 등의 세정액을 사용하여, 상기 고정화 담체를 세정해 두는 것이 바람직하다.
상기 고정화 담체에 접촉시키는 상기 효소액량은, 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R이 되도록 설정하면 좋으나, 비활성이 높은 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점에서, 상기 효소액의 부하 단백질 총량으로서, 바람직하게는 2 ~ 15mg/ml-R, 더 바람직하게는 3 ~ 10mg/ml-R, 더 바람직하게는 5 ~ 10mg/ml-R을 들 수 있다.
상기 고정화 담체와 상기 효소액을 접촉시키는 공정에 있어서, 상기 효소액에 포함되는 알룰로스 에피메라제량과 상기 고정화 담체의 비율에 대해서는, 상기 부하 단백질 총량의 범위를 충족할 수 있는 범위에서 적절히 설정하면 좋으나, 비활성이 높은 고정화 알룰로스 에피메라제를 한층 더 효율적으로 제조한다는 관점에서, 상기 고정화 담체의 팽윤시의 부피 1ml 당, 접촉시키는 상기 효소액에 포함되는 알룰로스 에피메라제의 총량이 200 ~ 2000U, 바람직하게는 500 ~ 1000U, 더 바람직하게는 600 ~ 900U이 되는 비율을 들 수 있다.
상기 효소액을 상기 고정화 담체에 접촉시키는 방법에 대해서는, 특별히 제한되지 않으며, 통상적으로 고정화 효소의 제조에서 채용되고 있는 방법을 사용하면 좋으나, 구체적으로는, 상기 고정화 담체를 충전한 칼럼에 상기 효소액을 통액하는 방법, 상기 효소액을 넣은 용기에 상기 고정화 담체를 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 고정화 담체를 충전한 칼럼에 상기 효소액을 통액하는 방법인 경우, 상기 고정화 담체를 충전한 칼럼에 대한 상기 효소액의 공간속도에 대해서는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 0.1 ~ 1.0hr-1, 바람직하게는 0.2 ~ 0.8hr-1, 더욱더 바람직하게는 0.4 ~ 0.6hr-1을 들 수 있다. 또한, 당해 방법에 의하여 고정화 알룰로스 에피메라제를 제조하는 경우, 칼럼을 통액시켜서 배출된 효소액은, 다시 칼럼으로 통액함으로써, 효소액을 순환시켜서 상기 효소액을 반복해서 통액하는 것이 바랍직하다.
또한, 상기 고정화 담체를 충전한 칼럼으로 상기 효소액을 통액하는 방법인 경우, 상기 효소액을 통액하는 시간에 대해서는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 5 ~ 20시간, 바람직하게는 10 ~ 18시간, 더 바람직하게는 12 ~ 16 시간을 들 수 있다.
또한, 상기 효소액을 넣은 용기에 상기 고정화 담체를 첨가하는 방법인 경우, 상기 효소액을 넣은 용기에 상기 고정화 담체를 첨가하여, 필요에 따라서 교반을 행하여, 알룰로스 에피메라제가 상기 고정화 담체에 고정화될 때까지 인큐베이트(incubate)하면 좋다.
또한, 상기 고정화 담체를 충전한 칼럼으로 상기 효소액을 통액하는 방법인 경우, 상기 효소액을 넣은 용기에 상기 고정화 담체를 첨가하여 인큐베이트하는 시간에 대해서는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 10 ~ 40 시간, 바람직하게는 15~35 시간, 더 바람직하게는 20 ~ 30 시간을 들 수 있다.
이리하여 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제는, 필요에 따라서, 완충액 등 세정액을 사용하여 세정을 행하여도 좋다. 또한, 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제는, 필요에 따라서, 글루타르알데히드나 폴리에틸렌이민 등으로 가교시켜서, 알룰로스 에피메라제의 고정화를 강고히 해도 좋다.
[고정화 알룰로스 에피메라제의 특성용도]
이리하여 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제는, 알룰로스 에피메라제의 비활성이 높고, 우수한 내구성을 구비하고 있다.
본 발명의 제조방법으로 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제가 가지는 비활성으로서, 보통 150U/ml-R 이상, 바람직하게는 150 ~ 500U/ml-R, 더 바람직하게는 200 ~ 500U/ml-R, 각별히 바람직하게는 250 ~ 500U/ml-R을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법으로 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제가 구비하는 내구성으로서는, 이하 시험조건에서의 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성 반감기가 150일 이상, 바람직하게는 160 ~ 250일, 더 바람직하게는 200 ~ 240일을 들 수 있다.
