JP4977125B2 - 新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該酵素を生産する微生物および当該酵素の製造方法に関する。
糖転移酵素は生体内において糖タンパク質や糖脂質等（以下、複合糖質）の糖鎖の生合成に関与する酵素である。その反応生成物である複合糖質の糖鎖は生体内において非常に重要な機能を有している。例えば、主に哺乳類細胞において、糖鎖は分化や発生における細胞間および細胞−細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることなどが明らかにされている。
これを応用した例として、血液中の赤血球を生産するホルモンであるエリスロポエチンが挙げられる。天然型のエリスロポエチンは効果の持続性が低い欠点があった。そこで、エリスロポエチンは元来糖タンパク質であるが、新たな糖鎖を付加することによって、生体内における寿命を向上させた組換えエリスロポエチンタンパク質が開発、製造され、市販された。今後もこのように糖鎖を付加あるいは改変した医薬品、機能性食品等の開発が増えていくと考えられている。したがって、任意に糖鎖を合成・生産する手段の開発が求められている。とりわけ、最も効率的な手段のひとつとして、糖転移酵素の開発の重要性は増してきている。
これまでに約１５０種類以上の糖転移酵素遺伝子がヒト、マウス、ラットおよび酵母等の真核生物から単離されてきた。さらに、これらの遺伝子はＣＨＯ細胞や大腸菌等の宿主細胞で発現され、糖転移酵素活性を有するタンパク質が生産されてきた。一方、原核生物である細菌からも、２０〜３０種類程度の糖転移酵素遺伝子が単離されており、さらに大腸菌を用いる組換え生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現され、それらの基質特性や酵素化学的な諸性質が明らかにされている。
シアル酸は、糖鎖の非還元末端に存在することが多いため、糖鎖の機能発現において極めて重要な糖であると考えられている。そのため、糖転移酵素の中でもシアル酸転移酵素は最も需要の高い酵素の一つである。β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関して、動物、特に哺乳類由来のものが多く報告されている（Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993); Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987)）。しかし、これらの動物由来の酵素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であり、さらに酵素としての安定性が悪いという問題を有している。一方、細菌由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびその遺伝子としては、フォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）に属する微生物から分離されたものが唯一報告されている（国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号；米国特許６２５５０９４号公報）。
しかしながら、フォトバクテリウム・ダムセラ由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の、フォトバクテリウム・ダムセラからの生産性は５５０Ｕ／Ｌ（Yamamoto, T., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(2), 210-214 (1998)）であり、また、その遺伝子を含むプラスミドｐＥＢＳＴΔ１７８を形質転換した大腸菌によるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の生産性は、２２４．５Ｕ／Ｌ（Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 123, 94-100 (1998)）であり、更に高い生産性を有する酵素が求められている。また、フォトバクテリウム・ダムセラ由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の比活性は５．５Ｕ／ｍｇ（Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)）であり、この点においてもさらに活性の高い酵素が求められている。
また、酵素の種類は異なるが、公知の細菌由来のシアル酸転移酵素の中で生産性および活性が比較的高いものとしてパステレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のα２，３−シアル酸転移酵素が挙げられるが、その生産性は、６，０００Ｕ／Ｌ（Yu, H., et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619 (2005)）であり、比活性は６０Ｕ／ｍｇである。
シアル酸転移酵素の需要の高さから、さらに生産性および／または活性が高いβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素が求められている。
国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号パンフレット
米国特許６２５５０９４号公報
Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993)
Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987)
Yamamoto, T., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(2), 210-214 (1998)
Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 123, 94-100 (1998)
Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)
Yu, H., et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619 (2005)
本発明の課題は、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物に由来する新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することである。また、本発明は、細菌由来の公知のシアル酸転移酵素と比較してより高い生産性および／またはより高い活性を有する、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
また、本発明の課題は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子を利用して遺伝子組換え技術により本酵素を高生産する方法を提供することである。
本発明者らは日本全国から４，０００菌株以上の微生物を分離し、その性質について鋭意研究に努めた結果、フォトバクテリウム（Photobacterium）属に属する微生物の菌株から、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を生産する菌株を見出した。次に公知の遺伝子であるフォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のDNAをプローブに、当該菌株から新規なα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子をクローニングした。本新規遺伝子を大腸菌で発現させた結果、本遺伝子はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードし、その酵素生産量は１Ｌの培養液当り約１０，７００Ｕと高いことを見出した。さらに、この新規な組換え酵素を精製し詳細に解析した結果、本組換え酵素は、シアル酸を糖鎖中のガラクトース残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などにα２，６結合で効率よく転移させ、その比活性は約１１０Ｕ(ユニット)／ｍｇから約２６０Ｕ／ｍｇと高いことも見出した。このように、多くの点で公知の酵素であるフォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素よりも優れていることを明らかにし、本発明を完成させた。本発明は高い生産性および／または高い活性を有する、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸、ならびに、当該シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を提供する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の６位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの６位、またはガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはマンノースなどの複合糖質を構成しうる単糖であって６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、ここでいうシアル酸とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、N−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸（ジN−アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃα２，８（９）Ｎｅｕ５Ａｃ）などを示す。
