KR20090007699A - 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 그것을 코드하는 유전자 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 높은 생산성 및/또는 높은 활성을 가지는 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 및 당해 시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한, 당해 시알산 전이효소를 생산하는 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 당해 시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 포함한 벡터, 및 당해 벡터로 형질전환한 숙주세포를 제공함과 동시에, 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 제조하는 방법을 제공한다.

β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소

Description

신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 그것을 코드하는 유전자 및 그 제조방법{NOVEL β-GALACTOSIDE α2,6-SIALYLTRANSFERASE, GENE CODING FOR THE TRANSFERASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 당해 효소를 코드하는 유전자, 당해 효소를 생산하는 미생물 및 당해 효소의 제조방법에 관한 것이다.

당전이 효소는 생체 내에 있어서 당단백질이나 당지질 등(이하, 복합 당질)의 당사슬의 생합성에 관여하는 효소이다. 그 반응 생성물인 복합 당질의 당사슬은 생체 내에 있어서 매우 중요한 기능을 가지고 있다. 예를 들면, 주로 포유류 세포에 있어서, 당사슬은 분화나 발생에 있어서의 세포간 및 세포-세포 외 매트릭스 간의 시그널 전달이나 복합 당질의 태그로서 기능하는 중요한 분자라는 사실 등이 밝혀지고 있다.

이것을 응용한 예로서, 혈액 중의 적혈구를 생산하는 호르몬인 에리스로포이에틴을 들 수 있다. 천연형의 에리스로포이에틴은 효과의 지속성이 낮은 결점이 있었다. 따라서, 에리스로포이에틴은 원래 당단백질이지만, 새로운 당사슬을 부가하는 것에 의하여, 생체 내에 있어서 수명을 향상시킨 재조합 에리스로포이에틴 단백 질이 개발, 제조되어 시판되었다. 이후에도 이와 같이 당사슬을 부가 혹은 개변한 의약품, 기능성 식품 등의 개발이 증가하고 있다고 여겨지고 있다. 따라서, 임의로 당사슬을 합성·생산하는 수단의 개발이 요구되고 있다. 특히, 가장 효율적인 수단의 하나로서, 당전이 효소의 개발의 중요성은 증가해 오고 있다.

지금까지 약 150종류 이상의 당전이 효소 유전자가 인간, 마우스, 흰쥐 및 효모 등의 진핵생물로부터 단리되어 왔다. 게다가 이러한 유전자는 CHO 세포나 대장균 등의 숙주세포에서 발현되어, 당전이 효소 활성을 가지는 단백질이 생산되어 왔다. 한편, 원핵생물인 세균으로부터도, 20~30종류 정도의 당전이 효소 유전자가 단리되어, 대장균을 더 이용하는 재조합 생산계로 당전이 효소 활성을 가지는 단백질이 발현되어, 그러한 기질 특성이나 효소 화학적인 제성질이 밝혀지고 있다.

시알산은, 당사슬의 비환원 말단에 존재하는 것이 많기 때문에, 당사슬의 기능 발현에 있어서 지극히 중요한 당이라고 여겨지고 있다. 그 때문에, 당전이 효소 중에서도 시알산 전이효소는 가장 수요가 높은 효소의 하나이다. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 및 그 유전자에 관해서, 동물, 특히 포유류 유래의 것이 많이 보고되고 있다(Hamamoto, T., et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145(1993); Weinstein, J., et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743(1987)). 그러나, 이러한 동물 유래의 효소는 정제가 곤란하여 대량으로 얻을 수 없기 때문에 매우 고가이고, 또한 효소로서의 안정성이 나쁘다는 문제를 가지고 있다. 한편, 세균 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 및 그 유전자로서는, 포토박테리움·담세라(Photobacterium damselae)에 속하는 미생물로부터 분리된 것이 유일하게 보고되 어 있다(국제공개 제WO98/38315호; 미국특허공보 제6255094호).

그러나, 포토박테리움·담세라 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의, 포토박테리움·담세라로부터의 생산성은 550U/L(Yamamoto, T.,et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(2), 210-214 (1998))이며, 또한, 그 유전자를 포함한 플라스미드 pEBSTΔ178을 형질전환한 대장균에 의한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 생산성은, 224.5U/L(Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 123, 94-100(1998))이며, 더욱 높은 생산성을 가지는 효소가 요구되고 있다. 또한, 포토박테리움·담세라 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 비활성은 5.5U/mg(Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110(1996))이며, 이 점에 있어서도 한층 더 활성이 높은 효소가 요구되고 있다.

또한, 효소의 종류는 다르지만, 공지의 세균 유래의 시알산 전이효소 중에서 생산성 및 활성이 비교적 높은 것으로서 파스튜렐라·물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 α2,3-시알산 전이효소를 들 수 있지만, 그 생산성은, 6,000U/L(Yu, H., et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619 (2005))이며, 비활성은 60U/mg이다.

시알산 전이효소의 수요가 높기 때문에, 생산성 및/또는 활성이 더 높은 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소가 요구되고 있다.

특허 문헌 1: 국제공개 제WO98/38315호 팜플렛

특허 문헌 2: 미국특허공보 제6255094호

비특허문헌 1: Hamamoto, T., et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993)

비특허문헌 2: Weinstein, J., et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987)

비특허문헌 3: Yamamoto, T., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(2), 210-214 (1998)

비특허문헌 4: Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 123, 94-100 (1998)

비특허문헌 5: Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)

비특허문헌 6: Yu, H., et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619 (2005)

발명이 해결하고자하는 과제

본 발명의 과제는, 비브리오과(科) 포토박테리움속(屬)에 속하는 미생물에서 유래하는 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 및 그것을 코드하는 유전자를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 세균 유래의 공지의 시알산 전이효소와 비교하여 보다 높은 생산성 및/또는 보다 높은 활성을 가지는, 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 및 그것을 코드하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 과제는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 유전자를 이용하여 유전자재조합 기술에 의해 본 효소를 고생산하는 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 일본 전국으로부터 4,000 균주 이상의 미생물을 분리해, 그 성질에 대해서 예의 연구에, 노력한 결과, 포토박테리움(Photobacterium) 속에 속하는 미생물의 균주로부터, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 생산하는 균주를 발견하였다. 그 다음으로 공지의 유전자인 포토박테리움·담세라(Photobacterium damselae) 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 DNA를 프로브에, 당해 균주로부터 신규한 α2,6-시알산 전이효소 유전자를 클로닝하였다. 본 신규 유전자를 대장균으로 발현시킨 결과, 본 유전자는 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하고, 그 효소 생산량은 1L의 배양액 당 약 10,700 U로 높은 것을 발견하였다. 또한, 이 신규한 재조합효소를 정제하여 상세하게 분석한 결과, 본 재조합효소는, 시알산을 당사슬 중의 갈락토오스 잔기, N-아세틸갈락토사민잔기 등에 α2,6 결합으로 효율 좋게 전이시켜, 그 비활성은 약 110U(유닛)/mg로부터 약 260U/mg로 높은 것도 발견하였다. 이와 같이, 많은 점에서 공지의 효소인 포토박테리움·담세라(Photobacterium damselae) 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소보다도 우수한 것을 밝혀, 본 발명을 완성시켰다. 본 발명은 높은 생산성 및/또는 높은 활성을 가지는, 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 및 그것을 코드하는 핵산, 및, 당해 시알산 전이효소를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 제공한다. 본 명세서에 있어서, 「 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소」란, 시티딘 1인산(CMP)-시알산으로부터 시알산을, 복합 당질 당사슬 혹은 유리 당사슬 중의 갈락토오스잔기의 6위, 락토오스 혹은 N-아세틸락토사민 등의 올리고당에 존재하는 갈락토오스의 6위, 또는 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, 글루코오스, N-아세틸글루코사민 혹은 만노스등의 복합 당질을 구성할 수 있는 단당으로서 6위의 탄소에 수산기를 가지는 단당의 6위에 전이시키는 활성을 가지는 단백질을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성」이란, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소에 대하여 상술한 활성을 의미한다. 또한, 여기에서 말하는 시알산이란, 시알산 패밀리에 속하는 뉴라민산 유도체를 나타낸다. 구체적으로는, N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac), N-글리코릴뉴라민산(Neu5Gc), 5-디아미노-5-히드록시뉴라민산(KDN), 디시알산(디N-아세틸뉴라민산:Neu5Acα2,8(9)Neu5Ac)등을 나타낸다.

본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이다. 서열 번호 4의 아미노산 서열은, 서열 번호 2의 아미노산 18-514의 아미노산 서열의 N말단에 메티오닌을 부가한 서열에 상당한다. 서열 번호 12의 아미노산 서열은, 서열 번호 2의 아미노산 111-514의 아미노산 서열의 N말단에 메티오닌을 부가한 서열에 상당한다. 이 N말단의 메티오닌은, 단백질 발현을 위한 개시코돈에서 유래하는 것으로, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소로서의 활성에 영향을 미치는 것은 아니다. 또한, 단백질의 N말단의 메티오닌은 종종 세포내 프로세싱에 의해서 탈락하는 경우가 있다. 따라서, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이라고 하는 경우는, 서열 번호 4와 완전하게 일치하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질인 경우뿐만 아니라, N말단의 메티오닌이 결실하고 있는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질인 경우도 포함한다.

실시예 2에 있어서, ISH224-NIC0/pTrc(서열 번호 4: 서열 번호 2의 아미노산 18-514의 아미노산 서열의 N말단에 메티오닌을 부가한 서열) 및, ISH224-N3C0/pTrc(서열 번호 12: 서열 번호 2의 아미노산 111-514의 아미노산 서열의 N말단에 메티오닌을 부가한 서열)도, JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 활성을 유지하였다. 따라서, 서열 번호 2 중 적어도 아미노산 111-514가 존재하면 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 활성을 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 「서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질」은, 서열 번호 2의 아미노산 1-514 중의 아미노산 1-110의 전부 또는 일부를 결실하고 있는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는, 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 11의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질이다. 서열 번호 3의 염기 서열은, 서열 번호 1의 염기 52-1545의 염기 서열의 5' 말단에 개시 코돈(ATG)을 부가한 서열에 상당한다. 서열 번호 11의 염기 서열은, 서열 번호 1의 염기 331-1545의 염기 서열의 5' 말단에 개시 코돈(ATG)을 부가한 서열에 상당한다. 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 11의 염기 서열은, 각각, 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 코드한다.

본 발명의 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 12-15의 서열은 Leu-Thr-Ala-Cys이며, 리포박스(lipobox)로 불리는 공통 서열이기 때문에, 세균 내에서, 이 공통 서열의 Cys 아미노 말단측에서 절단된다고 생각된다(Madan Babu, M. and Sankaran, K. Bioinformatics. 18, 641-643 (2002)). 따라서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는 서열 번호 2의 아미노산 15-514의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이어도 좋다. 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는, 서열 번호 1의 염기 43-1545의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질이어도 좋다.

본 발명은 또한, 상기의 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 변이체로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 변이단백질도 포함한다. 이러한 변이단백질도 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소에 포함된다.

본 발명의 변이체 단백질은, 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 15-514, 서열 번호 4, 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함한 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질이어도 좋다. 치환은 보존적 치환이어도 좋고, 이것은 특정의 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 가지는 잔기로 치환한 것이다. 보존적 치환의 비한정적인 예에는, Ile, Val, Leu 또는 Ala 상호치환과 같은 지방족기 함유 아미노산 잔기 간의 치환, Lys 및 Arg, Glu 및 Asp, Gln 및 Asn 상호 치환과 같은 극성 잔기 간에서의 치환 등이 포함된다.

아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의한 변이체는, 야생형 단백질을 코드하는 DNA에, 예를 들면 주지 기술인 부위특이적 변이유발(예를 들면, Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982참조, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)을 일으키는 것에 의해 작성할 수 있다. 본 명세서 에 있어서, 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 부위특이적 변이유발법에 의해 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있는 정도의 아미노산을 의미한다.

부위특이적 변이유발법은, 예를 들면, 소망하는 변이인 특정의 불일치 이외에는, 변이를 받아야 할 한 가닥 사슬 파지 DNA에 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 다음과 같이 실시할 수 있다. 즉, 프라이머로서 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 파아지에 상보적인 사슬을 합성시키고, 얻어진 이중사슬 DNA로 숙주세포를 형질전환한다. 형질전환된 세균의 배양물을 한천에 플레이팅하고, 파아지를 함유하는 단일세포로부터 플라그를 형성시킨다. 그렇게 하면, 이론적으로는 50%의 새로운 콜로니가 한 가닥 사슬로서 변이를 가지는 파아지를 함유하고, 나머지의 50%가 원래의 서열을 가진다. 상기의 소망하는 변이를 가지는 DNA와 완전하게 일치하는 것과는 혼성화(hybridize)하지만, 원래의 사슬을 갖는 것과는 혼성화하지 않는 온도에 있어서, 얻어진 플라그를 키나아제 처리에 의해 표지한 합성 프로브와 혼성화시킨다. 다음에 당해 프로브와 혼성화하는 플라그를 모으고, 배양하여 DNA를 회수한다.

또한, 효소 등의 생물활성 펩타이드의 아미노산 서열에 그 활성을 유지하면서 1 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 일으키는 방법으로서는, 상기의 부위특이적 변이유발 이외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열하고, 다음에 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환, 삽입 또는 부가하고, 뒤이어 연결하는 방법도 있다.

본 발명의 변이체 단백질은 또한, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질이어도 좋다. 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는, 부위특이적 변위 유발 이외에 상술한 방법에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 변이체 단백질은 또한, 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질이어도 좋다.

또는, 본 발명의 변이체 단백질은, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열과, 적어도 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 동일성을 가지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질이어도 좋다.

2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해서 결정해도 좋다. 혹은, 2개의 단백질 서열의 동일성 퍼센트는, Needleman, S. B. 및 Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970)의 알고리즘에 근거하여, 그리고 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(UWGCG)에서 입수가능한 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써, 결정해도 좋다. GAP 프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) Henikoff, S. 및 Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992)에 기재된 것과 같은, 스코어링·매트릭스, blosum62; (2) 12의 갭 가중; (3) 4의 갭 길이 가중; 및 (4) 말단 갭에 대한 패널티 없음이 포함된다.

당업자에게 이용되는, 서열 비교 이외의 프로그램도 또한, 이용하여도 좋다. 동일성의 퍼센트는, 예를 들면 Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재되어 있는 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 정보와 비교하여 결정하는 것이 가능하다. 당해 프로그램은, 인터넷상에서 National Center for Biotechnology Information(NCBI), 혹은 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트로부터 이용하는 것이 가능하다. BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종조건(파라미터)은 상기 사이트에 자세하게 기재되어, 일부의 설정을 적절하게 변경하는 것이 가능하지만, 검색은 통상 디폴트 값를 이용하여 실시한다. 또는, 2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 유전정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스 제)등의 프로그램, 또는, FASTA 알고리즘 등을 이용하여 결정해도 좋다. 그 경우, 검색은 디폴트 값을 이용하여도 좋다.

