KR101221666B1

KR101221666B1 - 효모 표면 발현된 코리네박테리움 디프테리아 유래 트랜스-시알리다아제 및 이를 이용한 시알산 전구체 제조방법

Info

Publication number: KR101221666B1
Application number: KR1020100058265A
Authority: KR
Inventors: 권오석; 김성훈; 강현아; 오두병
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2013-01-14
Also published as: KR20100087060A

Abstract

본 발명은 효모 표면 발현된 박테리아인 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 유래의 트랜스-시알리다아제, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 클로닝된 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 전세포 효소 촉매 반응을 위한 세포 표면 발현된 재조합 트랜스-시알리다아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기의 세포 표면 발현된 트랜스-시알리다아제를 이용하여 시알산이 부가된 올리고당, 당지질, 당단백질 등의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로 효모 표면에 발현된 코리네박테리움 디프테리아 유래의 트랜스-시알리다아제는 코리네박테리움 디프테리아 감염에 의해 유발 되는 질병의 예방 또는 치료용 조성물 제작에 사용될 수 있다.

Description

효모 표면 발현된 코리네박테리움 디프테리아 유래 트랜스-시알리다아제 및 이를 이용한 시알산 전구체 제조방법 {Yeast surface displayed Corynebacterium diphtheriae trans-sialidase and its use for the production of sialic acid derivatives}

본 발명은 박테리아인 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 유래의 트랜스-시알리다아제, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 클로닝된 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 트랜스-시알리다아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 트랜스-시알리다아제를 이용하여 시알산 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

시알산(sialic acid)은 당전구체 구성의 필수 성분으로 지금까지 자연계에서 약 50여종의 시알산이 부가된 당쇄 전구체들이 발견되었다. 시알산은 포유류에 있어서 세포간 상호작용, 세포 내의 시그널을 결정하는 전구체의 역할, 당단백질의 안정화 등 세포 내의 생물학적 현상에 중요한 역할을 한다. 특히, 생체 내의 시알산은 병원체 감염시 최초 인지되는 당쇄 중의 하나로 알려져 있으며(Sasisekharan and Myette, Am. Sci. 91:432-441(2003); Vimr and Lichtensteiger, Trends Microbiol. 10:254-257(2002)), 세포표면에 존재하는 시알산은 병원 미생물 자체에서도 면역 회피 반응이나 세포 보호를 위한 캡슐 형태의 다당성 올리고당을 구성하는 성분으로 알려져 있다(Vimr et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68:132-153(2004)). 병원성 미생물 중 자체적으로 시알산을 합성하는 경우 세포 내에서 시알산 대사회로를 통해 합성되거나, 세포 외부의 시알산을 세포표면에 존재하는 시알산 트랜스포터(transporter)를 통해 세포 내로 이동시킨 후 시알산 대사 경로를 통해 시알산을 합성한다(Vimr and Lichtensteiger, Trends Microbiol. 10:254-257(2002)). 그러나, 그렇지 않은 경우에는 세포 표면의 시알산 전이효소인 트랜스-시알리다아제(trans-sialidase)에 의해 숙주나 세포 외부의 시알산 당쇄 전구체로부터 시알산을 절단해서 자신의 세포표면의 당쇄에 시알산을 부가한다고 알려져 있다(Scudder et al., J.Biol.Chem. 268:9886-9891(1993)).

트랜스-시알리다아제(trans-sialidase)는 트랜스-글루코시다아제(trans-glycosidase) 활성을 가지며, 시알릴락토오즈(sialyllactose)로부터 갈락토즈를 포함한 다양한 단당류, 이당류 및 올리고당에 시알산을 전이해주는 효소이다. 이 효소는 시알산 관련 대사회로의 부재로 인하여 시알산을 세포 내에서 합성할 수 없는 병원성 원생동물인 트리파노조마 종(Trypanosoma species)에서 최초로 발견되었다(Schenkman et al., Cell 65:1117-1125 (1991);Montagna et al., Eur.J.Biochem. 269:2941-2950(2002); Tiralongo et al., J.Biol.Chem. 278:23301-23310(2003)). 현재까지 트리파노조마 종인 트리파노조마 크루지(Trypanosoma Cruzi)(Scudder et al., J.Biol.Chem. 268:9886-9891(1993)), 트리파노조마 브루세이(Trypanosoma brucei)(Montagna et al., Eur.J.Biochem. 269:2941-2950 (2002)), 트리파노조마 콘골레스(Trypanosoma congolense)(Tiralongo et al., J.Biol.Chem. 278:23301-23310(2003))에서 3종의 트랜스-시알리다아제가 알려져 있다(국제특허공고 공개번호 WO9318787; 유럽특허공고 공개번호 EP0586687; 국제특허공고 공개번호 WO2004055176; 유럽특허공고 공개번호 EP1570054; 독일특허공고 공개번호 DE10258400).

시알산은 화학구조상으로 두 번째 탄소의 아노머릭(anomeric) 위치에 연결되어 있는 카복실 그룹, 세 번째 탄소의 디옥시(deoxy), 그리고 여섯 번째 탄소에 분기되어 있는 글리세롤 구조를 포함하는 화학구조를 이루고 있어 화학합성이 매우 복잡하여 수율이 매우 낮다고 알려져 있다. 또한 시알산이 부가된 당쇄 전구체의 경우 시알산의 복잡한 화학구조 이외에도 연결된 당쇄 전구체가 작용기가 많아서 원하는 위치에 시알산을 부가하는 반응이 쉽지 않기 때문에, 시알산이 부가된 당쇄 전구체의 대다수는 천연물에서의 추출이나 시알산 전이효소인 시알릴트랜스퍼라아제와 화학합성법을 병행하는 화학-효소 합성으로 생산되고 있다. 화학-효소 합성법인 시알릴트랜스퍼라아제에 의한 시알산 당쇄 전구체의 합성은 당쇄에 시알산 부가시 시알산 공여체로 고가의 뉴클레오타이드-당(neucleotide-sugar)인 시스티딘-5-모노포스포-N-아세틸-베타-뉴라믹산을 사용하기 때문에 생산 단가가 고가인 단점이 있다. 그러나 트랜스-시알리다아제를 이용하여 당쇄 전구체에 시알산을 부가하는 방법은 시알산 공여체를 당쇄 말단에 시스티딘-5-모노포스포-N-아세틸-베타-뉴라믹산에 비해 가격이 수십배 내지 수백배 저렴한 시알산 작용기를 갖는 시알릴락토오즈 또는 시알산이 부가되어 있는 당단백질의 당쇄 등의 기질을 사용하기 때문에 저가로 시알산이 부가된 올리고당 및 복합당쇄를 합성할 수 있는 장점을 지니고 있다(미국특허공고 공개번호 US5409817; 미국특허공고 공개번호 US6323008).

트리파노조마 종 유래의 트랜스-시알리다아제는 트랜스글루코시다아제의 활성을 이용하여 갈락토즈 당쇄를 포함하는 단당류, 이당류, 올리고당 당쇄의 갈락토즈 당쇄 말단에 선택적으로 α2→3 결합으로 시알산을 부가할 수 있다(국제특허공고 공개번호 WO9425615; Scudder et al., J.Biol.Chem. 268:9886-9891(1993)). 이 때 사용되는 시알산 수용체는 갈락토즈 당쇄를 포함하는 단당류, 이당류, 올리고당 이외에도 갈락토즈 잔기를 포함하는 펩타이드, 당지질 및 당단백질의 당쇄에도 위치 특이적인 시알산 전이가 가능하다(국제특허공고 공개번호 WO03031464; WO03016469; WO2004080960). 또한, 최근에는 시알산 생산이 불가능한 재조합 단백질 발현 시스템인 사카로마이시스 세레비지(Saccharomyces cerevisiae)에서 트리파노조마 크루지 유래의 트랜스-시알리다아제를 세포 표면 발현을 통해 세포 밖에서(in vitro) 갈락토즈 당쇄 말단에 시알산 당 잔기를 합성하는 기술이 개발되었다(Ryckaert et al., J. Biotechnol.119: 379-388 (2005)). 그러나, 현재까지 보고되어 있는 트리파노조마 종 유래의 트랜스-시알리다아제는 효소의 활성 및 기질 특이성이 매우 제한적이다.

