KR100527437B1 - β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 생산하는 방법 및 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 당단백질 또는 당지질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1) β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 및 히스티딘 태그가 포함된 발현벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 ompT 결핍 대장균에 형질전환하는 단계; 3) 상기 형질전환체를 배양하고 단백질 발현을 유도하는 단계; 및 4) 상기 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 생산 방법 및 상기에서 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민(Galactose-β1,4-N-acetylglucosamine) 구조를 갖는 당단백질 또는 당지질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생산방법에 의해 제조된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 ompT 결핍 숙주세포를 이용하고 저온에서 배양하여 단백질이 분해되지 않고 완전한 형태의 수용성 단백질로 발현되고, 최적 조건에서 효소반응을 수행함으로써 당단백질 및 당지질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대량 생산하는 방법 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 당단백질 및 당지질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정 프로테아제를 발현하지 않는 대장균을 숙주세포로 사용하고 저온에서 배양하여 수용성의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대량 생산하는 방법 및 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 당단백질 및 당지질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
탄수화물은 세포의 인식, 세포 부착, 증식 및 분화를 포함한 세포기능에서 중요한 역할을 한다(Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-130). 탄수화물의 화학적 합성은 비효율적이고 노동력이 많이 드는 공정이다(Ichikawa et al., 1992, Anal. Biochem. 202:215-238). 따라서 올리고사카라이드의 위치 및 입체특이적 합성을 위하여 효소를 촉매로 사용하여 탄수화물을 합성한다(Ichikawa et al., 1992, Anal. Biochem. 202:215-238: Gijsen et al., 1996, Chem. Rev. 96:443-473). 따라서, 탄수화물 합성을 위한 효소 중 하나인 글리코실트랜스퍼라제(Glycosyltransferase)를 대량생산하는 것은 의약분야 산업에서 매우 중요한 기술이다(Karlsson, 1991, Trends Pharmacol. Sci. 12:265-272).
β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(β-1,4-galactosyltransferase; EC 2.4.1.22)는 β-연결(β-linkage)을 갖는 당단백질(glycoproteins) 및 당지질에서 UDP-α-D-갈락토스의 갈락토스를 말단 N-아세틸글루코스아민으로 전달하는 역할을 한다(Ram and Munja, 1995, Crit. Rev. Biochem. 17:257-311). β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 암호화하는 cDNA는 인간(Appert et al., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 139:163-168; Masri et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657-663), 소(Narimatsu et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4720-4724; D'Agostaro et al., 1989, Eur. J. Biochem. 183:211-217) 및 쥐(Nakazawa et al., 1988, J. Biochem. 104:165-168; Shaper et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:10420-10428)로부터 분리되었다. 또한, 상기 포유류 갈락토실트랜스퍼라제를 고등진핵세포(Nguyen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:28000-28009; Borsig et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240:586-589), 효모(Kleene et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 201:160-167; Borsig et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240:586-589) 및 대장균(Chatterjee, 1991, Int. J. Biochem. 23:695-702; Nakazawa et al., 1993, J. Biochem. 113:747-753)에서 발현시켰다. 그러나 대장균 및 효모에서 발현시켰을 때 재조합 포유류 갈락토실트랜스퍼라제는 발현되는 양이 매우 적고, 효소 활성을 나타내지 않았다(Chatterjee, 1991, Int. J. Biochem. 23:695-702; Nakazawa et al., 1993, J. Biochem. 113:747-753; Borsig et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240:586-589). 또한, 고등진핵세포에서 발현시키는 것은 비용이 많이 들기 때문에 실용적이지 않다(Nguyen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:28000-28009; Borsig et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240:586-589).
상기와 같은 문제점을 극복하고 재조합 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대량 생산하기 위하여, 나이제리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 및 나이제리아 고노래아(Neisseria gonorrhoeae) 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 클로닝하고 이를 대장균에서 발현시켰다.
