KR20070069196A - 당전이 효소의 효소활성을 향상시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 비브리오과의 미생물에 유래하는 당전이 효소에 관하여, 종래의 효소반응계와 비교하여 효율적으로 당전이 반응을 행할 수 있는 저렴하고 간편한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 의하면, 비브리오과의 미생물 유래의 당전이 효소, 예컨대 포토박테리움ㆍ댐셀라(Photobacterium damselae) 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 포토박테리움ㆍ포스포레움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 비브리오속균(Vibrio sp.) 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 관하여, 그 효소반응계에 적량의 NaCl을 첨가하는 것에 의해, 그 효소활성이 증가한다.

Description

당전이 효소의 효소활성을 향상시키는 방법{METHOD OF ELEVATING THE ACTIVITY OF GLYCOSYLTRANSFERASE}

본 발명은, 당전이 효소의 활성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

당전이 효소는, 생체내에 있어서 당단백질, 당지질 등의 당쇄(糖鎖)의 생합성에 관여하는 효소이다. 그 반응 생성물인 당단백질이나 당지질 등의 당쇄(이하, 복합당질 당쇄)는, 분화나 발생에 있어서의 세포간 및 세포-세포외 매트릭스 사이의 시그널 전달이나 복합당질의 택(TACK)으로서 기능하는 중요한 분자인 것 등이 밝혀져 있다.

당쇄를 응용해서 산업화되어 있는 예로서, 에리트로포에틴의 당쇄부가를 들 수 있다. 에리트로포에틴은 본래 당쇄가 부가되어 있지만, 그 당쇄의 수를 증가시키는 것에 의해, 생체에 있어서의 에리트로포에틴의 수명을 신장시킨 제품이 개발되어, 시판되고 있다. 금후, 이와 같은 당쇄를 부가한 제품의 시장판매가 증가할 것으로 예상된다. 그 때문에, 당전이 효소의 생산도 중요하게 된다. 또한, 복합당질 당쇄의 기능 해명을 행하는 동시에 여러가지 당쇄의 합성이 필요하게 되어, 대량생산이 필수로 된다.

일반적으로, 복합당질 당쇄의 합성방법은, 크게 2종류로 나눌 수 있다. 하나는, 화학합성법이며, 다른 쪽은 당전이 효소를 이용하는 효소법이다. 또, 화학합성법과 효소법을 사용하는 화학/효소적 합성법이라는 중간적인 합성방법도 존재한다.

화학합성법과 효소법을 비교했을 경우, 어느 쪽도 장점, 단점을 갖는다.

화학합성법의 장점으로서, 당쇄합성에 관한 수많은 지견이 있고, 여러가지 당쇄의 합성에 유연하게 대응할 수 있는 가능성이 있는 것을 들 수 있다. 그러나, 화학합성법에서는 일반적으로 보호ㆍ탈보호라는 공정을 거치지 않으면 안되고, 필연적으로 합성 경로가 길고 조작 자체도 번잡하므로, 높은 수율로 목적물을 얻을 수 없다는 단점이 있다. 더욱이, 전술한 바와 같이, 금후 단백질이나 지질 등의 당쇄수식이 중요하게 된다고 생각되고 있지만, 화학합성법에서는, 그 합성조건으로부터, 단백질이나 지질 등의 기능을 손상하지 않고 당을 부가하는 것은 지극히 어렵다.

한편, 효소법에는 화학합성법과 비교했을 경우, 이하의 장점이 있다. 효소법에서는, 반응 공정이 극히 간편해서, 높은 반응 수율로 목적물을 얻는 것이 가능하다. 더욱이, 온화한 조건에서 반응할 수 있기 때문에, 단백질이나 지질을 변성 시키지 않고, 그들의 당쇄수식에 응용할 수 있다.

지금까지, 약 150종류 이상의 당전이 효소 유전자가 인간, 마우스, 래트 및 효모 등의 진핵 생물로부터 단리되어 있고, 더욱이 CHO세포나 대장균 등을 숙주세포로 하는 생산계에서 당전이 효소활성을 갖는 단백질이 발현되어 있다. 그러나, 이들을 숙주로서 생산된 효소가 나타내는 비활성은, 본래의 조직이나 세포내에서의 당전이 효소의 비활성과 비교하면, 일반적으로 상당히 낮은 값을 나타낸다. 이것은, 대장균 등을 숙주로 하여 생산한 당전이 효소는, 동물세포내에서 생산되어 있는 본래의 당전이 효소와 단백질의 1차 구조는 동일하더라도, 단백질 부분에 부가되는 구조 등이 다르고, 그 결과, 본래의 효소와 비교해서 재조합 효소의 비활성이 저하한다고 생각되기 때문이다.

한편, 원핵생물인 세균으로부터도 하나의 당전이 효소 유전자가 단리되어 있고, 더욱이 대장균을 이용하는 생산계에서 당전이 효소활성을 갖는 단백질이 발현되어, 그들의 기질특성이나 효소화학적인 여러가지 성질이 밝혀져 있다. 그와 같은 미생물에 유래하고, 대량으로 생산가능한 안정한 당전이 효소의 예로서, Photobacterium damselae JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소가 보고되어 있다(일본국특허 제3062409호, 일본국특개평 10-234364). 동효소의 생산성은 배양액 1L당 550U이며, 동효소는 대량으로 생산할 수 있는 예로서 들 수 있다. 그러나, 보다 효율적인 당쇄합성을 가능하게 하기 위해서, 효소활성을 증가시키는 신규한 효소 반응방법의 개발이 요망되고 있었다.

또한, 포유류로부터 얻어진 시알산 전이효소에 관하여, 효소활성을 측정할 때에는, 많은 경우 그 반응계에 MgCl₂, CaCl₂ 등의 2가 이온을 첨가하는 것이 나타나 있다(그라이코바이올로지 실험 프로토콜, 세포공학별책, 1996년 7월 page104∼107, 슈쥰사). 또한, 특수한 호열성 세균으로부터 추출된 프로테아제 중에는, 1-5M이라는 극히 높은 NaCl의 농도에서, 활성이 촉진되는 것은 알려져 있었다 (Inouyeet al. J. Biochem 1997;122, 358-364).

그러나, 당전이 효소의 활성에 미치는 NaCl의 효과에 관해서는, 그 유래에 관계 없이, 어느 것도 분명하게 되어 있지 않았다.

특허문헌 1:일본국특개평 10-234364

비특허문헌 1:세포공학별책, 1996년 7월 page104∼107

비특허문헌 2:J. Biochem 1997;122, 358-364

도 1은 포토박테리움속에 속하는 세균(Photobacterium damselae) 유래의 당전이 효소(α2,6-시알산 전이효소;native)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 2는 포토박테리움속에 속하는 세균(Photobacterium damselae) 유래의 당전이 효소(α2,6-시알산 전이효소;native)에 대한 KCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 3은 래트 유래의 당전이 효소(α2,6-시알산 전이효소)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 4는 포토박테리움속에 속하는 세균(Photobacterium damselae) 유래의 당전이 효소(재조합 α2,6-시알산 전이효소의 데리션ㆍ뮤턴트;N2C1)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 5는 포토박테리움속에 속하는 세균(Phobacterium phosphoreum) 유래의 당전이 효소(α2,3-시알산 전이효소;467 native)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 6은 포토박테리움속에 속하는 세균(Phobacterium phosphoreum) 유래의 당전이 효소(재조합α2,3-시알산 전이효소;467 N0C0)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 7은 포토박테리움속에 속하는 세균(Phobacterium phosphoreum) 유래의 당전이 효소(재조합α2,3-시알산 전이효소;467 N2C0)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 8은 포토박테리움속에 속하는 세균(Phobacterium sp.) 유래의 당전이 효소(재조합α2,3-시알산 전이효소;224 N1C0)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 9는 비브리오속에 속하는 세균(Vibrio sp.) 유래의 당전이 효소(재조합α2,3-시알산 전이효소;FAJ N1CO)에 대한 NaCl의 효소활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 당전이 효소에 관해서, 종래의 효소반응계와 비교해서 효율적으로 당전이반응을 행할 수 있는 저렴하고 간편한 방법을 개발하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 상기 문제해결을 위하여 예의 연구에 노력한 결과, 비브리오과에 속하는 미생물 유래의 당전이 효소에 관해서, 그 효소반응계에 적량의 NaCl을 첨가하는 것에 의해, 그 효소활성이 증가하는 것을 찾아냈다.

본 발명의 효과는, Na이온에 특유하고, K 등의 다른 1가 이온, Mg^{2 +} 등의 2가 이온에서는 얻을 수 없다. 또한, 본 발명의 Na이온에 의한 활성증가는, 비브리오과에 속하는 미생물 유래의 당전이 효소에 특유한 효과이며, 본 발명의 시점에서는, 다른 생물 예컨대 포유류 유래의 당전이 효소에서는 확인되지 않는다.

따라서, 본 발명은, 비브리오과에 속하는 미생물 유래의 당전이 효소에 관해서, 그 효소반응계에 적량의 NaCl을 첨가하는 것에 의해, 효소활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

비브리오과에 속하는 미생물 유래의 당전이 효소는, 본 발명의 방법에서 NaCl을 첨가하는 것에 의해, 그 효소활성이 증가한다고 기대할 수 있고, 혹은, NaCl을 반응계에 추가하는 것에 의해 그 효소활성의 증가를 확인하는 것은, 본 명세서의 개시를 본 당업자에 있어서 용이하다.

본 발명의 방법에 있어서, 비브리오과(Vibrionaceae)에 속하는 미생물의 예로서는, 비브리오속(Vibrio), 포토박테리움속(Photobacterium), 알로모나스속(Allomonas), 카테노코커스속(CateN0C0ccus), 엔테로비브리오속(Enterovibrio), 혹은 살리니비브리오속(Salinivibrio) 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 비브리오과에 속하는 미생물 중에서 바람직한 것은 포토박테리움속에 속하는 미생물, 혹은 비브리오속에 속하는 미생물이다. 포토박테리움속에 속하는 미생물의 예로서는, 포토박테리움ㆍ댐셀라(Photobacterium damselae), 혹은 포토박테리움ㆍ포스포레움(Photobacterium phosphoreum), 혹은 포토박테리움ㆍ앵거스텀(Photobacterium angustum), 혹은 포토박테리움ㆍ인디컴(Photobacterium indicum), 혹은 포토박테리움ㆍ이리오피스카리움(Photobacterium iliopiscarium), 혹은 포토박테리움ㆍ프로펀덤(Photobacterium profundum), 혹은 포토박테리움ㆍ레이오그나시(Photobacterium leiognathi), 혹은 포토박테리움속균(Photobacterium sp.) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 비브리오속에 속하는 미생물로서는, 비브리오ㆍ피셔리(Vibrio fisheri), 혹은 비브리오ㆍ아에로게네스(Vibrio aerogenes), 혹은 비브리오ㆍ칼비엔시스(Vibrio calviensis), 혹은 비브리오ㆍ루모이엔시스(Vibrio rumoiensis), 혹은 비브리오ㆍ살모니시다(Vibrio salmonicida), 혹은 비브리오ㆍ콜레라(Vibrio cholerae), 혹은 비브리오ㆍ알기노리티커스(Vibrio alginolyticus), 혹은 비브리오ㆍ발니피카스(Vibrio vulnificus), 혹은 비브리오속균(Vibrio sp.) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 비브리오과 미생물은, 한정되는 것은 아니지만, 해양성 미생물인 것이 바람직하다. 해양성 미생물은, 예컨대, 해수, 해사, 해산어개류 등으로부터 얻어지는 미생물이다.

비브리오과 미생물 유래의 당전이 효소의 바람직한 것은, 시알산 전이효소이다. 그 일례는, 일본국특개평 10-234364에 개시되어 있는 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소이다. 또한, 비브리오과에 속하는 미생물 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소이어도 상관 없다.

비브리오과에 속하는 미생물 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 본 발명자들에 의해 동정되었다. 이들 효소에 관해서는, PCT/JP2005/007340(2005년 4월 15일 출원) 및 PCT/JP2005/010814(2005년 6월 13일 출원)에서 국제특허출원되어 있고, 이들 출원은 본 명세서에 인용에 의해 원용된다. 또한, 이들 효소의 동정과 조제에 관한 구체적인 방법 및 결과는, 뒤에 나타내는 참고예에도 기재했다.

본 명세서에 있어서, 당전이 효소는, 천연재료로서 비브리오과에 속하는 미생물중 혹은 그 배양배지로부터 추출한 효소, 및 유전자공학에 의해 당해 효소가 유래하는 비브리오과에 속하는 미생물 이외의 숙주세포에서 제조된 효소의 어느 것이나 포함하는 것이며, 또한 효소의 정제 정도는, 겔 전기영동에 의한 분석에서 단일 밴드를 나타내는 정도까지 충분히 정제한 것, 및 조(粗)정제품에서 활성을 갖는 효소의 양쪽을 포함하는 것으로 한다. 더욱이, 당전이 효소는 천연의 효소와 동일한 폴리펩티드로 되어 있어도 좋고, 혹은 천연효소의 활성부위를 포함하도록 가공된 폴리펩티드로 되는 것이어도 좋다.

본 발명의 방법에 있어서, 효소반응을 행하는 조건은, 상기 당전이 효소가 반응하는 조건이면, 특별히 제한은 없다. 효소반응용액에는, 한정하는 것은 아니지만, 아세트산 완충액, 카코질레이트 완충액, 인산완충액, 비스트리스 완충액 등의 완충액을 이용해도 좋다. 반응용액의 pH 및/또는 반응 온도는, 각각의 당전이 효소가 반응하는 조건이면 어느 것이라도 좋고, 바람직하게는 각각의 당전이 효소의 지적 pH 및/또는 지적 온도이다. 당공여체 및 당수용체 농도의 조건은, 당전이 효소가 반응하는 조건이면 특별히 제한은 없고, 당업자이면, 이들의 농도를 적당히 설정할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 당전이 효소의 반응계에 NaCl을 첨가하는 시기에 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 효소반응 전에, 효소반응용 완충액에, 효소용액에, 당수용체 기질용액에, 또는 당공여체 용액에 용해시켜 두어도 좋고, 혹은 이들과 독립하여 적당 농도의 NaCl용액을 조정하고, 이것을 반응계에 첨가해도 좋다. NaCl 용액을 효소 반응 성분과 독립하여 조정하는 태양에서는, 반응의 직전 또는 반응의 도중에서 NaCl을 반응계에 첨가하는 것도 가능하다.

어떻든, 본 발명의 방법에 있어서, 첨가하는 NaCl의 양은, 반응계의 전량을 기준으로 하여, 0.1M∼2.OM, 바람직하게는 0.1M∼1.5M, 더욱 바람직하게는 0.2M∼1.0M이다.