(내구성 시험조건)
재킷이 부착된 유리제 칼럼(내경 20mm, 길이 400mm)에, 활성이 4500U에 상당되는 양의 고정화 알룰로스 에피메라제를 충전하였다. 별도로, 2mM인 황산 마그네슘을 첨가하고, 탄산 나트륨을 더 첨가하여 pH 7.8 ~ 8.0으로 조정한 35질량%인 프럭토스 용액을 준비한다. 당해 프럭토스 용액을, 고정화 알룰로스 에피메라제가 충전된 유리제 칼럼에, 재킷 온도 55℃, 상향류(上向流)로 프럭토스 분획이 0.004g/hr/U이 되도록 연속적으로 접촉시킨다. 예를 들어, 비활성이 450U/ml-R인 고정화 알룰로스 에피메라제인 경우, 재킷이 부착된 유리제 칼럼(내경 20mm, 길이 400mm)에 고정화 알룰로스 에피메라제를 10ml 충전하고, 상기 프럭토스 용액을, 공간속도 5hr-1로 통액한다. 칼럼에서 유출된 유출액을 24시간 마다 한 번 채취하고, 채취한 각각 액을, 탈염하여 필터 여과한 후, HPLC 분석하고, 프럭토스 및 알룰로스의 피크 면적을 차지하는 알룰로스의 면적을 구하고, 변환율로 하였다. 변환율을 시간 경과적으로 구성하여 근사직선을 구하고, 그 근사직전으로부터 시험개시 1일 후의 변환효율의 반이 되는 일수를 구하고 반감기로 한다.
이와 같이, 본 발명의 제조방법으로 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제는, 알룰로스 에피메라제의 비활성이 높고, 우수한 내구성을 가지고 있으므로, 프럭토스 또는 글루코오스로부터 알룰로스를 공업적으로 연속적으로 제조하는데 적합하다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제는, 단독으로 알룰로스 제조에 사용해도 좋고, 또한 다른 고정화 효소(예를 들어, 고정화 글루코오스 이소메라아제 등)와 조합하여 알룰로스 제조에 사용해도 좋다.
실시예
이하에 실시예를 나타내며 본 발명을 더 상세하게 설명할 것이지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1(고정화 담체 스크리닝)
1. 고정화에 사용되는 알룰로스 에피메라제의 조제
고정화에 사용되는 알룰로스 에피메라제는, 다음 (1) 및 (2)에 나타내는 공정을 거쳐서 조제하였다.
(1) 균체 배양과 균체 회수
0.5질량%인 알룰로스를 포함하는 최소 염배지(MSM 배지) 4L에 아르드로박터 글로비포르미스 M30(Arthrobacter globiformis M30) 주(株)를 식균(植菌)하고, 자 퍼멘터(jar fermenter)를 이용하여 30℃로 24시간, 교반속도 400rpm, 통기량 매분 0.10L/배지L로 배양하였다. 이 배양액으로부터 원심분리에 의하여 균체 100g(습윤중량)을 회수하고, 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정하였다.
(2) 조효소의 추출공정
얻어진 균체 100g(습윤중량)을 50mM 인산 완충액(pH8.0) 1000ml에 현탁하여, 그것에 10g 난백 라이소자임(식품 첨가물, Kewpie사제(社製)) 및 5g 염화 나트륨을 가하고, 37℃로 120분 동안 가열함으로써, 효소의 추출반응을 행하였다. 그 후, 55℃로 15분 동안 더 가열을 행하여, 원심분리(12000rpm, 30분)에 의하여 얻어진 상청액을 조효소액으로 하였다. 당해 조효소액에 포함되는 총 단백질 1mg 당 알룰로스 에피메라제의 비활성은 4.9U/mg이었다.
2. 고정화 담체의 1차 스크리닝
알룰로스 에피메라제의 고정화 담체로서, 표 1에 나타낸 이온 교환수지(시판품)를 평가하였다.