리포올리고사카라이드(LOS) 생합성에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 N. 메닝지티디스 406Y 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 보고되었고, 이는 혈청그룹(serogroup) L에 속한다(Jennings et al., 1995, Mol. Microbiol. 18:729-740). N. 메닝지티디스에서 3개의 유전자(lgtA, lgtB 및 lgtE)로 이루어진 하나의 유전자좌(locus)는 락토-N-네오테트라오스 체인(lacto-N-neotetraose chain)에서 적어도 3개의 당(sugars)을 첨가하기 위하여 필요한 글리코실트랜스퍼라제 효소를 암호화한다. 상기 유전자 중에서 박테리아 병원균 N. 메닝지티디스 406Y에서 유래한 lgtB 유전자는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 암호화하는 것으로 알려져 있다(Wakarchuk et al., 1998, Protein Engineeering, 11:295-302). N. 메닝지티디스 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza; High et al., 1993, Mol. Microbiol. 9:1272-1282), 해모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi; Sun et al., 2000, J. Bacteriol. 182:2292-2298), 해모필러스 솜너스(Haemophilus sommnus; GenBank accession no. AF096997) 및 파트렐라 해모리티카(Pateurella haemolytica; Potter and Lo, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 129:75-81) 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 상동성이 있다. 상기 박테리아 효소들은 리포올리고사카라이드의 생합성에 관여한다.
N. 메닝지티디스(ATCC 13102)는 혈청그룹 C로 분류되고, 이는 유행성 수막염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, N. 메닝지티디스 406Y(혈청그룹 L)와는 다른 것으로 보고되었다(Wakarchuk et al., 1998, Protein Engineering, 11:295-302).
현재까지 N. 메닝지티디스 406Y에서 유래한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 생산에 대한 보고가 일부 있으나, 다른 혈청그룹의 N. 메닝지티디스 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 생산에 대한 보고가 없고, 완전한 효소 활성을 나타내는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대량으로 생산하는 방법에 대한 보고도 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 클로닝하여 발현벡터 및 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체로부터 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대량 생산하는 방법을 개발하고, 상기에서 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 최적 활성을 나타내기 위한 최적 조건을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 생산하는 방법 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 높은 활성을 나타내기 위한 최적 조건을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에서 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민(Galactose-β1,4-N-acetylglucosamine) 구조를 갖는 당단백질 또는 당지질을 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 생산하는 방법은,
1) β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 및 히스티딘 태그가 포함된 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터로 ompT 결핍 대장균을 형질전환시키는 단계;
3) 상기 형질전환체를 배양하고 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 발현을 유도하는 단계; 및
4) 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 나이제리아 메닝지티디스(ATCC 13102) 또는 나이제리아 고노래아(ATCC 31151)에서 분리한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 사용하였고, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 1에서 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하는 벡터는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그를 첨가하여 단백질 발현 후 정제를 용이하게 하였다.
또한, 본 발명에 사용하는 발현벡터 및 숙주세포는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 본 발명에서는 프로모터로 T7 프로모터를 사용하였고, T7 RNA 폴리머라제를 갖고 있지 않은 대장균을 숙주세포로 사용하였다. 본 발명에서는 프로모터로 T7lac 프로모터를 사용하였으며, IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pET28a(Novagen 사)를 발현벡터로 사용하였다.
본 발명의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 ompT 프로테아제가 존재하는 숙주세포에서 발현시킨 후 정제하는 경우에는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 C-말단 일부가 절단되어 효소활성을 잃게 된다(도 2의 A 참조). 이는 갈락토실트랜스퍼라제의 C-말단 서열에서 염기성 아미노산 잔기 짝의 클러스터링이 ompT 프로테아제 절단 위치를 생산하기 때문이다(Wakarchuk et al., 1998, Protein Engineering, 11:295-302). 따라서 상기 단계 2에서 숙주세포로 ompT 결핍 대장균을 사용하여 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 발현시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서 ompT 결핍 대장균은 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 ompT 결핍 균주인 대장균 BL21(DE3)(Novagen 사)를 숙주세포로 사용하였다.