따라서 합성수율이 높고 광범위한 기질 특이성을 나타내는 트랜스-시알리다아제의 개발이 필요하다. 지금까지 알려진 트랜스-시알리다아제 활성을 가지는 병원성 미생물을 대상으로 트랜스-시알리다아제를 조사한다면 유사 유전자의 클로닝 및 재조합 단백질의 특성 연구를 통해 신규 유전자를 확보할 가능성이 매우 높다. 시알산 절단을 위한 가수분해효소인 시알리다아제(또는 뉴라미니다아제(neuraminidase))는 많은 수 발견됐지만(Tayor, Curr. Opin Struct.. Biol. 6:830-837(1996); Vimr, Trends Microbiol. 2:271-277(1994); Abrashev and Dulguerova, Exp. Pathol. Parasitol. 4:35-40(2000)), 트랜스-시알리다아제의 활성을 갖는 미생물은 단지 코리네박테리움 디프테리아(Corycebacterium diphtheriae) (Mattos-Guaraldi et al., FEMS Microbiol. Lett. 168:167-172(1998); Mattos-Guaraldi et al., 2:1507-1512(2000))만이 알려져 있고, 이 경우에도 정밀한 생화학적 메커니즘 및 관련 유전자나 단백질의 서열에 대한 정보는 전혀 규명된바 없다. 또한, 코리네박테리움 디프테리아에서는 디프테리아 톡신(diphtherial toxin)의 발현을 저해하는 조건에서 시알리다아제(뉴라미니다아제)가 생산된다고 알려져 있으며, 이 조건에서 분리된 시알리다아제의 생화학적 특성 및 효소의 활성이 보고되어 있으나(Warren and Spearing, J.Bacteriol. 86:950-955(1963); Moriyana and Barksdale, J.Bacterol. 94:1565-1581(1967)), 이들의 유전자 및 단백질 서열에 대해서는 알려진 바 없다. 또한 상기의 시알리다아제들이 기존에 보고되었던 코리네박테리움 디프테리아에서 트랜스-시알리다아제 활성을 나타내는 효소인지에 대해서는 더더욱 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 경제적으로 시알산이 부가된 당쇄 전구체를 합성하고, 화학반응 및 화학촉매를 이용하여 시알산이 부가된 올리고당 및 복합 당쇄를 합성할 때 당 및 당쇄의 복잡한 화학구조로 인하여 합성수율이 낮은 단점을 극복하기 위하여, 미생물 코리네박테리움 디프테리아에서 신규 트랜스시알리다아제 유전자를 발굴하고, 이로부터 생산된 재조합 단백질을 이용하여 시알산이 부가된 당쇄를 합성함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 코리네박테리움 디프테리아 유래의 신규 트랜스-시알리다아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 트랜스-시알리다아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 트랜스-시알리다아제를 이용하여 시알산을 포함하는 올리고당, 올리고다당, 당전구체, 당지질 또는 당단백질에서 시알산을 절단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 트랜스-시알리다아제를 이용하여 시알산이 부가된 올리고당, 당지질, 당펩타이드 또는 당단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아 유래의 신규 트랜스-시알리다아제에 관한 것이다.

본 발명의 트랜스-시알리다아제는 다른 트랜스-시알리다아제와 마찬가지로 단백질의 N-말단에 세포외 분비신호서열 및 C-말단에 세포막결합부위를 가지고 있으며, 특히 전형적인 트랜스-시알리다아제 및 시알리다아제에서 발견되는 4개의 Ser-Xxa-Asp-Xxa-Gly-Xxa-Thr-Trp(SxDxGTW)에 상보적인 도메인을 포함한다(도 1A). 분자량은 약 50 내지 80 kDa이며, 비교적 넓은 pH 범위에서 효소 활성을 가지나(도 3), pH 4.0 이상, 바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0에서 최대 활성을 나타낸다. 또한, 2가 금속이온인 수은(Hg² ⁺), 구리(Cu² ⁺), 철(Fe² ⁺), 아연(Zn² ⁺), 니켈(Ni² ⁺) 및 카드뮴(Cd² ⁺)에 대해서 시알리다아제 효소의 활성이 저해되는 특성을 갖는다. 또한, 본 발명의 트랜스-시알리다아제는 공여물질인 시알산-올리고당, 시알산 유도체 및 이들 당잔기를 포함하는 당단백질로부터, 수용체인 단당류인 포도당, 갈락토오즈, 이당류인 유당, 락토사민, 이들의 화학구조를 포함하는 복합 당쇄, 당단백질의 당쇄 및 당지질의 당쇄로 시알산을 전이하는 활성을 나타낸다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 가지고 트랜스-시알리다아제 효소 활성 및 시알리다아제 효소 활성을 가지는 단백질을 제공한다. 서열번호 2의 아미노산 서열은 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp의 뉴클레오타이드 ORF(open reading frame)의 아미노산 서열을 나타내며, 총 733개의 아미노산을 포함한다. 이 중 N-말단 부분의 32개의 아미노산 서열은 단백질이 세포 밖으로 분비되는 신호서열(signal sequence)로 추정된다.

또한, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 가지고 트랜스-시알리다아제 효소 활성 및 시알리다아제 효소 활성을 가지는 단백질을 제공한다. 서열번호 4의 트랜스-시알리다아제는 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp 중에서 신호서열을 코딩하는 부분의 유전자 111 bp를 제외한 2,091 bp의 5'말단 부분에 6개의 히스티딘 펩타이드로 구성된 18 bp의 히스티딘 폴리펩타이드-태그를 추가한 2,109 bp가 코딩하는 총 702개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 구성된 단백질이다. 약 70 kDa 크기의 상기 재조합 단백질을 웨스턴 블롯을 통해서 분석한 결과 상기의 단백질이 세포질 내에 발현된 것을 확인하였고, 메틸움베릴페릴-뉴라미닉산에 대한 시알리다아제 활성을 분석한 결과 효소의 활성이 높음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 가지고 트랜스-시알리다아제 효소 활성 및 시알리다아제 효소 활성을 가지는 단백질을 제공한다. 서열번호 6의 트랜스-시알리다아제는 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 효모 표면에 발현시키기 위하여, 효모 표면 발현 시스템에 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 ORF(open reading frame) 중 시스널 시퀀스(signal sequence)를 제외한 부분을 클로닝하고, 히스티딘-태그(6xHis-tag)를 부착하여 얻은 것이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 트랜스-시알리다아제의 유전자를 포함하는 발현벡터 pYD1-Cdip_NanH를 열처리 방법을 이용하여 효모 일종인 싸카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) EBY100 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에 형질전환시켜 효모 표면에 트랜스-시알리다아제를 생산하는 재조합 균주들을 제작하였다.

본 발명의 트랜스-시알리다아제는 상기와 같은 특징을 가지고 있는 한, 상기 서열번호 2, 4, 6의 트랜스-시알리다아제의 단편 및 이의 아미노산 서열이 변이된 변이체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 트랜스-시알리다아제의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여, 상기 트랜스-시알리다아제의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드를 변화시키거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 트랜스-시알리다아제 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함되며, 이러한 아미노산 잔기의 삽입, 결실 및 치환은 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 용이하게 이루어질 수 있다.

따라서, 추가적인 양태로서, 본 발명은 상기 트랜스-시알리다아제의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖고 트랜스-시알리다아제 및은 시알리다아제 효소 활성을 가지는 단백질을 제공한다. 본 발명에서 트랜스-시알리다아제 또는 이를 코딩하는 유전자에 대해 사용되는 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 단백질의 경우 본 발명의 트랜스-시알리다아제 단백질, 특히 효소 활성 부위(catalytic domain)의 아미노산 서열과 90% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행한다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 트랜스-시알리다아제의 활성 효과 및 기질특이성을 살펴보았다.

우선, 재조합 트랜스-시알리다아제의 시알산-당 공여체의 선택성을 확인하기 위해 수용체로서 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드를 사용하고 다양한 공여체로서, 시알산(sialic acid), 시아릴-알파-2,3-락토오즈(sialyl-α(2,3)-lactose, NeuAc-α(2,3)-Gal-β1,4-Glc), 시아릴-알파-2,6-락토오즈(sialyl-α(2,6)-lactose, NeuAc-α(2,6)-Gal-β1,4-Glc), 파라-나이트로페닐-알파-시알로사이드(p-Nitrophenyl-α-sialoside), 4-메틸움베릴페릴-알파-시알로사이드(4-methylumbellifery-α-sialoside), 시알산 당쇄를 포함하는 당단백질인 페투인(fetuin) 및 트랜스페린(transferrin)을 사용하여 수용체와 공여체를 몰 농도 비율로 1대 2로 반응시켜 트랜스-시알리다아제 효소활성 측정방법을 통해 기질 특이성을 조사한 결과, 상기의 트랜스-시알리다아제 효소는 시아릴-알파-2,3-락토오즈 및 시아릴-알파-2,6-락토오즈에 높은 기질 특이성을 보여주었고, 당단백질인 페투인과 트랜스페린에 대해서도 광범위한 활성을 보여주었다 (표 1).

또한, 재조합 트랜스-시알리다아제의 당 수용체의 선택성을 확인하기 위해 공여체로서 시아릴-알파-2,3-락토오즈를 사용하고, 다양한 수용체로서, 4-메틸-움베릴페론(4-methyl-umbelliferone, MU)이 콘쥬게이션(conjugation)되어 있는 4-메틸움베릴페릴-베타-갈락토피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-galactopyranoside, MU-Gal), 4-메틸움베릴페릴-베타-글루코피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-glucopyranoside, MU-Glc), 4-메틸움베릴페릴-베타-락토피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-lactopyranoside, MU-Lac), 4-메틸움베릴페릴-베타-셀로바이오사이드(4-methylumbellifery-β-D-cellobioside, MU-Cel)를 사용하여 수용체와 공여체를 몰 농도 비율로 1대 2로 반응시켰다. 그 결과, 상기의 재조합 트랜스-시알리다아제 효소는 메틸움베릴페릴이 콘쥬게이션 되어 있는 갈락토즈, 글루코스, 락토오즈, 셀로바이오즈에 대해 거의 비슷한 활성을 나타내었으며 특이적으로 어떤 특정 수용체에 특이성을 나타내지 않아 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 판단되었다(표 2).