본 발명의 방법에 있어서, 사용할 수 있는 당수용체의 예로서, 단당류, 이당류, 다당류, 당펩티드, 당단백질, 당지질 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서, 사용할 수 있는 당공여체의 예로서는, 당 뉴클레오티드, 예컨대 CMP-NeuAc, CMP-KDN, CMP-NeuGc 등의 CMP-시알산, UDP-갈락토오스, GDP-후코스, GDP-만노스, UDP-N-아세틸글루코사민, UDP-N-아세틸갈락토사민, UDP-글루코오스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, 당전이 효소는 글리코실기를 포함하는 당공여체로부터 당수용체에 글리코실기를 전이하는 반응을 촉매하는 효소이다. 당전이 효소의 예에는, 시알산의 전이반응을 촉매하는 시알산 전이효소, 글루코오스의 전이반응을 촉매하는 글루코오스 전이효소, 갈락토오스의 전이반응을 촉매하는 갈락토오스 전이 효소, N-아세틸갈락토사민의 전이반응을 촉매하는 아세틸갈락토사민 전이효소, N-아세틸글루코사민의 전이반응을 촉매하는 아세틸글루코사민 전이효소, 만노스의 전이반응을 촉매하는 만노스 전이효소, 후코스의 전이반응을 촉매하는 후코스 전이효소를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 명세서에 있어서 시알산 전이효소는, 시알산을 포함하는 당공여체로부터 당수용체에 시알산을 전이하는 반응을 촉매하는 효소이다. 본 발명의 방법에 있어서의 시알산 전이효소의 예로서는, 갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 갈락토시드-α2,4-시알산 전이효소, 갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 시알산-α2,8-시알산 전이효소, 및 시알산-α2,9-시알산 전이효소 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서의 시알산 전이효소는, 갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소, 및/또는, 갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소이다.

본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소」는, 시티딘1인산(CMP)-시알산으로부터 시알산을, 복합당질 당쇄 혹은 유리의 당쇄를 구성하고 있는 갈락토오스 잔기 등의 6위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 6위치, 락토오스 혹은 N-아세틸락토사민 등의 올리고당을 구성하고 있는 갈락토오스 잔기 등의 6위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 6위치, 또는 갈락토오스, 만노스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 등의 복합당질을 구성할 수 있는 단당으로서 6위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 6위치에 전이시키는 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 또, 어느 단당도, α배위이어도, β배위이어도 상관 없다. 본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 활성」은, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소에 관해서 상술한 활성을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소」는, 시티딘1인산(CMP)-시알산으로부터 시알산을, 복합당질 당쇄 혹은 유리의 당쇄를 구성하고 있는 갈락토오스 잔기 등의 3위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 3위치, 락토오스 혹은 N-아세틸락토사민 등의 올리고당을 구성하고 있는 락토오스 잔기 등의 3위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 3위치, 또는 갈락토오스, 만노스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 등의 복합당질을 구성할 수 있는 단당으로서 3위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 3위치에 전이시키는 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 또, 어느 단당도, α배위이어도, β배위이어도 상관 없다. 본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 활성」은, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 관해서 상술한 활성을 의미한다.

또한, 여기에서 말하는 「시알산」은, 시알산 패밀리에게 속하는 노이라민산 유도체를 나타낸다. 구체적으로는, N-아세틸노이라민산(Neu5Ac), N-글리코릴노이라민산(Neu5Gc), 5-데아미노-5-히드록시노이라민산(KDN), 디시알산 등을 나타내지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법은, 비브리오과에 속하는 미생물에 유래하는 당전이 효소에 관해서, 그 효소반응계에 NaCl을 첨가하는 것에 의해, 효소활성을 증가시키는 방법이다. 여기에서, 효소활성이 증가한다는 것은, 당해 반응을 NaCl의 존재하에서 행하는 것에 의해, NaCl의 비존재하에 비하여 당해 반응의 효율이 높아지는 것을 말한다. 바람직한 태양에 있어서, 효소활성이 증가한다는 것은, 당해 반응을 NaCl의 존재하에서 행하는 것에 의해, NaCl의 비존재하에 비하여, 효소의 상대활성이 1배보다 크고, 보다 바람직하게는 1.1배보다 크고, 더욱 바람직하게는 1.2배보다 큰 것을 말한다. 증가한 효소활성의 상한은 특별히 정하지 않아도 좋고, 바람직하게는 10배 이하, 5배 이하, 3배 이하, 2배 이하이어도 좋다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1 비브리오과 미생물 유래의 α2,3-시알산 전이효소의 동정과 클로닝

재료 및 방법

참고예 1-1: α2,3-시알산 전이효소를 발현하는 미생물의 스크리닝과 균주의 동정

해수, 해사, 바다흙탕물 혹은 해산어개류를 접종원으로 했다. 이 접종원을 마린브로스아가 2216배지(벡톤ㆍ딕킨손제)로 이루어지는 평판 배지상에 도포하고, 15℃, 25℃ 혹은 30℃에서 생육하는 미생물을 취득했다. 통상의 방법을 따라, 얻어진 미생물을 순수배양한 후, 마린브로스 2216배지(벡톤ㆍ딕킨손제)로 이루어진 액체배지를 이용하여 각각의 미생물을 배양했다. 미생물이 충분히 육성한 후에, 배양액으로부터 균체를 원심분리에 의해 모았다. 모은 균체에, 0.2% 트리톤X-100(간토화학제)을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0)을 첨가하고, 균체를 현탁했다. 이 균체 현탁액을 빙냉하, 초음파처리하여 세포를 파쇄했다. 이 세포 파쇄액을 효소용액으로서 시알산 전이활성을 측정하고, 더욱이, 피리딜아미노화 당쇄를 이용하여, 시알산 결합양식의 결정을 행하였다. 그 결과, α2,3-시알산 전이활성을 갖는 균주 JT-ISH-467주, JT-ISH-224주, 및 JT-FAJ-16주를 얻었다. 또, JT-ISH-467주는, 오징어의 표피로부터, JT-ISH-224주는 꼬치고기의 내장으로부터, 및 JT-FAJ-16주는 전갱이의 내장으로부터, 각각 얻어졌다.

시알산 전이활성은, J.Biochem.,120, 104-110(1996)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있는 방법에 준해 측정했다. 구체적으로는, 당공여체 기질 CMP-NeuAc(70nmol, ¹⁴C에서 NeuAc를 라벨한 CMP-NeuAc 25000cpm을 포함하고, 356cpm/nmol), 당수용체 기질로서 락토오스(1.25μmol), 및 상기에 기재한 방법에서 조제한효소를 포함하는 반응용액(30μl)을 이용해서 효소반응을 행하였다. 효소반응은 25℃에서 10분간으로부터 30분간 행하였다. 반응 종료후, 반응용액에 197ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 Dowex1×8(PO₄ ³폼, 0.2×2cm, BIO-RAD제) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)에 포함되는 반응 생성물, 즉, 시아릴락토오스에 포함되는 방사활성을 측정함으로써 효소활성을 산출했다.

또한, 시알산 결합양식의 결정은 피리딜아미노화 당쇄를 이용하여 행하였다. 얻어진 효소를 이용하고, 피리딜아미노화 당쇄를 당수용체 기질로서 효소반응을 행하였다. 피리딜아미노화 당쇄로서는, 피리딜아미노화 락토오스(Galβ1, 4Glc-PA, 타카라바이오제 PA-Sugar Chain O26)를 이용하여 분석했다. 또, 표품(標品)으로서, 피리딜아미노화 α2,3시아릴락토오스(NeuAcα2, 3Galβ1, 4Glc-PA, 타카라바이오제 PA-Sugar Chain O29)를 이용했다. 당수용체 기질이 2.0μM, CMP-NeuAc가 5.7μM 및 효소가 20mU/ml 정도로 되도록, 각각을 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0) 혹은 비스트리스 완충액(pH6.0) 25μl 중에 용해하고, 25℃하에서 3시간으로부터 18시간반응시켰다. 반응 종료후, 100℃에서 2분간 반응용액을 처리하는 것에 의해 효소를 실활시켰다. 그 후, HPLC에서 반응 생성물의 분석을 행하였다.

HPLC시스템으로서 Shimadzu LC10A(시마즈제작소제)를 이용하고, 분석 컬럼으로는 Takara PALPAK Type R(타카라바이오제)을 이용했다. 0.15% N-부탄올을 포함하는 100mM 아세트산-트리에틸아민(pH5.O)으로 평형화한 컬럼에 용출액A(100mM 아세트산-트리에틸아민, pH5.0)로 희석한 반응액을 주입했다. 피리딜아미노화 당쇄의 용출에는 용출액A(100mM 아세트산-트리에틸아민, pH5.0) 및 용출액B(0.5%, N-부탄올을 포함하는 100mM아세트산-트리에틸아민, pH5.0)을 이용하여, 30∼100% 용출액B의 직선농도구배법(0∼35분) 및 100% 용출액B(35∼50분)에 의해, 순차 피리딜아미노화 당쇄를 용출했다. 또, 분석은 이하의 조건에서 행하였다(유속:1ml/min, 컬럼 온도:40℃, 검출:형광(Ex:320nm, Em:400nm)).

(i) JT - ISH -467주

얻어진 JT-ISH-467주의 성질은 이하와 같았다:

(균학적 성질)

(1) 세포의 형태는 간균(桿菌)에서, 크기는 0.7∼0.8μm×1.5∼2.0μm.

(2) 운동성 -

(3) 그램 염색성 -

(4) 포자의 유무 -

(생리학 생화학적 성질)

(1) 생육온도 4℃에서는 +, 25℃에서는 +, 30℃에서는 -

(2) 집락의 색조 특징적 집락색소를 산생하지 않음

(3) O/F테스트 +/-

(4) 카탈라아제 테스트 -

(5) 옥시다아제 테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산(酸) 산생(産生) -

(7) 글루코오스로부터의 가스 산생 -

(8) 발광성 +

(9) 질산염 환원 +

(10) 인돌 산생 +

(11) 포도당 산성화 -

(12) 아르기닌디히드로라제 +

(13) 우레아제 -

(14) 에스크린 가수분해 -

(15) 젤라틴 가수분해성 -

(16) β-갈락토시다제 +

(17) 포도당 자화성 -

(18) L-아라비노스 자화성 -

(19) D-만노스 자화성 -

(20) D-만니톨 자화성 -

(21) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(22) 말토오스 자화성 -

(23) 글루콘산칼륨 자화성 -

(24) n-카프린산 자화성 -

(25) 아디핀산 자화성 -

(26) dl-말산 자화성 -

(27) 시트르산나트륨 자화성 -

(28) 아세트산페닐 자화성 -

(29) 치토크롬옥시다아제 +

(30) 균체내 DNA의 GC 함량(몰%）39.7%

(16S rRNA 유전자의 염기서열 해석 및 DNA - DNA 하이브리다이제이션에 의한 종의 동정)

JT-ISH-467주로부터, 통상의 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA유전자의 전체 염기서열을 증폭하고, 염기서열을 결정했다. 염기서열을 서열번호3에 나타냈다. 이 염기서열은 포토박테리움ㆍ포스포레움(Photobacterium phospLoreum) 기준주인 ATCC11040주의 16S rRNA유전자의 염기서열에 대하여, 상동율 100%의 높은 상동성을 나타냈다. 이 결과로부터, JT-ISH-467주는 포토박테리움속에 속하는 것이 분명하게 되었다. 그러나, 16S rRNA유전자는 세균의 전체 게놈의 일부일 뿐이므로, 16S rRNA유전자의 염기서열에 의한 동정해석은 종 레벨의 극히 근연한 생물 사이의 거리에 대하여는 오차가 상당히 크다고 보고 있다. 따라서, 속내에 있어서 균주의 유연관계의 정량적인 평가에 일반적으로 이용되고 있는 DNA-DNA 하이브리다이제이션 시험법을 이용하여, 종의 결정을 행하였다. JT-ISH-467주 및 포토박테리움ㆍ포스포레움 기준주인 NCIMB1282주(ATCC11040주와 동일주)의 전체 DNA를 추출하고, 공시했다. 그 결과, 84.7%의 높은 상동값(DNA-DNA relatedness)이 얻어졌다. 일반적으로, 동일종간의 DNA-DNA 상동값은 60% 이상을 나타내는 것으로부터, JT-ISH-467주는 포토박테리움ㆍ포스포레움(Photobacterium phosphoreum)로 동정되었다. 또, DNA-DNA 하이브리다이제이션 시험은 「미생물의 분류ㆍ동정실험법」(스즈키 켄이치로ㆍ히라이시 아키라ㆍ요코타 아키라편, 슈프링거ㆍ페어라크 동경주식회사, 2001년 9월, 참조에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 따라, 마이크로플레이트를 이용한 포토비오틴 표식법에 의해 행했다.

(ii) JT - ISH -224주

얻어진 JT-ISH-224주의 성질은 이하와 같았다:

(균학적 성질)

(1) 세포의 형태는 간균으로, 크기는 0.7∼0.8μm×1.O∼1.5μm.

(2) 운동성 +

(3) 그램 염색성 -

(4) 포자의 유무 -

(생리학 생화학적 성질)

(1) 생육온도 4℃에서는 -, 25℃에서는 +, 30℃에서는 +, 37℃에서는 -

(2) 집락의 색조 특징적 집락색소를 산생하지 않음

(3) O/F테스트 +/-

(4) 카탈라아제 테스트 +

(5) 옥시다아제 테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산(酸) 산생(産生) +

(7) 글루코오스로부터의 가스 산생 +

(8) 발광성 -

(9) 질산염 환원 +

(10) 인돌 산생 +

(11) 포도당 산성화 -

(12) 아르기닌디히드로라제 +

(13) 우레아제 -

(14) 에스크린 가수분해 -

(15) 젤라틴 가수분해성 -

(16) β-갈락토시다제 +

(17) 포도당 자화성 -

(18) L-아라비노스 자화성 -

(19) D-만노스 자화성 -

(20) D-만니톨 자화성 -

(21) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(22) 말토오스 자화성 -

(23) 글루콘산칼륨 자화성 -

(24) n-카프린산 자화성 -

(25) 아디핀산 자화성 -

(26) dl-말산 자화성 -

(27) 시트르산나트륨 자화성 -

(28) 아세트산페닐 자화성 -

(29) 치토크롬옥시다아제 +

(30) O/129 감수성, 10μg -, 15μg +

(31) 균체내 DNA의 GC함량(몰%）39.4%

(16S rRNA 유전자의 염기서열 해석)

JT-ISH-224주로부터, 통상의 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA유전자의 전체 염기서열을 증폭하고, 염기서열을 결정했다. 염기서열을 서열번호32에 나타냈다.

JT-ISH-224주는 마린아가상에서의 생육성, 간균, 그램 염색성, 글루코오스 발효적 분해성, O/129감수성 등의 형태관찰 및 생리ㆍ생화학적 성상시험의 결과로부터 비브리오과에 속하는 것이 나타났다. 더욱이, JT-ISH-224주의 16S rRNA유전자의 DNA염기서열은 포토박테리움ㆍ포스포레움(Photobacterium phosphoreum) 기준주ATCC11040의 16S rRNA유전자의 서열에 가장 상동성이 높고, 그 상동율은 99.2%인 것, 다음에 포토박테리움ㆍ이리오피스카리움(Photobacterium iliopiscarium) 기준주ATCC51760의 16S rRNA유전자의 서열에 상동성이 높고, 그 상동율은 99.1%인 것이 분명하게 되었다. 이들의 결과로부터, JT-ISH-224주는 포토박테리움속(Photobacterium sp.)에 속하는 미생물인 것이 분명하게 되었다.

(iii) JT - FAJ -16주

얻어진 JT-FAJ-16주의 성질은 이하와 같았다:

(균학적 성질)

(1) 세포의 형태는 간균에서, 크기는 0.7∼0.8μm×1.2∼1.5μm.