상기 단계 3에서 형질전환체는 저온에서 배양하여 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 생산한다. 상기 형질전환체를 37℃에서 배양하는 경우에는 저온에서 배양하는 경우보다 단백질 총생산량은 다소 높으나 발현된 단백질의 대부분이 불용성으로 발현된다(도 1의 A 참조). 그러나 상기 형질전환체를 37℃ 보다 낮은 25℃에서 배양하는 경우에는 일부분만이 불용성으로 발현되고, 대부분은 수용성 상태로 발현되게 된다(도 1의 B 참조). 따라서, 본 발명에서 형질전환체를 배양하고 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 발현을 유도하는 것은 22℃ 내지 37℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 24 내지 30℃에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 단계 4의 정제는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 N-말단 또는 C-말단에 부가된 히스티딘 태그의 금속이온과 결합하는 능력을 이용하여 용이하게 정제할 수 있다. 구체적으로 히스티딘 결합 레진을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수용하여 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 정제한다. 히스티딘 결합 레진은 히스티딘이 Ni 금속에 결합하는 원리를 이용한 모든 레진을 사용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Ni-NTA 레진을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 정제하였다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소 활성을 분석한 결과, 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민 구조를 갖는 당단백질 또는 당지질을 제조하는 정상적인 효소 활성을 갖는 것으로 확인되었다(도 3 참조).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민 구조를 갖는 당단백질 또는 당지질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 N-복합당질을 갖는 재조합 당단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 최적 활성을 나타내기 위하여 pH 5 내지 pH 8에서 반응시키는 것이 바람직하며, pH 6.5 내지 pH 7.0에서 반응시키는 것이 더욱 바람직하다(도 4 참조).
또한, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 활성을 위하여 2가 금속이온을 첨가할 수 있는데, 본 발명에서는 Mn2+, Mg2+또는 Ca2+를 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하고, Mn2+를 첨가하여 반응시키는 것이 더욱 바람직하다(도 5 참조). 반응액에 첨가하는 2가 금속이온의 농도는 5 내지 20 mM을 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하며, 10 mM을 첨가하여 반응시키는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 나이제리아 메닝지티디스(ATCC 13102)의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제인 경우에는 Mn2+, Mg2+ 또는 Ca2+ 대신에 Fe2+를 첨가하여 반응시킬 수 있다.
또한, Mn2+가 존재할 때 다른 2가 이온의 영향을 알아보면, Mn2+ 이온의 존재하에서 Ni2+는 부분적으로 N. 메닝지티디스 및 N. 고노래아의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 촉진하지만, Cu2+ 및 Zn2+ 이온은 Mn2+ 이온 존재하에서 갈락토실트랜스퍼라제의 활성을 완전히 저해하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명에서 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 최적 활성을 나타내기 위하여 비이온성 계면활성제를 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하다. 비이온성 계면활성제로는 트리톤 X-100, NP-40 및 옥틸-굴루코사이드 등 여러 종류의 계면활성제를 사용할 수 있으며, 트리톤 X-100를 첨가하는 것이 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비이온성 계면활성제로 트리톤 X-100을 0.5%-2% 수준에서 첨가하였을 때 갈락토실트랜스퍼라제 활성이 약 1.5배 증가하였다(도 8 참조). 일반적으로, 대부분의 진핵생물 및 원핵생물 유래의 갈락토실트랜스퍼라제는 막에 결합되어 있고 계면활성제-용해로 정제된다. 비이온성 계면활성제는 활성형 단백질 구조를 안정화시키고, 효소 및 기질 사이의 상호작용을 증가시킨다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 클로닝 및 발현
본 발명자들은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자(lgtB)를 클로닝하기 위하여 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)(ATCC 13102) 및 N. 고노래아(N. gonorrhoeae)(ATCC 31151)의 게놈 DNA를 사용하였다.