또한, 시알산을 포함하는 당단백질 페투인을 시알산-공여체로 사용하여 다양한 당-수용체, 즉 파라-나이트로페닐-베타-갈락토피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-galactopyranoside), 파라-나이트로페닐-베타-락토피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-lactopyranoside), 파라-나이트로페닐-베타-락토-N-바이오사이드(p-Nitrophenyl-β-lacto-N-bioside), 파라-나이트로페닐-베타-글루코피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-glucopyranoside), 파라-나이트로페닐-베타-셀로바이오사이드(p-Nitrophenyl-βcellobioside), 글루코즈(glucose), 락토오즈(lactose) 및 락토사민(lactosamine)에 대한 활성을 얇은 막 크로마토그래피(Thin layer chromatography)로 확인하였더니 역시 광범위한 활성을 확인할 수 있었다(도 5).

또한, 효모 표면에 발현된 트랜스-시알리다아제의 활성을 확인하기 위해, 4-메틸움베릴페릴-알파-시알로사이드를 이용하여 갈락토오즈를 주입한 후 배양시간에 따른 전세포(whole cell)의 가수분해 활성을 측정하였더니, 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 pYD1-Cdip_NanH 벡터를 가지고 있는 재조합 효모가 대조군인 pYD1 벡터만을 가지고 있는 효모에 비해 시알리다아제 활성이 1,000배 이상 높은 효소 활성을 보여주었다 (도 10-C).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 트랜스-시알리다아제 활성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다. 바람직하게는 서열번호 1, 3, 5에 기재된 핵산서열을 가지고 상기 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 핵산분자이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖고 트랜스-시알리다아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산분자를 제공하며, 상동성에 대한 사항은 상기 언급된 아미노산 서열의 용어 “상동성”을 동일하게 적용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 코리네박테리움 디프테리아 유래의 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 “벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 구체적인 일 양태로서, 본 발명의 발현 벡터는 트랜스-시알리다아제를 생산하는 DNA의 클로닝을 위하여, 코리네박테리움 디프테리아으로부터 해당 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 추출하고, 상기 추출한 염색체를 소정의 발현 벡터에 클로닝하여 제작할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주가 통상 사용되며, 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)과 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 대장균이다.

본 발명에서 숙주 세포로의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 염화칼슘 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

구체적인 실시예에서, 본 발명자는 상기 서열번호 4의 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터 pET-Cdip_NanH를 염화칼슘 침전법을 사용하여 대장균 BL21(DE3)pLysS (Novagen, EMD Biosciences Inc, Madison, USA)에 형질전환시켜 트랜스-시알리다아제를 생산하는 재조합 균주 BL21(DE3)pLysS/ pET-Cdip_NanH를 제작하였으며, 이를 2007년 1월 22일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC 11065BP호로 기탁하였다. 또한, 본 발명자들은 서열번호 6의 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터 pYD1-Cdip_NanH를 열처리 방법을 이용하여 효모 일종인 싸카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) EBY100(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에 넣어 형질전환시켜 효모 표면에 트랜스-시알리다아제를 생산하는 재조합 균주 Saccharomyces cerevisiae EBY100/ pYD1-Cdip_NanH를 제작하였으며, 이를 2007년 1월 22일자로 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 KCTC 11066BP로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 트랜스-시알리다아제의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 트랜스-시알리다아제의 제조 과정에서 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들어, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장 방식에 따라 현탁 배양 및 부착 배양, 배양 방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 구체적으로 본 발명자는 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 보유한 재조합 대장균을 Luria-Bertani(LB) 배지로 37°C에서 10 시간 이상 전배양 한 후, 재조합 대장균의 전배양액을 100분의 1 부피 비로 다시 LB 배지에 접종하여 37°C에서 600 nm에서 흡광도가 0.6-0.8 될 때 까지 배양하였다.

형질전환체를 배양하여 수득한 트랜스-시알리다아제는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 이 중 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되고 있으며, 컬럼의 종류와 순서의 선택에는 어느 경우에나 적용될 수 있는 법칙은 없고 단백질의 특성, 배양 방법 등에 따라 이온교환 크로마토 그래피, 크기배제 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등에서 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자는 Ni-NTA 와 Q-Sepharose 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 재조합 단백질을 용출시켜 분리 정제하였다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 코리네박테리움 디프테리아 유래의 트랜스-시알리다아제를 이용하여 다음 반응으로 이루어지는 군에서 선택되는 반응에 의해 이당류 이상의 올리고당류 중 시알산이 부가된 당쇄 결합 특이적인 당쇄전구체, 당단백질 또는 당지질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

NeuAc(α2→3)을 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가;

NeuAc(α2→6)을 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가;

NeuAc(α2→3)을 Gal(β1→4)Glc 잔기 또는 Glc(β1→4)Glc 잔기에 부가;

NeuAc(α2→6)을 Gal(β1→4)Glc 잔기 또는 Glc(β1→4)Glc 잔기에 부가;

NeuAc(α2→3)을 Gal(β1→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(β1→3)GlcNac 잔기에 부가;

NeuAc(α2→6)을 Gal(β1→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(β1→3)GlcNac 잔기에 부가;

NeuAc(α2→3)을 Gal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac 잔기에 부가;

NeuAc(α2→6)을 Gal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac 잔기에 부가;

NeuAc(α2→3)을 Gal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNac 잔기에 부가;

NeuAc(α2→6)을 Gal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNac 잔기에 부가;

상기 반응에서, NeuAc는 N-아세틸 뉴라미닉 산(N-acetyl neuraminic acid) 즉, 시알산(sialic acid)을 의미하고, Gal을 갈락토오즈를, Glc는 글루코스를, Fuc는 푸코스(fucose)를, GlcNac는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamin)을 나타낸다.

본 발명의 시알산이 부가된 당쇄 결합 특이적인 당쇄 전구체, 당단백질 또는 당지질을 생산하는 방법은, 상기 트랜스-시알리다아제를 수용체 및 시알산 공여체의 혼합물과 접촉시켜 시알산이 부가된 당쇄 결합 특이적인 당쇄전구체, 당단백질 또는 당지질을 생산하는 공정을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 시알산이 부가된 당쇄 결합 특이적인 당쇄 전구체, 당단백질 또는 당지질을 생산하는 방법은, 상기 트랜스-시알리다아제를 갈락토오즈 또는 포도당 잔기를 포함하는 수용체 성분에, 시알산을 말단에 가지고 있는 단당류 및 올리고당, 당단백질의 당쇄 또는 당지질의 당쇄를 포함하는 반응 혼합물을 접촉시켜 시알산α2→3 (또는α2→6) 갈락토오즈(또는 글루코스) 를 생산하는 단계를 포함한다. 형질 전환된 재조합 균주로부터 생산된 효소를 분리정제하였고, 농축된 효소 용액을 수용체인 당류와 공여체인 시알산 전구체들과 반응시켜 당쇄 결합 특이적인 당쇄 전구체, 당단백질의 복합당쇄 및 당지질의 복합당쇄 등을 생성시켰다. 특히, 바람직한 당쇄 전구체, 당단백질의 복합당쇄 및 당지질의 복합당쇄는 다음과 같다:

단당류: D-Gal-R ;

이당류: D-Gal-β-(14)-D-Glc-R ;

당단백질 복합당쇄: (Gal)₂(GlcNAc)₂Man₃(GlcNAc)₂-R, (Gal)₃(GlcNAc)₃Man₃(GlcNAc)₂-R, (Gal)₄(GlcNAc)₄Man₃(GlcNAc)₂-R, D-Gal-β-(14)-D-GlcNAc-β-(13)-D-Gal-β-(14)-D-Glc-R.

본 발명의 트랜스-시알리다아제는 가수분해 활성인 시알리다아제 효소 활성을 동시에 포함하여 시알산이 부가되어 있는 당쇄로부터 시알산을 절단할 수 있다. 트랜스-시알리다아제 효소 활성은 반응 기질 농도, 반응용매, 반응용매의 pH 등 효소의 반응 조건 환경에 의해 시알산 절단후, 절단된 시알산의 부가 속도보다 시알산 절단 속도가 빠른 시알리다아제만의 활성을 보이기도 한다. 본 발명의 트랜스-시알리다아제가 최적의 활성을 나타내기 위하여 pH 4.0 이상에서 반응시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0이다.