2개의 핵산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사와 수학적 계산에 의해 결정이 가능하거나, 또는 보다 바람직하게는, 이 비교는 컴퓨터·프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교하는 것에 의하여 이루어진다. 대표적인, 바람직한 컴퓨터·프로그램은, 유전학 컴퓨터·그룹(GCG; 위스콘신 주 매디슨)의 위스콘신·패키지, 버젼 10.0 프로그램 「GAP」이다(Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387). 이 「GAP」프로그램의 사용에 의해, 2개의 핵산 서열의 비교 이외에, 2개의 아미노산 서열의 비교, 핵산 서열과 아미노산 서열과의 비교를 행할 수 있다. 여기에서, 「GAP」프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) 뉴클레오티드에 대한 (동일물에 대해서 1, 및 비동일물에 대해서 0의 값을 포함한다) 일원(unary) 비교 매트릭스의 GCG 실행과 Schwartz 및 Dayhoff 감수 「폴리펩티드의 서열 및 구조의 아틀라스(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)」국립 바이오 의학연구 재단, 353-358 페이지, 1979에 기재된 것과 같은, Gribskov 및 Burgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986의 가중 아미노산 비교 매트릭스; 또는 다른 비교 가능한 비교 매트릭스; (2) 아미노산의 각 갭에 대해서 30의 패널티와 각 갭중의 각 기호에 대해서 추가의 1의 패널티; 또는 뉴클레오티드서열의 각 갭에 대해서 50의 패널티와 각 갭중의 각 기호에 대해서 추가의 3의 패널티; (3) 엔드 갭에의 노-패널티; 및 (4) 긴 갭에는 최대 패널티 없음이 포함된다. 당업자에 의해 사용되는 다른 서열 비교 프로그램에서는, 예를 들면, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에 의해 사용이 이용가능한 BLASTN프로그램, 버젼 2.2.7, 또는 UW-BLAST 2.0 알고리즘이 사용가능하다. UW-BLAST 2.0에 대한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트:http://blast.wustl.edu에 기재되어 있다. 또한 BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어 부착 매트릭스를 사용하고, 사용가능한 선택파라미터는 이하와 같다: (A) 낮은 조성복잡성을 가지는 쿠에리-서열의 세그먼트(Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다; Wootton 및 Federhen, 1996「서열데이터베이스에 있어서의 조성편중영역의 분석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71도 참조바람), 또는, 단주기성 내부 리피트로 이루어지는 세그먼트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정된다)를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이터베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 역치, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단순히 우연하게 발견되는 적합의 기대 확률; 있는 적합에 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 역치보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다); 바람직한 E-스코어 역치의 수치는 0.5이거나, 또는 바람직함이 증가하는 순으로, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75, 또는 1e-100이다.

본 발명의 변이단백질은 또한, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열의 상보사슬에 스트린젠트한 조건으로 혼성화하는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질이어도 좋다.

여기에서, 「스트린젠트한 조건 하」란, 중간 정도 또는 높은 정도로 스트린젠트한 조건에 있어서 혼성화하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 예를 들면, DNA의 길이에 근거해, 일반적인 기술을 가지는 당업자에 의해서, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 기본적인 조건은, Sambrook등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3판, 제6-7장, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 나타나고, 그리고 니트로셀룰로오스 필터에 관해, 5×SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 전(前) 세정용액, 약 40-50℃에서, 약 50% 포름아미드, 2×SSC-6×SSC(또는 약 42℃에서 약 50% 포름아미드 중의, 스타크용액(Stark's solution)등의 다른 유사의 혼성화(hydridization)용액)의 혼성화조건, 및 예를 들면, 약 40℃-60℃, 0.5-6×SSC, 0.1% SDS의 세정 조건의 사용이 포함된다. 바람직하게는 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 약 50℃, 6×SSC의 혼성화 조건(및 세정 조건)을 포함한다. 고(高) 스트린젠트한 조건도 또한, 예를 들면 DNA의 길이에 근거해, 당업자에 의해서, 용이하게 결정하는 것이 가능하다.

일반적으로, 이러한 조건은, 중간 정도로 스트린젠트한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염농도에서의 혼성화(예를 들면, 약 65℃, 6×SSC 내지 0.2×SSC, 바람직하게는 6×SSC, 보다 바람직하게는 2×SSC, 가장 바람직하게는 0.2×SSC의 혼성화) 및/또는 세정을 포함하고, 예를 들면 상기와 같은 혼성화 조건, 및 대략 65℃-68℃, 0.2×SSC, 0.1% SDS의 세정을 따른다고 정의된다. 혼성화 및 세정의 완충액에서는, SSC(1×SSC는, 0.15M NaCl 및 15mM 구연산나트륨이다)에 SSPE(1×SSPE는, 0.15M NaCl, 10mM NaH₂PO₄, 및 1.25mM EDTA, pH 7.4이다)를 대용하는 것이 가능하고, 세정은 혼성화가 완료한 후에 15분간 실시한다.

또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판의 혼성화 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, ECL direct labeling & detection system(Amersham 사제)를 사용한 혼성화 등을 들 수 있다. 스트린젠트한 혼성화로서는, 예를 들면, 키트 중의 hybridization buffer에 Blocking 시약을 5% (w/v), NaCl을 0.5M이 되도록 가하고, 42℃에서 4시간 실시하며, 세정은, 0.4% SDS, 0.5xSSC중에서, 55℃에서 20분을 2회, 2xSSC중에서 실온, 5분을 1회 실시한다는 조건을 들 수 있다.

시알산 전이효소 활성은, 공지의 수법, 예를 들면, J. Biochem., 120, 104-110 (1996)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있는 방법으로 측정해도 좋다. 예를 들면, 당 공여체 기질로서 CMP-NeuAc(N-아세틸뉴라민산)을, 그리고 당 수용체 기질로서 락토오스를 이용하여 효소반응을 실시해, 반응 생성물인 시아릴 락토오스의 양을 평가하는 것으로 효소활성을 평가할 수 있다. 또한, 효소 1단위(1U)는, 1분간에 1마이크로몰의 시알산을 전이하는 효소량이다.

당 수용체 기질에 전이한 시알산의 결합양식의 결정방법으로서는, 한정하는 것은 아니지만, 피리딜 아미노화 당사슬을 이용하는 수법, 반응 생성물의 핵자기공명분광법(NMR)에 의한 분석 등, 당업자에게 공지된 수법의 어느 쪽이든 이용하여 실시할 수 있다. 피리딜 아미노화 당사슬을 이용하는 수법은, 피리딜 아미노화 당사슬을 당 수용체 기질로서 효소반응을 실시하는 것을 포함한다. 구체적으로는, 피리딜 아미노화 락토오스(Gal β1-4Glc-PA, 다카라 바이오 제)을 당 수용체 기질, CMP-NeuAc를 당 공여체 기질로서 이용하여 효소반응을 실시해, 반응 생성물을 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석해, 반응 생성물의 보유시간으로부터 시알산이 전이된 위치를 특정한다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 본 발명의 효소는, 포토박테리움속에 속하는 미생물 유래이다. 본 발명의 효소는, 포토박테리움속에 속하는 미생물이면 특별히 한정되지 않고, 포토박테리움속에 속하는 신종의 미생물 유래의 효소이어도 좋다.

본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 효소학적 성질 및 이화학적 성질은, 상기에 정의한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 것 외에, 한정하는 것은 아니지만, 최적 pH가 pH 5~6의 범위이며, 최적온도가 25~35℃이고,분자량이 SDS-PAGE분석으로 56,000±3,000Da 정도이다.

또한, 한 양태에 있어서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는, 높은 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 여기에서, 높은 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성이란, 효소 lmg 당 6U 이상, 10U 이상, 20U 이상, 40U 이상, 60U 이상, 100U 이상의 활성을 가지는 것을 말한다.

β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산

본 발명은, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 핵산은, 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 15-514, 서열 번호 4, 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는 핵산이다. 본 발명의 핵산은 또한, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 염기 43-1545, 서열 번호 3, 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산이다.

본 발명의 핵산은, 상기의 핵산의 변이체로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 핵산이어도 좋다. 그러한 핵산도 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산에 포함된다.

그러한 핵산의 변이체는, 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 15-514, 서열 번호 4, 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함한 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 핵산이다. 본 발명의 핵산의 변이체는 또한, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 염기 43-1545, 서열 번호 3, 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 그것보다 많은 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함한 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산이다. 아미노산 또는 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 및/부가는, 상술한 방법에 의해 도입할 수 있다.

또한, 그러한 핵산의 변이체는, 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 15-514, 서열 번호 4, 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 핵산이다. 본 발명의 핵산의 변이체는 또한, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 염기 43-1545, 서열 번호 3, 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열과, 바람직하게는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 동일성을 가지는 핵산으로서, 당해 핵산은 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 상기 핵산이다. 여기에서, 아미노산 서열 또는 염기 서열의 동일성은, 상기에 나타낸 방법으로 결정할 수 있다.

그러한 핵산의 변이체는 더욱이, 서열 번호 1, 서열 번호 1의 염기 43-1545, 및 서열 번호 3, 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열의 상보사슬에 스트린젠트한 조건, 또는 고도로 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 당해 핵산은 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 상기 핵산이다. 여기에서, 스트린젠트한 조건 또는 고도로 스트린젠트한 조건이란, 상기에서 정의했던 대로이다.

β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소를 발현하는 미생물

본 발명자들은, 비브리오과 포토박테리움속에 속하는 미생물이 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 발현하는 것을 발견해냈다. 따라서 본 발명은, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 발현하는 미생물을 제공한다. 본 발명의 미생물은, 포토박테리움속에 속하고, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 생산능력을 가지는 미생물이다. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 생산능력을 가지는 포토박테리움속에 속하는 미생물의 예로서는, 포토박테리움속(Photobacterium sp.) JT-ISH-224주(기탁 번호:NITE BP-87)을 들 수 있다. 또한, 상기의 포토박테리움속의 미생물은 일반적으로 해양성 세균이며, 해수 중 또는 해산(海産)의 어패류로부터 분리된다. 예를 들면, 본 발명의 포토박테리움속 JT-ISH-224주는 이시카와현산의 카마스로부터 분리된 것이다.

본 발명의 미생물은, 예를 들면 이하에서 설명하는 것과 같은 스크리닝법을 이용하여 분리할 수 있다. 해수(海水), 해사(海砂), 해니(海泥) 혹은 해산 어패류를 미생물원으로 한다. 해수, 해사, 해니는 그대로 혹은 멸균 해수로 희석해, 접종원으로 한다. 해산 어패류는 표면의 점액 등을 루프로 마찰시켜 뽑아내어 접종원으로 하거나, 내장기를 멸균 해수 중에 마사슬한 액체를 접종원으로 한다. 이것들을 마린 브로스 아가 2216배지(벡톤·디킨슨제)나 염화나트륨 첨가 뉴트리엔트 아가 배지(벡톤·디킨슨제)등의 평판배지 상에 도포해, 여러가지 온도조건 하에서 생육하는 해양성 미생물을 취득한다. 통상적인 방법에 따라, 얻어진 미생물을 순수배양한 후, 마린 브로스 2216배지(벡톤·디킨슨제)나 염화나트륨 첨가 뉴트리엔트 브로스 배지(벡톤·디킨슨제)등의 액체배지를 이용하여, 각각의 미생물을 배양한다. 미생물이 충분히 생육한 후, 배양액으로부터 균체를 원심분리에 의해서 모은다. 모은 균체에 계면활성제인 0.2% 트리톤 X-100(칸토 화학제)을 포함한 20mM 카코딜레이드 완충액(pH 6.0)을 첨가하여, 균체를 현탁한다. 이 균체 현탁액을 빙랭(氷冷)하, 초음파처리하여 세포를 파쇄한다. 이 세포 파쇄액을 효소용액으로 하여, 통상적인 방법에 따라서 시알산 전이활성을 측정하여, 시알산 전이활성을 가지는 균주를 얻을 수 있다.

본 발명의 포토박테리움속 JT-ISH-224주는 상기의 스크리닝법을 이용하는 것으로 얻어졌다. 얻어진 상기의 균주의 균학적 성질 및 생리학 생화학적 성질, 및 16S-rRNA 유전자의 염기 서열분석에 의한 종의 동정에 대해서는, 실시예 1에서 상술한다.

포토박테리움속 JT-ISH-224주는, 부다페스트조약의 규약에 따라서, 2005년 3월 11일자로 NITE BP-87으로서, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁센터-(NPMD: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary; 일본 치바현 키사라즈시가즈사 가마다리 2-5-8)에 기탁되고있다.

β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소를 제조하는 방법

본 발명은, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 제조하는 방법과도 관련된다. 바람직한 양태에 있어서 본 발명의 방법은, 본 발명의 효소를 고생산한다. 구체적으로는, 본 발명의 방법에 있어서의 본 발명의 효소생산성은, 1L 배양액 당 50U/L 이상, 1,000U/L 이상, 10,000U/L 이상이다.

(1) β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소를 발현하는 미생물을 배양하는 것에 의한 당해 효소의 제조방법

본 발명의 한 양태에 있어서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는 포토박테리움속에 속하는 미생물 유래이며, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 생산능력을 가지는 미생물을 배지에 배양하고, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 생산시켜, 이것을 채취하는 것에 의해서 얻을 수 있다.

여기에서 이용하는 미생물로서는, 포토박테리움속에 속하고, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 생산능력을 가지는 미생물이면, 어느 균주에서도 이용할 수 있다. 포토박테리움속에 속하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 있어서 이용하는 미생물의 예로서는, 포토박테리움속 JT-ISH-224주(기탁 번호 NITE BP-87)를 들 수 있다.

상기 미생물의 배양에 이용하는 배지로서는, 그러한 미생물이 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기물 등을 포함하는 것을 이용한다. 탄소원으로는, 펩톤, 트립톤, 카세인분해물, 육즙, 포도당 등을 들 수 있고, 바람직하게는 펩톤을 이용한다. 질소원으로는, 효모 엑기스를 이용하는 것이 바람직하다. 염류로는, 염화나트륨, 구연산철, 염화마그네슘, 황산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 브롬화칼륨, 염화스트론튬, 붕산나트륨, 규산나트륨, 플루오르화나트륨, 질산암모늄, 인산수소2나트륨 등을 적절히 조합시켜 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 성분을 포함한 마린 브로스 2216배지(벡톤·디킨슨제)를 이용하여도 좋다. 또한, 상기 염류를 적절히 포함한 인공해수를 이용하여, 이것에 펩톤, 효모 엑기스 등을 첨가한 배지를 사용하여도 좋다. 배양 조건은 배지의 조성이나 균주에 따라 다소 다르지만, 예를 들면, 포토박테리움속 JT-ISH-224주를 배양하는 경우, 배양 온도는 20~30℃, 바람직하게는 25~30℃정도, 배양 시간은 6~48시간, 바람직하게는 15~24시간 정도이다.

목적하는 효소는 균체 내에 존재하기 때문에, 공지의 균체 파쇄법, 예를 들면 초음파 파쇄법, 프렌치 프레스 파쇄법, 글래스비즈 파쇄법, 다이노밀 파쇄법 등의 어느 방법을 실시하면 좋고, 그 균체 파쇄물로부터 목적하는 효소를 분리정제 한다. 본 발명의 방법에 있어서의 바람직한 균체 파쇄법은 초음파 파쇄법이다. 예를 들면, 균체 파쇄물로부터 원심분리에 의해 고체물을 제거한 후에, 얻어진 균체 파쇄액상청을 시판의 음이온교환칼럼, 양이온교환칼럼, 겔여과 칼럼, 히드록시아파타이트 칼럼, CDP-헥산올아민아가로스칼럼, CMP-헥산올아민아가로스칼럼, 소수성 칼럼 등의 칼럼크로마토그래피 및 네이티브-PAGE등을 적절히 조합하여 정제할 수 있다.