구체적으로, 상기 N. 메닝지티디스(ATCC 13102) 및 N. 고노래아(ATCC 31151)를 콜롬비아 혈액 아가 플레이트(Columbia blood agar plate)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 18시간 동안 배양하였다. β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 증폭하기 위하여, 상기 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였고, Pfu DNA 폴리머라제(Stratagen, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 두 미생물의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 증폭하기 위하여 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머를 사용하였고, 상기 프라이머는 제한효소 절단부위 서열이 포함되도록 제작하였다. PCR 반응 용액은 10X pfu 반응 버퍼(200 mM Tris-Cl, pH 8.0, 20 mM MgCl2, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2
SO4, Triton X-100, 100 ㎍/㎖ nuclease-free BSA(Stratagen, USA) 10 ㎕, Pfu polymerase 1 ㎕(2.5 units), 주형 게놈 DNA 1 ㎍ 및 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머 각각 50 pmoles을 포함하며, 전체 반응 부피는 100 ㎕이다. PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 게놈 DNA를 변성시킨 후, 1) 94℃ 50초, 2) 55℃ 50초 및 3) 72℃에서 2분의 사이클을 30회 반복수행하였다. 30 사이클 후에 72℃에서 10분간 연장 반응을 수행하여 PCR을 종결하였다. 상기와 같은 방법으로 증폭된 0.73 kb의 PCR 산물을 BamHI 및 KpnI으로 절단하고, 이를 pQE30(QIAGEN, Valencia, USA)의 BamHI/KpnI 위치에 삽입하여 이를 "pQgal4M"(N. 메닝지티디스 유래의 lgtB 유전자) 및 "pQgal4G"(N. 고노래아 유래의 lgtB 유전자)라 명명하였다. pQgal4M는 N. 메닝지티디스 유래의 서열번호 1로 기재되는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하고, pQgal4G는 서열번호 2로 기재되는 N. 고노래아 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 발현한다.
상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 벡터를 대장균 M15(QIAGEN, Valencia, USA)에 형질전환시켰다. 상기 pQal4M을 포함하는 대장균 M15 세포를 37℃에서 4시간 또는 25℃에서 8시간 발현 유도하였다. 상기 세포배양액을 원심분리한 후 용해 버퍼(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1 mM PMSF)에서 재현탁하였다. 상기 세포를 마이크로팁을 가지고 차가운 곳에서 50% 전력으로 20초 간격으로 5번 초음파 처리 후, 원심분리에 의해 수용성 및 불용성 분획을 분리하였다. 0.1 ㎖의 세포 배양액으로부터 전체 세포 용해물 및 수용성 및 불용성 분획을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다. 밴드는 마니아티스 등(Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambroch, J. 1982, In Molecular Cloning, pp. 1-188, Cold Spring Harbor, New York)의 방법에 따라 쿠마지 블루(Coomassie blue) 염색으로 시각화하였다.
그 결과, IPTG로 발현을 유도하였을 때 주요 밴드는 33 kDa에서 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 발현되는 것으로 나타났다(도 1). 37℃에서 세포 배양한 경우 대부분의 갈락토실트랜스퍼라제는 불용성으로 발현되고, 매우 적은 양만이 수용성 단백질로 발현되었다(도 1의 A). 그러나, 세포배양 온도를 37℃에서 25℃로 낮춘 경우에 전체 단백질 생산량은 감소하였지만, 갈락토실트랜스퍼라제는 일부만 불용성으로 발현되고 대부분은 수용성 단백질로 발현되었다(도 1의 B).
<실시예 2> β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 발현 및 정제
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 배양한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 포함된 세포로부터 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 정제하였다. β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다(Koh et al., 2001, J. Biochem. Mol. Biol. 34:559-565). 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 25℃, 쉐이킹 플라스크에서 100 ㎖ 부피로 배양하였다. 상기 배양액의 A600이 0.5가 될 때 0.5 mM IPTG로 유도하였다. 8시간 유도 후 세포를 수집하여 원심분리하고, 30 ㎖ 용해버퍼로 재현탁하였다. 세포를 마이크로팁을 가지고 차가운 곳에서 50% 전력으로 1분 간격으로 10번 초음파 처리 후, 세포 용해물을 75,000 x g로 10분 동안 원심분리하였다. 침전물은 10 ㎖ 용해버퍼로 다시 추출하였다. 상기 상등액을 합쳐서 5 ㎖ Ni-NTA 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 용해버퍼로 세척한 후, 단백질은 용출 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, 1 mM PMSF)로 용출하였다. 용출분획은 저장 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM NaCl, 20% 글리세롤)로 투석하였다. 컬럼 분획은 12% SDS-PAGE에 의해 각각의 정제 단계에서 확인하였다.