또한, 본 발명의 트랜스-시알리다아제의 기질로 사용되는 시알산 전구체는 극성을 나타내어 세포 안으로 투과하기 어렵기 때문에 본 발명에서는 트랜스-시알리다아제를 효모 표면에 발현시켜 시알산 부가 반응을 수행하였다. 트랜스-시알리다아제의 세포 표면 시스템은 미생물, 효모, 곰팡이, 세포주 등을 포함하는 캐리어에 콘쥬게이션시켜 사용될 수 있으며 또한 효소 고정화 기법을 사용하여 세포 이외에도 다양한 지지체에 고정화시켜 시알산 부가 반응 및 절단 반응을 수행할 수 있는 효소반응 시스템을 개발할 수 있다. 이 방법은 기존에 알려진 방법으로 당업자에 의해 결정할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 트랜스-시알리다아제를 포함하는, 코리네박테리움 디프테리아의 감염에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 트랜스-시알리다아제는 디프테리아를 발병시키는 병원성 미생물인 코리네박테리움 디프테리아 표면에서 발견되는 단백질로, 생체에 감염된 코리네박테리움 디프테리아 제어를 위한 백신접종을 위한 항원으로 사용될 수 있다. 본 단백질은 캐리어에 콘쥬게이션 되거나 재조합 단백질의 형태 및 일부 펩타이드 형태로 사용될 수 있으며, 동물용 및 인간형 백신을 위한 보조약 첨가와 더불어 또한 사용될 수 있다. 코리네박테리움 디프테리아 균주의 세포표면에서 항원 결정자에 상당하는 트랜스-시알리다아제를 함유하는 백신은, 예를 들어 근육주사, 복강주사, 정맥주사 등으로 투여할 수 있으며 또한 임의의 비경구적 경로를 통해 투여될 수도 있다.

박테리아인 코리네박테리움 디프테리아 유래의 트랜스-시알리다아제는 원생동물 트리파노조마 종 유래의 효소에 비해 광범위한 기질특이성을 가지며, 이로 인해 위치 특이적으로 시알산-알파-2,3(혹은 2,6)-갈락토즈 (NeuAc(α23)Gal 혹은 NeuAc(α26)Gal) 결합을 갖는 이당류, 다당류, 올리고당, 당지질, 당-펩타이드 또는 당단백질의 시알산 당쇄를 합성할 수 있다. 또한, 상기의 트랜스-시알리다아제는 대장균이나 효모와 같은 미생물에서 재조합 단백질 형태로 생산시 발현 효율 및 활성형 단백질의 생산 수율이 매우 높고 그 효소 활성이 우수하다. 특히 상기 효소는 수용체로서 단당류인 갈락토오즈, 포도당과 이당류인 유당, 락토사민, 셀로바이오사이드, 이들의 화학구조를 포함하는 복합 당쇄, 당단백질의 당쇄 및 당지질의 당쇄를, 공여물질로서 시알산-올리고당 및 시알산 유도체를 사용하여 당쇄 결합 특이적인 생물전환 반응을 위한 화학-효소촉매로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 트랜스-시알릴다아제는 광범위한 기질 특이성, 위치 특이성, 광학 특이성 반응을 함으로써 시알산 당쇄 합성시 수율의 증대 및 반응공정의 단순화를 유도할 수 있는 획기적인 전환점을 마련하였다.

도 1은 트라파노조마 크루지와 코리네박테리움 유래의 트랜스-시알리다아제의 구조적 특징(1A)과 대장균에서 생산하는 재조합 트랜스-시알리다아제의 간략한 특징 및 활성(1B)을 나타낸다.
도 2는 재조합 트랜스-시알리다아제(재조합 단백질Ⅰ)가 발현되는 재조합 대장균의 배양배지, 주변세포질 및 세포질에서의 상대적인 효소 활성을 나타내다.
도 3은 코리네박테리움 디프테리아 유래의 재조합 트랜스-시알리다아제 유전자 Cdip-NanH를 포함하는 재조합 단백질Ⅳ를 발현하는 플라스미드 pET-Cdip_NanH를 나타다.
도 4는 정제된 재조합 트랜스-시알리다아제의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. (S: 표준단백질 마커, 1: 대장균 세포추출액, 2: Ni-NTA 칼럼을 통과하여 분리된 단백질 분획, 3: Q-Sepharose 칼럼을 통과하여 분리된 단백질)
도 5는 시알산을 포함하는 당단백질 페투인을 시알산 공여체로 사용하여, 다양한 수용체에 시알산이 전이되는 것을 확인한 얇은 막 크로마토그래피이다. 도 5A는 대조군 실험으로 트랜스-시알리다아제와 공여체 없이 반응한 반응액을 점적하였고, 도 5B는 트랜스-시알리다아제와 공여체를 포함한 반응액을 점적하였다. 각 레인(lane)별로는 파라-나이트로페닐-베타-갈락토피라노사이드(1), 파라-나이트로페닐-베타-락토피라노사이드(2), 파라-나이트로페닐-베타-락토-N-바이오사이드(3), 파라-나이트로페닐-베타-글루코피라노사이드(4), 파라-나이트로페닐-셀로바이오사이드(5), 글루코즈(6), 락토오즈(7), 락토사민(8)과 같은 수용체를 바꾸어가며 반응을 하였으며, 대조를 위하여 시알산(*)과 공여체인 페투인(**)도 함께 점적하였다. 각 반응의 산물을 보면 아래로부터 공여체인 페투인(Ft) 밴드(band)가 보이고, 그 위에 유리되어진 시알산(SA), 당이 두개인 이당류(DS)들과 하나의 당으로 분리된 단당류(MS)들이 보이고, 그 위에 2개의 밴드로 시알산콘쥬게이트 이당류(SD)와 시알산콘쥬게이트 단당류(SM)가 있고, 그 위에 파라-나이트로페닐 이당류(PD)와 파라-나이트로페닐 단당류(PM)의 밴드들이 관찰되었다.
도 6은 pH에 따른 재조합 트랜스-시알리다아제의 활성을 나타낸다. (●: MES 완충용액(pH5.0-7.0), ○: MOPS 완충용액(pH6.5-8.0), ■: Tris-HCl 완충용액(pH7.5-9.0))
도 7은 2가 양이온 및 킬레이트제 첨가시 재조합 트랜스-시알리다아제의 활성을 나타낸다.
도 8은 재조합 트랜스-시알리다아제에 의해 가수분해가 가능한 당쇄 위치 특이적인 시알산 결합을 갖는 당단백질의 당쇄 및 당지질의 당쇄를 나타낸다.
도 9는 효모 표면에 코리네박테리움 디프테리아 유래의 재조합 트랜스-시알리다아제를 발현시킬 수 있는 재조합 플리스미드 pYD1-Cdip_NanH를 나타낸다.
도 10은 효모(싸카로마이시스 세레비지 EBY100) 표면에 재조합 트랜스-시알리다아제의 발현을 위해서 발현유도체 첨가후 재조합 단백질의 발현양을 시간별로 측정한 웨스턴블롯 분석 데이터(A)와 효모 표면에 발현된 재조합 단백질을 마우스 안티-엑스프레스 항체와 에프아이티시-콘쥬게이트(FITC-conjugate) 고트 안티 마우스 이뮤노글로블린 G(goat anti-mouse IgG) 항체를 사용하여 형광 라벨링을 시킨 후 공초점현미경을 통해 분석한 형광 이미지 데이터(B), 그리고 배양액에 갈락토오즈 주입 후 시간에 따른 단위 재조합 균주당 시알리다아제의 활성을 나타낸다(C).

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 바이오인포매틱스를 통한 박테리아 트랜스- 시알리다아제 코딩 유전자의 선별

박테리아 유래 트랜스-시알리다아제 후보를 선정하기 위해 현재 효소의 생화학적 특성 및 단백질의 3차원 구조가 밝혀진 트리파노조마 크루지(Trypanosoma cruzi)의 아미노산 서열(미국 국립보건원(NIH) 국가생명공학정보센터(NCBI) NCBI accession no. 1S0J)을 쿼리(query) 시퀀스로 사용하여 유사한 아미노산 서열 후보를 찾아내었다. 이 중 미생물 유래의 트랜스-시알리다아제 후보를 선별한 후 다중 유전자 및 아미노산 서열 분석, 단백질 위치분석 및 도메인(domain) 분석를 통해 시알리다아제가 가지고 있는 특징적인 세린(Ser)-x-아스파테이트(Asp)-x-글리신(Gly)-x-트레오닌(Thr)-트립토판(Trp)(x: 20개의 모든 아미노산)의 아미노산 서열을 포함하는 모티프(motif)를 기준으로 코리네박테리움을 트랜스-시알리다아제 후보 균주로 최종 선별하였다 (도 1A).

실시예 2. 코리네박테리움 디프테리아 트랜스- 시알리다아제 클로닝

트랜스-시알리다아제 유전자를 클로닝하기 위해 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae KCTC3075)를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에서 분양받았다. 분양받은 균주를 브레인 헐트 인퓨젼 브로스(Brain Heart Infusion Broth)에서 72 시간 배양한 후, 균체를 회수하여 염색체 분리 키트(AccuPrep Genomic DNA Extraction kit, 바이오니아, 대전, 대한민국)를 이용하여 염색체(genomic DNA)를 추출하였다. 트랜스-시알리다아제 클로닝을 위하여 미국 보건성에서 운영되고 있는 Genbank(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi)의 원생동물 염색체 데이터베이스로부터 추정 트랜스-시알리다아제를 코딩하고 있는 유전자의 프로모터 부분을 포함하는 영역을 찾아 프라이머(primer)를 제작하였다. 제작한 프라이머는 다음과 같다:

Forward Cdip_NanH: 5'-CCTAGGATTTTGACTCCGCGAAAGTAA-3' (서열번호 7)

Reward Cdip_NanH: 5'-CCGCTCGAGCCTTATTCCAGGAATGTTAAAAG-3' (서열번호 8)

코리네박테리움 디프테리아 염색체를 주형으로 효소중합반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 프로모터 부분을 포함하는 트랜스-시알리다아제 유전자를 코딩하는 2,572 bp의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 DNA　분리정제키트(AccuPrep PCR purification kit, 바이오니아, 대전, 대한민국)를 이용해 순수정제 하여 pGEM-T easy 벡터(Promega, Madison, Wiscosin, USA)와 함께 접합 시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환 시켰다. 플라스미드를 형질 전환된 대장균으로 부터 분리하여 DNA　시퀀싱을 수행하였다(솔젠트, 대전, 대한민국). 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp의 뉴클레오타이드의 ORF(open reading frame)만을 상기에서 언급한 Genbank의 유전자와 상동성을 아미노산 서열 수준에서 비교한 결과, 상동성(identity)이 76%, 유사성(similarity)이 84%로 나타났다. 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp는 총 733개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하고 있으며, N-말단 부분의 32개의 아미노산 서열은 단백질이 세포 밖으로 분비되는 신호서열(signal sequence)로 추정된다. 분석된 본 단백질의 코딩 염기서열 및 아미노산 서열은 서열번호 1과 서열번호 2에 각각 기술 하였다.

