JP4638447B2 - 糖転移酵素の酵素活性を向上させる方法 - Google Patents
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Description
実施例1 P. damsela JT0160株由来の糖転移酵素の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
P. damsela JT0160株から、既に報告されている方法(特許第3062409号)に従ってβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を精製した。酵素の精製純度はSDS-PAGEで確認し、最終精製酵素は電気泳動的に単一のタンパク質であることを確認した。この完全精製した酵素を用いて以下の実験を行った。
結果
P. damsela JT0160株由来のシアル酸転移酵素は、酵素反応系中のNaClの存在により、その酵素活性が増加することが認められた。NaClが酵素反応系に0.2Mから1M濃度で存在した場合、NaCl無添加の場合と比較して、その酵素活性はいずれも約1.2倍から1.4倍に向上した(図1)。
実施例2 P. damsela JT0160株由来の糖転移酵素の酵素活性に及ぼすKClの影響
材料および方法
実施例1と同様にして、P. damsela JT0160株からβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を完全精製し、以下の実験を行った。
結果
酵素反応系中に添加した様々な濃度のKClが、P. damsela JT0160株由来のシアル酸転移酵素活性を向上させることは認められなかった(図2)。
実施例3 P. damsela JT0160株由来の糖転移酵素の酵素活性に及ぼす2価イオンを含む塩類の影響
材料および方法
実施例1と同様にして、P. damsela JT0160株からβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を完全精製し、以下の実験を行った。
結果
反応溶液中の各種2価イオンを含む塩類が、P. damsela JT0160株由来のα2,6-シアル酸転移酵素活性を向上させることは認められなかった(表1)。
材料および方法
ラット肝臓由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素(和光純薬製)を使用し、酵素に添付されてきた酵素活性測定法に若干の変更を加えた以下の方法で実験を行った。
結果
結果を図3に示す。なお、図3では反応溶液中にNaClを含まない場合を1とした相対活性で示した。ラット肝臓由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素では、NaClの添加による酵素活性の上昇は認められなかった。
実施例5 Photobacterium. damselaに属する各種菌株から調製した糖転移酵素(粗酵素)の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
Photobacterium damselaに属し、JT0160とは異なる菌株 ATCC33539T及びATCC35083を培養し、得られた菌体からP. damsela JT0160の粗酵素溶液調製方法(Purification and characterization of a Marine bacterial β-Galactoside α2,6-Sialyltransferase from Photobacterium damsela JT0160 J.Biochem. 120, 104-110. 1996)に従って粗酵素溶液を調整した。それらの粗酵素を用いて以下の実験を行った。
結果
いずれの菌株由来の糖転移酵素についても、0.5M NaClが反応系に存在した場合、酵素活性が向上していた。その程度は菌株によって異なるが、おおよそ1.2から2.4倍程度に酵素活性が上昇した(表2)。
材料および方法
P. damsela JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素遺伝子のデリーション・ミュータントN2C1を作製し、精製発現プラスミドに組換え、同発現プラスミドで大腸菌の形質転換を行った。形質転換された大腸菌をL Broth(アンピシリン:最終濃度0.2mg/ml、IPTG:最終濃度1mMを含む)で、30℃、180rpmで12時間培養した後に、遠心分離で菌体を集めた。集めた菌体を20mM Sodium cacodyrate buffer(pH5.0)に懸濁後、4℃で超音波処理を行うことで菌体を破砕して、N2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質を含む粗酵素液を調製した。N2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質は、P. damsela JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素をコードする遺伝子配列から想定されるアミノ酸配列と比較すると、そのアミノ酸配列のN末端側(Met)から107残基のアミノ酸及び、C末端側から178残基のアミノ酸が削除されているが、天然の酵素と実質的に同じ酵素活性を有する。このN2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質を用いて以下の実験を行った。
結果
その結果、反応溶液中に0.2〜1.5MまでのNaClが含まれている場合、NaCl無添加の場合と比較して、酵素活性の活性化が認められた(図4)。
Claims (4)
- フォトバクテリウム(Photobacterium)属に属する微生物に由来するβ−ガラクトシド−α2,6−シアル酸転移酵素を用いて、糖転移反応を行うに際し、当該反応をNaClの存在下で行うことにより、NaClの非存在下に比べて当該反応の効率を高める方法。
- NaClを0.1M〜1.5Mの濃度で存在させる請求項1記載の方法。
- NaClを0.2M〜1.0Mの濃度で存在させる請求項1記載の方法。
- フォトバクテリウム(Photobacterium)属の微生物が、フォトバクテリウム・ダムセーラ(Photobacterium damsela)である請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
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