(2) 운동성 -

(3) 그램 염색생 -

(4) 포자의 유무 -

(생리학 생화학적 성질)

(1) 생육온도 4℃에서는 +w, 25℃에서는 +, 30℃에서는 +, 37℃에서는 +

(2) 집락의 색조 담황색∼크림색

(3) O/F테스트 +/+

(4) 카탈라아제 테스트 +

(5) 옥시다아제 테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산 산생 +

(7) 글루코오스로부터의 가스 산생 -

(8) 질산염 환원 +

(9) 인돌 산생 -

(10) 포도당 산성화 +

(11) 아르기닌디히드로라제 -

(12) 우레아제 -

(13) 에스크린 가수분해 +

(14) 젤라틴 가수분해성 -

(15) β-갈락토시다제 +

(16) 포도당 자화성 -

(17) L-아라비노스 자화성 -

(18) D-만노스 자화성 -

(19) D-만니톨 자화성 -

(20) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(21) 말토오스 자화성 -

(22) 글루콘산칼륨 자화성 -

(23) n-카프린산 자화성 -

(24) 아디핀산 자화성 -

(25) dl-말산 자화성 -

(26) 시트르산나트륨 자화성 -

(27) 아세트산페닐 자화성 -

(28) 치토크롬옥시다아제 +

(29) O/129감수성, -

(30) 만니톨 발효성, +

(31) 이노시톨 발효성, +

(32) 아라비노스 발효성, +

(33) 럼노스 발효성, -

(34) 사카로스 발효성, -

(35) 생육성(NaCl), 3% NaCl +, 4% NaCl +, 6% NaCl +,

(36) 전분 가수분해, -

(37) Tween80분해, -

(38) H₂S 산생, -

(39) 아세토인 산생(VP테스트), -

(16S rRNA유전자의 염기서열 해석)

JT-FAJ-16주로부터, 통상의 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA유전자의 전체 염기서열을 증폭하고, 염기서열을 결정했다. 염기서열을 서열번호33에 나타냈다.

JT-FAJ-16주는 마린아가상에서의 생육성, 간균, 그램 염색성, 글루코오스 발효적 분해성, O/129감수성 등의 형태관찰 및 생리ㆍ생화학적 성상시험의 결과로부터 비브리오과에 속하는 것이 나타났다. 더욱이, JT-FAI-16주의 16S rRNA유전자의 DNA염기서열은 비브리오ㆍ루모이엔시스(Vibrio rumoiensis) 기준주의 16S rRNA유전자의 서열에 가장 상동성이 높고, 그 상동율은 99.5%인 것이 분명하게 되었다. 이들의 결과로부터, JT-FAJ-16주는 비브리오속(Vibrio sp.)에 속하는 미생물인 것이 분명하게 되었다.

참고예 1-2: 포토박테리움 포스포레움 ( Photobacterium phosphoreum ) JT - ISH -467로부터의 α2,3-시알산 전이효소의 추출 및 정제

마린아가2216 평판배지상에서 계대(繼代)배양한 포토박테리움 포스포레움 JT-ISH-467주의 콜로니로부터 균체를 루프로 채취하고, 마린브로스2216 액체배지 10ml에 접종하고, 25℃, 매분 180회전에서 8시간 진탕하여 배양했다.

본 배양은, 이하의 순서로 실시했다. 20g/L의 Bacto Peptone 및 4g/L의 Bacto Yeast Extract를 가한 마린브로스2216 배지를 1000ml용(容)의 코브 부착 플라스크에 300ml 넣고, 오토클레이브(121℃, 15분간)에서 멸균했다. 이것을 36개(합계 10.8L) 준비했다. 각각의 플라스크에 전술의 배양액 10ml를 접종하고, 25℃, 매분 180회전에서 24시간 진탕하여 배양했다. 배양액을 원심분리하고, 균체를 회수했다. 습윤중량에서 약 60g을 얻었다.

이 균체를, 990ml의 0.2% 트리톤X-100 및 3M 염화나트륨을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.O)에 현탁하고, 빙냉하에서 초음파 파쇄했다. 균체 파쇄액을 4℃, 100,000×g에서 1시간, 원심분리를 행하고, 상청을 얻었다. 얻어진 상청을, 투석막 튜브에 넣고, 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0) 중에서 4℃, 염화나트륨이 20mM 정도로 될 때까지 투석했다. 투석후, 용액중에 침전이 생겼기 때문에, 4℃에서, 100,000×g에서 1시간 원심분리를 행하여, 침전을 제거했다.

이 조효소액을, 0.2% 트리톤X-100 되는 계면활성제를 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0)으로 평형화한 HiPrep 16/10 DEAE FF(아마샴바이오사이언스제)라는 음이온교환컬럼에 흡착시켜, 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함하는 동일 완충액에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화나트륨 농도가 0.25M 부근에서 용출된 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

회수한 분획을 20mM 인산완충액(pH6.0)으로 희석하고, 미리 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 인산완충액(pH6.0)으로 평형화한 하이드록시아파타이트(Bio-Rad제)에 흡착시켜, 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 인산완충액(pH6.0)으로부터 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 500mM 인산완충액(pH6.0)에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 인산완충액 농도가 125mM 부근에 용출된 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

이 분획을 MonoQ 5/50 GL(아마샴바이오사이언스제) 음이온교환컬럼에 흡착시켜, 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함하는 동일 완충액에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화나트륨 농도가 300mM 부근에서 용출되는 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

이 분획을, 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH7.0)으로 10배 희석하고, MonoQ 5/50 GL(Pharmacia제) 음이온교환컬럼에 흡착시켰다. 0.2% 트리톤X-100을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH7.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함하는 동일 완충액에, 직선농도구배법으로 용출시켰다. 염화나트륨 농도가 300mM 부근에서 용출되는 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

이 분획을 0.2% 트리톤X-100 및 0.2M 염화나트륨을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH7.O)으로 2배 희석하고, HiLoad 16/60 Superdex 200 prepgrade(아마샴바이오사이언스제) 겔여과컬럼으로 분획했다. 0.2% 트리톤X-100 및 0.2M 염화나트륨을 포함하는 20mM 카코질레이트 완충액(pH7.O)에서 용출시켰다.

활성이 있었던 분획을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(아크릴아미드겔의 농도는 12.5%)한 결과, 목적효소는 단일인 밴드를 나타내고, 약 39,000의 분자량을 나타냈다(본 명세서에 있어서 467 native라 표기한다). 이 분획의 비활성은, 균체 파쇄시의 비활성에 비하여 약 350배로 상승했다(표 3).

조효소액으로부터의 JT-ISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소의 정제에 관해서, 상술한 각각의 정제공정을 거친 시료의 효소활성을 표 1에 나타낸다. 효소활성은, 실시예 7-1에 기재한 것과 동일하게 J. Biochem. 120, 104-110(1996)에 기재되어 있는 방법에서 측정했다. 또한, 단백질의 정량은 Coomassie Protein Assay Reagen(PIERCE제)을 이용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라서 단백질의 정량을 행하였다. 효소 1단위(1U)는, 1분간에 1마이크로몰의 시알산을 전이하는 효소량으로 했다.

[표 1]

조효소액으로부터의 JTISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소의 정제표

참고예 1-3: 피리딜아미노화 당쇄를 이용한 시알산 결합양식의 결정

참고성 1-2에서 얻어진 효소를 이용하여, 참고예 1-1과 같이, 피리딜아미노화 당쇄를 당수용체 기질로 해서 효소반응을 행하였다. 그 결과, 본 효소를 이용하는 것에 의해, 피리딜아미노화 락토오스로부터 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스가 합성되는 것이 분명하게 되었다.

참고예 1-4: 포토박테리움 ㆍ 포스포레움 JT - ISH -467주가 생산하는 α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 유전자의 염기서열 해석 및 당해 유전자의 형질전환

(1) 게놈 DNA 의 정제와 게놈 라이브러리의 작성

JT-ISH-467주의 균체 펠렛 약 0.5g으로부터, Qiagen Genomic-tip 100/G(Qiagen사제)를 이용하여, 키트 첨부의 설명서에 따라, 약 100μg의 게놈 DNA를 조제했다. 1-2μg의 DNA에 대하여, 0.1∼0.2유닛의 사염기 인식의 제한효소Sau3AI를 반응시켜, 부분분해를 행하였다. 반응 버퍼는 효소에 첨부한 것을 이용하고, 반응 조건은 37℃, 30분으로 했다. 반응 종료후, 반응액에 최종농도 25mM의 EDTA pH8.0을 가하고, 페놀ㆍ클로로포름 처리를 행하였다. 게놈 DNA를 에탄올 침전으로 회수하고, TE 400μl에 용해했다. 원심 튜브(히타치제작소제 40PA)에, 그라디엔트 제작장치를 이용하여, 40% 슈크로오스 버퍼(20mM Tris pH8.0, 5mM EDTA pH8.0, 1M NaCl)와 10% 슈크로오스 버퍼로부터, 40-10%의 그라디엔트를 제작하고, 거기에 상기의 부분분해 DNA용액을 중층했다. 초원심기(히타치제작소제 SCP70H, 로터:SRP28SA)를 이용하여, 26,000rpm, 20℃, 15시간 원심했다. 원심후 튜브의 저부에 25G의 바늘로 구멍을 뚫고, 저부의 액부터 1ml씩 회수했다. 회수한 게놈 DNA를 포함하는 샘플의 일부를, 서브머린 전기영동조를 이용하여, 0.5-0.6% 아가로스 겔 /TAE버퍼중에서, 26V, 20시간 전기영동을 행하고, 9-16kb의 사이즈의 DNA를 포함하는 분획을 파악했다. 마커로서 λ/HindIII를 이용했다. 9-16kb의 사이즈의 DNA단편을 포함하는 분획에 TE를 2.5ml 가하여 슈클로오스 농도를 낮춘 후, 에탄올 침전, 린스를 행하고, 소량의 TE에 용해했다.

JT-ISH-467주의 게놈 라이브러리 작성을 위한 벡터로서, λDASH II(Stratagene제)를 이용했다. λDASH II/BamHI벡터와 게놈 DNA단편의 라이게이션 반응은 Stratagene제의 라이게이션 키트를 이용하여, 12℃에서 하룻밤 행하였다. 반응 후, 반응액을 GigaPack III Gold Packaging extract와 반응시켜, 게놈 DNA가 조합된 λ벡터를 파지 입자에 받아들이게 했다. 파지액은 500μl의 SM버퍼와 20μl의 클로로포름 중에서 4℃ 보관했다. 대장균XL1-Blue MRA(P2)(Stratagene제)을 LBMM(LB+0.2% 말토오스+10mM MgSO₄) 중에서 A₆₀₀=0.5로 될 때까지 배양하고, 이 배양액 200μl에, 적량의 파지 용액을 가하고, 37℃에서 15분간 배양했다. 여기에 48℃에서 보온한 NZY 톱 아가로스를 4ml 가하고, 혼합하고, NZY 아가 플레이트(직경 9cm의 플라스틱 샤알레)에 플래팅했다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양하고, 플라크 수를 세고, titer를 계산한 바, 라이브러리 사이즈는 약 30만pfu(plaque forming unit)로 산출되었다.

(2) 프라이머 설계와 프로브 작성

Procise 494 cLC Protein Sequencing System(Applied Biosystems제)을 이용하여, JT-ISH-467주 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 아미노 말단(N말단) 아미노산 서열, 및 내부 아미노산 서열을 결정했다.

N말단 아미노산 서열의 결정은, 다음과 같이 행하였다. 당해 시알산 전이효소를 5/20% 그라디엔트 겔(ATTO제)에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 행하였다. 영동후, 당해 효소를 PVDF막에 흡착시켜, 아미노산 서열 분석장치에 의해, 아미노 말단측 10개의 아미노산의 서열을 결정했다. 그 결과, 당해 효소의 N말단 아미노산 서열은 XNSDSKHNNS(서열번호4)이었다.

또한, 내부 아미노산 서열의 결정은, 다음과 같이 행하였다. 당해 시알산 전이효소를 5/20% 그라디엔트 겔(ATTO제)에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 행하였다. 겔을 염색한 후, 원하는 밴드를 꺼내고, 리질엔드펩티다제를 포함하는 트리스 버퍼(pH8.5)를 가하고, 35℃, 20시간의 처리를 행하였다. 그 후, 용액의 전량을 역상HPLC(컬럼:Symmetry C18 3.5μm)에 제공하여, 단편 펩티드를 분리했다. 아미노산 서열 분석장치에 의해, 당해 효소의 내부 아미노산 서열은, SLDSMILTNEIK(서열번호5), FYNFTGFNPE(서열번호6) 및 GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)을 갖는 것이 분명하게 되었다.

상기한 바와 같이 결실된 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467유래 α2,3-시알산 전이효소의 부분 아미노산 서열, 즉 N말단 아미노산 서열:XNSDSKHNNS(서열번호4)와, 3군데의 내부 아미노산 서열 중, 2군데의 내부 아미노산 서열:FYNFTGFNPE(서열번호6) 및 GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)을 기초로 이하의 degenerate프라이머를 설계, 합성했다. 즉, N말단의 아미노산 서열:XNSDSKHNNS(서열번호4)로부터, 하기의 표 2에 나타내는 3개의 프라이머를 합성했다.

[표 2]

표 중, Y는 티민 또는 시토신; W는 티민 또는 아데닌; S는 시토신 또는 구아 닌; R은 아데닌 또는 구아닌; N은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티 민; I는 이노신;을 각각 나타낸다.

또한, 내부 아미노산 서열:GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)로부터 하기의 표 3에 나타내는 4개의 프라이머를 합성했다.

[표 3]

표 중, H는 티민, 시토신 또는 아데닌; Y는 티민 또는 시토신; R는 아데닌 또는 구아닌; D는 아데닌, 구아닌 또는 티민; N은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민;을 각각 나타낸다.

더욱이, 내부 아미노산 서열:FYNFTGFNPE(서열번호6)로부터 하기의 표 4에 나타내는 2개의 프라이머를 합성했다.

[표 4]

표 중, Y는 티민 또는 시토신; R은 아데닌 또는 구아닌; N은 아데닌, 구아 닌, 시토신 또는 티민;을 각각 나타낸다.

이들의 프라이머를 이용하여, 상기 (1)에서 추출ㆍ정제한 JT-ISH-467주의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 행하고, 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브가 되는 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분길이 DNA를 증폭했다. 프라이머 조합은, N말단 서열 유래의 3개의 프라이머의 각각을, 467in1FW(서열번호12), 467in1FW2(서열번호14) 혹은 467in2FW(서열번호16)의 9개의 조합, 467in1RV(서열번호11) 혹은 467in1RV2(서열번호13)과 467in2FW(서열번호16)의 2개의 조합, 더욱이 467in2RV(서열번호15)와 467in1FW(서열번호12) 혹은 467in1FW2 (서열번호14)의 2개의 조합의, 총계 13조합이다. PCR 반응은 이하와 같이 행하였다. 50μl의 반응액 중에, 게놈 DNA 250ng, 10(Ex taq버퍼 5μl, 2.5mM 각 dNTPs 4μl, 프라이머를 각각의 서열에 관해서 5pmole, Ex taq(타카라바이오제) 0.5μl를 각각 함축성, 프로그램템프콘트롤시스템 PC-700(ASTEK사)을 이용하고, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 40회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, 9개의 프라이머 조합(467N-RV(서열번호8)과 467in1FW(서열번호12), 467N-RV(서열번호8)와 467in2FW(서열번호16), 467in1RV(서열번호11)와 467in2FW(서열번호16), 467in2RV(서열번호15)와 467in1FW(서열번호12)의 조합 이외의 9개)에 있어서, PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물 중, 특이적 또한 높은 증폭 효율이 얻어진 조합(467N-RV3(서열번호10)과 467in1FW(서열번호12)) 유래의 PCR산물을 벡터pCR2.1TOPO(Invitrogen제)에 클로닝 했다. 라이게이션 반응은 벡터 키트 첨부의 설명서에 따랐다. 대장균 TB1에 일렉트로코포레이션법을 이용해서 DNA를 도입하고, 통상의 방법(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edition(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다))에 따라 플라스미드DNA를 추출했다. 이 클론에 관해서, M13프라이머(타카라바이오제)를 이용하여, ABI PRISM형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer제)로, PCR산물의 염기서열을 그 양단으로부터 결정했다.