실시예 3. 코리네박테리움 디프테리아 트랜스- 시알리다아제 생산을 위한 재조합 균주 제작 및 대장균 내에서의 재조합 단백질의 생산

대장균 내에서의 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제 유전자의 발현을 위해서, 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 ORF(open reading frame)만을 코딩하는 영역을 찾아 프라이머 세트를 제작하였다. 제작한 프라이머는 다음과 같다:

재조합 트랜스-시알리다아제 I:

5'-CCAATTCCATATGCATTCCTCAAACCGAACCTACAGCC-3' (서열번호 9)

5'-CCGCTCGAGCCTTATTCCAGGAATGTTAAAAG-3' (서열번호 10);

재조합 트랜스-시알리다아제 II:

5'-CGGGCCATGGGGGTGCATTCCTCAAACCGAACCTACAGCC-3'(서열번호 11)

5'-CCGCTCGAGCTACCTCATGCCCGGAATGTTAAAAGG-3' (서열번호 12);

재조합 트랜스-시알리다아제 III:

5'-CATGCCATGGGGGAAGAGCTCGAAACTGTTGTGCCTGC-3'(서열번호 13)

5'-CCGCTCGAGCTACCTCATGCCCGGAATGTTAAAAGG-3' (서열번호 14);

재조합 트랜스-시알리다아제 IV

5'-CCAATTCCATATGCACCACCACCACCACCACGAGCTCGAAACTGTTGTGC-3' (서열번호 15)

5'-CCGCTCGAGCCTTATTCCAGGAATGTTAAAAG-3' (서열번호 16).

이때 재조합단백질 I, IV의 각각의 프라이머에는 NdeI과 XhoI 제한효소 부위를, 그리고 재조합단백질 II, III의 각각의 프라이머에는 NcoI과 XhoI 제한효소 부위를 넣었다. 코리네박테리움 디프테리아 염색체를 주형으로 효소중합반응을 통해 트랜스-시알리다아제 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 DNA　분리정제키트(AccuPrep PCR purification kit, 바이오니아, 대전, 대한민국)를 이용해 순수정제 하였으며, 각각의 적절한 제한효소를 이용하여 증폭된 유전자의 양끝을 절단한 후, 미리 동일 제한효소로 처리된 발현벡터 pET-21a 와 pET-32a(Novagen, EMD Biosciences Inc, Madison, USA)과 함께 접합(ligation)시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여, 제한효소 절단 DNA 절편 크기 확인과 DNA 시퀀싱을 실시한 후 최종적으로 확인하야 발현된 벡터를 제작하였다. 그리고 이를 염화칼슘 침전법으로 대장균 BL21(DE3)pLysS (Novagen, EMD Biosciences Inc, Madison, USA)에 넣어 형질전환을 시켜 트랜스-시알리다아제를 생산하는 재조합 균주들을 제작하였다.

코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 보유한 재조합 대장균들을 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지(트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L)로 37°C에서 10 시간 이상 전배양 하였다. 재조합 대장균의 전배양액을 100분의 1 부피 비로 다시 LB 배지에 접종하여 37°C에서 600 nm에서 흡광도가 0.6-0.8 될 때 까지 배양한 후 글루코실트랜스퍼라아제의 발현을 위해 이소프로필-베타-티오갈락토피란노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종 0.3 mM이 되게 첨가한 후 30°C에서 6시간을 더 배양한 후 배양액에서 원심분리기를 통해 세포를 회수하였다.

상기 재조합 대장균 균주들에서 생산되는 재조합 단백질들의 간략한 도식 및 단백질 활성은 도 1B에 기술하였으며 각각의 재조합 단백질에 대한 상세한 설명은 하기에 기록된 특성과 같다:

재조합 단백질 I은 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제의 신호서열 (signal sequence)을 포함하는 유전자 2,202 bp의 3’말단 부분에 18 bp의 6개의 히스티딘 펩타이드로 구성된 히스티딘 폴리펩타이드-태그(6xHis-tag)를 추가하여 2,220 bp가 코딩하는 총 739개의 아미노산 서열로 구성된 단백질이다. 약 75 kDa 크기의 재조합 단백질을 세포 내에 발현할 것으로 예상했으나 웨스턴 블롯 분석을 통해서 약 10 kDa 이하의 재조합 단백질이 확인되었다. 하지만, 재조합 트랜스-시알리다아제 I의 메틸움베릴페릴-뉴라미닉산에 대한 시알리다아제 활성을 확인한 결과 효소의 활성은 확인되었다. 따라서 본 결과는 상기의 재조합 단백질의 C-말단 부분의 약 10 kDa의 일부분이 대장균 내의 프로티아제에 의해 절단된 것으로 판단된다. 또한, 효소의 활성을 측정하기 위해 트랜스-시알리다아제를 생산하는 재조합 대장균을 배양 후 회수하여 배양배지(culture medium), 주변세포질(periplasm) 및 세포질(cytoplasm)로 분획하였다. 분획 후 얻어진 각 부분의 세포추출물의 효소의 활성을 확인한 결과, 발현된 재조합 단백질의 80% 이상이 대장균의 주변세포질(periplasm)에 존재하는 것을 확인하였다 (도 2).

재조합 단백질 II는 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp에 5‘말단 부분에 483 bp의 약 17.6 kDa의 싸이오레독신-태그(thioredoxin (Trx)-tag)와 6개의 히스티딘 폴리펩타이드-태그를 추가하여 2,685 bp가 코딩하는 총 895개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 구성된 단백질이다. 약 100 kDa 크기의 재조합 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 통해서 상기의 단백질이 세포질(cytoplasm)내에 발현된 것을 확인하였으나, 재조합 트랜스-시알리다아제 II의 메틸움베릴페릴-뉴라미닉산에 대한 시알리다아제 활성을 확인한 결과 효소의 활성은 나타나지 않았다.

재조합 단백질 III은 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp 중에서 신호서열을 코딩하는 부분의 유전자 111 bp를 제외한 2,091bp의 5‘말단 부분에 483 bp(약 17.6 kDa)의 싸이오레독신-태그와 6개의 히스티딘 폴리펩타이드-태그를 추가하여 2,574 bp가 코딩하는 총 858개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 구성된 단백질이다. 약 95 kDa 크기의 재조합 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 통해서 상기의 단백질이 세포질(cytoplasm) 내에 발현된 것을 확인하였으나, 재조합 트랜스-시알리다아제 III의 메틸움베릴페릴-뉴라미닉산에 대한 시알리다아제 활성을 확인한 결과 효소의 활성은 나타나지 않았다.

재조합 단백질 IV는 코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 2,202 bp 중에서 신호서열을 코딩하는 부분의 유전자 111 bp를 제외한 2,091bp의 5'말단 부분에 18 bp의 6개의 히스티딘 펩타이드로 구성된 히스티딘 폴리펩타이드-태그를 추가하여 2,109 bp가 코딩하는 총 702개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 구성된 단백질이다. 약 70 kDa 크기의 재조합 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 통해서 상기의 단백질이 세포질 내에 발현된 것을 확인하였다. 상기의 재조합 트랜스-시알리다아제 IV는 메틸움베릴페릴-뉴라미닉산에 대한 시알리다아제 활성을 확인한 결과 효소의 활성이 높게 나타났다.

상기의 재조합 단백질 IV를 생산하는 재조합 균주가 포함하는 재조합 벡터 pET-Cdip-NanH를 (도 3)에 기술하였으며, 본 재조합 벡터의 염기서열 및 상기의 재조합 벡터가 생산하는 재조합 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 3과 서열번호 4에 기술하였다. 상기의 재조합 단백질 IV를 생산하는 재조합 균주 BL21(DE3)pLysS/ pET-Cdip_NanH는 2007년 1월 22일자로 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC 11065BP호로 기탁하였다.

실시예 4. 재조합 코리네박테리움 디프테리아 트랜스- 시알리다아제 효소의 정제

(단계 1) 재조합 균주의 배양

코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제 유전자를 코딩하는 발현벡터를 보유한 재조합 대장균들을 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지(트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L)로 37°C에서 10 시간 이상 전배양 하였다. 재조합 대장균의 전배양액을 100분의 1 부피 비로 다시 LB 배지에 접종하여 37°C에서 600 nm에서 흡광도가 0.6-0.8 될 때 까지 본배양한 후 트랜스-시알리다아제의 발현을 위해 이소프로필-베타-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종 0.3 mM이 되게 첨가한 후 30°C에서 6시간을 더 배양한 후 배양액에서 원심분리기를 통해 세포를 회수하였다.