[표 1]
Figure pct00001
2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 표 1의 이온 교환수지 355mg과 상기에서 조제된 30U의 알룰로스 에피메라제를 포함하는 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)을 혼합하여, 20℃로 설정한 체임버 내에서 트위스트 믹서를 이용하여 24시간 천천히 교반시켰다. 다음으로, 피펫을 이용하여 상청액을 제거하고, 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 다섯 번 세정하여, 고정화 알룰로스 에피메라제로 하였다.
1차 스크리닝에 있어서의 고정화 알룰로스 에피메라제의 효소 활성 측정방법은 다음과 같다. 즉, 50mM인 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M의 알룰로스 용액 500μl, 50mM인 인산 완충액(pH8.0) 480μl 및 웨이스트(waste) (KimWipes)로 불필요한 수분을 제거한 고정화 알룰로스 에피메라제 20mg을 마이크로 튜브에 투입하여, 온수욕에 담그고 50℃로 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 95℃의 비등욕 중에 5분 동안 투입하여 효소를 불활성화시켜서, 이온 교환수지에 의한 탈염, 필터 여과한 후, HPLC(분석 칼럼 : MCIGEL CK08EC Mitsubishi Chemical사제(社製))분석하여, 생성한 프럭토스와 알룰로스의 총 피크 면적에 대한 프럭토스의 피크 면적비로부터, 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/ml-R)를 구하였다.
얻어진 결과를 표 ２에 나타낸다. 그 결과, 스티렌계 다공질형 약염기성 이온 교환수지 및 스티렌계 겔형 약염기성 이온 교환수지로 고정화된 알룰로스 에피메라제의 비활성이 높고, 특히 스티렌계 다공질형으로 3급 아민을 가지는 이온 교환수지, 스티렌계 겔형으로 3급 아민을 가지는 이온 교환수지로 고정화된 알룰로스 에피메라제의 비활성이 높다는 경향이 인정되었다. 그러나, 데이터에는 나타내지 않았으나, 프럭토스에 고정화 알룰로스 에피메라제를 작용시키고 알룰로스를 연속적으로 생성시킨 별도의 실험에 있어서 스티렌계 다공질형 3급 아민이어도, 강염기성 음이온 교환수지는, 생성된 알룰로스를 분해하고, 순도를 낮추는 것이 인정되어, 고정화 담체로서 부적절한 것을 알게 되었다.
[표 2]
Figure pct00002
3. 고정화 담체의 2차 스크리닝
다음으로, 1차 스크리닝에서 비활성이 높고, 효울적이라고 평가된 No.1 및 3의 이온 교환수지에 대하여, 고정화에 사용되는 알룰로스 에피메라제의 단위수를 늘리고, 흡착 고정화 용량을 평가하였다.
알룰로스 에피메라제는 대장균 발현계를 이용하여 생산된 것을 사용하였다. 즉, Arthrobacter globiformis M30 주(株) 유래인 알룰로스 에피메라제 유전자를 pQE 벡터(QIAGEN사)에 편입시키고, 그것을 대장균 M15(QIAGEN사)에 도입하여 발현시키고, 얻어진 균체 16g을 80ml인 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 현탁하고, 초음파 처리 및 원심분리에 의하여 추출 및 정제하였다. 얻어진 알룰로스 에피메라제의 비활성는 93.8U/mg이었다.
2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 표 1에 나타낸 No. 1 또는 3의 이온 교환수지 1ml와 450U 또는 1000U인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)을 혼합하여, 20℃로 설정한 체임버 내에서 트위스트 믹서를 이용하여 24시간 천천히 교반시켰다. 그 후, 피펫을 이용하여 상청액을 제거하고, 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 다섯 번 세정하여, 고정화 알룰로스 에피메라제로 하였다. 2차 스크리닝에 있어서의 고정화 알룰로스 에피메라제의 효소활성 측정방법은 다음과 같다. 즉, 50mM인 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M인 알룰로스 용액 2500μl, 50mM인 인산 완충액(pH8.0) 2480μl 및 웨이스트(waste) (KimWipes)로 불필요한 수분을 제거한 고정화 알룰로스 에피메라제 20mg을 10ml인 나사 캡이 부착된 시험관에 투입하여, 온수욕에 가로로 눕혀서 두고, 50℃로 15분 동안 진탕반응을 시켰다. 5질량%인 염산 수용액을 첨가하여 pH3.0 ~ 2.5로 조정하여 효소를 불활성화시키고, 이온 교환수지에 의한 탈염, 필터 여과한 다음, HPLC(분석 칼럼 : MCIGEL CK08EC Mitsubishi Chemical 사제(社製))분석하고, 생성된 프럭토스와 알룰로스의 총 피크 면적에 대한 프럭토스의 피크 면적비로부터, 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/ml-R)을 구하였다.