또한, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는 완전히 정제해도 좋지만, 부분 정제품에서도 충분한 활성을 가지기 때문에, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는 정제품이어도 좋고, 또는 부분 정제품이어도 좋다.

(2) 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소를 제조하는 방법

본 발명은, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 당해 발현 벡터를 함유하는 숙주세포를 제공한다. 그리고, 본 발명은, 당해 발현 벡터를 함유하는 숙주세포를, 재조합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 발현된 재조합 단백질을 회수하는 것에 의하여 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 제조하는 방법도 제공한다.

본 발명의 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 제조하기 위해서는, 사용하는 숙주에 따라서 선택된 발현 벡터에, 포유동물, 미생물, 바이러스, 또는 곤충 유전자 등으로부터 유도된 적당한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드서열에 기능 가능하게 연결한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산 서열을 삽입한다. 조절 서열의 예로서, 전사 프로모터, 오퍼레이터, 또는 인핸서, mRNA 리보솜 결합부위, 및, 전사 및 번역의 개시 및 종결을 제어하는 적절한 서열을 들 수 있다.

본 발명의 벡터에 삽입되는 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산서열은, 상술한 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산의 염기 서열이다. 이 서열은, 리더서열을 포함하고 있어도, 포함하지 않아도 좋다. 리더서열을 포함하는 경우, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-42에 상당하는 리더서열이어도 좋고, 또한 다른 생물원 유래의 리더서열로 치환하여도 좋다. 리더서열을 치환하는 것에 의해서, 발현한 단백질을 숙주세포의 밖에 분비시키도록 발현 시스템을 설계하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질은, 당해 효소를 코드하는 핵산에 이어서, His태그, FLAG^TM태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 등을 코드하는 핵산을 연결한 핵산을 벡터에 삽입하는 것에 의하여, 융합 단백질로서 발현하는 것도 가능하다. 본 발명의 효소를 이러한 융합 단백질로서 발현 시키는 것에 의하여, 당해 효소의 정제 및 검출을 용이하게 할 수 있다.

β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질의 발현에 적합한 숙주세포에는, 원핵세포, 효모 또는 고등진핵세포가 포함된다. 세균, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주로 이용하는 적절한 클로닝 및 발현 벡터는, 예를 들면, Pouwels 등, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있다.

원핵생물에는, 그램 음성 또는 그램 양성균, 예를 들면, 대장균 또는 고초균이 포함된다. 대장균과 같은 원핵세포를 숙주로 사용하는 경우, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질은, 원핵세포 내에서의 재조합 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하기 위해서 N말단 메티오닌잔기를 포함하도록 해도 좋다. 이 N말단 메티오닌은, 발현 후에 재조합 α2,6-시알산 전이효소 단백질로부터 절리할 수도 있다.

원핵 숙주세포 내에서 이용하는 발현 벡터는, 일반적으로 1 또는 2 이상의 표현형 선택가능 마커유전자를 포함한다. 표현형 선택가능 마커유전자는, 예를 들면, 항생물질내성을 부여하거나, 또는 독립영양요구성을 부여하는 유전자이다. 원핵숙주세포에 적합한 발현 벡터의 예에는, pBR322(ATCC37017)와 같은 시판의 플라스미드 또는 그것들로부터 유도되는 것이 포함된다. pBR322는, 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로, 형질전환세포를 동정하는 것이 용이하다. 적절한 프로모터 및 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 핵산의 DNA 서열이, 이 pBR322 벡터 내에 삽입된다. 다른 시판의 벡터에는, 예를 들면, pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, 스웨덴, 웁살라) 및 pGEM1(Promega Biotech., 미국, 위스콘신주, 메디슨)등이 포함된다.

원핵숙주세포용 발현 벡터에 있어서 통상 이용되는 프로모터 서열에는, tac 프로모터, β-락타마아제(페니실리나아제)프로모터, 락토오스 프로모터(Chang등, Nature 275:615, 1978; 및 Goeddel등, Nature 281:544, 1979, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다.)등이 포함된다.

또한, 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 효모 숙주 내에서 발현시켜도 좋다. 바람직하게는, 사카로미세스속(Saccharomyces, 예를 들면, S.cerevisiae)를 이용하지만, 피키아속(Pichia) 또는 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces)과 같은 다른 효모 속을 이용하여도 좋다. 효모 벡터는, 2μ 효모 플라스미드로부터의 복제 기점의 서열, 자립복제서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열, 및 선택 가능한 마커유전자를 함유하는 것이 많다. 효모α인자 리더서열을 이용하여, 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질의 분비를 실시하게 할 수도 있다. 효모 숙주로부터의 재조합 폴리펩티드의 분비를 촉진하는데 적합한 다른 리더서열도 알려져 있다. 효모를 형질전환하는 방법은, 예를 들면, Hinnen등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933, 1978(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있다.

포유동물 또는 곤충 숙주세포 배양계를 이용하고, 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 발현할 수도 있다. 포유동물기원의 주화(株化)세포계도 이용할 수 있다. 포유동물 숙주세포 발현 벡터를 위한 전사 및 번역 제어 서열은, 바이러스 게놈으로부터 얻을 수 있다. 통상 이용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스2 등에서 유도된다. SV40 바이러스 게놈, 예를 들면, SV40 기점, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 부위, 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도되는 DNA 서열을 이용하여, 포유동물 숙주세포 내에서의 구조 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전자 요소를 부여해도 좋다. 포유동물 숙주세포 내에서 이용하기 위한 벡터는, 예를 들면, Okayama 및 Berg(Mol. Cell. Biol., 3:280, 1983, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다.)의 방법으로 구축할 수 있다.

본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 산생(産生)하는 1가지의 방법은, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포를, 당해 단백질이 발현하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 계속하여, 이용한 발현계에 따라 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 배양배지 또는 세포 추출액으로부터 회수한다.

재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 정제하는 조작은, 이용한 숙주의 형(型) 및 본 발명의 단백질을 배양배지 중에 분비시킬지 어떨지하는요인에 따라서 적절히 선택된다. 예를 들면, 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 정제하는 조작에는, 음이온교환칼럼, 양이온교환칼럼, 겔여과 칼럼, 히드록시아파타이트 칼럼, CDP-헥산올아민아가로스 칼럼, CMP-헥산올아민아가로스 칼럼, 소수성 칼럼 등의 칼럼크로마토그래피 및 네이티브-PAGE등, 또는 그러한 조합이 포함된다. 또한, 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소에 정제를 용이하게 하는 태그 등을 융합시켜 발현시켰을 경우에는, 어피니티크로마토그래피에 의한 정제 방법을 이용하여도 좋다. 예를 들면, 히스티딘 태그, FLAG^TM 태그, 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 등을 융합시켰을 경우에는, 각각, Ni-NTA(니트릴로트리아세트산)칼럼, 항FLAG 항체를 연결한 칼럼, 또는 글루타치온을 연결한 칼럼 등을 이용하여 어피니티크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는 전기영동적으로 단일 밴드로 될 때까지 정제해도 좋지만, 부분정제품에서도 충분한 활성을 가지기 때문에, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는 정제품이어도 좋고, 또는 부분 정제품이어도 좋다.

항체

본 발명은, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질, 또는 그 단편에 대하여 제작해도 좋다. 여기에서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 단편은, 당해 효소의 아미노산 서열 중, 적어도 6 아미노산, 적어도 10 아미노산, 적어도 20 아미노산, 또는 적어도 30 아미노산을 포함한 서열을 가지는 단편이다.

항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 또는 그 단편을, 당해 기술분야에 있어서 항체 제작을 위해 이용되는 동물, 예를 들면, 한정되는 것은 아니지만, 마우스, 흰쥐, 토끼, 기니피그, 염소 등에 면역하여 제작해도 좋다. 항체는 폴리클론성 항체이어도, 또는 모노클론성 항체이어도 좋다. 항체는, 당업자에게 주지한 항체 제작방법에 근거하여 제작할 수 있다.

본 발명의 항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을 어피니티 정제에 의해 회수하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질을, 웨스턴 블로팅이나 ELISA 등의분석에 있어서 검출하는데 이용할 수도 있다.

발명의 효과

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 및 그것을 코드하는 핵산을 제공하는 것으로서, 생체 내에 있어서 중요한 기능을 가진다는 점이 밝혀진 당사슬의 합성·생산수단을 제공한다는 관점에 있어서 공헌한다. 특히, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는, 기존의 것과 비교해도, 생산효율이 높고, 비활성이 높고, 수용체 기질 특이성이 더욱 광범위하다. 시알산은, 생체 내의 복합당질 당사슬에 있어서 비환원 말단에 존재하는 것이 많고, 당사슬 기능이라는 관점에서 매우 중요한 당이기 때문에, 시알산 전이효소는 당전이 효소 중에서도 가장 수요가 높은 효소의 하나이며, 본 발명의 신규한 시알산 전이효소의 제공은, 그러한 높은 수요에 응하는 것이다.

[도 1a] 도 1a는, JT-ISH-224주 조효소액을, 피리딜아미노화 락토오스(PA-락토오스) 및 CMP-시알산에 반응시킨 반응용액의 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다. 보유시간이 3.995분의 정점은 PA-락토오스, 4.389분의 정점은 PA-6'-시아릴 락토오스, 5.396분의 정점은 PA-3'-시아릴 락토오스이다.

[도 1b] 도 1b는, JT-ISH-224주 조효소액을, 피리딜 아미노화(PA) 락토오스에 반응시킨 반응용액의 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다. 도 1a의 실험에 대해서 시알산 공여체인 CMP-시알산을 반응액에 혼합하고 있지 않은 대조실험의 결과이다. 보유시간이 3.993분의 정점은 PA-락토오스이다.

[도 1c] 도 1c는, PA-락토오스의 표품의 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다. PA-락토오스는, 보유시간 4.026분의 정점으로서 나타내어진다.

[도 1d] 도 1d는, PA-3'-시아릴 락토오스의 표품의 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다. PA-3'-시아릴 락토오스는, 보유시간 5.447분의 정점으로서 나타내어진다.

[도 1e] 도 1e는, 공지의 효소인 Photobacterium damselae JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 PA-락토오스 및 CMP-시알산에 반응시킨 반응용액(피리딜아미노화 α2,6-시아릴 락토오스가 생성되고 있다)의 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다. 보유시간이 4.000분의 정점은 PA-락토오스, 4.406분의 정점은 PA-6'-시아릴 락토오스이다.

[도 1f] 도 1f는, 공지의 효소인 Photobacterium damselae JTO160주 유래의 α2,6-시알산 전이효소를 PA-락토오스에 반응시킨 반응용액의 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다. 도 1e의 실험에 대해, CMP-시알산을 반응액에 혼합하고 있지 않은 대조실험이다. 보유시간이 3.995분의 정점은 PA-락토오스이다.

[도 2a] 도 2a는, JT-ISH-224 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 NlC0의 효소활성에 있어서의 반응 pH의 영향을 나타내는 그래프이다. 도 중의 약호는, 각각 이하의 것을 나타낸다: Ac: 아세트산 완충액, Cac: 카코딜산 완충액, Phos: 인산 완충액, TAPS: TAPS 완충액.

[도 2b] 도 2b는, JT-ISH-224 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N1CO의 효소활성에 있어서의 반응 온도의 영향을 나타내는 그래프이다.

[도 2c] 도 2c는, JT-ISH-224 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N1CO의 효소활성에 있어서의 반응액 중의 NaCl 농도의 영향을 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발 명의 기술적 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 근거해 용이하게 본 발명에 수정·변경을 가할 수 있고, 그들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 1: β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소를 생산하는 미생물의 스크리닝과 균주의 동정

해수, 해사, 해니 혹은 해산 어패류를 접종원으로 하였다. 이 접종원을 마린 브로스 아가 2216배지(벡톤·디킨슨제)로 이루어지는 평판배지 상에 도포하고, 15℃, 25℃ 혹은 30℃에서 생육하는 미생물을 취득하였다. 통상적인 방법에 따라, 얻어진 미생물을 순수배양한 후, 마린 브로스 2216배지(벡톤·디킨슨제)로 이루어지는 액체배지를 이용하여 각각의 미생물을 배양하였다. 미생물을 충분히 성육한 후에, 배양액으로부터 균체를 원심분리에 의해서 모았다. 모은 균체에, 0.2% 트리톤 X-100(칸토 화학제)을 포함하는 20mM 카코딜레이드 완충액(pH 6.0)을 첨가하여, 균체를 현탁하였다. 이 균체 현탁액을 빙랭하, 초음파처리하여 세포를 파쇄하였다. 이 세포 파쇄액을 조효소 용액으로서 시알산 전이활성을 측정하여, 시알산 전이활성을 가지는 균주 JT-ISH-224주를 얻었다. 또한 JT-ISH-224주는 카마스의 내장으로부터 얻을 수 있었다.

시알산 전이활성은, J. Biochem., 120, 104-110 (1996)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있는 방법으로 측정하였다. 구체적으로는, 당 공여체 기질 CMP-NeuAc(70nmol, ¹⁴C로 NeuAc를 라벨한 CMP-NeuAc 약 20,000cpm를 포함한다. NeuAc는 N-아세틸뉴라민산을 나타낸다), 당 수용체 기질로서 락토오스(1.25μmol), NaCl을 0.5M 농도가 되도록 첨가하고, 상기에 기재한 방법으로 조제한 효소를 포함한 반응용액(30㎕)을 이용하여 효소반응을 실시하였다. 효소반응은 25℃에서 10분간에서 180분간 정도 실시하였다. 반응 종료 후, 반응용액에 1.97㎖의 5mM 인산 완충액(pH 6.8)을 가하고, 이 용액을 Dowex1×8(PO₄ ³-폼, 0.2×2cm, BIO-RAD제) 칼럼에 제공하였다. 이 칼럼의 용출액(0~2㎖)에 포함되는 반응 생성물, 즉, 시아릴 락토오스에 포함되는 방사활성을 측정하는 것으로, 효소활성을 산출하였다. 효소 1단위(1U)는, 1분간 1마이크로몰의 시알산을 전이하는 효소량이다.

다음으로, 시알산의 결합양식을 분명히 하기 위해서, PA-락토오스를 기질로하는 반응을 실시하였다. 얻어진 조효소액을 이용하여, 피리딜 아미노화 당사슬을 당 수용체 기질로서 효소반응을 실시하였다. 피리딜 아미노화 당사슬로서는, 피리딜 아미노화 락토오스(Galβ1-4Glc-PA, 다카라 바이오 제)를 이용하여 분석하였다. 5㎕의 조효소 액체에 1.5㎕의 5mM CMP-NeuAc 및 1.5㎕의 10pmol/㎕ 당 수용체 기질을 가해, 25℃하에서 18시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 100℃에서 2분간 반응용액을 처리하는 것에 의해 효소를 실활(失活)시켰다. 그 후, HPLC로 반응생성물의 분석을 실시하였다. HPLC 시스템으로서 Shimadzu LC10A(쉬마즈 제작소 제)를 이용하여, 분석 칼럼에는 Takara PALPAK Type R(다카라 바이오 제)을 이용하였다. 0.15% N-부탄올을 포함한 100mM 아세트산-트리에틸아민(pH 5.0)으로 평형화한 칼럼에 72㎕의 용출액 A(100mM 아세트산-트리에틸아민, pH 5.0)을 가한 반응액을 주입하였 다. 피리딜 아미노화 당사슬의 용출에는 용출액 A(100mM 아세트산-트리에틸아민, pH 5.0) 및 용출액 B(0.5%, n-부탄올을 포함하는 100mM 아세트산-트리에틸아민, pH 5.0)을 이용하여, 30~50% 용출액 B의 직선농도구배법(0~20분) 및 100% 용출액 B(21~35분)에 의해, 순차 피리딜 아미노화 당사슬을 용출하였다. 또한, 분석은 이하의 조건으로 실시하였다(유속: 1㎖/min, 칼럼온도: 40℃, 검출: 형광(Ex:320nm, Em:400nm)). 그 결과, JT-ISH-224주는 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성 및 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 활성을 가지는 것이 분명해졌다(도 1a~f).