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を提供する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の６位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの６位、またはガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはマンノースなどの複合糖質を構成しうる単糖であって６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、ここでいうシアル酸とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、N−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸（ジN−アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃα２，８（９）Ｎｅｕ５Ａｃ）などを示す。
本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号２、配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１８−５１４のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを付加した配列に相当する。配列番号１２のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１１１−５１４のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを付加した配列に相当する。このＮ末端のメチオニンは、タンパク質発現のための開始コドンに由来するものであり、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素としての活性に影響を及ぼすものではない。また、タンパク質のＮ末端のメチオニンはしばしば細胞内プロセッシングによって脱落する場合がある。従って、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質という場合は、配列番号４と完全に一致するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である場合のみならず、Ｎ末端のメチオニンが欠失しているアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である場合も含む。
実施例２において、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ（配列番号４：配列番号２のアミノ酸１８−５１４のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを付加した配列）及び、ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０／ｐＴｒｃ（配列番号１２：配列番号２のアミノ酸１１１−５１４のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを付加した配列）も、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の活性を保持した。よって、配列番号２のうち少なくともアミノ酸１１１−５１４が存在すればβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の活性を保持しうる。よって、本発明の「配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質」は、配列番号２のアミノ酸１−５１４中のアミノ酸１−１１０の全部又は一部を欠失しているアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。
また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号１、配列番号３または配列番号１１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質である。配列番号３の塩基配列は、配列番号１の塩基５２−１５４５の塩基配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列に相当する。配列番号１１の塩基配列は、配列番号１の塩基３３１−１５４５の塩基配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列に相当する。配列番号１、配列番号３および配列番号１１の塩基配列は、それぞれ、配列番号２、配列番号４および配列番号１２のアミノ酸配列をコードする。
本発明の配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素において、配列番号２のアミノ酸１２−１５の配列はLeu−Thr−Ala−Cysであり、リポボックスと呼ばれる共通配列であるため、細菌内で、この共通配列のCysのアミノ末端側で切断されると考えられる（Madan Babu, M. and Sankaran, K. Bioinformatics. 18, 641-643 (2002)）。従って、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は配列番号２のアミノ酸１５−５１４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号１の塩基４３−１５４５の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。
本発明はまた、上記の本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の変異体であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する変異タンパク質をも包含する。このような変異タンパク質もまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素に含まれる。
本発明の変異体タンパク質は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸１５−５１４、配列番号４、配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。置換は保存的置換であってもよく、これは特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
なお、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次いで連結する方法もある。
本発明の変異体タンパク質はまた、配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加は、部位特異的変位誘発のほか上述した方法により行うことができる。
本発明の変異体タンパク質はさらに、配列番号２、配列番号２のアミノ酸１５−５１４、、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
または、本発明の変異体タンパク質は、配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
本発明の変異タンパク質はまた、配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Stark's solution）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
シアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、J. Biochem., 120, 104-110 (1996)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定してもよい。例えば、糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を、そして糖受容体基質としてラクトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物であるシアリルラクトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。なお、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。
糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけではないが、ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を糖受容体基質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを糖供与体基質として用いて酵素反応を行い、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。
本発明の一態様において本発明の酵素は、フォトバクテリウム属に属する微生物由来である。本発明の酵素は、フォトバクテリウム属に属する微生物であれば特に限定されるものではなく、フォトバクテリウム属に属する新種の微生物由来の酵素であってもよい。