(단계 2) Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피

회수된 균체를 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)으로 균체를 3번 세척한 후 동일 완충용액을 넣고 15분간 음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄하였다. 만들어진 세포추출물에서 파쇄 되지 않은 균체와 비용해성 단백질을 제거하기 위해 10,000 rpm에서 30분간 원심분리를 한 후 침전된 세포 잔해물을 제거하고 다음 단계를 진행하였다. 아머샴파마시아 액타 에프피엘시 시스템(Amersham-Pharmacia FPLC system) (Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 이용하여 10 mM 이미다졸(imidazole)과 0.3 M 염화나트륨(NaCl)이 들어있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)으로 평형화시킨 Ni-NTA 칼럼(1.5 x 10 cm)에 세포추출물을 주입하고, 동일 완충용액 5 배 부피로 세척한 다음, 200 mM 이미다졸과 0.3 M 염화나트륨이 들어있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)으로 이미다졸을 10mM에서 200mM까지 점차 증가시키면서 재조합 트랜스-시알리다아제를 용출시켰다. 이때 용출 속도는 분당 1 ml로 하였으며 단백질의 활성이 나타나는 분획을 모아 한외여과하여 농축시켰다.

(단계3) Q-Sepharose 칼럼 크로마토그래피

Ni-NTA 컬럼으로 분리한 재조합 단백질을 좀더 순수하게 분리하기 위해 50 mM Tris-HCl 완충용액으로(pH 7.6)로 평형시킨 Q-Sepharose 컬럼(3.0 x 11 cm)에 Ni-NTA 칼럼에서 분리된 단백질을 주입하고 동일 완충용액을 3배 부피로 세척한 다음, 1.0 M 염화나트륨이 포함된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)으로 염화나트륨의 농도를 0 M 에서1.0 M로 점차 증가시키면서 시켜 단백질을 용출시켰다. 이때 용출 속도는 분당 1 ml로 하였으며 재조합 트랜스-시알리다아제의 메틸움베릴페릴-뉴라미닉산에 대한 시알리다아제 활성을 나타나는 분획을 모아 한외여과하여 농축시켰다.

(단계 4) SDS-PAGE 분석

상기의 각 정제단계에서 얻어진 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용해 분리한 후 코마시에 브릴리언트 블루(Coommassie Brilliant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus Protein^TM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 재조합 트랜스-시알리다아제의 순도 및 크기를 분석하였다. 상기 각 단계에서의 분석결과는(도 4)와 같다. 재조합단백질의 N-말단에 폴리히스티딘-태그가 융합된 형태의 재조합 단백질 크기는 약 70 kDa 이었다.

실시예 5. 질량분석기를 이용한 재조합 단백질 크기 분석

재조합 트랜스-시알리다아제 단백질의 정확한 분자량을 측정하고, 이로부터 상기 실시예 3에서 기술한 재조합 단백질의 대장균 내의 프로티아제에 의한 절단부위를 유추하기 위해서, 분리된 단백질을 증류수로 투석시켜 단백질 용액 내에 있는 염을 제거한 후 한외여과로 재조합 트랜스-시알리다아제를 1 mg/ml 이상의 농도로 농축시켰다. 25% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 트리플루오아세테트산(trifluoroacetic acid)이 1:2의 비율로 혼합된 용액에 시나피닉산(sinapinic acid)을 포화농도로 용해시킨 후 이 용액을 농축된 단백질과 부피비로 1:1로 혼합하여 질량분석기 MALDI-TOF 타깃 위에서 단백질을 결정화시켰다. 결정화된 단백질을 질량분석기 Microflex Maldi-TOF(Bruker Daltonik GmbH. Bremen, Germany)을 이용하여 재조합 트랜스-시알리다아제의 크기를 분석하였다.

질량분석기로 얻어진 재조합 트랜스-시알리다아제의 분자량은 66,390.757 Da으로 분석되었다. 서열목록 4의 아미노산 서열을 에스파시 프로테옴 서버 (ExPaSy Proteomics Sever)의 Compute pI/Mw tool (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)을 이용하여 이론적인 트랜스-시알리다아제의 단백질 크기를 예측한 결과 75,017.06 Da로 분석되었다. 질량분석기와 컴퓨터를 이용한 이론적인 값을 비교한 결과 서열목록 2의 아미노산 서열에서 66,360.15 Da과 9,366.58 Da으로 나누어지는 614 번째 아미노산인 라이신(lysine, K)과 615번째 아미노산인 글루타믹산(glutamic acid, E) 사이가 대장균의 프로티아제에 의해서 절단되는 것으로 유추할 수 있었다.

실시예 6. 재조합 트랜스- 시알리다아제 특성 규명 및 활성측정

재조합 트랜스-시알리다아제의 활성은 갈락토오즈(galactose)에 형광그룹을 갖는 4-메틸-움베릴페론(4-methyl-umbelliferone, MU)이 결합된 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-galactopyranoside, MU-Gal)를 수용체로, 공여물질로 시알산 전구체들 반응을 이용하여 Schrader et al.의 방법에 따라 형광분석기(fluorescence spectroscopy)로 측정하였다(Schrader et al., Anal . Biochem . 322:139-147 (2003)). 상세한 트래스-시알리다아제의 활성 측정 방법은 하기에 기술하였다:

50 mM MES (pH 6.5) 완충용액에서 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드를 수용체로 시아릴-α2,3-락토오즈(sialyl-α2,3-lactose)를 공여체로 하여 재조합 트랜스-시알리다아제를 첨가한 후 37°C에서 120 분 동안 반응하였다. 효소 반응 후 반응물 전체를 음이온 교환 수지인 QAE-세파덱스(QAE-sephadex)가 충진된 컬럼에 흘려주어 효소 반응 후 생성된 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드(MU-Gal)에 시알산(NeuAc)이 전이된 올리고당(NeuAc-α2,3-Gal-MU)을 컬럼에 흡착시켰다. 미반응한 MU-Gal을 제거하기 위해 증류수로 컬럼을 3배 부피로 세척을 한 후, 컬럼 부피와 같은 양의 1 M 염산(HCl)을 흘려주어 컬럼에 부착된 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드에 시알산이 전이된 올리고당(NeuAc-α2,3-Gal-MU)을 탈착시켰다. 컬럼에서 1 M 염산으로 탈착시킨 시알산이 전이된 올리고당을 100°C에서 45 분간 가열하여 NeuAc-α2,3-Gal와 형광을 나타내는 MU (4-methyl-umbelliferone)을 산-가수분해(acid-hydrolysis)를 시켰다. 산-가수분해된 MU 양을 형광분석기를 이용하여 여기파장 람다(lambda, λ) 365 nm와 방출파장 람다 450 nm에서 형광도를 측정하였다.

이때 모든 효소 반응은 두 번 이상 측정 하였으며, 효소의 활성을 나타내는 1 유니트(units, U)는 분당 1 마이크로몰(μM)의 시알산을 공여체에서 수용체로 전달해주는데 필요한 효소의 양으로 정의한다.

재조합 트랜스-시알리다아제의 시알산-당 공여체의 선택성을 확인하기 위해, 수용체로 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드를 공여체로 시알산(sialic acid), 시아릴-알파-2,3-락토오즈(sialyl-α(2,3)-lactose, NeuAc-α(2,3)-Gal-β1,4-Glc), 시아릴-알파-2,6-락토오즈(sialyl-α(2,6)-lactose, NeuAc-α(2,6)-Gal-β1,4-Glc), 파라-나이트로페닐-알파-시알로사이드(p-Nitrophenyl-α-sialoside), 4-메틸움베릴페릴-알파-시알로사이드(4-methylumbellifery-α-sialoside)와 시알산 당쇄를 포함하는 당단백질인 페투인(fetuin)과 트랜스페린(transferrin)을 이용하여 수용체와 공여체를 몰 농도 비율로 1대 2로 반응시켰다. 위에서 언급한 트랜스-시알리다아제 효소활성 측정방법을 이용하여 기질 특이성을 조사한 결과, 상기의 트랜스-시알리다아제 효소는 시아릴-알파-2,3-락토오즈 및 시아릴-알파-2,6-락토오즈에 높은 기질 특이성을 보여주었다. 특이하게도 상기의 효소는 지금까지 원생동물에서 보고된 트랜스-시알리다아제와 달리 알파-2,3 결합에 대한 효소의 활성 뿐 아니라 알파-2,6 결합을 갖는 시알산 전구체에 대해서도 활성을 나타내었다. 또한 시알산 올리고당 이외에도, 시알산 잔기를 갖는 당단백질인 페투인과 트랜스페린을 시알산 공여체로 이용하여 당단백질의 당쇄로부터 시알산을 수용체에 전달하는 활성이 있다는 것을 보여주었다 (표 1).