결정된 DNA염기서열(929bp:서열번호17)에 관해서, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GeneBank 데이터베이스에 대하여, BLAST프로그램에 의한 상동성 검색을 행하였다. 그 결과, 유의한 상동성을 나타내는 DNA서열은 검출되지 않았다. 이것은 본 발명에 의해 밝혀진, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 DNA염기서열이 신규한 서열인 것을 의미한다. 다음에, 이 염기서열을 아미노산으로 번역하여, 다시 BLAST서치를 행한 바, 포토박테리움ㆍ댐셀라(Photobacterium damselae)의 α2,6-시알산 전이효소JC5898)와 30%의 상동성, 파스트렐러ㆍ물토시다 아종 물토시다주 (Pasteurella multocida subsp. multocida) Pm70의 가정상의 단백질 Pmol88(AAKO2272)과 26%의 상동성, 헤모필스ㆍ듀크레이(Haemophilus ducreyi) 35000HP주의 가정상의 단백질HDOO53(AAP95068)과 21%의 상동성이 검출되었다. 더욱이, 번역된 아미노산 서열은, 상기의 정제 효소로부터 직접 결정된 내부 아미노산 서열:FYNFTGFNPE(서열번호6)와 SLDSMILTNAIK(서열번호5)의 전체를 포함하고, N말단 아미노산 서열:XNSDSKHNNS(서열번호4)와, 내부 아미노산 서열:GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)의 일부를 포함하고 있었다. 이상의 결과로부터, 클로닝된 DNA는, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 일부이며, 또한 본 발명의 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열은, 이미 보고된 서열과 30% 정도 밖에 상동성을 나타내지 않는 신규한 아미노산 서열인 것이 분명하게 되었다.

(3) 스크리닝과 유전자 클로닝

상기 (2)에서 클론화된 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 일부로 이루어지는 DNA단편을, pCR2.1 TOPO벡터로부터 제한효소 EcoRI로 꺼내고, 이것을 프로브로 하여, 상기 (1) 제작한 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝했다. 직경 9cm의 원형 샤알레에 λDASH II/BamHI 벡터 키트(Stratagene제)의 설명서에 따라서, 약 300-500pfu의 파지를 숙주균 XL1-blue MRA(P2)와 함께 플래팅했다. 플라크를 Hybond-N+ 나일론 멤브레인 필터(Amersham제)에 접촉시켜, 멤브레인 첨부의 설명서에 따라서 알칼리 처리를 행하여 DNA를 변성시켜, 멤브레인상에 고정시켰다. 프로브는 rediprime II^TM DNA labelling system(아마샴바이오사이언스제)을 이용해서 ³²P 라벨했다. 하이브리다이제이션은 0.5M 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 7% SDS, 1mM EDTA 중에서 65(C에서 하룻밤, 세정의 조건은 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1mM EDTA, 5% SDS 중에서 65℃, 15분을 2회, 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1% SDS, 1mM EDTA 중에서 65(C, 15분을 2회 행하였다. 1차 스크리닝에서 약 5,000pfu의 파지로부터 24개의 포지티브 클론이 얻어졌다. 그 중 18개의 클론에 관해서, 플라크의 정제를 겸한 2차 스크리닝을 행하였다. 그 결과, 6종류의 선발ㆍ정제 플라크를 얻을 수 있었다.

이들의 플라크를 회수하고, 각각 대장균 XL1-blue MRA(P2)와 함께, 한 장 수만pfu로 되도록 NZY플레이트에 플래팅하고, 하룻밤 37℃에서 보온했다. 플라크가 1면에 나와 있는 6장의 플레이트에 SM버퍼를 4ml씩 붓고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 파스퇴르 피펫으로, 파지 플레이트 라이세이트를 회수하고, QIAGEN Lambda Mini Kit(키아젠제)로, λDNA를 추출, 정제했다. 이들 6종류의 λDNA, 및 (1)에서 정제한 JT-ISH-467주의 전체 게놈 DNA를 제한효소 EcoRI, HindIII로 소화하고, 0.7% 아가로스 겔 전기영동에서 분획후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블로팅에 의해, 겔을 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(아마샴바이오사이언스제)에 전사했다. 이 필터에 관해서, 상기의 929bp의 프로브(서열번호17)를 이용하여, 상술한 바와 같이 서던하이브리다이제이션을 행하였다. 그 결과, EcoRI소화에서는, 9kb 또는 그 이상의 밴드가 검출되었다. 한편, HindIII소화의 경우, 모든 λDNA, 게놈 DNA와 함께 4.6kb의 밴드가 검출되었다. 그래서, λDNA를 다시 HindIII로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동을 행하고, 4.6kb HindIII단편을 회수하고, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)의 HindIII부위에, 통상의 방법에 따라 클로닝했다.

다음에, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 전체 염기서열을 결정하기 위해서, 동일 유전자의 부분 DNA서열(상술, 929bp:서열번호17)을 기초로 이하의 표 5에 나타내는 프라이머를 합성했다.

[표 5]

이들의 프라이머를 이용하여, ABI PRISM 형광 시퀀서(Mode1 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer제)로, 4.6kb HindIII단편의 내부 염기서열을 해석하고, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 내부, 및 그 근방의 염기서열을 해석했다. 그 결과, 서열목록의 서열번호1의 서열을 얻었다. 이 서열은, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 오픈 실린딩 프레임(ORF)의 전체 염기서열이다. 최초의 ATG의 상류에는 동일한 판독 프레임에서, 번역 종지코돈이 나타나므로 이것이, 본 유전자의 번역 개시코돈이라고 생각된다.

포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 1230염기로 이루어지고, 409개 아미노산을 코드하고 있었다. 이 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호2에 나타낸다. 이 아미노산 서열은, 정제 효소로부터 결정된 4개소의 아미노산 서열 모두를 완전히 포함한다. N말단의 아미노산 서열의 1문자째가 해독되지 않고 있었지만, 유전자로부터 연역되는 이 부분의 아미노산은 Cys(시스테인)이었다. 또한 성숙 단백의 N말단은, 서열목록의 서열번호2의 서열의 중의 제22번째의 Cys인 것으로부터, 처음의 21아미노산으로 이루어지는 서열은, 포토박테리움ㆍ포스포레움에 있어서는 프로세싱을 받고, 제거된다고 생각되었다. 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스제)을 이용하여, 본 발명의 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 단백질 전장 및 그 유전자 전장과, 그들의 호몰로그의 전장끼리의 상동성을 해석한 바, 아미노산 서열에서는, 포토박테리움ㆍ댐셀라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 32%의 상동성, 파스트렐러ㆍ물토시다 아종 물토시다주 Pm70의 가정상의 단백질 Pmol88(AAKO2272)과 28%의 상동성을 갖고, 그리고, 유전자 DNA서열에서는 각각과 53%, 51%의 상동성을 갖고 있었다.

(4) 발현 벡터의 구축

클론화한 유전자가, 시알산 전이활성을 가질 것인가 아닌가를 조사하기 위해서, 동일 유전자의 전장, 및 N 말단측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현 벡터에 조합하고, 대장균 내에서 단백질을 생산시켜, 이 발현 단백질의 활성을 측정했다.

포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 관해서, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7에서 해석을 행한 바, N말단의 24아미노산이, 시그널 펩티드라고 예측되었다. 따라서, 유전자 전장(본 명세서에 있어서 467-N0C0 유전자라 표기한다)을 클론화하기 위한 프라이머 467-23ST-N0-Pci(서열번호27) 및 467-23ST-CO-Bm(서열번호26), 더욱이 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 제거된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 명세서에 있어서 467-N2CO 유전자라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 467-23ST-N2-Nco(서열번호25) 및 467-23ST-CO-Bm(서열번호26)을 설계, 합성했다(표 6).

[표 6]

클로닝용으로 프라이머에 미리 조합한 제한효소 PciI(467-23ST-N0-Pci), NcoI(467-23ST-N2-Nco), BamHI(467-23ST-CO-Bm)부위를 밑줄로 나타냈다. 번역 개시코돈 ATG, 번역 종지코돈에 대응하는 상보서열 TAA를 사각으로 둘러쌌다. 더욱이, 프라이머 서열 중, 제한효소 부위보다 3'측에서, 주형 DNA와 어닐링하는 부분의 서열을 굵은 글씨로 나타냈다. PCR시의 주형 DNA는, 포토박테리움ㆍ포토박테리움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자 전장을 포함하는 상기 HindIII 4.6kb 단편이 조합된 플라스미드를 이용했다. PCR의 반응 조건은 이하와 같이 설정했다. 50μl의 반응액 중에, 주형 DNA 100ng, 10×Ex taq buffer 5μl, 2.5mM 각 dNTP 4μl, 프라이머 50pmole, Ex taq(타카라바이오제) 0.5μl를 각각 포함하고, 프로그램템프 콘트롤시스템 PC-700(ASTEK제)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 15회, 72℃6분을 1회 행하였다. 그 결과, 467-N0C0 유전자에서 약 1.2kb, 467-N2CO 유전자에서 약 1.1kb의 PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR 산물 중, 467-N0C0 유전자를 제한효소 PciI(New England Biolab제)와 BamHI(타카라바이오제)로 2중 소화하고, 그리고, 467-N2CO 유전자를 제한효소 NcoI(타카라바이오제)과 BamHI에서 2중 소화한 후, 겔 정제했다. 대장균 발현용 벡터는 pTrc99A(Phamacia LKB제)를 이용했다. 이 벡터를 같은 제한효소 PciI과 BamHI, 또는 제한효소 NcoI과 BamHI에서 2중 소화해 겔 정제한 것을, 제한효소 처리를 행한 PCR산물과 Takara Ligation Kit(타카라바이오제)를 이용하여 라이게이션하고, 대장균TB1로 형질전환했다. 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출, 제한효소분석하고, 삽입의 조합을 확인했다. 더욱이, 클론한 467-N0C0 유전자 및 클론한 467-N2CO 유전자의 전체 염기서열을 결정하고, PCR반응에 의한 염기서열의 변이가 없는 것을 확인했다. 즉, 클론한 467-N0C0 유전자는 서열번호1에 나타내는 염기서열을 포함하고, 그리고 클론한 467-N2CO 유전자는 서열번호1의 제73번째의 염기로부터 제1230번째의 염기까지의 서열을 포함하고 있었다.

(5) 발현유도와 활성 측정

상기 (4)에서 얻어진 467-N0C0 유전자, 467-N2CO 유전자에 관해서, 단백질 발현 유도실험을 행하였다. 467-N0C0 유전자 및 467-N2CO 유전자가 각각 조합된 발현벡터 pTrc99A를 갖는 대장균TB1의 단일 콜로니를, 항생물질 암피실린(최종농도 100(g/mL)를 포함하는 LB배지(5ml)에 접종하고, A₆₀₀ = 0.5 정도로 될 때까지 30℃에서 균을 전배양하고, 그 후 IPTG(이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노시드, 와코쥰야쿠공업제)를 최종 농도에서 1mM이 되도록 가하고, 30℃에서 4시간 더 진탕하여 배양했다. 배양액 2ml 중의 균체를 원심분리에 의해 모았다. 이 균체를, 200μl의 0.336% 트리톤X-100 및 0.5M 염화나트륨을 포함하는 20mM 비스트리스 완충액(pH7.0)에 현탁하고, 빙냉하에서 초음파 파쇄했다. 얻어진 파쇄액을 조효소액으로 하고, 활성측정에 공시했다. 반응은 2반복에서 행하고, 반응 조성은 실시예 1과 동일하게 행하였다. 다만, 반응 시간은 15시간으로 했다. 그 결과, 하기의 표 7에 나타낸 바와 같이, 467-N0C0 유전자 형질전환체의 조효소액중 및 467-N2CO 유전자 형질전환체의 조효소액 중에는, 당공여체인 CMP-NeuAc중의 ¹⁴C에서 라벨된 NeuAc를 당수용체 기질인 락토오스에 전이하는 인자, 즉 시알산 전이효소 활성이 존재하는 것이 나타났다. 이 결과로부터 467-N0C0 유전자, 또는 467-N2CO 유전자를 도입한 대장균에는 시알산 전이효소가 발현되어 있는 것이 분명하게 되었다.

[표 7]

JT-ISH-467주 유래 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 유전자를 조합한 대장균 파쇄액중의 시알산 전이효소 활성

(6) α2,3-시알산 전이활성의 확인

상기 (5)의 조효소액을 이용하여, 467-N2CO 유전자를 도입한 대장균에서 발현된 시알산 전이효소가 α2,3-시알산 전이활성을 가질 것인가 아닌가 조사했다. 참고예 1-1와 동일하게, 당수용체로서 피리딜아미노화 락토오스를 이용하여, 효소반응을 행하였다. 반응 종료후, 95℃에서 5분간, 반응용액을 열처리하는 것에 의해 효소를 실활시켜, HPLC에서 분석했다. 또, 효소반응은, 피리딜아미노화 락토오스가 2.0μM, CMP-시알산이 5.7μM로 되도록, 각각을 20mM 카코질레이트 완충액(pH6.0) 25μl 중에 용해하고, 25℃하에서 6시간 행하였다(반응 1). 한편, CMP 시알산을 포함하지 않은 반응액을 공시한 대조실험(반응 2)을 행하였다. 또한, 표품의 보호시간을 분명하게 하기 위하여, 열처리(95℃, 5분간)에 의해 실활시킨 조효소액을 가하고, 피리딜아미노화 락토오스 및 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스를 첨가한 시험을 행하였다.

표품의 분석 결과로부터, 피리딜아미노화 락토오스의 유지 시간은 4.1분, 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스의 유지 시간은 5.4분인 것이 나타났다. 이것에 의해 반응 1에서는 검출되지만, 반응 2에서는 검출되지 않는 유지 시간 5.3분의 피크가, 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스인 것이 분명하게 되었다. 즉, 467-N2CO 유전자를 도입한 대장균에서 발현된 시알산 전이효소가 α2,3-시알산 전이활성을 갖는 것이 증명되었다.

또한, 동일하게 467-N0C0 유전자를 도입한 대장균에서 발현된 시알산 전이효소가 α2,3-시알산 전이활성을 가질 것인가 아닌가 조사했다. 그 결과, 대장균에서 발현된 시알산 전이효소에 의한 반응에 있어서, 반응 생성물로서 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스의 피크가 검출되었다. 따라서, 이 효소가 α2,3-시알산 전이활성을 갖는 것이 분명하게 되었다.