그 결과, 발현된 단백질은 분해되지 않은 완전한 갈락토실트랜스퍼라제로 나타났다(도 1). 그러나 완전한 갈락토실트랜스퍼라제는 대장균 M15 균주로부터 갈락토실트랜스퍼라제를 정제하는 단계에서 29.5 kDa 및 28 kDa의 두 개의 주요 산물로 절단된다(도 2의 A). 갈락토실트랜스퍼라제의 C-말단 서열에서 염기성 아미노산 잔기의 클러스터링이 ompT 프로테아제 절단 위치를 생산하는 것으로 이전에 보고되었는데(Wakarchuk et al., 1998, Protein Engineering, 11:295-302), 상기와 같이 두 개의 산물로 절단된 것은 ompT 프로테아제에 의한 것이다. 갈락토실트랜스퍼라제에서 단백질 분해 절단의 위치 확인은 ompT가 상기에서 관찰된 분해를 담당하는 것을 보여준다.
<실시예 3> ompT 결핍 균주를 사용한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 발현 및 정제
본 발명자들은 상기 실시예 2의 ompT 프로테아제에 의한 단백질 분해 문제를 해결하기 위하여, ompT 결핍 균주인 대장균 BL21(DE3)을 숙주 세포로 사용하여 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 발현시켰다. 상기와 같은 목적을 위하여 상기 실시예 1에서 클로닝한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 T7 박테리오파지 프로모터를 포함하는 발현벡터 pET28a(Novagen, Darmstadt, Germany)에 옮겨서 클로닝하였다.
구체적으로 상기 실시예 1에서 제조한 pQgal4M 및 pQgal4G의 BamHI-SalI 절편을 포함하는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 pET28a의 BamHI-SalI 위치에 삽입시켰고, 그 결과 제조된 발현벡터를 "pETgal4M"(N. 메닝지티디스 유래의 lgtB 유전자) 및 "pETgal4G"(N. 고노래아 유래의 lgtB 유전자)라 명명하였다.
상기에서 제조한 발현벡터는 ompT 결핍 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조하였다. 플라스미드의 정제, 아가로스의 전기영동 및 세포 형질전환은 마니아티스 등(Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambroch, J. 1982, In Molecular Cloning, pp. 1-188, Cold Spring Harbor, New York)의 방법에 따라 수행하였다.
그 결과, pETgal4M을 포함하는 대장균 BL21(DE3)의 단백질 정제 단계에서 갈락토실트랜스퍼라제의 절단된 형태는 거의 나타나지 않았다(도 2의 B). 이는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 ompT 결핍 대장균에서 발현시켜 단백질을 생산함으로써 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 분해를 방지할 수 있음을 나타낸다.
<실시예 4> β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 정제한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소활성을 분석하였다. 갈락토실트랜스퍼라제 효소활성 분석은 김등(Kim et al., 1997, J. Biochem. Mol. Biol. 30:95-100)이 보고한 방법을 변형하여 수행하였다. 구체적으로, 정제된 단백질의 효소 활성은 에펜도르프 튜브에 있는 20 mM MOPS(pH 7.85), 10 mM MnCl2, 10 mM ATP, 20 mM N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 및 이미 건조된 5X10 cpm [3H]UDP-α-D-갈락토스(UDP-Gal)이 포함된 30 ㎕ 반응액에 의해 시험관 내에서 측정하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응 후, 1 ㎖ 증류수를 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응 혼합물은 5% 소듐 보레이트로 미리 평형화시킨 1 ㎖ 다우엑스(Dowex, AG1-X8) 피펫 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 상기와 동일한 용액 1 ㎖로 5회 세척한 후, 각각의 분획에서 트리튬-표지된 갈락토스 β1-4 N-아세틸글루코스아민(Galβ1-4GlcNAc)을 리퀴드 신틸레이션 카운터로 정량하였다. 반응산물 이당류(Galβ1-4GlcNAc)를 확인하기 위하여, 반응 혼합물은 5% 소듐 보레이트로 미리 평형화시킨 바이오-젤 P-4 컬럼(Bio-Gel P-4 column; 1.5X100 ㎝)에 로딩하였다. 이당류에서 삽입된 트리튬-표지된 갈락토스를 리퀴드 신틸레이션 카운터(Beckman liquid scintillation counter LS6500)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 반응 산물 이당류(분획 85-90)는 자유 갈락토스(분획 95-100)로부터 분리되어, 상기에서 제조한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 정상적인 효소활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
<실시예 5> pH에 따른 효소활성 분석
본 발명자들은 pH가 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소활성에 미치는 영향을 알아보았다. 구체적으로 pH 4 내지 pH 9에서 상기 실시예 3에서 정제한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소 활성을 측정하였다. pH 4 내지 pH 6에서는 아세트산 버퍼를 사용하였고, pH 6.5 내지 pH 9에서는 MOPS 버퍼를 사용하였다. 효소 활성 측정은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 재조합 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 넓은 pH 범위에서 활성을 나타내었고, pH 5 내지 pH 7.5에서 효소 활성이 높았다(도 4). 이는 적정 pH가 약 7.2인 랫트 뇌 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(Nomura et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:13570-13577)와 효소 활성을 위한 pH 범위가 유사한 것으로 나타났다.