JT - ISH -224주 세균학적 동정

얻어진 JT-ISH-224주 성질은 이하와 같았다:

( 균학적 성질)

(1) 세포의 형태는 간균(바실러스)으로, 크기는 0.7~0.8μm×1.0~1.5μm.

(2) 운동성 +

(3) 그램염색성 -

(4) 포자의 유무 -

(생리학 생화학적 성질)

(1) 생육 온도 4℃에서는 -, 25℃에서는 +, 30℃에서는 +, 37℃에서는 -

(2) 집락의 색조 특징적 집락색소를 산생하지 않음

(3) 0/F 테스트 +/-

(4) 카탈라아제테스트 +

(5) 옥시다아제테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산 산생 +

(7) 글루코오스로부터의 가스 산생 +

(8) 발광성 -

(9) 질산염환원 +

(10) 인돌 산생 +

(11) 포도당 산성화 -

(12) 아르기닌디히드로라아제 +

(13) 우레아제 -

(14) 에스쿠린 가수분해 -

(15) 젤라틴 가수분해성 -

(16) β-갈락토시다아제 +

(17) 포도당 자화성 -

(18) L-아라비노스 자화성 -

(19) D-만노스 자화성 -

(20) D-만니톨 자화성 -

(21) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(22) 말토오스 자화성 -

(23) 글루콘산칼륨 자화성 -

(24) n-카프린산 자화성 -

(25) 아디핀산 자화성 -

(26) dl-말산 자화성 -

(27) 구연산나트륨 자화성 -

(28) 아세트산페닐 자화성 -

(29) 시토크롬옥시다아제 +

(30) 0/129 감수성, 10㎍ -, 15㎍ +

(31) 균체내 DNA의 GC 함량(몰% ) 39.4%

16S rRNA 유전자의 염기 서열분석

JT-ISH-224주로부터, 통상적인 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA 유전자의 전 염기 서열을 증폭하고, 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열을 서열 번호 5에 나타내었다.

JT-ISH-224주는 마린 아가 상에서의 생육성, 간균, 그램염색성, 글루코오스 발효적 분해성, 0/129 감수성 등의 형태 관찰 및 생리·생화학적 성상시험 결과로부터 비브리오 과에 속하는 것으로 나타났다. 게다가, JT-ISH-224주 16S rRNA 유전자의 DNA 염기 서열은 포토박테리움·포스포레움(Photobacterium phosphoreum) 기준주 ATCC11040의 16S rRNA 유전자의 서열에 가장 상동성이 높고, 그 상동율은 99.2% 이며, 다음으로 포토박테리움·일리오피스카리움(Photobacterium iliopiscarium) 기준주 ATCC51760의 16S rRNA 유전자의 서열에 상동성이 높고, 그 상동율은 99.1%인 것이 분명해졌다. 이러한 결과로부터, JT-ISH-224주는 비브리오 과 포토박테리움속(Photobacterium sp.)에 속하는 미생물인 것이 분명해졌다.

실시예 2: JT - ISH -224주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 유전자의 클로닝과 염기 서열 결정, 및 당해 유전자의 대장균에서의 발현

(1) JT - ISH -224주에 있어서의 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 유전자 호모로그의 존재의 확인

실시예 1에서 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 것이 분명해진 JT-ISH-224주에 있어서, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 호모로그가 존재하는지를 분명히 하기 위해, 게놈 서던 혼성화를 실시하였다. JT-ISH-224의 균체 펠릿 약 0.5g으로부터, Qiagen Genomic-tip 100/G(Qiagen 사제)를 이용하여, 키트 첨부의 설명서에 따라서, 약 100㎍의 게놈 DNA를 조제하였다. 다음으로, JT-ISH-224주 게놈 DNA수 ㎍을 제한효소 EcoRI, 또는 HindⅢ로 소화해, 0.7% 아가로스 겔 전기영동으로 분획 후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블로팅에 의해, 겔을 Hybond-N + 나일론 멤브레인필터(아메르샴 바이오 사이언스 제)에 전사하였다. 이 필터에 관해서, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자(GeneBank 아크셋션 번호: E17028)의 부분 단편(ATG로부터 HindⅢ까지의 약 1.2kb EcoRI-HindⅢ 단편)을 프로브로서 이용하고, 서던 혼성화를 실시하였다. 혼성화실험은 ECL direct labeling & detection system(아메르샴 사제)를 사용하였다. 키트 첨부의 설명서에 따라서 프로브를 라벨링 하였다. 혼성화는, 키트 중의 혼성화 완충 액(hybridization buffer)에 블로킹 시약을 5% (w/v), NaCl을 0.5M이 되도록 가해 37℃(통상 42℃)에서 4시간 실시하였다. 세정은, 0.4% SDS, 0.5xSSC중에서, 50℃(통상 55℃)에서 20분을 2회, 2xSSC중에서 실온, 5분을 1회 실시하였다. 시그널의 검출은, 키트 첨부의 설명서에 따랐다. 그 결과, EcoRI 소화로, 약 12.5kb의 밴드가, HindⅢ 소화로, 약 9kb의 밴드가 검출되었다. 이 결과로부터, JT-ISH-224주에는, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 호모로그가 존재한다는 것이 분명해졌다.

(2) JT - ISH -224주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 유전자의 클로 닝

(i) 게놈 라이브러리 구축

JT-ISH-224주 게놈 DNA1-2㎍에 대해, 0.1~0.2유닛의 4염기 인식의 제한효소 Sau3AI를 반응시켜, 부분분해를 실시하였다. 게놈 DNA는 총량 80㎍ 처리하였다. 반응 완충액은 효소에 첨부한 것을 이용하고, 반응 조건은 37℃, 30분으로 하였다. 반응 종료 후, 반응액에 최종농도 25mM의 EDTA pH 8.0을 가해, 페놀·클로로포름 처리를 실시하였다. 게놈 DNA를 에탄올 침전으로 회수하고, TE 400㎕에 용해하였다. 원심 튜브(히다치제작소제 40PA)에, 그래디엔트(변화도) 제작 장치를 이용하여, 40% 슈크로스 완충액(20mM Tris pH 8.0, 5mM EDTA pH 8.0, 1M NaCl)과 10% 슈크로스 완충액으로부터, 40-10%의 그래디엔트를 제작해, 거기에 상기의 부분분해 DNA 용액을 중층하였다. 초원심기(히다치제작소제 SCP70H, 로터: SRP28SA)를 이용하고, 26,000rpm, 20℃, 15시간 원심하였다. 원심 후 튜브의 저부에 25G의 침으로 구멍을 뚫어, 저부의 액으로부터 1㎖씩 회수하였다. 회수한 게놈 DNA를 포함하는 샘플의 일부를, 서브 마린 전기영동조를 이용하여, 0.5-0.6% 아가로스 겔/TAE 완충액 중에서, 26V, 20시간 전기영동을 실시해, 9-16kb의 사이즈의 DNA를 포함하는 프랙션을 파악하였다. 마커로서 λ/HindⅢ를 이용하였다. 9-16kb의 사이즈의 DNA단편을 포함한 프랙션에 TE를 2.5㎖ 가해 슈크로오스 농도를 내린 후, 에탄올 침전, 린스를 실시해, 소량의 TE에 용해하였다.

JT-ISH-224주 게놈 라이브러리 작성을 위한 벡터로서, λDASHⅡ(Stratagene제)를 이용하였다. λDASHⅡ/BamHI 벡터와 게놈 DNA 단편의 라이게이션 반응은 Stratagene제의 라이게이션 키트를 이용하고, 12℃에서 밤새 실시하였다. 반응 후, 반응액을 GigaPack Ⅲ Gold Packaging extract와 반응시켜, 게놈 DNA가 만들어진 λ벡터를 파아지 입자에 삽입시켰다. 파아지액은 500㎕의 SM 완충액과 20㎕의 클로로포름 중에서 4℃보관하였다. 대장균 XL1-Blue MRA(P2)(Stratagene제)를 LBMM(LB + 0.2% 말토오스 + 10mM MgSO₄) 중에서 A₆₀₀=0.5가 될 때까지 배양하고, 이 배양액 200㎕에, 최적용량의 파아지 용액을 가해, 37℃에서 15분간 배양하였다. 여기에 48℃에서 보온한 NZY 톱아가로스를 4㎖ 가하고, 혼합하여, NZY 아가 플레이트(직경 9cm의 플라스틱 샬레)에 플레이팅 하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하고, 플라그 수를 세어, titer를 계산한바, 라이브러리 사이즈는 약 30만 pfu(plaque forming unit)로 산출되었다.

(ⅱ) 플라그 혼성화와 JT - ISH -224주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이 효소 유전자를 포함한 게놈 단편의 서브클로닝

다음으로, 전술한 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 부분 단편을 프로브에 이용하여, JT-ISH-224주 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 직경 9cm의 환형 샬레에 λDASHⅡ/BamHI 벡터 키트(Stratagene사제)의 설명서에 따라서, 수백 pfu의 파아지를 숙주균 XL1-blue MRA(P2)와 함께 플레이팅하였다. 플라그를 Hybond-N + 나일론 멤브레인 필터(Amersham 사제)에 접촉시켜, 멤브레인 첨부의 설명서에 따라서 알칼리처리를 행한 DNA를 변성시켜, 멤브레인 상에 고정시켰다. 프로브의 라벨링, 혼성화 조건은, 상기(1)에 기재의 방법으로 실시하였다. 그 결과, 플라그 정제를 겸한 2차 선발까지, 8개의 클론을 얻고, 그 중 4개의 플라그를 회수하고, 각각 대장균 XL1-blue MRA(P2)와 함께, 1매 수만 pfu가 되도록 NZY 플레이트에 플레이팅 하여, 밤새 37℃에서 보온하였다. 플라그가 일면에 나와 있는 6매의 플레이트에 SM 완충액를 4㎖씩 따라, 4℃에서 밤새 침강하였다. 파스퇴르 피펫으로, 파아지 플레이트 라이세이트를 회수해, QIAGEN Lambda Mini Kit(키아겐사제)로, λDNA를 추출, 정제하였다. 이러한 4종의 λDNA 샘플을, 제한효소 EcoRI와 HindⅢ, EcoRI와 BamHI, 또는 EcoRI와 XhoI로 소화하였다. 소화물을 아가로스 겔 전기영동으로 분획하고, 상술의 (1)과 같게 나일론 멤브레인 필터에 전사하였다. 이 필터를 사용하여, 재차 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 부분 단편을 프로브에 이용하여, 서던분석을 실시하였다. 그 결과, EcoRI-BamHI 소화의 경우, 10kb의 밴드가 검출되었다. 10kb의 길이의 게놈은 통상적인 방법으로 고카피 플라스미드 벡터에 서브 클론화하는 것은 곤란한 것으로 생각되었기 때문에, 각종의 제한효소를 이용한 서던 혼성화를 더 실시하였다. 사용한 효소는 BglⅡ, EcoRV, KpnⅠ, NheⅠ, PstⅠ, PvuⅡ, SacⅠ, SalⅠ, XbaⅠ이다. 그 결과, EcoRV로 6.6kb, KpnⅠ로 7kb, NheⅠ로 3.5kb의 밴드가 검출되었다. 거기에서 λDNA 샘플을 재차 NheⅠ로 소화해, TAE 완충액 중에서 저융점 아가로스(SeaPlaqueGTG)를 사용한 아가로스 겔 전기영동을 실시하였다. 3.5kb의 DNA 단편을 겔 마다 절제, 겔과 등량의 200mM NaCl를 가해, 65℃에서 10분 처리하여, 겔을 융해하였다. 이 샘플을 페놀 추출, 페놀·클로로포름추출, 클로로포름추출을 각각 1회 실시하고, 에탄올 침전에 의해서 3.5kb DNA 단편을 회수하였다. 이 단편을 Ligation kit(다카라 바이오 제)를 이용하여, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)의 XbaⅠ부위(탈인산처리한 것)에 라이게이션 하였다. 라이게이션 반응 후, DNA를 일렉트로포레이션에 의해서 대장균 TB1에 형질전환하고, 암피실린(100(g/㎖)을 포함하는 LA 한천배지에 플레이팅하였다. 37℃ 밤새 배양하여 얻어진 콜로니를 복수, LB 배지(암피실린 함유)에 접종하고, 37℃에서 밤새 진탕 배양해, 통상적인 방법(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edition(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다))에 따라 플라스미드를 추출하였다.

(ⅲ) JT - ISH -224주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 유전자의 전체 염기 서열의 결정

다음으로, 상기에서 인서트(삽입) DNA가 확인된 플라스미드에 관해서 M13 프 라이머(다카라바이오제)를 이용하여, ABI PRISM 형광 시퀀스(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사제)로, 3.5kb NheI 단편의 양단의 염기 서열을 결정하였다. 얻어진 DNA 서열을, 유전정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver. 7(제네틱스사제)을 이용하여, 아미노산 서열로 번역해, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GeneBank 데이터베이스에 대해서, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색을 실시하였다. 그 결과, 다른 한쪽의 DNA 서열로부터 번역된 아미노산 서열이, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 아미노산 서열과 유의한 동일성을 나타냈다. 동일성을 나타낸 영역의 방향성으로부터, 3.5kb NheⅠ 단편 중에는 완전한 JT-ISH-224주 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자가 포함된다는 것이 암시되었다.

다음으로, JT-ISH-224주의 동효소의 유전자의 DNA 서열을 완전하게 결정하기 위해, 3.5kb NheⅠ 단편으로부터 얻어진 DNA 서열을 기본으로, 2종의 프라이머: ISH224-26ST-C3-R(5'-TTCATCGTCATCTAATCGTGGC-3'(22mer):서열 번호 6);

ISH224-26ST-C4-R(5'-AGTTGTTGCGTACCACAAGT-3'(20mer):서열 번호 7);

을 합성하여, 염기 서열결정에 이용하였다.

이러한 프라이머를 이용하여, 상술한 바와 같이 염기 서열을 결정한 결과, 서열표의 서열 번호 1의 서열을 얻었다. 이 서열은, JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 오픈리딩프레임(ORF)의 전체 염기 서열이다. 포토박테리움속 JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 1545염기쌍으로 되어, 514개의 아미노산을 코드하고 있었다. 이 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 2에 나타낸다. GENETYX Ver.7을 이용하여 DNA 서열, 및 아미노산 서열 분석을 실시했는데, JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 DNA 서열은, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자와 63%의 동일성을 가지고 있었다. 또한 아미노산 서열에서도, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 54.5%의 동일성을 나타냈다.