참고예 1-5: 포토박테리움속 세균 JT - ISH -224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝과 , 염기서열 분석 및 당해 유전자의 대장균에서의 발현

(1) JT - ISH -224주의 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소 활성과 동일 효소유전자의 존재의 확인

참고예 1-1에서 시알산 전이효소 활성을 갖는 것이 분명하게 된 포토박테리움속 JT-ISH-224주에 있어서, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호몰로그가 존재할 것인가 아닌가를 밝히기 위해서, 게노믹 서던하이브리다이제이션을 실시했다. 참고예 1-4에 기재한 방법으로, JT-ISH-224주의 균체 펠렛으로부터 게놈 DNA를 조제한 후, JT-ISH-224주의 게놈 DNA를 제한효소 EcoRI 또는 HindIII에서 소화하고, 0.7% 아가로스 겔 전기영동에서 분획후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블로팅에 의해, 겔을 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(아마샴바이오사이언스제)에 전사했다. 이 필터에 관해서, 상기의 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로서 이용하여, 참고예 1-4에 기재한 방법으로 서던하이브리다이제이션을 행하였다. 다만 하이브리다이제이션 온도, 및 세정처리의 온도는, 55℃로 했다. 그 결과, EcoRI소화에서는, 16kb의 밴드가 검출되었다. 한편, HindIII 소화의 경우, 5kb와 2.7kb의 밴드가 검출되었다. 이 결과로부터, JT-ISH-224주에는 JT-ISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호몰로그가 존재하는 것이 분명하게 되었다.

(2) JT - ISH -224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝

다음에, JT-ISH-224주의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝을 행하였다. 참고예 1-4에 기재한 방법에 의해, JT-ISH-224주의 게놈 DNA로부터, λDASH II(Stratagene제)을 이용하여, 게놈 라이브러리를 구축했다. JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브에 이용하여, JT-ISH-224주의 게놈 라이브러리를 스크리닝했다. 다만, 참고예 1-4과 동일하게 하이브리다이제이션, 및 세정의 온도는 55℃로 했다. 그 결과, 플라크 정제를 겸한 2차 선발까지, 12클론을 얻고, 그 중 6개의 λDNA를, 참고예 1-4와 같이 QIAGEN Lambda Mini Kit(키아젠제)를 이용해서 정제했다. 더욱이 이 중 3클론의 λDNA샘플, 및 JT-ISH-224주의 전체 게놈 DNA에 관해서, 제한효소 EcoRI 또는 HindIII로 소화했다. 소화물을 아가로스 겔 전기영동에서 분획하고, 상술한 바와 같이 나일론 멤브레인 필터에 전사했다. 이 필터를 이용하여, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브에 이용하고, 서던분석을 행하였다. 하이브리다이제이션, 세정의 온도는 55℃로 했다. 그 결과, EcoRI소화의 경우, 12kb 또는 그 이상의 밴드가 검출된 것에 대해, HindIII 소화의 경우는, 3개 모두의 λDNA샘플과 JT-ISH-224주의 전체 게놈 DNA에 관해서, 5kb와 2.7kb의 두개의 밴드가 검출되었다. 그래서 λDNA샘플을 다시 HindIII로 소화하고, 이들 5kb와 2.7kb의 2개의 DNA단편을 겔 정제하고, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)의 HindIII부위에 통상의 방법을 따라 클로닝했다.

다음에, 이들의 클론에 관해서, M13프라이머(타카라바이오제)를 이용하여, ABIPRISM 형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사제)로, 5kb HindIII 단편과 2.7kb HindIII 단편의 양단의 염기서열을 결정했다. 그 결과, 5kb단편의 한쪽의 DNA서열, 및 2.7kb의 한쪽의 DNA서열로부터 추정되는 아미노산 서열이, 데이터베이스 검색의 결과와 함께, 시알산 전이효소와 상동성을 나타냈다. JT-ISH-224주의 동일 효소의 유전자의 DNA를 완전히 결정하기 위해서, HindIII 2.7kb 단편으로부터 얻어진 DNA서열을 기초로, 하기의 표 8의 프라이머를 합성하고, 염기서열 결정에 이용했다.

[표 8]

그 결과, 서열목록의 서열번호28의 서열을 얻었다. 이 서열은, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 오픈 실린딩 프레임(ORF)의 전체 염기서열이다. 최초의 ATG의 상류에는 동일한 판독 프레임에서 번역 종지코돈이 나타나므로, 이것이 본 유전자의 번역 개시코돈이라고 생각된다. 포토박테리움속 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 그것과 동일하게, 1230염기로 이루어지고, 409개의 아미노산을 코드하고 있었다. 이 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호29에 나타낸다. 유전자 내부에는 HindIII부위를 갖고 있었다. GENETYX Ver.7 을 이용해서 핵산, 및 아미노산 서열의 해석을 행한 바, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자는, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자와 92%의 상동성을 갖고 있었다. 또한 아미노산 서열에서도, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소와 92%의 상동성을 나타냈다. 더욱이, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열은, 포토박테리움ㆍ댐셀라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 33%의 상동성, 파스트렐러ㆍ물토시다 아종 물토시다주 Pm70의 가정상의 단백질 Pmol88(AAKO2272)과 29%의 상동성을 나타내고, 유전자 DNA서열에서는 각각, 54%, 50%라는 상동성이었다.

(3) 발현벡터의 구축

클론화한 유전자가, 시알산 전이효소 활성을 가질 것인가 아닌가를 조사하기 위해서, 동일 유전자의 전장, 및 N 말단측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현 벡터에 조합하고, 대장균 내에서 단백질을 생산시켜, 이 발현 단백질의 활성을 측정했다.

JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 관해서, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7에서 해석을 행한 바, N말단의 24아미노산이, 시그널 펩티드라고 예측되었다. 따라서, 유전자 전장(본 명세서에 있어서 224-N0C0 유전자라 표기한다)을 클론화하기 위한 프라이머 224-23ST-N0-Pci(서열번호35), 224-23ST-COnew-Bm(서열번호37), 더욱이 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 제외된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 명세서에 있어서 224-N1C0 유전자라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 224-23ST-N1-Nco(서열번호36), 224-23ST-COnew-Bm(서열번호37)을 설계, 합성했다(표 9).

[표 9]

클로닝용으로 프라이머에 미리 조합한 제한효소 PciI(224-23ST-N0-Pci), NcoI(224-23ST-N1-Nco), BamHI(224-23ST-C0new-Bm)부위를 밑줄로 나타냈다. 번역 개시코돈 ATG, 및 번역 종지코돈에 대응하는 상보서열 TAA를 사각으로 둘러쌌다. 더욱이, 프라이머 서열 중, 주형 DNA와 어닐링하는 부분의 서열을 굵은 글씨로 나타냈다. 프라이머 224-23ST-N0-Pci의 경우, 후의 클로닝용에 PciI부위를 도입하므로써, 번역 개시코돈 ATG 직후의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된다. 이 때문에, 번역 개시 메티오닌의 직후의 아미노산 서열이 류신(Leu)으로부터 페닐알라닌(Phe)으로 치환된다. Leu과 Phe는 동일한 소수성의 아미노산인 것, 이 부분은 시그널 펩티드 영역인 것으로부터, 이 변이에 의해 효소활성에 큰 변화를 가져올 가능성은 낮다고 판단했다.

계속해서 PCR을 행하고, 발현 벡터에 재조합 하기 위한 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 증폭했다. 주형 DNA는, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 포함하는 상기 λDNA를 이용했다. PCR의 반응 조건은 이하와 같이 설정했다. 50μl의 반응액 중에, 주형 DNA 100ng, 10×Ex taq buffer 5μl, 2.5mM 각 dNTP 4μl, 프라이머 50pmole, Ex taq(타카라바이오제) 0.5μl를 각각 함축성, 프로그램템프 콘트롤 시스템 PC-700(ASTEK제)을 이용하고, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 15회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, 224-N0C0 유전자에서 약 1.2kb, 그리고 224-NlCO 유전자에서 약 1.1kb의 PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물을, 제한효소 PciI(New England Biolab사제)와 BamHI(224-N0C0 유전자의 경우), 또는 제한효소 NcoI과 BamHI(224-N1C0 유전자의 경우)로 2중 소화한 후, 겔 정제했다. 대장균 발현용 벡터는 pTrc99A를 이용했다. 이 벡터를 동일한 제한효소 PciI와 BamHI(224-N0C0 유전자를 도입하는 경우), 또는 제한효소 NcoI과 BamHI(224-N1C0 유전자를 도입하는 경우)로 2중 소화하여 겔 정제한 것을, 제한효소 처리를 행한 PCR산물과 Takara Ligation Kit(타카라바이오제)를 이용하여 라이게이션하고, 대장균 TB1로 형질전환했다. 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출, 제한효소 분석하고, 삽입의 재조합을 확인하고, 그리고 클론한 224-N0C0 유전자, 및 클론한 224-N1C0 유전자의 전체 염기서열을 확인했다. 그 결과, 224-N0C0 유전자에 있어서는, 상술하의 시토신(C)으로부터 티민(T)으로의 치환이 확인되었지만, 그 이외에는 염기서열의 변이는 없었다. 동일하게 224-N1CO 유전자의 경우는, 염기서열의 변이는 없고, 원하는 염기서열, 즉 서열목록의 서열번호28 중, 제73번째의 염기로부터 제1230번째의 염기까지를 포함하고 있었다.

(4) 발현 유도와 활성 측정

참고예 1-4와 동일하게, 224-N0C0 유전자 및 224-NlCO 유전자의 2클론에 관해서, 단백질 발현유도 실험을 행하고, 효소활성을 측정했다. 그 결과, 하기의 표10에 나타낸 바와 같이, 224-N0C0 유전자 및 224-N1C0 유전자의 형질전환체의 조효소액 중에 시알산 전이효소 활성이 존재하는 것이 나타났다.

[표 10]

JT-ISH-224주 유래 JT-ISH-467β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 유전자 호몰로그를 재조합한 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

(5)α2,3-시알산 전이효소 활성의 확인

참고예 1-4와 동일하게, 224-N0C0 유전자 및 224-N1C0 유전자를 각각 대장균에 도입하여 효소를 발현시키고, 피리딜아미노화 락토오스를 당수용체로서 이용하는 반응에 의해, α2,3-시알산 전이효소 활성을 조사했다. 대장균에서 발현된 시알산 전이효소에 의한 반응 생성물을 HPLC에 의해 평가한 결과, 어느 쪽의 클론을 이용한 반응에 관해서도 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스의 피크가 검출되었다. 이 결과로부터, JT-ISH-224주 유래의 시알산 전이효소가 α2,3-시알산 전이활성을 갖는 것이 분명하게 되었다.

참고예 1-6: 비브리오속 세균 JT - FAJ -16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝과 염기서열 해석, 및 당해 유전자의 대장균에서의 발현

(1) JT - FAJ -16주의 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소 활성과 동일 효소 유전자의 존재의 확인

참고예 1-1에서 시알산 전이효소 활성을 갖는 것이 분명하게 된 비브리오속 JT-FAJ-16주에 있어서, 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호몰로그가 존재할 것인가 아닌가를 밝히기 위해서, 게노믹서던하이브리다이제이션을 실시했다. 참고예 1-4에 기재한 방법으로, JT-FAJ-16주의 균체 펠렛으로부터 게놈 DNA를 조제한 후, 제한효소 EcoRI, HindIII로 소화하고, 0.7% 아가로스 겔 전기영동에서 분획후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블로팅에 의해, 겔을 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(아마샴바이오사이언스제)에 전사했다. 이 필터에 관해서, 상기의 929bp의 프로브(서열번호17)를 이용하여, 참고예 1-4에 기재한 방법으로 서던하이브리다이제이션을 행하였다. 다만 하이브리다이제이션 온도, 및 세정 처리의 온도는, 55℃로 했다. 그 결과, EcoRI 소화에서, 3.6kb의 밴드가, HindIII 소화에서, 7kb의 밴드가 검출되었다. 즉 JT-FAJ-16주에는 JT-ISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호몰로그가 존재하는 것이 분명하게 되었다.

(2) JT - FAJ -16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝

다음에, JT-FAJ-16주의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝을 행하였다. 참고예 1-4에 기재한 방법으로, JT-FAJ-16주의 게놈 DNA로부터, λDASHII(Stratagene제)을 이용하여, 게놈 라이브러리를 구축했다. JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로 이용하여, JT-FAJ-16주의 게놈 라이브러리를 스크리닝했다. 다만, 하이브리다이제이션실험은 ECL direct labelling & detection system(아마샴바이오사이언스제)을 사용했다. 키트 첨부의 설명서에 따라서 프로브를 작성했다. 하이브리다이제이션은, 키트중의 하이브리다이제이션 버퍼에 블록킹 시약을 5%(w/v), NaCl을 0.5M로 되도록 가하고, 37℃에서 4시간 행하였다. 세정은, O.4% SDS, 0.5X SSC 중에서, 50℃에서 20분을 2회, 2X SSC 중에서 실온, 5분을 1회 행하였다. 시그널의 검출은, 키트 첨부의 설명서에 따랐다.

그 결과, 플라크 정제를 겸한 1차 선발에서, 12클론을 얻고, 그 중 6개의 λDNA를, 참고예 1-4와 같이 QIAGEN Lambda MiniKit(키아젠제)를 이용하여 정제했다. 더욱이 이들의 λDNA 샘플, 및 JT-FAJ-16주의 전체 게놈 DNA에 관해서, 제한효소 EcoRI로 소화했다. 소화물을 아가로스 겔 전기영동에서 분획하고, 상술한 바와 같이 나일론 멤브레인 필터에 전사했다. 이 필터를 이용하여, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로 이용하고, ECL 시스템을 이용하여, 상술과 동일한 조건에서 서던 분석을 행하였다. 그 결과, 6개 모두의 λDNA 샘플과 JT-FAJ-16주의 전체 게놈 DNA에 관해서, 3.6kb의 밴드가 검출되었다. 거기에서 λDNA샘플을 다시 EcoRI로 소화하고, 이 3.6kb의 DNA단편을 겔 정제하고, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(1)의 EcoRI 부위에 통상의 방법에 따라 클로닝 했다.

다음에, JT-FAI-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 포함한다고 생각된 EcoRI 3.6kb 단편에 관해서, M13 프라이머(타카라바이오제)를 이용하여, ABI PRISM 형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer제)로, 양단의 염기서열을 결정했다. 그 결과, 편측 단의 DNA서열로부터 추정되는 아미노산 서열이, 데이터베이스 검색에서 포토박테리움ㆍ댐셀라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 27%의 상동성을 나타냈다. JT-FAJ-16주의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 전체 염기서열을 완전히 결정하기 위해서, EcoRI 3.6kb 단편으로부터 얻어진 DNA서열을 기초로, 하기의 표 11에 기재된 프라이머를 합성하고, 염기서열 결정에 이용했다.

[표 11]

얻어진 염기서열 데이터로부터 더욱이 이하의 표 12에 기재된 프라이머를 설계, 합성하고, 전체 염기서열의 결정을 행하였다.

[표 12]

그 결과, 서열목록의 서열번호30의 서열을 얻었다. 이 서열은, JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 오픈 실린딩 프레임(ORF)의 전체 염기서열이다. 최초의 ATG의 상류에는 동일한 판독 프레임에서 번역 종지코돈이 나타나므로, 이것이 본 유전자의 번역 개시코돈이라고 생각된다. JT-FAI-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 1209염기로 되고, 402개 아미노산을 코돈하고 있었다. 이 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호31에 나타낸다. GENETYX Ver.7을 이용하여 핵산, 및 아미노산 서열의 해석을 행한 바, JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자는, JT-ISH-467주 및 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자와, 각각 69.7% 및 68%의 상동성을 갖고 있었다. 또한 아미노산 서열에서도, 각각, 64.7% 및 64.8%의 상동성을 나타냈다. 더욱이, JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열은, 포토박테리움ㆍ댐셀라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 30.5%의 상동성, 파스트렐러ㆍ물토시다 아종 물토시다주 Pm70의 가정상의 단백질 Pmol88(AAKO2272)과 27.3%의 상동성을 나타내고, 유전자 DNA서열에서는 각각, 51.2%, 48.3%라는 상동성이었다.