<실시예 6> 금속이온에 의한 효소활성 분석
본 발명자들은 2가 금속이온에 의해 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 어떤 영향을 받는지 알아보았다. 구체적으로, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Zn2+, Nn2+, Mg2+ 또는 Ca2+를 10 mM 농도로 효소 반응액에 첨가하였을 때 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성 측정은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, N. 메닝지티디스 및 N. 고노래아 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 둘 다 Mn2+가 보조인자로 필요한 것으로 나타났다(도 5). Mg2+ 및 Ca
2+ 이온은 어느 정도까지 효소 활성을 활성화시켰다. N. 메닝기티디스 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 반응에서 보조인자로 Mn2+를 Fe2+로 대체하여도 유사한 활성을 나타낼 수 있었으나, N. 고노래아 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 반응에서는 이를 대체하는 경우에는 효소 활성을 나타내지 않았다. 반면, Ni2+, Zn2+ 및 Cu2+ 이온은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 활성화시키지 못하였다. 랫트 뇌 유래 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 경우에는 Mn2+가 활성을 위해 필수적이다. 또한, Mg2+ 및 Ca2+는 부분적으로 갈락토실트랜스퍼라제를 활성화시킨다. 그러나, Fe2+ 및 Ni2+
는 갈락토실트랜스퍼라제를 활성화시키지 못한다(Nomura et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:13570-13577). 또한 N. 메닝기티디스 유래 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 암호화하는 lgtA 유전자는 Mn2+가 반드시 필요하고, Mg2+, Fe2+ 및 Ca2+ 이온은 덜 효과적이다(Blixt, O. et al., 1999, Glycobiology. 1999 Oct;9(10):1061-71). 상기 결과로부터 원핵세포 및 진핵세포 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 모두 Mn2+ 이온을 보조인자로 필요로 한다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명자들은 갈락토실트랜스퍼라제 반응에서 Mn2+ 이온이 존재할 때 다른 2가 양이온의 영향을 알아보았다.
그 결과 도 6에서 보는 바와 같이, Ni2+ 이온 존재하에서 Mn2+는 부분적으로 N. 메닝기티디스 및 N. 고노래아의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 촉진하였다. 반면 Cu2+ 및 Zn2+ 이온은 Mn2+ 이온 존재하에서 갈락토실트랜스퍼라제의 활성을 완전히 저해하였다.
<실시예 7> NaCl 농도에 따른 효소활성 분석
본 발명자들은 NaCl 농도에 의해 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 어떤 영향을 받는지 알아보았다. 구체적으로 NaCl을 여러 가지 농도(0-1,000 mM)로 사용하였을 때 N. 메닝기티디스 및 N. 고노래아 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 분석하였다. 효소 활성은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 여러 가지 농도의 NaCl에서 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 유사한 효소 활성을 나타내었다(도 7). 상기와 같은 결과로부터 갈락토실트랜스퍼라제의 활성은 NaCl 염 농도에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있다.
<실시예 8> 비이온성 계면활성제에 의한 효소활성 분석
본 발명자들은 비이온성 계면활성제에 의한 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 효소활성을 분석하였다. 구체적으로, 비이온성 계면활성제 트리톤(Triton) X-100을 0% 내지 5% 첨가하여 반응시켰을 때 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성 측정은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, 비이온성 계면활성제(트리톤 X-100)를 첨가하여 반응시킨 활성은 이를 넣지 않고 반응시킨 갈락토실트랜스퍼라제의 활성보다 약 1.5배 증가하였다.