얻어진 결과를 표 3에 나타낸다. 그 결과, 놀랍게도, 부하 효소 단위수를 늘린 경우는, 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성이 상승되는 것이 인정되었다. 그리고, 가장 비활성이 높은 고정화 알룰로스 에피메라제를 주는 이온 교환수지는 표 1의 No. 1에 나타낸 이온 교환수지(Oragano사제(社製)인 앰버라이트 FPA95)인 것도 밝혀졌다.
[표 3]
Figure pct00003
더욱이, 표 1의 No. 1에 나타낸 이온 교환수지(Oragano 사제(社製)인 앰버라이트 FPA95)를 이용하고, 고정화에 제공되는 알룰로스 에피메라제의 부하 효소 단위를 바꾸고, 알룰로스 에피메라제의 고정화를 행하였다. 구체적으로는, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 표 1에 나타낸 No. 1 또는 3의 이온 교환수지 1ml와, 상기 비활성 93.8U/mg인 알룰로스 에피메라제 540U, 630U, 900U, 1350U 또는 1800U를 포함하는 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)을 혼합하여, 20℃로 설정한 체임버 내에서 트위스트 믹서를 이용하여 24시간 천천히 교반하였다. 그 후, 피펫을 이용하여 상청액을 제거하고, 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 다섯 번 세정하여, 고정화 알룰로스 에피메라제를 조제하며, 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/ml-R)과 고정화 후에 잔존하는 효소액의 활성(U/ml)을 측정하였다. 구체적으로는, 50mM인 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M인 알룰로스 용액 2500μl, 50mM인 인산 완충액(pH8.0) 2480μl 및 웨이스트(waste) (KimWipes)로 불필요한 수분을 제거한 고정화 알룰로스 에피메라제 20mg을 10ml인 나사 캡이 부착된 시험관에 투입하여, 온수욕에 가로로 눕혀서 두고, 50℃로 15분 동안 진탕 반응시켰다. 5질량%인 염산 수용액을 첨가하여 pH3.0 ~ 2.5로 조정하여 효소를 불활성화시키고, 이온 교환수지에 의한 탈염, 필터 여과한 후, HPLC(분석 칼럼 : MCIGEL CK08EC Mitsubishi Chemical 사제(社製))분석하여, 생성된 프럭토스와 알룰로스의 총 피크 면적에 대한 프럭토스의 피크 면적비로부터, 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성(U/ml-R)을 구하였다. 또한, 2mM인 황산 마그네슘을 포함하는 50mM인 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M인 알룰로스 용액 2500μl, 2mM인 황산 마그네슘을 포함하는 50mM인 인산 완충액(pH8.0) 2167μl 및 잔존 효소액 333μl를 나사 캡이 부착된 시험관에 투입하여, 온수욕에 담그고 50℃로 15분 동안 반응시킨다. 5질량%인 염산 수용액을 첨가하여 pH2.5 ~ 3.0로 조정하여 효소를 불활성화시키고, 이온 교환수지에 의한 탈염, 필터 여과한 후, HPLC 분석한다. 생성된 프럭토스의 피크 면적비를 이용하여 잔존하는 효소 활성(U/ml)을 구하였다.
얻어진 결과를 표 4에 나타낸다. 이 결과, 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R 범위 내이면, 비활성이 높은 고정화 알룰로스 에피메라제를 효율적으로 제조할 수 있는 것을 알게 되었다.
[표 4]
Figure pct00004
4. 다른 미생물 유래 알룰로스 에피메라제의 고정화
표 1의 No. 1 및 3의 이온 교환수지에 대하여, 다른 미생물 유래 알룰로스 에피메라제의 흡착 고정화 용량을 동일하게 평가하였다.