(3) 발현벡터의 구축

클론화한 유전자가, 시알산 전이효소 활성을 가질 것인가 아닌가를 조사하기 위해서, 동일 유전자의 전장, 및 N 말단측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현 벡터에 조합하고, 대장균 내에서 단백질을 생산시켜, 이 발현 단백질의 활성을 측정했다.

JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 관해서, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7에서 해석을 행한 바, N말단의 22아미노산이, 시그널 펩티드라고 예측되었다. 그래서, 유전자 전장(본 실시예에 있어서 FAJ-N0C0 유전자라 표기한다)을 클론화하기 위한 프라이머 FAJ23STN0-BspHI(서열번호43), FAJ23STCO-BamHI(서열번호45), 더욱이 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 제외된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 실시예에 있어서 FAJ-N1CO 유전자라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 FAJ23STN1-BspHI(서열번호44), FAJ23STCO-BamHI(서열번호45)를 설계, 합성했다(표 13).

[표 13]

클로닝용으로 프라이머에 미리 조합한 제한효소 BspHI(FAJ23STN0-BspHI, FAJ23STN1-BspHI), BamHI(FAJ23STCO-BamHI) 부위를 밑줄로 나타냈다. 번역 개시코돈 ATG, 번역 종지코돈에 대응하는 상보서열 TAA를 사각으로 둘러쌌다. 더욱이, 프라이머 서열 중, 주형DNA와 어닐링하는 부분의 서열을 굵은 글씨로 나타냈다. 이들의 프라이머를 이용해서 PCR을 행하고, 발현 벡터에 조합하기 위한 JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 증폭했다. 주형DNA는, 동유전자를 포함하는 상기 3.6kb의 DNA단편을 이용했다. PCR의 반응 조건은 이하와 같이 설정했다. 50μl의 반응액 중에, 주형DNA 300ng, 10×Ex taq buffer 5μl, 2.5mM 각 dNTP 4μl, 프라이머 50pmole, Ex taq(타카라바이오제) 0.5μl를 각각 포함하고, 프로그램템프 콘트롤 시스템 PC-700(ASTEK제)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 10회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, FAJ-N0C0에서 약 1.2kb, FAJ-N1C0에서 약 1.1kb의 PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물을, TA클로닝용 벡터 pCR2.1TOPO(Invitrogen제)에, TA클로닝 키트(Invitrogen제)에 첨부된 설명서에 따라, 클로닝 했다. 대장균은 TB1을 사용했다. 얻어진 콜로니로부터 통상의 방법으로 플라스미드를 정제하고, 제한효소 EcoRI에서 PCR산물의 벡터로의 도입을 확인했다. 도입이 확인된 플라스미드 샘플을, 제한효소 BspHI와 BamHI로 2중 소화한 후, 1.2kb(FAJ-N0C0 유전자) 또는 1.1kb(FAJ-N1C0 유전자) 단편을 겔 정제했다. 이들의 DNA샘플을, 미리 제한효소 NcoI과 BamHI로 2중 소화한 대장균 발현용 벡터 pTrc99A에, Takara Ligation Kit(타카라바이오제)를 이용하여 라이게이션하고, 대장균 TBl에 조합했다. 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출, 제한효소 분석을 행하여 삽입의 재조합을 확인하고, 클론된 FAJ-N0C0 유전자 및 클론된 FAJ-N1C0 유전자의 전체 염기서열을 확인했다. FAI-N0C0 유전자에 관해서는, 염기서열의 변이는 없고, 원하는 염기서열, 즉, 서열목록의 서열번호30 중, 제 1번째의 염기로부터 제 1209번째의 염기마저를 포함하고 있었다. 또한, FAJ-N1C0 유전자에 관해서는, 염기서열의 변이는 없고, 원하는 염기서열, 즉, 서열목록의 서열번호30 중, 제67번째의 염기로부터 제 1209번째의 염기까지를 포함하고 있었다.

(4) 발현 유도와 활성 측정

참고예 1-4와 동일하게, FAJ-N0C0 유전자, 및 FAJ-N1C0 유전자의 2클론에 관해서, 단백질 발현유도 실험을 행하고, 효소활성을 측정했다. 그 결과, 하기의 표 14에 나타낸 바와 같이, FAJ-N0C0 유전자 및 FAJ-N1C0 유전자의 형질전환체의 조효소액 중에 시알산 전이효소 활성이 존재하는 것이 나타났다.

[표 14]

JT-FAJ-16주 유래 JT-ISH-467β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 유전자 호몰로그를 재조합한 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

(5) α2,3-시알산 전이활성의 확인

참고예 1-4와 동일하게, FAJ-N0C0 유전자, 및 FAJ-N1C0 유전자를 각각 대장균에 도입해서 효소를 발현시키고, 피리딜아미노화 락토오스를 당수용체로서 이용하는 반응에 의해, α2,3-시알산 전이효소 활성을 조사했다. 대장균에서 발현된 시알산 전이효소에 의한 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석한 결과, 어느 클론을 이용한 반응에 있어서도 피리딜아미노화 α2,3-시아릴락토오스의 피크가 검출되었다. 이 결과로부터, JT-FAI-16주 유래의 시알산 전이효소가 α2,3-시알산 전이활성을 갖는 것이 분명하게 되었다.

실시예 1 P. damselae JTO160주 유래의 당전이 효소(α2,6-시알산 전이효소)의 효소활성에 미치는 NaCl의 영향

재료 및 방법

해양성 미생물인 P.damselae JTO160주로부터, 이미 보고되어 있는 방법(특허 제 3062409호)에 따라서 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 정제했다. 효소의 정제 순도는 SDS-PAGE에서 확인하고, 최종 정제 효소는 전기영동적으로 단일한 단백질인 것을 확인했다. 이 완전 정제한 효소를 사용하여 이하의 실험을 행하였다.

반응용액 20μl 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(50.066nmol, 25000cpm), 당수용체 기질 락토오스(1mmol), 시알산 전이효소(0.5mU∼1.5mU), NaCl을 각각 0∼2.5M 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행했다(30℃, 1분). 효소반응 종료후, 각각의 조건에 있어서 락토오스에 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출하고, 각 시험구에 있어서의 효소활성에 대한 NaCl의 영향을 검토했다.

또 구체적으로는, 반응 종료후, 반응용액에 1.98ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 AG1×2Resin(PO₄ ^{3 -}form, 0.2×2cm) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(OH^-form)(BIO-RAD사제)을 1M 인산완충액(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수로 현탁하여 작성했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)의 방사활성을 측정했다. 이 컬럼의 용출액에는, 반응에서 생긴 ¹⁴C-NeuAc(N-아세틸노이라민산)이 결합한 시아릴락토오스 및 미반응의 락토오스가 포함되지만, 미반응의 CMP-¹⁴C-NeuAc는 컬럼에 유지된 그대로이다. 따라서, 효소반응의 결과 생긴 시아릴락토오스 유래의 ¹⁴C의 방사활성은, 모두 반응 생성물 유래이며, 이 분획의 방사활성으로부터 효소활성을 산출할 수 있다.

결과

P.damselae JTO160주 유래의 시알산 전이효소는, 효소반응계 중의 NaCl의 존재에 의해, 그 효소활성이 증가하는 것이 확인되었다. NaCl이 효소반응계에 O.2M 로부터 1M 농도로 존재한 경우, NaCl 무첨가의 경우와 비교하여, 그 효소활성은 어느 것이나 약 1.2배로부터 1.4배로 향상했다(도 1).

실시예 2 P.damselae JTO160주 유래의 당전이 효소(α2,6-시알산 전이효소)의 효소활성에 미치는 KCl의 영향

재료 및 방법

실시예 1과 동일하게 하여, P.damselae JTO160주로부터 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 완전 정제하고, 이하의 실험을 행하였다.

반응용액에 20μl 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(50.066nmol, 25000cpm), 당수용체 기질 락토오스(1mmol), 시알산 전이효소(0.5mU∼1.5mU), KCl을 각각 0∼1M 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행하였다(30℃, 1분). 효소반응 종료후, 각각의 조건에 있어서 락토오스에 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출하고, 각 시험구에 있어서의 효소활성에 대한 KCl의 영향을 검토했다. 또 구체적으로는, 반응 종료후, 반응용액에 1.98ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 AG1-×2Resin(PO₄ ^{3 -}form, 0.2×2cm) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(OH^-fom)(BIO-RAD사제)을 1M 인산완충액(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수에 현탁하여 작성했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)의 방사활성을 측정했다.

결과

효소반응계 중에 첨가한 여러가지 농도의 KCl이, P.damselae JTO160주 유래의 시알산 전이효소 활성을 향상시키는 것은 확인되지 않았다(도 2).

실시예 3 P.damselae JTO160주 유래의 당전이 효소의 효소활성에 미치는 2가 이온을 포함하는 염류의 영향

재료 및 방법

실시예 1과 동일하게 하여, P.damselae JTOl60주로부터 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 완전 정제하고, 이하의 실험을 행하였다.

반응용액 20μl 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(50.066nmol, 25000cpm), 당수용체 기질 락토오스(1mmol), 시알산 전이효소(0.5mU∼1.5mU), MgCl₂ㆍMgSO₄ㆍCoCl₂ㆍCaCl₂ㆍMnCl₂ㆍFeSO₄를 각각 최종 농도 OmM, 10mM, 20mM로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행하였다(30℃, 1분). 효소반응 종료후, 각각의 조건에 있어서 락토오스로 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출하고, 각 시험구에 있어서의 효소활성에 대한 각종 염류의 영향을 검토했다. 또 구체적으로는, 반응 종료후, 반응용액에 1.98ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 AG1-×2Resin(PO₄ ^3-form, 0.2×2cm) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(OH^-form) (BIO-RAD사제)을 1M 인산완충액(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수에 현탁하여 작성했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)의 방사활성을 측정했다.

결과

반응용액 중의 각종 2가 이온을 포함하는 염류가, P.damselae JTO160주 유래의 α2,6-시알산 전이효소 활성을 향상시키는 것은 확인되지 않았다(표 15).

[표 15]

첨가한 각종 무기염류의 종류와 반응용액 중의 농도, 상대활성값의 관계

실시예 4 래트 간장 유래의 시알산 전이효소(α2,6-시알산 전이효소)의 효소활성에 미치는 NaCl의 영향

재료 및 방법

래트 간장 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소(와코쥰야쿠제)를 사용하고, 효소에 첨부되어 온 효소활성 측정법에 약간의 변경을 가한 이하의 방법으로 실험을 행하였다.

당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(50.066nmol, 25000cpm), 당수용체 기질 아시아로페츠인(10mg), 시알산 전이효소(1mU∼5mU), NaCl을 각각 0∼1.4M 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행했다(37℃, 1시간). 효소반응 종료후, 반응용액을 Sephadex G-50 super fine(아마추어시암제) 컬럼(0.8×20cm)에 제공하고, 0.1M NaCl용액을 이동층으로 이용하여, 2∼4ml로 용출하는 반응 생성물(아시아로페츠인에 ¹⁴C로 라벨된 NeuAc가 전이한 효소반응 생성물)을 포함하는 고분자 분획을 모았다. 또, 이 분획에는, 미반응의 CMP-¹⁴C-NeuAc는 용출되지 않은 것은 컨트롤 실험으로 반응마다 확인을 행하였다. 그 분획으로부터 아시아로페츠인으로 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출했다.

결과

결과를 도 3에 나타낸다. 또, 도 3에서는 반응용액 중에 NaCl을 포함하지 않을 경우를 1로 한 상대 활성으로 나타냈다. 래트 간장 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소에서는, NaCl의 첨가에 의한 효소활성의 상승은 확인되지 않았다.

실시예 5 Photobacterium. damselae에 속하는 각종 균주로부터 조제한 당전이 효소(α2,6-시알산 전이효소의 조효소)의 효소활성에 미치는 NaCl의 영향

재료 및 방법

Photobacterium damselae에 속하고, JTO160과는 다른 균주 ATCC33539T 및 ATCC35083을 배양하고, 얻어진 균체로부터 P. damselae JTO160의 조효소 용액 조제 방법(Purification and characterization of a Marine bacterial β-Galactoside α2,6-Sialyltransferase from Photobacterium damselae JTO160 J.Biochem. 120, 104-110. 1996)에 따라서 조효소 용액을 조정했다. 그들의 조효소를 사용하여 이하의 실험을 행하였다.

반응용액 20μl 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(50.066nmol, 25000cpm), 당수용체 기질 락토오스(1mmol), 각종 균주 유래의 당전이 효소(1mU 이하), NaCl을 각각 0.5M 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행하였다(30℃, 1분). 효소반응 종료후, 각각의 조건에 있어서 락토오스에 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출하고, 각 시험구에 있어서의 효소활성에 대한 NaCl의 영향을 검토했다. 또 구체적으로는, 반응 종료후, 반응용액에 1.98ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 AG1-×2Resin(PO₄ ^{3 -}form, 0.2×2cm) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(OH^-form)(BIO-RAD사제)을 1M 인산완충액(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수에 현탁하여 작성했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)의 방사활성을 측정했다.

결과

어느 균주 유래의 당전이 효소에 관해서도, 0.5M NaCl이 반응계에 존재한 경우, 효소활성이 향상하고 있었다. 그 정도는 균주에 따라 다르지만, 대략 1.2로부터 1.3배 정도로 효소활성이 상승했다(표 16).

[표 16]

Photobacterium속에 속하는 미생물 유래 당전이 효소의 활성에 미치는 NaCl의 영향

실시예 6 P. damselae JTO160 유래의 당전이 효소(재조합 α2,6-시알산 전이효소의 데리션ㆍ뮤턴트;N2C1)의 효소활성에 미치는 NaCl의 영향

재료 및 방법

P. damselae JTO160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소 유전자의 데리션ㆍ뮤턴트 N2C1을 제작하고, 발현 플라스미드에 재조합하고, 동발현 플라스미드에서 대장균의 형질전환을 행하였다. 형질전환된 대장균을 L Broth(앰피실린:최종농도 0.2mg/ml, IPTG:최종농도 1mM을 포함한다)에서, 30℃, 180rpm에서 12시간 배양한 후에, 원심분리로 균체를 모았다. 모은 균체를 20mM Sodium cacodyrate buffer(pH5.0)에 현탁후, 4℃에서 초음파 처리를 행하므로써 균체를 파쇄하여, N2C1 유전자 유래의 시알산 전이효소 단백질을 포함하는 조효소액을 조제했다. N2C1 유전자 유래의 시알산 전이효소 단백질은, P. damselae JTQ160주 유래의 β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소를 코드하는 유전자 서열로부터 상정되는 아미노산 서열과 비교하면, 그 아미노산 서열의 N 말단측(Met)으로부터 107잔기의 아미노산 및, C 말단측으로부터 176잔기의 아미노산이 삭제되어 있지만, 천연의 효소로 실질적으로 동일한 효소활성을 갖는다. 이 N2C1 유전자 유래의 시알산 전이효소 단백질을 사용하여 이하의 실험을 행하였다.