(3) JT - ISH -224주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 유전자 발현 벡터의 구축

클로닝화한 유전자가, 시알산 전이효소 활성을 가지는지 여부를 조사하기 위해, 또한 JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 대량으로 얻기 위해, 동유전자의 전체길이, 및 N말단측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현 벡터에 끼워 넣고, 대장균 내에서 단백질을 생산시켜, 이 발현 단백질의 활성을 측정하였다.

JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 대해서, 유전정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7로 분석을 실시했는데, N말단의 17 아미노산이 시그널 펩티드라고 예측되었다. 그래서, 유전자 전체길이(본 실시예에 있어서 ISH224-NOCO로 표기한다)을 클로닝화하기 위한 프라이머 ISH224-26ST-N0BspHI(5'-AGAATATCATGAAAAACTTTTTATTATTAAC-3'(31 mer): 서열 번호 8), ISH224-26ST-COBamHI(5'-TTTTTTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACC-3'(33 mer):서열 번호 10), 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 더 제거된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 실시예에 있어서 ISH224-N1C0으로 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 ISH224-26ST-N1PciⅠ(5'-CTTGTAACATGTCAGAAGAAAATACACAATC-3'(31 mer): 서열 번호 9), ISH224-26ST-COBamHI(5'-TTTTTTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACC-3'(33 mer): 서열 번호 10)을 설계, 합성하였다.

3.5kb NheⅠ 단편을 포함하는 플라스미드를 주형에, 이들 프라이머를 이용하여 PCR을 실시해, 발현 벡터에 조합해 넣기 위한 JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자를 증폭하였다. PCR의 반응 조건은 이하와 같이 설정하였다. 50㎕의 반응액 중에, 주형 DNA 500ng, 10×Ex taq buffer 5㎕, 2.5mM 각 dNTP 4㎕, 프라이머 50pmole, Ex taq(다카라바이오제) 0.5㎕을 각각 포함해, 프로그램템프 제어방식 PC-700(ASTEK제)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분 , 55℃ 1분 , 72℃ 2분을 5회, 72℃ 6분을 1회 실시하였다. 그 결과, ISH224-NOCO로 대략 1.55kb, ISH224-N1CO로 대략 1.5kb의 PCR 산물이 증폭되었다. 이들 PCR 산물을, 벡터 pCR4TOPO(lnvitrogen 사제)에 클로닝하였다. 라이게이션 반응은 벡터 키트 첨부의 설명서에 따랐다. 대장균 TB1에 일렉트로포레이션법을 이용하여 DNA를 도입해, 통상적인 방법(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edition)에 따라 플라스미드 DNA를 추출하였다. 인서트의 확인된 클론에 관해서, M13 프라이머(Takara사제)를 이용하고, ABI PRISM 형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사제)로, PCR 산물의 염기 서열을 그 양단으로부터 결정하였다. 그 결과, ISH224-NOCO에 있어서는, 서열표의 서열 번호 1의 제718번째 의 티민(T)이 시토신(C)에 염기치환되어 있었다. 이 변이에 의해서, 코돈이 TTA에서 CTA로 변화하지만, 이러한 코돈은 함께 류신(Leu)을 코드하기 때문에, 아미노산 변이는 생기지 않는다. 한편, ISH224-N1CO에는 염기 서열의 변화는 없었다. ISH224-N1CO 의 염기 서열은 서열 번호 3에 나타낸다.

염기 서열이 확인된 ISH224-NOCO 및 ISH224-N1CO의 대표 클론 각각 하나에 대해서, 제한효소 BspHI와 BamHI(ISH224-NOCO의 경우), 또는 제한효소 PciI와 BamHI(ISH224-N1CO의 경우)로 이중 소화한 후, 상술한 (2)의 (ⅱ)과 같게 겔 정제 하였다. 대장균 발현용 벡터는 pTrc99A(pharmacia LKB제)를 이용하였다. 이 벡터를 제한효소 NcoⅠ와 BamHI로 이중 소화해 겔 정제한 것을, 제한효소처리를 실시한 ISH224-NOCO 및 ISH224-N1CO의 PCR 산물과 Takara Ligation Kit(다카라바이오제)를 이용하여 라이게이션하여, 대장균 TB1에 형질전환하였다. 통상적인 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출, 제한효소분석하고, 인서트의 편입을 확인해, ISH224-NOCO/pTrc, 및 ISH224-N1CO/pTrc를 완성하였다.

또한, JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 각종 단축형 단백질을 작성하기 위해, 이하의 프라이머를 설계하였다.

프라이머 이름, 서열(서열 번호), 길이

224-26-N2Bsp AAACTTTCATGACGCAACAACTATTAACAGAA(서열 번호 15), 32mer

224-26-N3Bsp AAGTAATCATGAACGTAGTGGCTCCATCTTTA(서열 번호 16), 32mer

224-26-N3.1Bsp CACGTGTCATGACTCTTCAGCAGCTAATGGAT(서열 번호 17), 32mer

224-26-N2Bsp에서는, N말단측 62아미노산이 결실하고, 한편 N말단에 메티오닌이 도 입된다. 224-26-N3Bsp에서는, N말단측 110아미노산이 결실하고, 한편 N말단에 메티오닌이 도입된다. 224-26-N3.1 Bsp에서는, N말단측 127아미노산이 결실하고, 한편 N말단에 메티오닌이 도입된다. 이들 프라이머와, 상술의 프라이머 ISH224-26ST-C0BamHI와의 조합으로, ISH224-N1CO를 주형에 이용하여, 상기와 같게 PCR을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 벡터 pCR4TOPO(Invitrogen 사제)에 클로닝하여, 염기 서열을 확인했는데, 모든 조합의 클론에 관해서, 그러한 염기 서열은, 주형으로 한 ISH224-N1CO의 염기 서열과 100%의 상동성을 나타냈다. 224-26-N2Bsp와 ISH224-26ST-COBamHI의 조합으로 얻을 수 있는 클론을 N2CO, 224-26-N3Bsp와 ISH224-26ST-COBamHI의 조합으로 얻을 수 있는 클론을 N3CO, 224-26-N3.1Bsp와 ISH224-26ST-COBamHI의 조합으로 얻을 수 있는 클론을 N3.1 CO이라고 명명하였다. 이들 클론에 대해서, 제한효소 BspHI와 BamHI로 이중 소화한 후, 상술한 바와 같이, 대장균 발현용 벡터는 pTrc99A에 클로닝하여, ISH224-N2CO/pTrc, ISH224-N3CO/pTrc, 및 ISH224-N3.1CO/pTrc를 완성하였다.

(4) 발현 유도와 활성측정

상기(3)에서 얻어진 5종류의 클론(ISH224-NOCO/pTrc, ISH224-N1CO/pTrc, ISH224-N2CO/pTrc, ISH224-N3CO/pTrc, 및 ISH224-N3.1CO/pTrc)에 관해서, 단백질 발현유도 실험을 실시하였다. 각 클론이 편입된 발현 벡터 pTrc99A를 가지는 대장균 TB1의 단일 콜로니를, 항생제 암피실린(최종 농도 100㎍/㎖)을 포함한 LB 배지(6㎖)에 접종하고, A₆₀₀=0.5 정도가 될 때까지 30℃에서 세균을 전(前) 배양해, 그 후 IPTG(이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노시드, 와코 순약공업사제)를 최종 농도로 1mM가 되도록 가해, 30℃에서 4시간 정도 더 진탕 배양하였다. 배양액 4㎖ 중의 균체를 원심분리에 의해서 모았다. 이 균체를, 200㎕의 0.336% 트리톤 X-100 및 0.5M 염화 나트륨을 포함한 20mM 비스트리스 완충액(pH 7.0)에 현탁해, 빙랭하에서 초음파 파쇄하였다. 얻어진 파쇄액을 조효소액으로 하여, 이것을 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM 카코딜산 완충액(pH 5.0)으로 200배 희석하고, 활성측정에 공시(供試)하였다. 반응은 2번 반복으로 실시하였다. 반응 조건은 표 1-1 및 표 1-2의 각주에 나타나는 대로이다. 그 결과, 하기의 표 1-1 및 표 1-2에 나타나듯이, ISH224-N3.1CO/pTrc이외의 클론의 조효소액 중에는 당 공여체인 CMP-NeuAc중의 ¹⁴C로 라벨된 NeuAc를 당 수용체 기질인 락토오스에 전이하는 인자, 즉 시알산 전이효소 활성이 존재하는 것이 나타났다. 이상의 결과로부터, ISH224-NOCO/pTrc, ISH224-N1CO/pTrc, ISH224-N2CO/pTrc, 및 ISH224-N3CO/pTrc를 도입한 대장균에는 시알산 전이효소가 발현되고 있는 것이 분명해졌다.

이상, ISH224-N3CO가, JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 활성을 보관 유지하는 최소의 클론이었다. 따라서, 서열 번호 2 가운데 적어도 아미노산 111-514가 존재하면 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 활성을 유지할 수 있다는 것이 판명되었다.

[표 1-1]

표 1-1: JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자를 재조합 한 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

[표 1-2]

표 1-2: JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자를 재조합한 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

(5) β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이활성의 확인

상기 (4)의 ISH224-N1CO 클론 및 ISH224-NOCO 클론으로부터 조제한 조효소액을 이용하고, ISH224-NOCO/pTrc, 및 ISH224-N1CO/pTrc를 도입한 대장균으로 발현된 시알산 전이효소가 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이활성을 가지는지 여부를 조사하였다. 실시예 1과 같게, 당 수용체로서 피리딜 아미노화 락토오스(Gal β1-4Glc-PA, 다카라 바이오 사제 PA-Sugar Chain O26)을 이용하여, 효소반응을 실시하였다. 그 결과, 실시예 1과 같게, PA-6'-시아릴 락토오스(Neu5Ac α2-6Galβ1-4Glc-PA)가 검출되었다. 즉, 양 클론주 유래의 시알산 전이효소는 모두 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이활성을 가지는 것이 분명해졌다. 이러한 결과로부터, 포토박테리움속 JT-ISH-224주 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자가 클로닝되고, 또한, 대장균 내에서 발현되었다는 것이 증명되었다.

실시예 3: JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소의 생산성

ISH224 - NOCO 클론과 ISH224 - N1CO 클론의 비교

실시예 2에서 얻어진 ISH224-NOCO 클론과 ISH224-N1CO클론에 관하여, 경시적인 단백질 발현유도 실험을 실시하였다. 각 클론이 편입된 발현 벡터 pTrc99A를 가지는 대장균 TB1의 단일 콜로니를, 항생물질 암피실린(최종 농도 100㎍/㎖)을 포함한 LB 배지(6㎖)에 접종하고, 30℃에서 약 8시간 배양하였다. 일전에 배양액을 항생물질 암피실린(최종 농도 100㎍/㎖)을 포함한 LB 배지(300㎖)에 접종하고, 30℃에서 진탕 배양하였다. OD600=0.5 정도가 되었을 때, IPTG(이소프로필- β-D(-)-티오 갈락토피라노시드, 와코순약공업사제)를 최종 농도로 1mM가 되도록 가해, 30℃에서 한층 더 진탕 배양하였다. 배양 4, 6, 22, 및 28시간 후, 배양액 중의 균체를 원심분리에 의해서 모았다. 이 균체를, 0.336% 트리톤 X-100 포함하는 20mM 비스트리스 완충액(pH 6.0)에 현탁해, 빙랭하에서 초음파 파쇄하였다. 얻어진 파쇄액을 조효소액으로 해, 이것을 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM 카코딜산 완충액(pH 5.0)으로 200배 희석하여, 활성측정에 공시하였다. 반응은 2번 반복하여 실시하였다. 반응 조건은 표 2의 각주에 나타낸 것과 같다. 그 결과, 하기의 표 2에 나타나듯이, ISH224-NOCO클론에서는, IPTG 첨가 4시간 후에, β-갈락토시드-α2,6시알산 전이활성이 최대로 되고, 그 생산량은 5,501U/L·배지였다. 한편, ISH224-N1CO 클론에서는 IPTG 첨가 22시간 후에, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이활성이 최대로 되고, 그 생산량은 10,776U/L·배지였다.

[표 2]

표 2: JT-ISH-224주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자를 재조합한 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

이상으로부터, ISH224-NOCO 클론보다 ISH224-N1CO 클론 쪽이, β-갈락토시드 -α2,6시알산 전이효소의 생산성이 높은 것이 분명해졌다.

본 출원 전에 분명하게 한 포토박테리움·담세라 유래의 재조합형의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 생산성, 즉, 플라스미드 pEBSTΔ178을 형질전환 한 대장균에 의한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 생산성은 224.5U/L(Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110(1996))이다. 이 효소와 비교해, JT-ISH-224 유래 재조합 α2,6-시알산 전이효소의 생산성은 약 48배 높다는 것이 분명해졌다. 또한, 효소의 종류가 다르지만, 미생물 유래의 시알산 전이효소로서는 생산성이 높은 파스튜렐라·물토시다(Pasteurella multocida) 유래의α2,3-시알산 전이효소의 생산성은 6,000U/L(Yu, H. et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619, 2005)이다. 이 효소와 비교해도, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 생산성은, 약 1.8배 정도 높다.

실시예 4-1: ISH224 - N1CO 으로부터의 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소의 추출, 정제 및 정제 단백질의 아미노 말단 아미노산 서열의 결정

(1) 추출 및 정제

LBAmp 평판배지 상에서 계대(繼代)배양한 ISH224-N1CO의 콜로니로부터 균체를 루프로 채취해, 30㎕의×200 암피실린(400mg/20㎖)을 첨가한 6㎖-LB 액체배지 10㎖에 접종해, 30℃, 매분 180회전으로 8시간 진탕 배양하였다.

본 배양은, 이하의 순서로 실시하였다. 1.5㎖의×200 암피실린(400mg/20㎖)+300㎕의 1M IPTG(1.192g/5㎖)를 첨가한 300㎖-LB 배지를 1000㎖용 코브 부착 플라스크에 300㎖ 붓고, 이것을 9개(합계 2.7 L) 준비하였다. 각각의 플라스크에 전(前) 배양액 12㎖를 접종해, 30℃, 매분 180회전으로 24시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여, 균체를 회수하였다. 젖은 상태의 중량으로 약 15g를 얻었다.

이 균체를, 990㎖의 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)에 현탁해, 1.6g/26㎖로 하여, 빙랭하에서 초음파 파쇄하였다. 균체 파쇄액을 4℃, 100,000×g으로 1시간, 원심분리를 실시하여, 상청액을 얻었다.

이 조효소액을, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)으로 평형화 한 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP(Amersham사제)라는 음이온교환칼럼에 흡착시켜, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)으로부터 1M 염화 나트륨을 포함한 상기 완충액에 직선 농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화 나트륨 농도가 0.25M 부근에서 용출된 효소활성을 가지는 프랙션을 회수하였다.

회수한 프랙션을 20mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 희석하고, 미리 0.336% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 히드록시아파타이트(Bio-Rad제)에 흡착시켜, 0.336% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 인산 완충액(pH 6.0)으로부터 0.336% 트리톤 X-100을 포함하는 500mM 인산 완충액(pH 6.0)에 직선 농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 인산 완충액 농도가 125mM 부근에서 용출된 효소활성을 가지는 프랙션을 회수하였다.