다른 미생물 유래 알룰로스 에피메라제는, Clostridium Cellulolyticum H10 주(株) 유래 알룰로스 에피메라제를 사용하였다. 즉, Lifetechnologies사에서 합성한 당해 알룰로스 에피메라제 유전자를 pQE 벡터(QIAGEN사)에 편입시키고, 그것을 대장균 M15(QIAGEN사)에 도입하여 발현시키고, 얻어진 균체 16g을 80ml인 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)로 현탁하여, 초음파 처리 및 원심분리에 의하여 추출 및 정제하였다. 얻어진 알룰로스 에피메라제의 비활성은 156U/mg이었다.
2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 표 1의 No. 1 및 3의 이온 교환수지 1ml와 630U인 알룰로스 에피메라제(단백질량으로 6.7mg)를 포함하는 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)을 혼합하여, 20℃로 설정한 체임버 내에서 트위스트 믹서를 이용하여 24시간 천천히 교반하였다. 다음으로, 피펫을 이용하여 상청액을 제거하고, 10ml인 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 다섯 번 세정하여, 고정화 알룰로스 에피메라제를 얻었다. 2차 스크리닝과 동일한 방법으로 당해 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성을 측정하였다.
얻어진 결과를 표 5에 나타낸다. 이 결과에서, 2차 스크리닝과 동일하게 가장 비활성이 높은 고정화 알룰로스 에피메라제를 주는 이온 교환수지는, 표 1의 No. 1에 나타낸 이온 교환수지(Oragano사제(社製)인 앰버라이트 FPA95)였다.
[표 5]
Figure pct00005
실시예 2(고정화 알룰로스 에피메라제의 제조)
고정화 저활성 알룰로스 에피메라제의 제조(비교예)
고정화 저활성 알룰로스 에피메라제는, 다음 (1) ~ (3)에 나타낸 공정을 거쳐서 조제하였다.
(1) 균체 배양과 균체 회수공정
0.5질량%인 알룰로스를 포함하는 최소 염배지(MSM배지) 4L에 Arthrobacter globiformis M30 주(株)를 식균(植菌)하여, 자 퍼멘터(jar fermenter)를 이용하여 30℃로 24시간, 교반속도 400rpm, 통기량 매분 0.10L/배지L로 배양하였다. 이 배양액으로부터 원심분리에 의하여 균체 100g(습윤중량)을 회수하여, 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정하였다.
(2) 조효소의 추출공정
얻어진 균체100g(습윤중량)을 50mM 인산 완충액(pH8.0) 1000ml에 현탁하여, 거기에 10g 난백 라이소자임(심품 첨가물, Kewpie 사제(社製)) 및 5g 염화 나트륨을 가하고, 37℃로 120분 동안 가열하는 것에 의하여, 효소 추출 반응을 행하였다. 그 후, 55℃로 15분 동안 더 가열을 행하여, 원심분리(12000rpm, 30분)에 의하여 얻어지는 상청액을 조효소액으로 하였다. 조효소액에 포함되는 총 단백질 1mg 당 알룰로스 에피메라제의 비활성은 4.9U/mg이었다.
(3) 알룰로스 에피메라제의 고정화
습윤상태인 이온 교환수지(표 1 No. 4에 나타낸 이온 교환수지, Purolite 사제(社製), 상품명 : PUROLITE A103S) 50ml를 칼럼에 충전하고, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 후, 상기에서 조제한 알룰로스 에피메라제를 4500U(단백질량으로 918mg) 포함하는 500ml인 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH8.0)을, 4℃로 16시간, 순환시키면서 이온 교환수지로 통액하여 효소를 흡착한 후에, 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정하여 고정화 알룰로스 에피메라제를 얻었다. 이 때, 부하된 단백질량은 18.3mg/ml-R이었다. 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성은 56U/ml-R이었다.
2. 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제의 제조
알룰로스 에피메라제는 대장균 발현계를 이용하여 생산된 것을 사용하였다. 즉, Arthrobacter globiformis M30 주(株) 유래인 알룰로스 에피메라제 유전자를 pQE 벡터(QIAGEN사)에 편입시키고, 그것을 대장균 M15 주(株)(QIAGEN사)에 도입하여 발현시키고, 얻어진 균체 16g을 160ml인 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 현탁하고, 초음파 처리 및 원심분리에 의하여 추출 및 정제하여, 알룰로스 에피메라제액을 얻었다. 얻어진 알룰로스 에피메라제액에 포함되는 총 단백질 1mg 당 알룰로스 에피메라제의 비활성은 51.9U/mg이었다.