반응용액 20μl 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(50.066nmol, 25000cpm), 당수용체 기질 락토오스(1mmol), N2C1(0.5mU∼1.5mU), NaCl을 각각 0∼2.5M 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행하였다(30℃, 1분). 효소반응 종료후, 각각의 조건에 있어서 락토오스에 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출하고, 각 시험구에 있어서의 효소활성에 대한 NaCl의 영향을 검토했다.

또 구체적으로는, 반응 종료후, 반응용액에 1.98ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 AG1-×2Resin(PO₄ ^{3 -}form, 0.2×2cm) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(0H^-form)(BIO-RAD사제)을 1M 인산완충액(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수에 현탁하여 작성했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)의 방사활성을 측정했다.

결과

그 결과, 반응용액 중에 0.2∼1.5M까지의 NaCl이 포함되어 있는 경우, NaCl 무첨가의 경우와 비교하여, 효소활성의 활성화가 확인되었다(도 4).

실시예 7 비브리오과 미생물 유래의 당전이 효소(재조합 α2,3-시알산 전이효소)의 효소활성에 미치는 NaCl의 영향

재료 및 방법

포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주로부터 추출ㆍ정제한 α2,3-시알산 전이효소(467 native), JT-ISH-467주 유래의 재조합 α2,3-시알산 전이효소(467 N0C0 또는 467 N2CO), 포토박테리움속 JT-ISH-224주 유래의 재조합 α2,3-시알산 전이효소(224 N1C0), 및, 비브리오속 JT-FAJ-16주 유래의 재조합 α2,3-시알산 전이효소(FAJ N1C0)에 관해서, 이들의 효소활성에 미치는 NaCl의 영향을 조사했다. 재조합 효소는 어느 것이나, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 단일의 밴드를 나타낼 정도로 완전히 정제한 것을 이용했다.

467 N2CO, 224 N1C0 및 FAJ N1C0에 관하여, 반응용액 30μl 중에, 1μl의 1M카코질레이트 완충액(pH5.5), 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(70.041nmol, 25400cpm), 당수용체 기질 락토오스(2.88μmol), 시알산 전이효소(약 2mU), NaCl을 각각 0∼2. 0M 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행하였다(25℃, 5분). 또한, 467 native 및 467 N0C0에 관해서, 반응용액 30μl 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(7.041nmol, 25400cpm), 당수용체 기질 락토오스(2.88μmol ), 시알산 전이효소(약 250μU), NaCl을 각각 0∼2.OM 농도로 되도록 첨가하고, 효소반응을 행하였다(25℃, 5분). 효소반응 종료후, 각각의 조건에 있어서 락토오스에 전이된 NeuAc의 방사활성을 측정하여 효소활성을 산출하고, 각 시험구에 있어서의 효소활성에 대한 NaCl의 영향을 검토했다.

또 구체적으로는, 반응 종료후, 반응용액에 1.98ml의 5mM 인산완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 AG1-×2Resin(PO₄ ^{3 -}form, 0.2×2cm) 컬럼에 제공했다. 이 컬럼의 용출액(0∼2ml)의 방사활성을 측정했다. 이 컬럼의 용출액에는, 반응에서 생긴 ¹⁴C-NeuAc(N-아세틸노이라민산)이 결합한 시아릴락토오스 및 미반응의 락토오스가 포함되지만, 미반응의 CMP-¹⁴C-NeuAc는 컬럼에 유지된 그대로이다. 따라서, 효소반응의 결과 생긴 시아릴락토오스 유래의 ¹⁴C의 방사활성은, 모두 반응 생성물 유래이며, 이 분획의 방사활성으로부터 효소활성을 산출할 수 있다.

결과

467 native, 467 N0C0, 467 N2CO, 224 N1CO, 및 FAJ N1CO에 관한 결과는, 각각, 도 5 내지 도 9에 나타낸다. 포토박테리움ㆍ포스포레움 JT-ISH-467주, 포토박테리움속 JT-ISH-224주, 및 비브리오속 JT-FAJ 1116주 유래의 시알산 전이효소 혹은 재조합 시알산 전이효소는 어느 것이나, 효소반응계 중의 NaCl의 존재에 의해, 그 효소활성이 증가하는 것이 확인되었다. NaCl이 효소반응계에 0.2M로부터 1.5M 농도로 존재한 경우, NaCl 무첨가의 경우와 비교하여, 그 효소활성은 어느 것이나 약 1.5배로부터 2.6배로 향상했다.

SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACCO INC. <120> A Method for Enhancing an Activity of a Transglycosidase <130> YCT-1090 <150> PCT/JP2004/015363 <151> 2004-10-18 <160> 45 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1230 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <220> <221> CDS <222> (1)..(1230) <223> /gene="467-23ST" /product="꺚-galactoside-꺙2,3-sialyltransferase" <400> 1 atg ttc gtt ttt tgt aaa aaa ata ttt ttt ttg att ttt att tca cta 48 Met Phe Val Phe Cys Lys Lys Ile Phe Phe Leu Ile Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 atg att ctg ggg ggc tgt aat agt gac tct aag cac aat aac tca gat 96 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Lys His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 ggt aat att aca aaa aat aaa aca ata gaa gtt tat gtt gat aga gca 144 Gly Asn Ile Thr Lys Asn Lys Thr Ile Glu Val Tyr Val Asp Arg Ala 35 40 45 aca tta cca act att caa caa atg act cag att att aat gaa aat tca 192 Thr Leu Pro Thr Ile Gln Gln Met Thr Gln Ile Ile Asn Glu Asn Ser 50 55 60 aat aat aag aaa ctt att tct tgg tct cga tac cct att aat gat gaa 240 Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 acg tta tta gaa tca att aat gga tca ttt ttt aaa aat agg cca gag 288 Thr Leu Leu Glu Ser Ile Asn Gly Ser Phe Phe Lys Asn Arg Pro Glu 85 90 95 cta att aaa tct ctt gat tct atg ata ctt act aat gag att aaa aaa 336 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Glu Ile Lys Lys 100 105 110 gta atc att aat ggt aat acc tta tgg gca gta gat gtc gtt aat att 384 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Val Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 ata aaa tca att gaa gct ctt gga aaa aaa aca gag att gaa cta aat 432 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Leu Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 ttt tat gat gac ggt agt gca gaa tat gtt cga tta tat gac ttt tca 480 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 aga tta cct gaa tca gaa caa gaa tat aaa ata tcc tta tca aag gat 528 Arg Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 aac att caa tca agt ata aat gga act caa cca ttt gat aac tca att 576 Asn Ile Gln Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asn Ser Ile 180 185 190 gaa aat atc tat ggc ttt tcg cag tta tac cca aca aca tat cat atg 624 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 ctc aga gca gat att ttt gaa act aat tta cct ttg acc tct ttg aaa 672 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Thr Ser Leu Lys 210 215 220 aga gta ata tca aat aat att aag caa atg aaa tgg gat tat ttt aca 720 Arg Val Ile Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Thr 225 230 235 240 act ttt aat tcc caa cag aag aat aaa ttc tat aat ttc acg gga ttt 768 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 aac cca gaa aaa att aag gaa caa tat aaa gca agc cct cat gaa aat 816 Asn Pro Glu Lys Ile Lys Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro His Glu Asn 260 265 270 ttt att ttt atc gga act aat tca gga aca gca acg gca gag caa caa 864 Phe Ile Phe Ile Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 ata gat att ctt aca gaa gct aaa aag cca gat agc ccg ata ata act 912 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Lys Pro Asp Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 aat tca att caa gga ttg gat ttg ttt ttc aaa gga cat ccg agt gca 960 Asn Ser Ile Gln Gly Leu Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 act tat aat caa caa atc att gat gct cat aat atg att gaa att tat 1008 Thr Tyr Asn Gln Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 aat aag ata cca ttt gaa gct cta ata atg act gat gca ttg cct gat 1056 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 gct gtc ggt gga atg gga agt tcg gta ttt ttt agc ttg cca aat aca 1104 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 gta gag aat aaa ttt att ttt tat aaa agt gat acg gat att gaa aat 1152 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 aat gct ctt ata caa gta atg att gaa ctg aat atc gtt aat aga aat 1200 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 gat gtt aag ttg ata agt gat ttg cag taa 1230 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 2 <211> 409 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 2 Met Phe Val Phe Cys Lys Lys Ile Phe Phe Leu Ile Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Lys His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 Gly Asn Ile Thr Lys Asn Lys Thr Ile Glu Val Tyr Val Asp Arg Ala 35 40 45 Thr Leu Pro Thr Ile Gln Gln Met Thr Gln Ile Ile Asn Glu Asn Ser 50 55 60 Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 Thr Leu Leu Glu Ser Ile Asn Gly Ser Phe Phe Lys Asn Arg Pro Glu 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Glu Ile Lys Lys 100 105 110 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Val Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Leu Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 Arg Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 Asn Ile Gln Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asn Ser Ile 180 185 190 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Thr Ser Leu Lys 210 215 220 Arg Val Ile Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Thr 225 230 235 240 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 Asn Pro Glu Lys Ile Lys Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro His Glu Asn 260 265 270 Phe Ile Phe Ile Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Lys Pro Asp Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Ile Gln Gly Leu Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 Thr Tyr Asn Gln Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 3 <211> 1397 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <400> 3 gctgacgagc ggcggacggg tgagtaatgc ctgggaatat accctgatgt gggggataac 60 tattggaaac gatagctaat accgcataat ctcttcggag caaagagggg gaccttcggg 120 cctctcgcgt caggattagc ccaggtggga ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca 180 aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgatcagcca cactggaact gagacacggt 240 ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa ccctgatgca 300 gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag tactttcagt tgtgaggaag 360 gcgttggagt taatagcttc agcgcttgac gttagcaaca gaagaagcac cggctaactc 420 cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 480 agcgcatgca ggcggtctgt taagcaagat gtgaaagccc ggggctcaac ctcggaacag 540 cattttgaac tggcagacta gagtcttgta gaggggggta gaatttcagg tgtagcggtg 600 aaatgcgtag agatctgaag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga 660 cgctcagatg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 720 aaacgatgtc tacttgaagg ttgtggcctt gagccgtggc tttcggagct aacgcgttaa 780 gtagaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 840 cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg 900 acatccagag aattcgctag agatagctta gtgccttcgg gaactctgag acaggtgctg 960 catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020 cttatccttg tttgccagca cgtaatggtg ggaactccag ggagactgcc ggtgataaac 1080 cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg ctacacacgt 1140 gctacaatgg cgtatacaga gggctgcaag ctagcgatag tgagcgaatc ccacaaagta 1200 cgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc 1260 gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320 atgggagtgg gctgcaccag aagtagatag cttaaccttc gggagggcgt ttaccacggt 1380 gtggttcatg actgggg 1397 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa refers to any amino acid <400> 4 Xaa Asn Ser Asp Ser Lys His Asn Asn Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 5 Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 6 Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Pro Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 7 Gly His Pro Ser Ala Thr Tyr Asn Gln Gln Ile Ile Asp Ala His Asn 1 5 10 15 Met Ile Glu Ile Tyr 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467N-RV <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 is inosine <400> 8 aaywsngayw snaarcayaa yaa 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467N-RV2 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 refers to inosine <400> 9 gaywsnaarc ayaayaayws 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467N-RV3 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 refers to any nucleobase <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 6 refers to inosine <400> 10 aaywsngayw snaarcayaa yaa 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1RV <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 refers to any nucleobase <400> 11 athathgayg cncayaayat g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1FW <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n at position 10 refers to any nucleobase <400> 12 catrttrtgn gcrtcdatda t 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1RV2 <400> 13 tayaaycarc arathathga ygc 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1FW2 <400> 14 gcrtcdatda tytgytgrtt rta 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in2RV <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 refers to any nucleobase <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n at position 15 refers to any nucleobase <400> 15 tayaayttya cnggnttyaa ycc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in2FW <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n at position 9 refers to any nucleobase <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 refers to any nucleobase <400> 16 ggrttraanc cngtraartt rta 23 <210> 17 <211> 929 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n at position 39 refers to any nucleobase <400> 17 aactggactg gaagcattat aactcagatg gtaatattnc aaaaaataaa ccaatagaag 60 tttatgttga tagagcaaca ttaccaacta ttcaacaaat gactcagatt attaatgaaa 120 attcaaataa taagaaactt atttcttggt ctcgataccc tattaatgat gaaacgttat 180 tagaatcaat taatggatca ttttttaaaa ataggccaga gctaattaaa tctcttgatt 240 ctatgatact tactaatgag attaaaaaag taatcattaa tggtaatacc ttatgggcag 300 tagatgtcgt taatattata aaatcaattg aagctcttgg aaaaaaaaca gagattgaac 360 taaattttta tgatgacggt agtgcagaat atgttcgatt atatgacttt tcaagattac 420 ctgaatcaga acaagaatat aaaatatcct tatcaaagga taacattcaa tcaagtataa 480 atggaactca accatttgat aactcaattg aaaatatcta tggcttttcg cagttatacc 540 caacaacata tcatatgctc agagcagata tttttgaaac taatttacct ttgacctctt 600 tgaaaagagt aatatcaaat aatattaagc aaatgaaatg ggattatttt acaactttta 660 attcccaaca gaagaataaa ttctataatt tcacgggatt taacccagaa aaaattaagg 720 aacaatataa agcaagccct catgaaaatt ttatttttat cggaactaat tcaggaacag 780 caacggcaga gcaacaaata gatattctta cagaagctaa aaagccagat agcccgataa 840 taactaattc aattcaagga ttggatttgt ttttcaaagg acatccgagt gcaacttata 900 atcaacaaat catcgacgcg cacaacatg 929 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV1 <400> 18 tgttgataga gcaacattac c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV2 <400> 19 tggtaatacc ttatgggcag 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV3 <400> 20 gaacagcaac 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aaa 336 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Asp Ile Lys Lys 100 105 110 gta atc atc aac ggt aat acc tta tgg gca gca gat gtc gtt aat att 384 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Ala Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 ata aaa tca att gaa gct ttt gga aaa aaa aca gaa ata gaa cta aat 432 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 ttt tat gat gat ggt agt gcg gaa tat gtt cgt tta tat gac ttt tca 480 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 aaa tta cca gaa tca gaa cag gaa tat aaa att tct ttg tca aag gat 528 Lys Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 aac att ctt tca agt ata aat gga act caa cca ttt gaa aat gtt gtt 576 Asn Ile Leu Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Glu Asn Val Val 180 185 190 gaa aac att tat ggt ttt tct cag tta tac cca acg aca tat cat atg 624 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 ctc aga gct gat att ttt gaa act aat tta cca ttg aga tcc ttg aaa 672 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Ser Leu Lys 210 215 220 ggg gta tta tca aat aat att aag caa atg aaa tgg gac tac ttt aaa 720 Gly Val Leu Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys 225 230 235 240 act ttc aat tca cag cag aag gat aaa ttt tat aat ttt aca ggc ttt 768 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asp Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 aac cca gac gaa att atg gag caa tat aaa gca agt cct aat aaa aac 816 Asn Pro Asp Glu Ile Met Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro Asn Lys Asn 260 265 270 ttt att ttt gtc ggt act aat tca gga act gca aca gca gag caa caa 864 Phe Ile Phe Val Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 att gat att ctg aca gaa gct aaa aat cca aat agt cct ata ata act 912 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Asn Pro Asn Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 aaa tca att caa ggg ttt gat ttg ttt ttt aaa gga cat cct agt gca 960 Lys Ser Ile Gln Gly Phe Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 act tat aat aaa caa atc ata gat gct cat aat atg att gaa att tat 1008 Thr Tyr Asn Lys Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 aat aag ata cca ttt gaa gct cta atc atg act gat gca ttg cct gat 1056 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 gct gtc ggt gga atg gga agt tcg gta ttt ttt agc ttg cca aat aca 1104 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 gta gag aat aaa ttt att ttt tat aaa agt gat acg gat att gaa aat 1152 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 aat gct ctt ata caa gtt atg att gaa cta aat att gtc aat aga aat 1200 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 gat gtt aag ttg ata agt gat ttg cag taa 1230 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 29 <211> 409 <212> PRT <213> Photobacterium sp. <400> 29 Met Leu Val Phe Cys Lys Lys Met Phe Phe Ser Val Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Asn His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 Gly Asn 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Gln Lys Asp Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 Asn Pro Asp Glu Ile Met Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro Asn Lys Asn 260 265 270 Phe Ile Phe Val Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Asn Pro Asn Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 Lys Ser Ile Gln Gly Phe Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 Thr Tyr Asn Lys Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 30 <211> 1209 <212> DNA <213> Vibrio sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1209) <223> /gene="FAJ16-23ST" /product="꺚-galactoside-꺙2,3-sialyltransferase" <400> 30 atg aaa aac att ata aca aaa aga atg cta att att ctt tct tct cta 48 Met Lys Asn Ile Ile Thr Lys Arg Met Leu Ile Ile Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 ttc act att atc gga tgc aac aat gat aac agc act acc aca aat aac 96 Phe Thr Ile Ile Gly Cys Asn Asn Asp Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn 20 25 30 aat gcg ata gaa ata tat gtt gat aga gcc act ctt cca act att cag 144 Asn Ala Ile Glu Ile Tyr Val Asp Arg Ala Thr Leu Pro Thr Ile Gln 35 40 45 caa atg aca aaa ata gtc agt caa aaa aca agt aat aaa aaa ctt att 192 Gln Met Thr Lys Ile Val Ser Gln Lys Thr Ser Asn Lys Lys Leu Ile 50 55 60 tca tgg tct aga tac cca ata act gat aaa tcg tta tta aaa aaa att 240 Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Thr Asp Lys Ser Leu Leu Lys Lys Ile 65 70 75 80 aat gca gaa ttt ttt aaa gaa caa ttt gaa tta act gaa tca cta aaa 288 Asn Ala Glu Phe Phe Lys Glu Gln Phe Glu Leu Thr Glu Ser Leu Lys 85 90 95 aac atc ata tta agt gaa aat atc gac aac ctt ata atc cat ggt aat 336 Asn Ile Ile Leu Ser Glu Asn Ile Asp Asn Leu Ile Ile His Gly Asn 100 105 110 aca ctc tgg tct ata gat gta gta gat ata ata aaa gaa gtt aat ctc 384 Thr Leu Trp Ser Ile Asp Val Val Asp Ile Ile Lys Glu Val Asn Leu 115 120 125 ctc ggg aaa aac ata cca att gaa tta cat ttt tat gac gat ggt tca 432 Leu Gly Lys Asn Ile Pro Ile Glu Leu His Phe Tyr Asp Asp Gly Ser 130 135 140 gct gaa tat gtg aga ata tac gaa ttt tca aaa ctg cct gag tca gaa 480 Ala Glu Tyr Val Arg Ile Tyr Glu Phe Ser Lys Leu Pro Glu Ser Glu 145 150 155 160 caa aaa tac aaa acg tca cta tct aaa aac aac ata aaa ttc agc ata 528 Gln Lys Tyr Lys Thr Ser Leu Ser Lys Asn Asn Ile Lys Phe Ser Ile 165 170 175 gat ggg act gat tca ttt aaa aac aca ata gaa aac att tat gga ttc 576 Asp Gly Thr Asp Ser Phe Lys Asn Thr Ile Glu Asn Ile Tyr Gly Phe 180 185 190 tca caa tta tac cca aca aca tat cac atg tta aga gcg gat ata ttc 624 Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met Leu Arg Ala Asp Ile Phe 195 200 205 gat aca aca tta aaa ata aac cca ttg aga gag ttg ctt tca aat aat 672 Asp Thr Thr Leu Lys Ile Asn Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ser Asn Asn 210 215 220 ata aaa caa atg aaa tgg gat tac ttt aaa gac ttt aat tat aaa caa 720 Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys Asp Phe Asn Tyr Lys Gln 225 230 235 240 aaa gat att ttt tac tct ttg act aac ttc aac cca aaa gaa ata cag 768 Lys Asp Ile Phe Tyr Ser Leu Thr Asn Phe Asn Pro Lys Glu Ile Gln 245 250 255 gaa gat ttc aac aaa aac tca aat aaa aac ttc att ttt ata gga agt 816 Glu Asp Phe Asn Lys Asn Ser Asn Lys Asn Phe Ile Phe Ile Gly Ser 260 265 270 aat agt gct aca gca aca gca gaa gag caa ata aat att att tca gaa 864 Asn Ser Ala Thr Ala Thr Ala Glu Glu Gln Ile Asn Ile Ile Ser Glu 275 280 285 gca aaa aaa gaa aat agt agc att ata aca aac tct ata tca gac tat 912 Ala Lys Lys Glu Asn Ser Ser Ile Ile Thr Asn Ser Ile Ser Asp Tyr 290 295 300 gat tta ttt ttc aaa ggc cac cca agc gcc aca ttc aac gaa caa ata 960 Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala Thr Phe Asn Glu Gln Ile 305 310 315 320 att aat gca cac gat atg atc gaa att aac aac aag atc cca ttc gaa 1008 Ile Asn Ala His Asp Met Ile Glu Ile Asn Asn Lys Ile Pro Phe Glu 325 330 335 gcg tta ata atg aca gga ata cta cct gat gct gta ggt ggg atg ggt 1056 Ala Leu Ile Met Thr Gly Ile Leu Pro Asp Ala Val Gly Gly Met Gly 340 345 350 agt tct gtt ttc ttt agc att cca aaa gaa gtg aaa aac aaa ttt gtt 1104 Ser Ser Val Phe Phe Ser Ile Pro Lys Glu Val Lys Asn Lys Phe Val 355 360 365 ttt tat aaa agc ggt acg gat ata gaa aac aat agc cta ata caa gta 1152 Phe Tyr Lys Ser Gly Thr Asp Ile Glu Asn Asn Ser Leu Ile Gln Val 370 375 380 atg cta aaa ctt aac tta ata aat cgt gac aat ata aaa cta atc agc 1200 Met Leu Lys Leu Asn Leu Ile Asn Arg Asp Asn Ile Lys Leu Ile Ser 385 390 395 400 gac att taa 1209 Asp Ile <210> 31 <211> 402 <212> PRT <213> Vibrio sp. <400> 31 Met Lys Asn Ile Ile Thr Lys Arg Met Leu Ile Ile Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ile Gly Cys Asn Asn Asp Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Ile Glu Ile Tyr Val Asp Arg Ala Thr Leu Pro Thr Ile Gln 35 40 45 Gln Met Thr Lys Ile Val Ser Gln Lys Thr Ser Asn Lys Lys Leu Ile 50 55 60 Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Thr Asp Lys Ser Leu Leu Lys Lys Ile 65 70 75 80 Asn Ala Glu Phe Phe Lys Glu Gln Phe Glu Leu Thr Glu Ser Leu Lys 85 90 95 Asn Ile Ile Leu Ser Glu Asn Ile Asp Asn Leu Ile Ile His Gly Asn 100 105 110 Thr Leu Trp Ser Ile Asp Val Val Asp Ile Ile Lys Glu Val Asn Leu 115 120 125 Leu Gly Lys Asn Ile Pro Ile Glu Leu His Phe Tyr Asp Asp Gly Ser 130 135 140 Ala Glu Tyr Val Arg Ile Tyr Glu Phe Ser Lys Leu Pro Glu Ser Glu 145 150 155 160 Gln Lys Tyr Lys Thr Ser Leu Ser Lys Asn Asn Ile Lys Phe Ser Ile 165 170 175 Asp Gly Thr Asp Ser Phe Lys Asn Thr Ile Glu Asn Ile Tyr Gly Phe 180 185 190 Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met Leu Arg Ala Asp Ile Phe 195 200 205 Asp Thr Thr Leu Lys Ile Asn Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ser Asn Asn 210 215 220 Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys Asp Phe Asn Tyr Lys Gln 225 230 235 240 Lys Asp Ile Phe Tyr Ser Leu Thr Asn Phe Asn Pro Lys Glu Ile Gln 245 250 255 Glu Asp Phe Asn Lys Asn Ser Asn Lys Asn Phe Ile Phe Ile Gly Ser 260 265 270 Asn Ser Ala Thr Ala Thr Ala Glu Glu Gln Ile Asn Ile Ile Ser Glu 275 280 285 Ala Lys Lys Glu Asn Ser Ser Ile Ile Thr Asn Ser Ile Ser Asp Tyr 290 295 300 Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala Thr Phe Asn Glu Gln Ile 305 310 315 320 Ile Asn Ala His Asp Met Ile Glu Ile Asn Asn Lys Ile Pro Phe Glu 325 330 335 Ala Leu Ile Met Thr Gly Ile Leu Pro Asp Ala Val Gly Gly Met Gly 340 345 350 Ser Ser Val Phe Phe Ser Ile Pro Lys Glu Val Lys Asn Lys Phe Val 355 360 365 Phe Tyr Lys Ser Gly Thr Asp Ile Glu Asn Asn Ser Leu Ile Gln Val 370 375 380 Met Leu Lys Leu Asn Leu Ile Asn Arg Asp Asn Ile Lys Leu Ile Ser 385 390 395 400 Asp Ile <210> 32 <211> 1500 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <400> 32 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggtaacagat tgatagcttg 60 ctatcaatgc tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgcct gggaatatac cctgatgtgg 120 gggataacta ttggaaacga tagctaatac cgcataatct cttcggagca aagaggggga 180 ccttcgggcc tctcgcgtca ggattagccc aggtgggatt agctagttgg tggggtaatg 240 gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctggaactga 300 gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggggaaacc 360 ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagttg 420 tgaggaaggc agttaagtta atagcttagy tgtttgacgt tagcaacaga agaagcaccg 480 gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc gagcgttaat cggaattact 540 gggcgtaaag cgcatgcagg cggtctgtta agcaagatgt gaaagcccgg ggctcaacct 600 cggaacagca ttttgaactg gcagactaga gtcttgtaga ggggggtaga atttcaggtg 660 tagcggtgaa atgcgtagag atctgaagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca 720 aagactgacg ctcagatgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccgtaa acgatgtcta cttgaaggtt gtggccttga gccgtggctt tcggagctaa 840 cgcgttaagt agaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa tgaattgacg 900 ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc 960 tactcttgac atccagagaa ttcgctagag atagcttagt gccttcggga actctgagac 1020 aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080 gcgcaaccct tatccttgtt tgccagcacg taatggtggg aactccaggg agactgccgg 1140 tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct 1200 acacacgtgc tacaatggcg tatacagagg gctgcaaact agcgatagta agcgaatccc 1260 acaaagtacg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1320 tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380 gtcacaccat gggagtgggc tgcaccagaa gtagatagct taaccttcgg gagggcgttt 1440 accacggtgt ggttcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtagccctag gggaacctgg 1500 <210> 33 <211> 1498 <212> DNA <213> Vibrio sp. <400> 33 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggaaacgaga agtagcttgc 60 tacttcggcg tcgagcggcg gacgggtgag taatgcatag gaagttgccc agtagagggg 120 gataaccatt ggaaacgatg gctaataccg cataacctct tcggagcaaa gcgggggacc 180 ttcgggcctc gcgctactgg atacgcctat gtgggattag ctagttggtg aggtaatggc 240 tcaccaaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300 cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct 360 gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagttgtg 420 aggaagggtg tgtagttaat aactgcgcat tttgacgtta gcaacagaag aagcaccggc 480 taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg 540 gcgtaaagcg catgcaggtg gtttgttaag tcagatgtga aagcccgggg ctcaacctcg 600 gaaggtcatt tgaaactggc aaactagagt actgtagagg ggggtagaat ttcaggtgta 660 gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat accagtggcg aaggcggccc cctggacaga 720 tactgacact cagatgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 cgccgtaaac gatgtctact tggaggttgt ggccttgagc cgtggctttc ggagctaacg 840 cgttaagtag accgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaatg aattgacggg 900 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta 960 ctcttgacat ccagagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tctgagacag 1020 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080 gcaaccctta tccttgtttg ccagcgagta atgtcgggaa ctccagggag actgccggtg 1140 ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac 1200 acacgtgcta caatggcgca tacagagggc agcaagctag cgatagtgag cgaatcccaa 1260 aaagtgcgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320 gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380 cacaccatgg gagtgggctg caaaagaagt aggtagttta accttcggga ggacgcttac 1440 cactttgtgg ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt agccctaggg gaacctgg 1498 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 224-23ST-inRV1 <400> 34 caggaactgc aacagcagag 20 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 224-23ST-N0-Pci <400> 35 aagggaatac atgttcgttt tttgtaaaaa aatg 34 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 224-23ST-N1-Nco <400> 36 gggatgtacc atggactcta atcacaataa ctcag 35 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 224-23ST-C0new-Bm <400> 37 attaaaatgg atccttactg caaatcactt atcaac 36 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJEc3.6RV1 <400> 38 ttcaaaactg cctgagtcag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJEc3.6RV2 <400> 39 atttcatggt ctagataccc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STinFW3 <400> 40 ctgactcagg cagttttgaa 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STinFW4 <400> 41 gaaagcaact ctctcaatgg g 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STinRV3 <400> 42 ataaacccat tgagagagtt g 21 <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STN0-BspHI <400> 43 tggataactc atgaaaaaca ttataacaaa aagaatg 37 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STN1-BspHI <400> 44 tattatcgtc atgaacaatg ataacagcac tacc 34 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STC0-BamHI <400> 45 tctttttagg atccttaaat gtcgctgatt agttttat 38

Claims (8)

1. 포토박테리움(Photobacterium)속에 속하는 미생물에 유래하는 당전이 효소를 이용하여, 당전이 반응을 행할 때에, 당해 반응을 NaCl의 존재하에서 행하는 것에 의해, NaCl의 비존재하에 비하여 당해 반응의 효율을 높이는 방법.
2. 제 1항에 있어서, NaCl을 0.1M∼1.5M의 농도로 존재시키는 방법.
3. 제 1항에 있어서, NaCl을 0.2M∼1.0M의 농도로 존재시키는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 포토박테리움(Photobacterium)속의 미생물이, 포토박테리움ㆍ댐셀라(Photobacterium damselae)인 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 당전이 효소가, 시알산 전이효소인 방법.
6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 당전이 효소가, β-갈락토시드-α2,6-시알산 전이효소인 방법.
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 당전이 효소가, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소인 방법.
8. 비브리오과에 속하는 미생물에 유래하는 당전이 효소를 이용하여, 당전이반응을 행할 때에, 당해 반응을 NaCl의 존재하에서 행하는 것에 의해, NaCl의 비존재하에 비하여 당해 반응의 효율을 높이는 방법.