이 프랙션을 MonoQ 5/50 GL(Amersham사제) 음이온 교환칼럼에 흡착시켜, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함한 상기 완충액에 직선 농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화 나트륨 농도가 300mM 부근에서 용출되는 효소활성을 가지는 프랙션을 회수하였다.

활성이 있던 프랙션을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(아크릴아미드겔의 농도는 12.5%)한 결과, 목적 효소는 단일 밴드를 나타내고, 약 56,000의 분자량을 나타냈다. 정제된 프랙션의 비활성은, 균체 파쇄 때의 비활성에 비하여 9.4배 상승 하였다(표 3-1). 이상부터, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N1CO의 비활성은 113U/mg이며, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 비활성 5.5U/mg(J. Biochem., 120, 104-110, 1996, T. Yamamoto et al.)과 비교하여, 약 21배였다. 또한, 효소의 종류가 다르지만, 파스튜렐라·물토시다(Pasteurella multocida)유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 비활성은 60U/mg(Yu, H. et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619, 2005.)이다. 이 효소와 비교해도, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N1CO의 비활성은, 약 1.9배 높다.

조효소액으로부터의 ISH224-N1CO 클론의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 정제에 대해서, 상술한 각각의 정제 공정을 거친 시료의 효소활성을 표 3-1에 나타낸다. 효소활성은, 실시예 1에 기재한 것과 같게 J. Biochem. 120, 104-110(1996)에 기재되어 있는 방법에 준하고, 표 3-1 각주에 나타낸 반응 조건으로 측정하였다. 또한, 단백질의 정량은 Coomassie Protein Assay Reagent(PIERCE제)를 이용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라서 단백질의 정량을 실시하였다. 효소 1단위(1 U) 는, 1분간 1마이크로몰의 시알산을 전이하는 효소량으로 하였다.

[표 3-1]

표 3-1: 조효소액으로부터의 ISH224-N1CO주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 정제표

(2) 아미노 말단 아미노산 서열의 결정

상기 (1)에서 단일 밴드까지 정제한 효소 용액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(아크릴아미드겔의 농도는 12.5%) 하였다. 영동 후에 단백질을 PVDF막에 전사해, CBB로 염색한 후, 목적 밴드 부분을 절제하고, Procise 494 HT Protein Sequencing System(Applied Biosystems)로 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 아미노 말단이 세린으로 시작되는 서열의 15 잔기목(Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys)까지 확정할 수 있었다. 이 결과로부터, ISH224-N1CO클론의 형질전환 대장균이 생산한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 단백질에 있어서, 아미노 말단의 메티오닌은 대장균 체내에서 프로세스 되었다고 생각된다.

실시예 4-2: ISH224 - N3CO 로부터의 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소의 추출 및 정제

(1) 추출 및 정제

LBAmp 평판배지 상에서 계대배양한 ISH224-N3CO의 콜로니로부터 균체를 루프로 채취하고, 30㎕의×200 암피실린(400mg/20㎖)을 첨가한 6㎖-LB 액체배지 10㎖에 접종하여, 30℃, 매분 180회전으로 8시간 진탕 배양하였다.

본 배양은, 이하의 순서로 실시하였다. 1.5㎖의×200 암피실린(400mg/20㎖)+300㎕의 1M IPTG(1.192g/5㎖)를 첨가한 300㎖-LB 배지를 1000㎖용의 코브 부착 플라스크에 300㎖ 붓고, 이것을 18개(합계 5.4 L) 준비하였다. 각각의 플라스크에 전 배양액 12㎖를 접종해, 30℃, 매분 180회전으로 24시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여, 균체를 회수하였다. 젖은 상태의 중량으로 약 33.1g을 얻었다.

이 균체를, 538.5㎖의 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)에 현탁하여, 1.6g/26㎖으로 하고, 빙랭하에서 초음파 파쇄하였다. 균체 파쇄액을 4℃, 100,000×g에서 1시간, 원심분리를 실시하여, 상청액을 얻었다.

이 조효소액을, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP(Amersham 사제)라는 음이온 교환칼럼에 흡착시켜, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.0)으로부터 1M 염화 나트륨을 포함한 상기 완충액에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화 나트륨 농도가 0.25M 부근에서 용출된 효소활성을 가지는 프랙션을 회수하였다.

회수한 프랙션을 20mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 희석하고, 미리 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM 인산 완충액(pH 6.0)로 평형화한 히드록시아파타이트(Bio-Rad제)에 흡착시켜, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM 인산 완충액(pH 6.0)으로부터 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 500mM 인산 완충액(pH 6.0)에 직선 농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 인산 완충액 농도가 125mM 부근에서 용출된 효소활성을 가지는 프랙션을 회수하였다. 이 프랙션을 Mono Q 5/50 GL(Amersham 사제) 음이온교환칼럼에 흡착시켜, 0.336% 트리톤 X-100을 포함한 20mM Bis-Tris 완충액(pH 6.

0)으로부터 1M 염화 나트륨을 포함한 상기 완충액에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화 나트륨 농도가 300mM 부근에서 용출되는 효소활성을 가지는 프랙션을 회수하였다.

활성이 있던 프랙션을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(아크릴아미드겔의 농도는 12.5%)한 결과, 목적 효소는 단일의 밴드를 나타내고, 약 40,000의 분자량을 나타냈다. 정제된 프랙션의 비활성은, 균체 파쇄 때의 비활성에 비해 131.5배 상승하였다(표 3-2). 이상으로부터, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6- 시알산 전이효소 N3CO의 비활성은 264U/mg이며, 포토박테리움·담세라 JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 비활성 5.5U/mg(J. Biochem., 120, 104-110, 1996, T. Yamamoto et al.)과 비교해, 약 48배였다. 또한, 효소의 종류가 다르지만, 파스튜렐라·물토시다(Pasteurellamultocida) 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 비활성은 60U/mg(Yu, H. et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619, 2005.)이다. 이 효소와 비교해도, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N3CO의 비활성은, 약 4.4배 높다.

조효소액으로부터의 ISH224-N3CO 클론의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N3CO의 정제에 대해서, 상술한 각각의 정제 공정을 거친 시료의 효소활성을 표 3-2에 나타낸다. 효소활성은, 실시예 1에 기재한 것과 같게 J. Biochem. 120, 104-110(1996)에 기재되어 있는 방법에 준하고, 표 3-2 각주에 나타낸 반응 조건으로 측정하였다. 또한, 단백질의 정량은 Coomassie Protein Assay Reagent(PIERCE제)를 이용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라서 단백질의 정량을 실시하였다. 효소 1단위(1 U)는, 1분간 1마이크로몰의 시알산을 전이하는 효소량으로 하였다

[표 3-2]

표 3-2: 조효소액으로부터의 ISH224-N3CO주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 정제표

실시예 5: JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 N1C0의 효소활성의 최적 pH , 최적온도 및 최적 염농도

실시예 4-1에서 조제한 정제 효소를 이용하여, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N1CO의 최적 pH, 최적온도, 최적 염농도를 조사하였다.

(1) JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 N1CO 의 효소활성의 최적 pH

아세트산 완충액(pH 4.0, pH 4.5, 및 pH 5.0), 카코딜산 완충액(pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, 및 pH 7.0), 인산 완충액(pH 7.0, pH 7.5, 및 pH 8.0), TAPS 완충액(pH 8.0, pH 8.5, 및 pH 9.0)을 조제하고, 이것을 이용하여, 25℃에서 각 pH 에 있어서의 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 도 2a에 나타나듯이, pH 5.0에 있어서, 효소활성이 최대였다. 또한, 각 pH에 있어서의 효소활성은 pH 5.0에 있어서의 효소활성을 100으로 하는 상대활성으로 나타났다.

(2) JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 N1CO 의 효소활성의 최적온도

카코딜산 완충액(pH 5.0)을 이용하여, 10℃에서 50℃까지의 5℃마다 반응 온도에 있어서, 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 도 2b에 나타나듯이, 30℃에 있어서, 효소활성이 최대였다. 또한, 각 온도에 있어서의 효소활성은 30℃에 있어서의 효소활성을 100으로 하는 상대활성으로 나타내었다.

(3) JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 N1CO 의 효소활성의 최적 염농도

카코딜산 완충액(pH 5.0)을 이용하고, 30℃에서, 반응액 중의 NaCl 농도를 각각 OM, 0.1M, 0.25M, 0.5M, 0.75M, 1.OM, 1.5M, 2.OM으로 조정하고, 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 도 2c에 나타나듯이, 0.5M부터 0.75M에 있어서 효소활성은 최대로 되었다. 또한, OM부터 1.OM까지는 거의 동일한 정도의 효소활성의 높이를 유지하였다. 또한 각 NaCl 농도에 있어서의 효소활성은 NaCl 농도 OM에 있어서의 효소활성을 100으로 하는 상대활성으로 나타내었다.

실시예 6: JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 및 JT0160균주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소(공지효소)의 수용체기질특 이성(단당·이당류· 삼당류 )의 비교

(재료 및 방법)

JT-ISH-224 유래 N1CO 재조합 대장균 및 포토박테리움·담세라 JTO160 균주로부터 조제한 균체 파쇄액을, 이온교환크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용하여 전기영동적으로 단일 밴드까지 정제한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 이용하고, 각종의 단당류, 이당류 및 삼당류에의 시알산의 전이활성의 유무를 조사하기 위해서, 이하의 실험을 실시하였다.

각종의 당 수용체 기질을 이용한 시알산 전이반응

반응용액 24㎕중에, 당 공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc를 포함한 CMP-NeuAc(10.9 nmol(8485cpm), 반응용액 중에서의 최종 농도: 0.455mM), 20mM 카코딜산 완충액(pH 5.0)으로 용해한 각종 당 수용체 기질(1μmol, 반응용액 중에서의 최종 농도: 42mM), 시알산 전이효소(JT-ISH-224 유래 N1CO에서는 3.OmU, JTO160 유래에서는 4.3mU), NaCl(반응용액 중에서의 최종 농도: 500mM)로 이루어지는 반응용액을 조제 하고, 30℃에서 2분간, 혹은 60분간, 효소반응을 실시하였다. 또한, 당 수용체 기질로서 이용한 단당류는, 메틸-α-D-갈락토피라노시드(Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노시드(Gal-β-OMe), 메틸-α-D-글루코피라노시드(Glc-α-OMe), 메틸-β- D-글루코피라노시드(Glc-β-OMe), 메틸-α-D-만노피라노시드(Man-α-OMe), 메틸-β-D-만노피라노시드(Man-β-OMe), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GalNAc)의 8종류를 이용하였다. 이당류로서 락토오스(Gal-β1,4-Glc), N-아세틸락토사민(Gal-β1,4-GlcNAc), 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-N-아세틸글루코사미니드(Gal-β1,3-GlcNAc-β-0Me), 메틸-α-D-갈락토피라노실-α1,3-갈락토피라노시드(Gal-α1,3-Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-갈락토피라노시드(Gal-β1,3-Gal-β-OMe)의 5종류를 이용하였다. 삼당류로서 2'-푸코실락토오스(Fuc-α1,2-Gal β1,4-Glc)의 1종류를 이용하였다. 단, 표 4-2에 나타내는 당사슬, 메틸-α-D-갈락토피라노실-α1,3-갈락토사미니드(Gal-α1,3-Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-갈락토사미니드(Gal-β1,3-Gal-β-OMe) 및 2'-푸코실락토오스(Fuc-α1,2-Gal β1,4-Glc)에 대해서는 최종 농도 8.4mM에서 반응시켰다.

효소반응 종료 후, 반응용액에 1.98㎖의 5mM 인산 완충액(pH 6.8)을 첨가하여 효소반응을 정지하였다. 그 후, 5mM 인산 완충액(pH 6.8)으로 희석한 효소반응용액(2㎖)을, AG1-×2Resin(PO₄ ³-폼, 0.2×2 cm)칼럼에 제공하였다. 이 칼럼은, AG1-×2Resin(OH-form, BIO-RAD 사제)를 1M 인산 완충액(pH 6.8)에 현탁하여, 30분후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수에 현탁하여 작성하였다. 이 칼럼의 용출액(0~2㎖)의 방사활성을 측정하였다. 이 칼럼의 용출액에는, 반응으로 생긴 ¹⁴C-NeuAc(N-아세틸뉴라민산)가 결합한 반응 생성물 및 미반응 당 수용체 기질이 포함 되지만, 미반응의 CMP-¹⁴C-NeuAc는 칼럼에 보유된 채로 있다. 따라서, 효소반응의 결과 생긴 각종 시알산 함유 당사슬 유래의 ¹⁴C의 방사활성은, 모두 반응 생성물 유래이며, 이 프랙션의 방사활성으로부터 효소활성을 산출할 수 있다.

상기 방법을 이용하여, 각각의 당 수용체 기질에 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정해 전이된 시알산을 산출하였다.

(결과)

이번 당 수용체 기질로서 이용한 14종류의 단당, 이당, 삼당의 어느 것에도 시알산이 전이하고 있다는 것이 분명해졌다(표 4-1 및 표 4-2). JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소는, 공지의 JTO160 균주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소와 비교하여, 광범위한 수용체 기질에 대하여 높은 당 전이활성을 나타냈다. 보다 구체적으로는, 메틸-β-D-갈락토피라노시드, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸락토사민, 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-N-아세틸글루코사미니드, 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-갈락토피라노시드, 2'-푸코실락토오스의 6종류의 당 수용체에 있어서, JT-ISH-224 유래 재조합 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 N1CO는, 공지의 JTO160 균주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소보다 높은 활성을 나타내어, 넓은 수용체 기질 특이성을 가지는 것이 분명해졌다. 또한, 각 수용체 기질에 대한 상대활성은, 락토오스에 대한 시알산 전이활성을 100으로 한 경우를 나타낸다.

[표 4-1]

표 4-1: ISH224-N1CO주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 수용체 기질 특이성(1)

[표 4-2]

표 4-2: ISH224-N1CO주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 수용체 기질 특이성(2)

실시예 7: JT - ISH -224 유래 재조합 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소 및 JT0160균주 유래 β- 갈락토시드 -α2,6-시알산 전이효소(공지효소)의 당단백질에 대한 수용체 기질특이성의 비교

당 수용체 기질로서 아시알로페투인을 이용하였다. 2mg의 아시알로페투인을 1㎖의 20mM Bis-tris 완충액(pH 6.0)에 용해시키고, 당 수용체 기질 용액으로 하였다. 당 공여체 기질로서 CMP-NeuAc를 이용하였다. 당 수용체 기질 용액 40㎕, 당 공여체 기질 5㎕, 효소 용액 5㎕(모두 10mU)을 혼합하고, 25℃, 2시간 인큐베이트 해 시알산 전이반응을 실시하였다. 반응 종료 후, 반응용액을 0.1M 염화 나트륨으로 평형화한 세파덱스 G-50 슈퍼파인(0.8x18.Ocm)에 제공하고, 겔 여과를 실시하였다. 당 단백질이 포함되는 겔여과의 용출액 프랙션(2~4㎖의 프랙션)을 모아, 이 프랙션의 방사활성을 액체섬광계수기를 이용하여 측정하는 것으로, 당 수용체 기질에 전이한 시알산의 정량을 실시하였다.