습윤상태인 이온 교환수지(표 1의 No. 1에 나타낸 이온 교환수지, Oragano 사제(社製), 상품명 : 앰버라이트 FPA95) 50ml를 칼럼에 충전하여, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 후, 상기에서 조제한 알룰로스 에피메라제를 13500U(단백질량으로 260mg), 22500U(단백질량으로 433mg) 또는 31500U(단백질량으로 607mg) 포함하는 500ml인 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH8.0)을, 4℃로 16시간, 순환하면서 이온 교환수지에 부하하여 효소를 흡착시킨 후에, 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정하여 고정화 알룰로스 에피메라제를 얻었다. 얻어진 고정화 알룰로스 에피메라제의 비활성은 각각, 160U/ml-R, 203U/ml-R, 243U/ml-R이었다.
실시예 3(고정화 알룰로스 에피메라제의 연속사용)
실시예 2에서 얻어진 고정화 저활성 알룰로스 에피메라제(56U/ml-R) 및 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제(160U/ml-R, 203U/ml-R, 243U/ml-R)를 이용하여 각각 연속 효소 반응을 실시하여, 효소 반응의 반감기를 평가하였다.
재킷이 부착된 유리제 칼럼(내경 20mm, 길이 400mm)에 56U/ml-R인 고정화 저활성 알룰로스 에피메라제를 80ml, 160U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제를 28ml, 203U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제를 22ml, 및 243U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제를 18.5ml 각각 충전하였다. 또한, 별도, 2mM이 되도록 황산 마그네슘을 첨가하여, 탄산 나트륨을 더 첨가하고 pH7.8 ~ 8.0로 조정한 35질량%인 프럭토스 용액을 준비하였다. 상기 칼럼으로 프럭토스 용액을, 재킷 온도 55℃로, 상향류(上向流)로 연속적으로 합계 4320시간 통액하였다. 고정화된 알룰로스 에피메라제량(1U) 당 0.007g/h인 프럭토스가 접촉하도록, 고정화 저활성 알룰로스 에피메라제인 경우는 공간속도를 SV=1로, 160U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제인 경우는 공간속도를 SV=3으로, 203U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제인 경우는 공간속도를 SV=3.6로, 243U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제인 경우는 공간속도를 SV=4.3으로 각각 설정하여 통액하였다. 유출액을 24시간 마다 한 번 채취하고, 채취한 각각 액의 일부를, 이온 교환수지에 의한 탈염 및 필터 여과를 행한 후, HPLC(분석 칼럼 : MCIGEL CK08EC Mitsubishi Chemical사제(社製)) 분석에 제공하여, 프럭토스 및 알룰로스의 피크 면적에 차지하는 알룰로스의 면적을 구하고, 변환율로 하였다. 변환율을 시간 경과적으로 구성하여 근사직선을 구하고, 그 근사직선으로부터 시험 개시 1일 후의 변환효율의 반이 되는 일수를 구하고 반감기로 하여 산출하였다.
얻은 결과를 도 1에 나타낸다. 그 결과, 의외로, 56U/ml-R인 고정화 저활성 알룰로스 에피메라제의 반감기가 144일인 것에 비해, 160U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제의 반감기는 154일, 203U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제의 반감기는 207일, 243U/ml-R인 고정화 고활성 알룰로스 에피메라제의 반감기는 237일이었다. 즉, 비활성이 높은 고정화 알룰로스 에피메라제는 반감기가 길어지고, 내구성이 우수하며, 보다 연속반응에 적합하다는 것이 밝혀졌다.

Claims (4)

  1. 비활성이 50U/mg 이상인 알룰로스 에피메라제를 포함하는 효소액이, 부하 단백질 총량이 1.3 ~ 15mg/ml-R이 되도록 스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환수지와 접촉시키는 공정을 포함하는 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지 또는 스티렌계 겔형 약염기성 음이온 교환의 이온 교환기가 3급 아민인 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    스티렌계 다공질형 약염기성 음이온 교환수지의 이온 교환기가 -N(CH3)2인 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이온 교환수지와 접촉시키는 상기 효소액의 알룰로스 에피메라제 단위수가 이온 교환수지 1ml 당 270U 이상인 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법.
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