재조합 트랜스-시알리다아제 효소의 당 수용체의 선택성을 확인하기 위해, 시아릴-알파-2,3-락토오즈를 공여체로 이용하고, 수용체로 4-메틸-움베릴페론(4-methyl-umbelliferone, MU)이 콘쥬게이션(conjugation)되어 있는 4-메틸움베릴페릴-베타-갈락토피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-galactopyranoside, MU-Gal), 4-메틸움베릴페릴-베타-글루코피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-glucopyranoside, MU-Glc), 4-메틸움베릴페릴-베타-락토피라노사이드(4-methylumbellifery-β-D-lactopyranoside, MU-Lac), 4-메틸움베릴페릴-베타-셀로바이오사이드 (4-methylumbellifery-β-D-cellobioside, MU-Cel)를 사용하였다. 이때 수용체와 공여체를 몰 농도 비율로 1대2로 반응시켰다. 상기의 재조합 트랜스-시알리다아제 효소는 메틸움베릴페릴이 콘쥬게이션 되어 있는 갈락토즈, 글루코스, 락토오즈, 셀로바이오즈에 대해 거의 비슷한 활성을 나타내었으며 특이적으로 어떤 특정 수용체에 특이성을 나타내지 않았다(표 2). 이 결과로 판단할 때 본 재조합 트랜스-시알리다아제는 수용체 기질에 대해 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 판단된다.

[표 1]

갈락토 피라노사이드를 수용체로 사용한 반응에서의 공여체에 대한 선택성 분석

[표 2]

시아릴-알파-2,3-락토오즈를 공여체로 사용한 반응에서의 수용체에 대한 선택성 분석

시알산을 포함하는 당단백질의 당쇄를 시알산-공여체로 사용하여 다양한 당-수용체에 대한 활성을 얇은 막 크로마토그래피(Thin layer chromatography)로 확인하였다. 시알산-공여체로 당단백질 페투인을 사용하였고 당 수용체는 파라-나이트로페닐-베타-갈락토피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-galactopyranoside), 파라-나이트로페닐-베타-락토피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-lactopyranoside), 파라-나이트로페닐-베타-락토-N-바이오사이드(p-Nitrophenyl-β-lacto-N-bioside), 파라-나이트로페닐-베타-글루코피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-glucopyranoside), 파라-나이트로페닐-베타-셀로바이오사이드(p-Nitrophenyl-βcellobioside), 글루코즈(glucose), 락토오즈(lactose), 락토사민(lactosamine)을 사용하였다. 50 mM MES 완충용액 (pH 6.5)에서 수용체-당과 공여체-당을 몰비율로 1대 20 으로 하여 37°C에서 2 시간 반응을 시켰다. 반응 후 반응물을 실리카겔(silica gel)이 코딩된 G-60 얇은막 크로마토그래피 판(thin layer chromatography　plate) (Merck, USA)에 점적한 후 에틸아세테이트(ethylacetate):아세트산(acetic acid):증류수(water)을 부피비로 2:1:1로 조성된 이동상으로 전개시켰다. 전개된 얇은막 크로마토그래피 판에서 시알산이 부가된 당을 확인하기 위해 증류수와 황산이 부피비로 75:20로 혼합되어 있는 용액에 2% 올시놀(orcinol)이 포함된 발색시약을 분사한 후 건조시켜 100°C에서 20분간 반응시켰다. 반응결과는 도 5에 나타내었다.

재조합 트랜스-시알리다아제 효소의 동력학 상수(kinetic parameter)는 수용체로 4-메틸움베릴페릴-갈락토피라노사이드(MU-Gal) 또는 4-메틸움베릴페릴-락토피라노사이드 (MU-Lac)를 이용하였고 시알산 공여체로 시아릴-알파2,3-락토오즈 또는 시아릴-알파2,6-락토오즈를 사용하였다. 이 때 수용체의 동력학 상수는 공여체를 1.0 mM을 사용하고 수용체의 농도를 0 - 25 mM 범위로 하였으며, 공여체의 동력학 상수는 수용체를 1.0 mM 사용하고 공여체의 농도를 0 - 40 mM 범위로 하였다. 시그마프롯(Sigma Plot, 버젼 9.0)을 이용해 각각의 기질을 이용하여 얻어진 효소의 초기속도 값을 미켈레스-멘텐 식(Michaelis-Menten equation)으로부터 비선형-회귀분석(non-linear regression analysis)을 통해 K _m 와 V _max 값을 계산하였다. 계산되어진 속도 상수 값은 (표-3)에 기술 하였다.

[표 3]

수용체와 공여체에 대한 재조합 트랜스-시알리다아제의 동력학 상수

트랜스-시알리다아제의 효소활성에 대한 pH의 영향을 알아보기 위하여, MES 완충용액(pH 5.0-7.0), MOPS 완충용액 (pH 6.5-8.0), Tris-HCl 완충용액(pH 7.5-9.0)을 각각 사용하여 위에서 언급한 효소활성 측정방법을 이용하여 효소의 활성을 정량하였다. 수용체와 공여체로 각각 MU-Gal과 시아릴-알파-2,3-락토오즈를 이용하여 효소의 활성을 확인한 결과, pH 6.0-7.0에서 효소활성은 최대로 나타났으며 pH 5.0-9.0의 범위에서 50% 이상의 효소 활성이 유지되어, 본 트랜스-시알리다제는 비교적 넓은 pH 범위에서 효소의 작용을 갖는 것으로 판단된다 (도 6).

트랜스-시알리다아제의 효소에서 2가 양이온은 효소의 활성을 증가시키거나 감소시키는 것으로 알려져 있다. 2가 양이온의 효소의 활성에 대한 영향을 조사하기 위하여, 망간(Mn² ⁺), 바륨(Ba² ⁺), 마그네슘(Mg² ⁺), 칼슘(Ca² ⁺), 코발트(Co² ⁺), 구리(Cu² ⁺), 철(Fe² ⁺), 수은(Hg² ⁺), 카드뮴(Cd² ⁺), 니켈(Ni² ⁺), 아연(Zn² ⁺) 및 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 1 mM을 사용하여 각각의 이온에 대한 효소의 활성을 조사하였다. 각각의 2가 양이온을 분리한 효소와 함께 50 mM MES 완충용액 (pH 6.5)에서 1 시간 미리 반응 시킨 후 효소의 활성을 위에서 언급한 효소활성 측정방법을 이용하여 효소의 활성을 측정한 결과, 2가 금속 이온에 의한 효소의 활성 증가는 관찰되지 않았다. 그러나 망간, 바륨, 코발트, 마그네슘, 칼슘 및 EDTA에 대해서는 효소의 활성의 변화가 거의 없었지만, 니켈과 카드뮴에 대해서는 금속이온을 첨가하지 않은 효소에 비해 효소의 활성이 50% 이하로 감소되었으며, 수은, 구리, 아연 및 철 이온에 대해서는 효소의 활성이 20% 이하로 크게 감소되었다 (도 7).

실시예 7. 재조합 트랜스- 시알리다아제의 당쇄 결합 특이적인 가수분해 활성 측정

트랜스-시알리다아제의 활성은 시알산 공여체로부터 시알산의 가수 분해 후 수용체의 당쇄 말단에 시알산을 부가해주는 반응으로, 공여체에 부가되어 있는 시알산의 특이적인 당쇄 결합에 따라 트랜스-시알리다아제의 활성이 좌우된다. 따라서 본 트랜스-시알리다아제의 이용 가능한 시알산 당쇄 결합을 확인하기 위하여 공여체의 당쇄결합 특이적인 시알산의 가수분해 활성을 측정하였다. 재조합 트랜스-시알리다아제의 당쇄 결합 특이적인 가수분해 활성은 다카라(Takara, Japan)에서 구입한 피리딜아민(pyridylamino (PA)) 그룹이 부가되어 당단백질의 복합당쇄 및 당지질 당쇄를 이용하였다. 효소반응 조건은 50 mM MES 완충용액 (pH 6.5)에서 당단백질의 복합당쇄 및 당지질 당쇄를 0.1 nM로 반응하였으며 이때 반응 온도는 37℃이었다. 반응 후 시알산이 절단된 피리미딜아민 그룹이 부착된 당단백질 및 당지질 당쇄는 쇼덱스-아사이팩 NH2P-50 컬럼을 사용하여 형광측정기가 부착된 HPLC로 측정하였다. 이 때 이동상은 트리에틸아민으로 pH 7.3으로 적정된 200 mM 초산 완충용액(pH 7.3)과 아세토나이트릴이 1:9 부피비로 혼합된 A 용액과 9:1 부피비로 혼합된 B 용액을 사용하였다. 이동상을 A 용액과 B 용액을 부피비 7.5:2.5의 비율로 시작하여 60분 후에 A 용액과 B 용액이 2.5:7.5의 비율로 농도구배가 되도록 하였다. 이때 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min 이었다. 본 효소에 의해 가수분해가 가능한 당쇄결합 특이적인 시알산이 부가된 당쇄 기질을 도 8에 기술하였다. 본 효소는 올리고당, 당단백질의 당쇄, 당지질의 당쇄의 갈락토즈 및 글루코즈 말단에 알파-2,3, 알파-2,6, 알파-2,8의 시알산을 모두 절단하는 효소로 판단된다.