그 결과, 어느 효소도 아시알로페투인에 시알산을 전이하는 것이 분명해졌다. 또한, JT-ISH-224 유래의 β-갈락토시드-α2,6시알산 전이효소(N1CO)는, 포토박테리움·담세라 JTO160 균주 유래의 β-갈락토시드-α2,6시알산 전이효소와 비교하여, 시알산의 전이 효율이 높다는 것이 분명해졌다.

[표 5]

표 5: ISH224-N1CO주 유래 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소의 수용체 기질 특이성(3)

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 및 그것을 코드하는 핵산을 제공하는 것에 의하여, 생체 내에 있어서 중요한 기능을 가진다는 것이 밝혀진 당사슬의 합성·생산수단을 제공한다. 특히, 시알산은, 생체 내의 복합 당질 당사슬에 있어서 비환원 말단에 존재하는 것이 많고, 당사슬 기능이라는 관점에서 지극히 중요한 당이기 때문에, 시알산 전이효소는 당전이 효소 중에서도 가장 수요가 높은 효소의 하나이다. 본 발명의 신규한 시알산 전이효소는, 당사슬을 응용한 의약품, 기능성 식품 등의 개발에 이용하는 것이 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco Inc. <120> A NOVEL b-GALACTOSIDE-a2,6-SIALYLTRANSFERASE, A GENE ENCODING THEREOF, AND A METHOD FOR PRODUCING THEREOF <130> FA0392-06085 <160> 17 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1545 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1545) <223> alpha-2,6-sialyltransferase <400> 1 atg aaa aac ttt tta tta tta act tta ata tta ctt act gct tgt aat 48 Met Lys Asn Phe Leu Leu Leu Thr Leu Ile Leu Leu Thr Ala Cys Asn 1 5 10 15 aat tca gaa gaa aat aca caa tct att att aaa aat gat att aat aaa 96 Asn Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys 20 25 30 act att att gat gag gag tat gtt aat tta gag cca att aat caa tca 144 Thr Ile Ile Asp Glu Glu Tyr Val Asn Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ser 35 40 45 aac atc tct ttt aca aaa cac tct tgg gta caa act tgt ggt acg caa 192 Asn Ile Ser Phe Thr Lys His Ser Trp Val Gln Thr Cys Gly Thr Gln 50 55 60 caa cta tta aca gaa caa aat aaa gag tca ata tca tta tct gta gtg 240 Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu Ser Val Val 65 70 75 80 gcg cca cga tta gat gac gat gaa aag tac tgc ttt gat ttt aat ggt 288 Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp Phe Asn Gly 85 90 95 gtt agt aat aaa ggt gaa aaa tat ata aca aaa gta aca tta aac gta 336 Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr Leu Asn Val 100 105 110 gtg gct cca tct tta gag gtt tat gtt gat cat gca tct ctt cca act 384 Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser Leu Pro Thr 115 120 125 ctt cag cag cta atg gat att att aaa tcg gaa gaa gaa aat cct aca 432 Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu Asn Pro Thr 130 135 140 gca caa aga tat ata gct tgg ggg aga ata gtt ccg act gat gag caa 480 Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr Asp Glu Gln 145 150 155 160 atg aaa gag tta aat att aca tcg ttt gca ttg ata aat aac cat aca 528 Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn Asn His Thr 165 170 175 cca gct gac tta gta caa gaa att gtt aag caa gca caa aca aag cat 576 Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln Thr Lys His 180 185 190 aga ttg aat gtt aaa ctt agc tct aac act gct cat tca ttt gat aat 624 Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser Phe Asp Asn 195 200 205 tta gtg cca ata cta aaa gaa tta aat tcg ttt aat aac gtt acg gta 672 Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn Val Thr Val 210 215 220 aca aat ata gat tta tat gat gat ggt tca gca gaa tat gta aat tta 720 Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Asn Leu 225 230 235 240 tat aac tgg aga gat aca tta aat aaa aca gat aat tta aaa att ggt 768 Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu Lys Ile Gly 245 250 255 aaa gat tat ctt gag gat gtc att aat ggt atc aat gaa gac act tca 816 Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu Asp Thr Ser 260 265 270 aat aca gga aca tca tct gtt tat aac tgg caa aaa cta tat cca gct 864 Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Ala 275 280 285 aac tac cat ttt tta aga aaa gat tat tta act tta gaa cca tca tta 912 Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu Pro Ser Leu 290 295 300 cat gag tta cga gac tat att ggt gat agt tta aag caa atg caa tgg 960 His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln Met Gln Trp 305 310 315 320 gat ggt ttc aaa aaa ttc aat agc aaa caa caa gaa tta ttc tta tcg 1008 Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu Phe Leu Ser 325 330 335 att gtt aat ttt gac aaa caa aaa tta caa aat gaa tat aat tca tct 1056 Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr Asn Ser Ser 340 345 350 aat tta cca aac ttt gtg ttt aca ggt acg act gta tgg gct ggt aac 1104 Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp Ala Gly Asn 355 360 365 cat gaa aga gag tat tat gcg aaa caa caa att aat gtc att aat aat 1152 His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val Ile Asn Asn 370 375 380 gca att aat gaa tcg agc cca cat tat tta ggc aat agt tat gat ttg 1200 Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Asp Leu 385 390 395 400 ttc ttc aaa ggt cac cct ggt ggc ggt atc att aat aca tta ata atg 1248 Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Ile Met 405 410 415 caa aac tat cct tca atg gtt gat att cca tca aaa ata tca ttt gaa 1296 Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile Ser Phe Glu 420 425 430 gtt ttg atg atg aca gat atg ctt cct gat gca gtt gct ggt ata gcg 1344 Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ile Ala 435 440 445 agc tct tta tat ttc acg ata cca gct gaa aaa att aaa ttt ata gtt 1392 Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys Phe Ile Val 450 455 460 ttt aca tcg aca gaa act ata act gat cgt gaa act gct ttg aga agt 1440 Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala Leu Arg Ser 465 470 475 480 cct tta gtt caa gta atg ata aaa cta ggt att gta aaa gaa gag aat 1488 Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys Glu Glu Asn 485 490 495 gta ctt ttt tgg gct gat ctg cca aat tgt gaa aca ggt gtt tgt att 1536 Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly Val Cys Ile 500 505 510 gca gtc tag 1545 Ala Val <210> 2 <211> 514 <212> PRT <213> Photobacterium sp. <400> 2 Met Lys Asn Phe Leu Leu Leu Thr Leu Ile Leu Leu Thr Ala Cys Asn 1 5 10 15 Asn Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys 20 25 30 Thr Ile Ile Asp Glu Glu Tyr Val Asn Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ser 35 40 45 Asn Ile Ser Phe Thr Lys His Ser Trp Val Gln Thr Cys Gly Thr Gln 50 55 60 Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu Ser Val Val 65 70 75 80 Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp Phe Asn Gly 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr Leu Asn Val 100 105 110 Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser Leu Pro Thr 115 120 125 Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu Asn Pro Thr 130 135 140 Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr Asp Glu Gln 145 150 155 160 Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn Asn His Thr 165 170 175 Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln Thr Lys His 180 185 190 Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser Phe Asp Asn 195 200 205 Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn Val Thr Val 210 215 220 Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Asn Leu 225 230 235 240 Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu Lys Ile Gly 245 250 255 Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu Asp Thr Ser 260 265 270 Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Ala 275 280 285 Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu Pro Ser Leu 290 295 300 His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln Met Gln Trp 305 310 315 320 Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu Phe Leu Ser 325 330 335 Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr Asn Ser Ser 340 345 350 Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp Ala Gly Asn 355 360 365 His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val Ile Asn Asn 370 375 380 Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Asp Leu 385 390 395 400 Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Ile Met 405 410 415 Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile Ser Phe Glu 420 425 430 Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ile Ala 435 440 445 Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys Phe Ile Val 450 455 460 Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala Leu Arg Ser 465 470 475 480 Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys Glu Glu Asn 485 490 495 Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly Val Cys Ile 500 505 510 Ala Val <210> 3 <211> 1497 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1497) <223> alpha-2,6-sialyltransferase <400> 3 atg tca gaa gaa aat aca caa tct att att aaa aat gat att aat aaa 48 Met Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys 1 5 10 15 act att att gat gag gag tat gtt aat tta gag cca att aat caa tca 96 Thr Ile Ile Asp Glu Glu Tyr Val Asn Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ser 20 25 30 aac atc tct ttt aca aaa cac tct tgg gta caa act tgt ggt acg caa 144 Asn Ile Ser Phe Thr Lys His Ser Trp Val Gln Thr Cys Gly Thr Gln 35 40 45 caa cta tta aca gaa caa aat aaa gag tca ata tca tta tct gta gtg 192 Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu Ser Val Val 50 55 60 gcg cca cga tta gat gac gat gaa aag tac tgc ttt gat ttt aat ggt 240 Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp Phe Asn Gly 65 70 75 80 gtt agt aat aaa ggt gaa aaa tat ata aca aaa gta aca tta aac gta 288 Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr Leu Asn Val 85 90 95 gtg gct cca tct tta gag gtt tat gtt gat cat gca tct ctt cca act 336 Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser Leu Pro Thr 100 105 110 ctt cag cag cta atg gat att att aaa tcg gaa gaa gaa aat cct aca 384 Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu Asn Pro Thr 115 120 125 gca caa aga tat ata gct tgg ggg aga ata gtt ccg act gat gag caa 432 Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr Asp Glu Gln 130 135 140 atg aaa gag tta aat att aca tcg ttt gca ttg ata aat aac cat aca 480 Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn Asn His Thr 145 150 155 160 cca gct gac tta gta caa gaa att gtt aag caa gca caa aca aag cat 528 Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln Thr Lys His 165 170 175 aga ttg aat gtt aaa ctt agc tct aac act gct cat tca ttt gat aat 576 Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser Phe Asp Asn 180 185 190 tta gtg cca ata cta aaa gaa tta aat tcg ttt aat aac gtt acg gta 624 Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn Val Thr Val 195 200 205 aca aat ata gat tta tat gat gat ggt tca gca gaa tat gta aat tta 672 Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Asn Leu 210 215 220 tat aac tgg aga gat aca tta aat aaa aca gat aat tta aaa att ggt 720 Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu Lys Ile Gly 225 230 235 240 aaa gat tat ctt gag gat gtc att aat ggt atc aat gaa gac act tca 768 Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu Asp Thr Ser 245 250 255 aat aca gga aca tca tct gtt tat aac tgg caa aaa cta tat cca gct 816 Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Ala 260 265 270 aac tac cat ttt tta aga aaa gat tat tta act tta gaa cca tca tta 864 Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu Pro Ser Leu 275 280 285 cat gag tta cga gac tat att ggt gat agt tta aag caa atg caa tgg 912 His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln Met Gln Trp 290 295 300 gat ggt ttc aaa aaa ttc aat agc aaa caa caa gaa tta ttc tta tcg 960 Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu Phe Leu Ser 305 310 315 320 att gtt aat ttt gac aaa caa aaa tta caa aat gaa tat aat tca tct 1008 Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr Asn Ser Ser 325 330 335 aat tta cca aac ttt gtg ttt aca ggt acg act gta tgg gct ggt aac 1056 Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp Ala Gly Asn 340 345 350 cat gaa aga gag tat tat gcg aaa caa caa att aat gtc att aat aat 1104 His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val Ile Asn Asn 355 360 365 gca att aat gaa tcg agc cca cat tat tta ggc aat agt tat gat ttg 1152 Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Asp Leu 370 375 380 ttc ttc aaa ggt cac cct ggt ggc ggt atc att aat aca tta ata atg 1200 Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Ile Met 385 390 395 400 caa aac tat cct tca atg gtt gat att cca tca aaa ata tca ttt gaa 1248 Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile Ser Phe Glu 405 410 415 gtt ttg atg atg aca gat atg ctt cct gat gca gtt gct ggt ata gcg 1296 Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ile Ala 420 425 430 agc tct tta tat ttc acg ata cca gct gaa aaa att aaa ttt ata gtt 1344 Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys Phe Ile Val 435 440 445 ttt aca tcg aca gaa act ata act gat cgt gaa act gct ttg aga agt 1392 Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala Leu Arg Ser 450 455 460 cct tta gtt caa gta atg ata aaa cta ggt att gta aaa gaa gag aat 1440 Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys Glu Glu Asn 465 470 475 480 gta ctt ttt tgg gct gat ctg cca aat tgt gaa aca ggt gtt tgt att 1488 Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly Val Cys Ile 485 490 495 gca gtc tag 1497 Ala Val <210> 4 <211> 498 <212> PRT <213> Photobacterium sp. <400> 4 Met Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys 1 5 10 15 Thr Ile Ile Asp Glu Glu Tyr Val Asn Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ser 20 25 30 Asn Ile Ser Phe Thr Lys His Ser Trp Val Gln Thr Cys Gly Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu Ser Val Val 50 55 60 Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp Phe Asn Gly 65 70 75 80 Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr Leu Asn Val 85 90 95 Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser Leu Pro Thr 100 105 110 Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu Asn Pro Thr 115 120 125 Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr Asp Glu Gln 130 135 140 Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn Asn His Thr 145 150 155 160 Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln Thr Lys His 165 170 175 Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser Phe Asp Asn 180 185 190 Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn Val Thr Val 195 200 205 Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Asn Leu 210 215 220 Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu Lys Ile Gly 225 230 235 240 Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu Asp Thr Ser 245 250 255 Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Ala 260 265 270 Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu Pro Ser Leu 275 280 285 His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln Met Gln Trp 290 295 300 Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu Phe Leu Ser 305 310 315 320 Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr Asn Ser Ser 325 330 335 Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp Ala Gly Asn 340 345 350 His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val Ile Asn Asn 355 360 365 Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Asp Leu 370 375 380 Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Ile Met 385 390 395 400 Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile Ser Phe Glu 405 410 415 Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ile Ala 420 425 430 Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys Phe Ile Val 435 440 445 Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala Leu Arg Ser 450 455 460 Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys Glu Glu Asn 465 470 475 480 Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly Val Cys Ile 485 490 495 Ala Val <210> 5 <211> 1500 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <400> 5 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggtaacagat tgatagcttg 60 ctatcaatgc tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgcct gggaatatac cctgatgtgg 120 gggataacta ttggaaacga tagctaatac cgcataatct cttcggagca aagaggggga 180 ccttcgggcc tctcgcgtca ggattagccc aggtgggatt agctagttgg tggggtaatg 240 gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctggaactga 300 gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggggaaacc 360 ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagttg 420 tgaggaaggc agttaagtta atagcttagy tgtttgacgt tagcaacaga agaagcaccg 480 gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc gagcgttaat cggaattact 540 gggcgtaaag cgcatgcagg cggtctgtta agcaagatgt gaaagcccgg ggctcaacct 600 cggaacagca ttttgaactg gcagactaga gtcttgtaga ggggggtaga atttcaggtg 660 tagcggtgaa atgcgtagag atctgaagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca 720 aagactgacg ctcagatgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccgtaa acgatgtcta cttgaaggtt gtggccttga gccgtggctt tcggagctaa 840 cgcgttaagt agaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa tgaattgacg 900 ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc 960 tactcttgac atccagagaa ttcgctagag atagcttagt gccttcggga actctgagac 1020 aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080 gcgcaaccct tatccttgtt tgccagcacg taatggtggg aactccaggg agactgccgg 1140 tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct 1200 acacacgtgc tacaatggcg tatacagagg gctgcaaact agcgatagta agcgaatccc 1260 acaaagtacg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1320 tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380 gtcacaccat gggagtgggc tgcaccagaa gtagatagct taaccttcgg gagggcgttt 1440 accacggtgt ggttcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtagccctag gggaacctgg 1500 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ISH224-26ST-C3-R <400> 6 ttcatcgtca tctaatcgtg gc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ISH224-26ST-C4-R <400> 7 agttgttgcg taccacaagt 20 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ISH224-26ST-N0BspHI <400> 8 agaatatcat gaaaaacttt ttattattaa c 31 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ISH224-26ST-N1PciI <400> 9 cttgtaacat gtcagaagaa aatacacaat c 31 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ISH224-26ST-C0BamHI <400> 10 ttttttggat ccctagactg caatacaaac acc 33 <210> 11 <211> 1218 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1218) <223> alpha-2,6-sialyltransferase <400> 11 atg aac gta gtg gct cca tct tta gag gtt tat gtt gat cat gca tct 48 Met Asn Val Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser 1 5 10 15 ctt cca act ctt cag cag cta atg gat att att aaa tcg gaa gaa gaa 96 Leu Pro Thr Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu 20 25 30 aat cct aca gca caa aga tat ata gct tgg ggg aga ata gtt ccg act 144 Asn Pro Thr Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr 35 40 45 gat gag caa atg aaa gag tta aat att aca tcg ttt gca ttg ata aat 192 Asp Glu Gln Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn 50 55 60 aac cat aca cca gct gac tta gta caa gaa att gtt aag caa gca caa 240 Asn His Thr Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln 65 70 75 80 aca aag cat aga ttg aat gtt aaa ctt agc tct aac act gct cat tca 288 Thr Lys His Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser 85 90 95 ttt gat aat tta gtg cca ata cta aaa gaa tta aat tcg ttt aat aac 336 Phe Asp Asn Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn 100 105 110 gtt acg gta aca aat ata gat tta tat gat gat ggt tca gca gaa tat 384 Val Thr Val Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr 115 120 125 gta aat tta tat aac tgg aga gat aca tta aat aaa aca gat aat tta 432 Val Asn Leu Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu 130 135 140 aaa att ggt aaa gat tat ctt gag gat gtc att aat ggt atc aat gaa 480 Lys Ile Gly Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu 145 150 155 160 gac act tca aat aca gga aca tca tct gtt tat aac tgg caa aaa cta 528 Asp Thr Ser Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu 165 170 175 tat cca gct aac tac cat ttt tta aga aaa gat tat tta act tta gaa 576 Tyr Pro Ala Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu 180 185 190 cca tca tta cat gag tta cga gac tat att ggt gat agt tta aag caa 624 Pro Ser Leu His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln 195 200 205 atg caa tgg gat ggt ttc aaa aaa ttc aat agc aaa caa caa gaa tta 672 Met Gln Trp Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu 210 215 220 ttc tta tcg att gtt aat ttt gac aaa caa aaa tta caa aat gaa tat 720 Phe Leu Ser Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr 225 230 235 240 aat tca tct aat tta cca aac ttt gtg ttt aca ggt acg act gta tgg 768 Asn Ser Ser Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp 245 250 255 gct ggt aac cat gaa aga gag tat tat gcg aaa caa caa att aat gtc 816 Ala Gly Asn His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val 260 265 270 att aat aat gca att aat gaa tcg agc cca cat tat tta ggc aat agt 864 Ile Asn Asn Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser 275 280 285 tat gat ttg ttc ttc aaa ggt cac cct ggt ggc ggt atc att aat aca 912 Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr 290 295 300 tta ata atg caa aac tat cct tca atg gtt gat att cca tca aaa ata 960 Leu Ile Met Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile 305 310 315 320 tca ttt gaa gtt ttg atg atg aca gat atg ctt cct gat gca gtt gct 1008 Ser Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala 325 330 335 ggt ata gcg agc tct tta tat ttc acg ata cca gct gaa aaa att aaa 1056 Gly Ile Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys 340 345 350 ttt ata gtt ttt aca tcg aca gaa act ata act gat cgt gaa act gct 1104 Phe Ile Val Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala 355 360 365 ttg aga agt cct tta gtt caa gta atg ata aaa cta ggt att gta aaa 1152 Leu Arg Ser Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys 370 375 380 gaa gag aat gta ctt ttt tgg gct gat ctg cca aat tgt gaa aca ggt 1200 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly 385 390 395 400 gtt tgt att gca gtc tag 1218 Val Cys Ile Ala Val 405 <210> 12 <211> 405 <212> PRT <213> Photobacterium sp. <400> 12 Met Asn Val Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu 20 25 30 Asn Pro Thr Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr 35 40 45 Asp Glu Gln Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn 50 55 60 Asn His Thr Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln 65 70 75 80 Thr Lys His Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser 85 90 95 Phe Asp Asn Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn 100 105 110 Val Thr Val Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr 115 120 125 Val Asn Leu Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu 130 135 140 Lys Ile Gly Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu 145 150 155 160 Asp Thr Ser Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu 165 170 175 Tyr Pro Ala Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu 180 185 190 Pro Ser Leu His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln 195 200 205 Met Gln Trp Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu 210 215 220 Phe Leu Ser Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr 225 230 235 240 Asn Ser Ser Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp 245 250 255 Ala Gly Asn His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val 260 265 270 Ile Asn Asn Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser 275 280 285 Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr 290 295 300 Leu Ile Met Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile 305 310 315 320 Ser Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala 325 330 335 Gly Ile Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys 340 345 350 Phe Ile Val Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala 355 360 365 Leu Arg Ser Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys 370 375 380 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly 385 390 395 400 Val Cys Ile Ala Val 405 <210> 13 <211> 1362 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <223> alpha-2,6-sialyltransferase <400> 13 atg acg caa caa cta tta aca gaa caa aat aaa gag tca ata tca tta 48 Met Thr Gln Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu 1 5 10 15 tct gta gtg gcg cca cga tta gat gac gat gaa aag tac tgc ttt gat 96 Ser Val Val Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp 20 25 30 ttt aat ggt gtt agt aat aaa ggt gaa aaa tat ata aca aaa gta aca 144 Phe Asn Gly Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr 35 40 45 tta aac gta gtg gct cca tct tta gag gtt tat gtt gat cat gca tct 192 Leu Asn Val Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser 50 55 60 ctt cca act ctt cag cag cta atg gat att att aaa tcg gaa gaa gaa 240 Leu Pro Thr Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu 65 70 75 80 aat cct aca gca caa aga tat ata gct tgg ggg aga ata gtt ccg act 288 Asn Pro Thr Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr 85 90 95 gat gag caa atg aaa gag tta aat att aca tcg ttt gca ttg ata aat 336 Asp Glu Gln Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn 100 105 110 aac cat aca cca gct gac tta gta caa gaa att gtt aag caa gca caa 384 Asn His Thr Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln 115 120 125 aca aag cat aga ttg aat gtt aaa ctt agc tct aac act gct cat tca 432 Thr Lys His Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser 130 135 140 ttt gat aat tta gtg cca ata cta aaa gaa tta aat tcg ttt aat aac 480 Phe Asp Asn Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn 145 150 155 160 gtt acg gta aca aat ata gat tta tat gat gat ggt tca gca gaa tat 528 Val Thr Val Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr 165 170 175 gta aat tta tat aac tgg aga gat aca tta aat aaa aca gat aat tta 576 Val Asn Leu Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu 180 185 190 aaa att ggt aaa gat tat ctt gag gat gtc att aat ggt atc aat gaa 624 Lys Ile Gly Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu 195 200 205 gac act tca aat aca gga aca tca tct gtt tat aac tgg caa aaa cta 672 Asp Thr Ser Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu 210 215 220 tat cca gct aac tac cat ttt tta aga aaa gat tat tta act tta gaa 720 Tyr Pro Ala Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu 225 230 235 240 cca tca tta cat gag tta cga gac tat att ggt gat agt tta aag caa 768 Pro Ser Leu His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln 245 250 255 atg caa tgg gat ggt ttc aaa aaa ttc aat agc aaa caa caa gaa tta 816 Met Gln Trp Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu 260 265 270 ttc tta tcg att gtt aat ttt gac aaa caa aaa tta caa aat gaa tat 864 Phe Leu Ser Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr 275 280 285 aat tca tct aat tta cca aac ttt gtg ttt aca ggt acg act gta tgg 912 Asn Ser Ser Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp 290 295 300 gct ggt aac cat gaa aga gag tat tat gcg aaa caa caa att aat gtc 960 Ala Gly Asn His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val 305 310 315 320 att aat aat gca att aat gaa tcg agc cca cat tat tta ggc aat agt 1008 Ile Asn Asn Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser 325 330 335 tat gat ttg ttc ttc aaa ggt cac cct ggt ggc ggt atc att aat aca 1056 Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr 340 345 350 tta ata atg caa aac tat cct tca atg gtt gat att cca tca aaa ata 1104 Leu Ile Met Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile 355 360 365 tca ttt gaa gtt ttg atg atg aca gat atg ctt cct gat gca gtt gct 1152 Ser Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala 370 375 380 ggt ata gcg agc tct tta tat ttc acg ata cca gct gaa aaa att aaa 1200 Gly Ile Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys 385 390 395 400 ttt ata gtt ttt aca tcg aca gaa act ata act gat cgt gaa act gct 1248 Phe Ile Val Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala 405 410 415 ttg aga agt cct tta gtt caa gta atg ata aaa cta ggt att gta aaa 1296 Leu Arg Ser Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys 420 425 430 gaa gag aat gta ctt ttt tgg gct gat ctg cca aat tgt gaa aca ggt 1344 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly 435 440 445 gtt tgt att gca gtc tag 1362 Val Cys Ile Ala Val 450 <210> 14 <211> 453 <212> PRT <213> Photobacterium sp. <400> 14 Met Thr Gln Gln Leu Leu Thr Glu Gln Asn Lys Glu Ser Ile Ser Leu 1 5 10 15 Ser Val Val Ala Pro Arg Leu Asp Asp Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Asp 20 25 30 Phe Asn Gly Val Ser Asn Lys Gly Glu Lys Tyr Ile Thr Lys Val Thr 35 40 45 Leu Asn Val Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Tyr Val Asp His Ala Ser 50 55 60 Leu Pro Thr Leu Gln Gln Leu Met Asp Ile Ile Lys Ser Glu Glu Glu 65 70 75 80 Asn Pro Thr Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Trp Gly Arg Ile Val Pro Thr 85 90 95 Asp Glu Gln Met Lys Glu Leu Asn Ile Thr Ser Phe Ala Leu Ile Asn 100 105 110 Asn His Thr Pro Ala Asp Leu Val Gln Glu Ile Val Lys Gln Ala Gln 115 120 125 Thr Lys His Arg Leu Asn Val Lys Leu Ser Ser Asn Thr Ala His Ser 130 135 140 Phe Asp Asn Leu Val Pro Ile Leu Lys Glu Leu Asn Ser Phe Asn Asn 145 150 155 160 Val Thr Val Thr Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr 165 170 175 Val Asn Leu Tyr Asn Trp Arg Asp Thr Leu Asn Lys Thr Asp Asn Leu 180 185 190 Lys Ile Gly Lys Asp Tyr Leu Glu Asp Val Ile Asn Gly Ile Asn Glu 195 200 205 Asp Thr Ser Asn Thr Gly Thr Ser Ser Val Tyr Asn Trp Gln Lys Leu 210 215 220 Tyr Pro Ala Asn Tyr His Phe Leu Arg Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Glu 225 230 235 240 Pro Ser Leu His Glu Leu Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Leu Lys Gln 245 250 255 Met Gln Trp Asp Gly Phe Lys Lys Phe Asn Ser Lys Gln Gln Glu Leu 260 265 270 Phe Leu Ser Ile Val Asn Phe Asp Lys Gln Lys Leu Gln Asn Glu Tyr 275 280 285 Asn Ser Ser Asn Leu Pro Asn Phe Val Phe Thr Gly Thr Thr Val Trp 290 295 300 Ala Gly Asn His Glu Arg Glu Tyr Tyr Ala Lys Gln Gln Ile Asn Val 305 310 315 320 Ile Asn Asn Ala Ile Asn Glu Ser Ser Pro His Tyr Leu Gly Asn Ser 325 330 335 Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Gly Gly Gly Ile Ile Asn Thr 340 345 350 Leu Ile Met Gln Asn Tyr Pro Ser Met Val Asp Ile Pro Ser Lys Ile 355 360 365 Ser Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp Ala Val Ala 370 375 380 Gly Ile Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Glu Lys Ile Lys 385 390 395 400 Phe Ile Val Phe Thr Ser Thr Glu Thr Ile Thr Asp Arg Glu Thr Ala 405 410 415 Leu Arg Ser Pro Leu Val Gln Val Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Lys 420 425 430 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Ala Asp Leu Pro Asn Cys Glu Thr Gly 435 440 445 Val Cys Ile Ala Val 450 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 224-26-N2Bsp <400> 15 aaactttcat gacgcaacaa ctattaacag aa 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 224-26-N3Bsp <400> 16 aagtaatcat gaacgtagtg gctccatctt ta 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 224-26-N3.1Bsp <400> 17 cacgtgtcat gactcttcag cagctaatgg at 32