일반적으로, 대부분의 진핵생물 및 원핵생물 유래의 갈락토실트랜스퍼라제는 막에 결합되어 있고, 계면활성제-용해로 정제된다. 막으로부터 효소의 용해는 활성을 촉진시키고, 기질 및 수용체의 접근성을 증가시킨다. 수용성 포유류 β1,4 갈락토실트랜스퍼라제는 트리톤 X-100과 같은 비이온성 계면활성제에 의해 활성화된다(Krezdorn, C. H. et al., 1993, Eur. J. Biochem.
212, 113-120; Oubihi et al., 2000, Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:785-792). 비이온성 계면활성제는 활성형 단백질 구조를 안정화시키고, 효소 및 기질 사이의 상호작용을 증가시키므로, 이를 첨가한 경우에 효소활성이 증가하는 것을 알 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 생산방법은 ompT 결핍 숙주세포를 이용하고 저온에서 배양하여 단백질이 분해되지 않고 완전한 효소활성을 나타내는 수용성 단백질 형태로 대량 생산할 수 있고, 상기 방법에 의해 제조된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 pH, 금속이온 및 비이온성 계면활성제 등의 반응조건을 최적화하여 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민 구조를 갖는 당단백질 또는 당지질을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 나이제리아 메닝기티디스의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대장균 M15에서 발현시킨 후 원심분리하고, 수용성 상등액(S)과 불용성 침전물(P)을 분리하여 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.
A : 37℃에서 단백질 발현 유도,
B : 25℃에서 단백질 발현 유도,
P : 불용성 침전물, S : 수용성 상등액, M : 마커,
도 2는 나이제리아 메닝지티디스의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 25℃로 발현을 유도하고, NiNTA-컬럼으로 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.
A : ompT 프로테아제가 존재하는 대장균 M15에서 발현,
B : OmpT 프로테아제가 결핍된 대장균 BL21(DE3)에서 발현,
C : 세포 용해물, F : 여과액, W : 세척 분획,
E1-E5 : 용출 분획, M : 마커
도 3은 본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제에 의해 합성된 이당류 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 pH에 따른 효소활성 정도를 나타낸 그래프이다.
●: 나이제리아 메닝지티디스(N. Me),
■: 나이제리아 고노래아(N. Go)
도 5는 본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 2가 금속 이온에 따른 효소활성 정도를 나타낸 그래프이다.
■: 나이제리아 메닝지티디스(N. Me),
□: 나이제리아 고노래아(N. Go)
도 6은 Mn2+ 이온을 다른 2가 금속 이온과 함께 따른 처리하였을 때 본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소활성 정도를 나타낸 그래프이다.
■: 나이제리아 메닝지티디스(N. Me),
□: 나이제리아 고노래아(N. Go)
도 7은 본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 NaCl 농도에 따른 효소활성 정도를 나타낸 그래프이다.
●: 나이제리아 메닝지티디스(N. Me),
■: 나이제리아 고노래아(N. Go)
도 8은 본 발명의 방법에 의해 생산된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 비이온 계면활성제인 트리톤 X-100 농도에 따른 효소활성 정도를 나타낸 그래프이다.