실시예 8. 효모 표면 발현시스템을 이용한 재조합 트랜스- 시알리다아제 전세포 반응 시스템 개발

코리네박테리움 디프테리아 트랜스-시알리다아제를 효모 표면에 발현시키기 위하여 효모 표면 발현 시스템에 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 ORF(open reading frame) 중 신호서열(signal sequence)를 제외한 부분을 클로닝 하였다. 신호서열를 제외한 부분을 클로닝 하기 위하여 다음과 같은 프라이머를 제작하였다:

5'-GGGGTACCTACCGCAGAACTGGAAGGAGGAGTGGCTGC-3' (서열번호 17)

5'-CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGG TGCCTTATTCCTGGAATGTTAAAAG-3' (서열번호 18).

각각의 프라이머에는 KpnI과 XhoI 제한효소 부위를 넣었다. XhoI 제한효소 부위를 넣은 프라이머에는 재조합단백질 발현 후에 단백질 말단에 히스티딘-태그(6xHis-tag)가 부착될 수 있도록 CAC 코돈(codon)을 디자인하여 넣어 주었다. 코리네박테리움 디프테리아 염색체를 주형으로 효소중합반응을 통해 트랜스-시알리다아제 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 DNA　분리정제키트(AccuPrep PCR purification kit, 바이오니아, 대전, 대한민국)를 이용해 순수정제 하였으며, 각각의 적절한 제한효소를 이용하여 증폭된 유전자의 양끝을 절단한 후, 미리 동일 제한효소로 처리된 발현벡터 pYD1(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)와 함께 접합시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환 시켰다. 형질 전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여, 제한효소 절단 DNA 절편 크기 확인과 DNA 시퀀싱을 실시한 후 최종적으로 확인된 벡터 pYD1-Cdip_NanH를 열처리 방법을 이용하여 효모 일종인 싸카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) EBY100 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에 형질전환시켜 효모 표면에 트랜스-시알리다아제를 생산하는 재조합 균주들을 제작하였다. 상기의 재조합 트랜스-시알리다아제를 효모표면에 발현하는 재조합 균주가 포함하는 재조합 벡터 pYD1-Cdip_NanH를 도 9에 기술하였으며, 본 재조합 벡터에서의 단백질을 코딩하는 염기서열 및 상기의 재조합 벡터로부터 만들어지는 재조합 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 5와 서열번호 6에 기술하였다. 상기의 재조합 트랜스-시알리다아제를 효모 표면에 발현하는 재조합 균주 Saccharomyces cerevisiae EBY100/ pYD1-Cdip_NanH는 2007년 1월 22일자로 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 KCTC 11066BP로 기탁하였다.

효모 표면에 트랜스-시알리다아제를 발현하기 위하여 형질 전환된 재조합 효모 균주를 YDP 복합배지(효모추출물 10 g/L, 펩톤 20 g/L, 덱스트로오즈 20 g/L)로 30°C에서 24 시간 이상 전배양 하였다. 재조합 효모균주의 전배양액을 100분의 1 부피 비로 다시 2% 갈락토오즈와 0.5% 카사미노산(Casamino acid) 포함된 YNB-CAA 배지에 접종하여 30°C에서 48시간을 더 배양한 후 배양액에서 원심분리기를 통해 세포를 회수하였다.

효모 표면에 발현된 트랜스-시알리다아제는 회수된 균체에 1M DTT (Dithiothreitol)를 처리하여 세포표면에 발현된 트랜스-시알리다아제를 탈착시킨 후 마우스 안티-엑스프레스(mouse anti-Xpress^TM) 항체(Invitrogen, Carlsbad, California,USA)를 사용하여 웨스턴브롯을 통해 재조합단백질의 발현을 조사한 결과, 세포 표면에서 재조합단백질의 발현이 확인되었다(도10-A). 세포표면에 발현된 단백질을 확인하기 위해 세포를 마우스 안티-엑스프레스항체와 에프아이티시-콘쥬게이트(FITC-conjugate) 고트 안티 마우스 이뮤노글로불린 G(goat anti-mouse IgG) 항체를 사용하여 형광 라벨링을 시킨 후 공초점현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)을 이용하여 세포표면에 발현된 단백질을 확인하였다. 확인한 결과 트랜스-시알리다아제가 효모 표면에 발현된 것을 효모 표면에 나타나는 형광을 통해 공초점현미경으로 확인할 수 있었다(도10-B).

효모 표면에 발현된 트랜스-시알리다아제의 활성은 4-메틸움베릴페릴-알파-시알로사이드를 이용하여 갈락토오즈 주입 후 배양시간에 따른 전세포(whole cell)의 가수분해 활성을 측정하였다. 37℃에서 OD600nm에서 1.0의 효모를 50mM Tris-HCl (pH7.2)의 완충용액에서 1μM의 4-메틸움베릴페릴-알파-시알로사이드와 20분간 반응시켜 효소의 가수분해도를 플루오리미터(fluoremeter)로 측정하였다. 측정결과 갈락토오즈 주입후 48시간이 되는 시점에서 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 pYD1-Cdip_NanH 벡터를 가지고 있는 재조합 효모가 대조군인 pYD1 벡터만을 가지고 있는 효모에 비해 시알리다아제 활성이 1,000배 이상 높은 효소활성을 보여주었다(도 10-C).

실시예 9. 당쇄 -전구체, 당단백질의 복합당쇄 및 당지질의 당쇄 말단에 효모 표면에 발현된 트랜스- 시알리다아제를 이용한 시알산( NeuAc ) 잔기의 부착을 통한 시알산 유도체 생산

상기 실시예 8에서 기술한 효모 표면에 발현된 재조합 트랜스-시알리다아제를 사용하여 당쇄-전구체 또는 당단백질 복합당쇄 말단에 시알산 잔기를 부착시킬 수 있는지 조사하기 위하여 표 4에 기술한 피리딜아민 그룹이 부가된 당단백질의 복합당쇄 및 당지질 당쇄를 수용체로 사용하여 효소반응을 실시하였다. 본 실시예에서 사용한 시알산 공여체는 실시예 6에서 재조합 트랜스-시알리다아제가 가장 높은 활성을 보여준 시아릴-알파2,3-락토오즈를 사용하였다. 반응 조건은 1 mM의 시아릴-알파2,3-락토오즈가 포함된 50 mM MES 완충용액(pH 6.5)에서 당단백질의 복합당쇄 및 당지질 당쇄를 0.1 nM로 하여 효모표면에 발현된 재조합 트랜스-시알리다아제와 반응하였으며, 이때 반응 온도는 37℃이었다. 4 시간 효소 반응 후 생성된 시알산 부가 당쇄와 미반응 당쇄를 쇼덱스-아사이팩 NH2P-50 컬럼을 사용하여 형광측정기가 부착된 HPLC로 측정하였으며 시알산 부가 여부를 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 유래의 시알리다아제(sialidase)를 반응물에 처리하여 시알산을 전이 시킨후 생성 기질을 같은 방법으로 HPLC를 이용하여 측정하였다.

반응 후 시알산이 부가된 당단백질 및 당지질 당쇄는 쇼덱스-아사이팩 NH2P-50 컬럼을 사용하여 형광측정기가 부착된 HPLC로 측정하였다. 이때 이동상은 100%　아세토나이트릴(이동상 A)과 트리에틸아민으로 pH 7.3으로 적정된 20 mM 초산 완충용액(이동상 B)을 사용하였다. 이동상을 A 용액과 B 용액을 부피비 7.5:2.5의 비율로 시작하여 35분 후에 A 용액과 B 용액이 5.5:4.5의 비율로 농도구배가 되도록 하였다. 이때 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min 이었다.

표 4에 제시한 바와 같이 본 발명의 박테리아 유래의 재조합 트랜스 시알리다아제는 당단백질 및 당지질에 부착되는 복합당쇄에 비해 단당류, 이당류 등 작은 올리고당에 대해 약간 높은 반응성을 보이고 있으나, 전반적으로는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖는 특징이 있다.

[표 4]

재조합-트랜스시알리다아제에 의해 시알산 전이가 가능한 올리고당, 당단백질 당쇄, 및 당지질 당쇄

한국생명공학연구원

KCTC11065BP

20070122

한국생명공학연구원

KCTC11066BP

20070122

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 코리네박테리움 디프테리아 유래의 트랜스-시알리다아제.
제 1항에 있어서, pH5.0 내지 pH9.0에서 효소 활성을 가짐을 특징으로 하는 트랜스-시알리다아제.
제 1항에 있어서, pH6.0 내지 pH7.0에서 효소 활성을 최대로 가짐을 특징으로 하는 트랜스-시알리다아제.
제 1항의 트랜스-시알리다아제를 코딩하는 핵산분자.
제 4항에 있어서, 서열번호 5의 핵산분자.
제 4항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
제 5항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, 도 9의 개열지도로 표시되는 재조합 발현벡터 pYD1-Cdip_NanH.
제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 9항에 있어서, 수탁번호 KCTC 11066BP인 형질전환체.
제 6항의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 트랜스-시알리다아제의 제조방법.
제 11항에 있어서, 상기 숙주세포가 싸카로마이시스 세레비지(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 트랜스-시알리다아제를 이용하여 시알산을 포함하는 올리고당, 올리고다당, 당전구체, 당지질 또는 당단백질에서 시알산을 절단하는 방법.
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