Claims (15)

1. 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산잔기 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는, 단리된 단백질.
2. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단리된 단백질로서:

   (a) 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그보다 많은 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열; 또는

   (b) 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상의 아미노산 동일성을 가지는 아미노산 서열;

   을 포함하여 이루어지는 상기 단백질.
3. 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는, 단리된 단백질.
4. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단리된 단백질로서:

   (a) 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 그보다 많은 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 염기 서열;

   (b) 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 염기 서열; 또는,

   (c) 서열 번호 1, 서열 번호 1의 염기 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열의 상보사슬에 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 염기 서열;

   을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는, 상기 단백질.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 포토박테리움속에 속하는 미생물 유래인, 단리된 단백질.
6. 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는, 단리된 핵산.
7. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 단 리된 핵산으로서:

   (a) 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그보다 많은 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열; 또는

   (b) 서열 번호 2, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 15-514, 서열 번호 4 및 서열 번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열;

   을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는, 상기 핵산.
8. 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 단리 된 핵산.
9. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코드하는 단리된 핵산으로서:

   (a) 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열에 있어서, 1 또는 그보다 많은 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 염기 서열;

   (b) 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서 열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 염기 서열; 또는

   (c) 서열 번호 1, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 43-1545, 서열 번호 3 및 서열 번호 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열의 상보사슬에 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 염기 서열;

   을 포함하여 이루어는, 상기 핵산.
10. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
11. 제 10항에 기재된 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포.
12. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 발현하는 포토박테리움속에 속하는 단리된 미생물.
13. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질의 제조방법으로서, 이하의 공정:

    1) 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 생산하는 미생물을 배양하고;

    2) 배양한 미생물 또는 배양 상청액으로부터, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 단리하는;

    것을 포함하여 이루어지는, 상기 제조방법.
14. 제 13항에 있어서, 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 생산하는 미생물이, 포토박테리움속(Photobacterium sp.)

    JT-ISH-224주(기탁 번호 NITE BP-87)인, 제조방법.
15. β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 재조합 단백질의 제조방법으로서, 이하의 공정:

    1) 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하고;

    2) 얻어진 형질전환세포를 배양하고; 그리고,

    3) 배양한 형질전환세포 또는 그 배양 상청액으로부터, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성을 가지는 단백질을 단리하는;

    것을 포함하여 이루어지는, 상기 제조방법.

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