■: 나이제리아 메닝지티디스(N. Me),
□: 나이제리아 고노래아(N. Go)
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Method for producing beta-1,4-galactosyltransferase
<130> 2p-07-02
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 275
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 1
Met Gln Asn His Val Ile Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Arg Arg Ala
11 15 20 25
His Ile Ala Ala Thr Phe Gly Arg His Gly Ile Pro Phe Gln Phe Phe
30 35 40
Asp Ala Leu Met Pro Ser Glu Arg Leu Glu Gln Ala Met Ala Glu Leu
45 50 55
Val Pro Gly Leu Ser Ala His Pro Tyr Leu Ser Gly Val Glu Lys Ala
60 65 70
Cys Phe Met Ser His Ala Val Leu Trp Lys Gln Ala Leu Asp Glu Gly
75 80 85 90
Leu Pro Tyr Ile Ala Val Phe Glu Asp Asp Val Leu Leu Gly Glu Gly
95 100 105
Ala Glu Lys Phe Leu Ala Glu Asp Ala Trp Leu Lys Glu Arg Phe Asp
110 115 120
Pro Asp Thr Ala Phe Ile Val Arg Leu Glu Thr Met Phe Met His Val
125 130 135
Leu Thr Ser Pro Ser Gly Val Ala Asp Tyr Cys Gly Arg Ala Phe Pro
140 145 150
Leu Leu Glu Ser Glu His Trp Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Ile Ser Lys
155 160 165 170
Lys Ala Ile Arg Phe Phe Leu Glu His Phe Val Met Leu Gln Pro Glu
175 180 185
Gln Ile Asn Pro Ile Asp Leu Met Met Phe Ser Asp Phe Phe Asp Arg
190 195 200
Glu Gly Met Pro Val Cys Gln Leu Asn Pro Ala Leu Cys Ala Gln Glu
205 210 215
Leu His Tyr Ala Lys Phe His Asp Gln Asn Ser Ala Leu Gly Ser Leu
220 225 230
Ile Glu His Asp Arg Leu Leu Asn Arg Lys Gln Gln Arg Arg Asp Ser
235 240 245 250
Pro Ala Asn Thr Phe Lys Arg Arg Leu Ile Arg Ala Leu Thr Lys Ile
255 260 265
Ser Arg Glu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Arg Arg Glu Gln Phe Ile Val
270 275 280
Pro Phe Gln
285
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 2
Met Gln Asn His Val Ile Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Arg Arg Ala
12 16 21 26
His Ile Ala Asp Thr Phe Gly Ser Arg Gly Ile Pro Phe Gln Phe Phe
31 36 41
Asp Ala Leu Met Pro Ser Glu Arg Leu Glu Pro Ala Met Ala Glu Leu
46 51 56
Val Pro Gly Leu Ser Ala His Pro Tyr Leu Ser Gly Val Glu Lys Ala
61 66 71
Cys Phe Met Ser His Ala Val Leu Trp Lys Gln Ala Leu Asp Glu Gly
76 81 86 91
Val Pro Tyr Val Ala Val Phe Glu Asp Asp Val Leu Phe Gly Lys Asp
96 101 106
Ala Glu Lys Phe Leu Ala Glu Asp Thr Trp Leu Gln Glu Arg Phe Asp
111 116 121
Pro Asp Ser Ala Phe Val Val Arg Leu Glu Thr Met Phe Met His Val
126 131 136
Leu Thr Ser Pro Ser Gly Leu Ala Asp Tyr Gly Gly Arg Ala Phe Pro
141 146 151
Leu Leu Glu Ser Glu His Cys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Ile Ser Arg
156 161 166 171
Lys Ala Met Arg Phe Phe Leu Asp Arg Phe Ala Val Leu Pro Pro Glu
176 181 186
Arg Leu His Pro Val Asp Leu Met Met Phe Gly Asn Pro Asp Asp Arg
191 196 201
Glu Gly Met Pro Val Cys Gln Leu Asn Pro Ala Leu Cys Ala Gln Glu
206 211 216
Leu His Tyr Ala Lys Phe His Asp Gln Asn Ser Ala Leu Gly Ser Leu
221 226 231
Ile Glu His Asp Arg Arg Leu Asn Arg Lys Gln Gln Arg Arg Asp Ser
236 241 246 251
Pro Ala Asn Thr Phe Lys His Arg Leu Ile Arg Ala Leu Thr Lys Ile
256 261 266
Gly Arg Glu Arg Glu Lys Arg Arg Lys Arg Arg Glu Gln Thr Ile Gly
271 276 281
Lys Ile Ile Val Pro Phe Gln
286
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 3
cgggatccat gcaaaccacg ttatcagc 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
gcggtaccgc aaatacgatg tccatct 27
Claims (9)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 나이제리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 또는 나이제리아 고노래아(Neisseria gonorrhoeae) 유래의 재조합 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 이용하여 갈락토스-β1,4-N-아세틸글루코스아민(Galactose-β1,4-N-acetylglucosamine) 구조를 갖는 당단백질 또는 당지질을 제조하는 방법에 있어서, 비이온성 계면활성제 트리톤 X-100을 첨가하고, Mn2+, Mg2+ 또는 Ca2+ 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 2가 금속이온을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 방법은 pH 6.5 내지 pH 7.0에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 5항에 있어서, 나이제리아 메닝지티디스 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제인 경우에는 상기 2가 금속이온 대신 Fe2+를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
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