本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の酵素学的性質および理化学的性質は、上記に定義したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することを特徴とするほか、限定するわけではないが、至適ｐＨがｐＨ５〜６の範囲であり、至適温度が２５〜３５℃であり、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で５６，０００±３，０００Ｄａ程度である。
また、一態様において、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、高いβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することを特徴とする。ここで、高いβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性とは、酵素１ｍｇあたり６Ｕ以上、１０Ｕ以上、２０Ｕ以上、４０Ｕ以上、６０Ｕ以上、１００Ｕ以上の活性を有することをいう。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。
本発明の核酸は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸１５−５１４、配列番号４、配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸はまた、配列番号１、配列番号１の塩基４３−１５４５、配列番号３、配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸である。
本発明の核酸は、上記の核酸の変異体であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。そのような核酸もまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸に含まれる。
そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸１５−５１４、配列番号４、配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。本発明の核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号１の塩基４３−１５４５、配列番号３、配列番号１１からなる群より選択される塩基配列において、１またはそれより多くのヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸である。アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／付加は、上述した方法により導入することができる。
また、そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸１５−５１４、配列番号４、配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。本発明の核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号１の塩基４３−１５４５、配列番号３、配列番号１１からなる群より選択される塩基配列と、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、アミノ酸配列または塩基配列の同一性は、上記に示した方法で決定することができる。
そのような核酸の変異体はさらに、配列番号１、配列番号１の塩基４３−１５４５、および配列番号３、配列番号１１からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、ストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件とは、上記で定義したとおりである。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現する微生物
本発明者らは、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物が新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現することを見いだした。よって本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現する微生物を提供する。本発明の微生物は、フォトバクテリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物である。β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有するフォトバクテリウム属に属する微生物の例としては、フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.) ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７）が挙げられる。なお、上記のフォトバクテリウム属の微生物は一般に海洋性細菌であり、海水中または海産の魚介類から分離される。たとえば、本発明のフォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株は石川県産のカマスから分離されたものである。
本発明者らは、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物が新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現することを見いだした。よって本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現する微生物を提供する。本発明の微生物は、フォトバクテリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物である。β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有するフォトバクテリウム属に属する微生物の例としては、フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.) ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７）が挙げられる。なお、上記のフォトバクテリウム属の微生物は一般に海洋性細菌であり、海水中または海産の魚介類から分離される。たとえば、本発明のフォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株は石川県産のカマスから分離されたものである。
本発明の微生物は、例えば以下に説明するようなスクリーニング法を用いて分離することができる。海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を微生物源とする。海水、海砂、海泥はそのままもしくは滅菌海水で希釈し、接種源とする。海産魚介類は表面の粘液等をループで擦り採って接種源としたり、内臓器を滅菌海水中で磨砕した液を接種源としたりする。これらをマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントアガー培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの平板培地上に塗布し、様々な温度条件下で生育する海洋性微生物を取得する。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントブロス培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの液体培地を用い、それぞれの微生物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に界面活性剤である０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁する。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株を得ることができる。
本発明のフォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株は上記のスクリーニング法を用いることで得られた。得られた上記の菌株の菌学的性質および生理学生化学的性質、ならびに１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析による種の同定については、実施例１に詳述する。
フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株は、ブタペスト条約の規約に従って、２００５年３月１１日付でＮＩＴＥ ＢＰ−８７として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ：National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary；日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法にも関する。好ましい態様において本発明の方法は、本発明の酵素を高生産する。具体的には、本発明の方法における本発明の酵素の生産性は、１Ｌの培養液あたり５０Ｕ／Ｌ以上、１，０００Ｕ／Ｌ以上、１０，０００Ｕ／Ｌ以上である。
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法にも関する。好ましい態様において本発明の方法は、本発明の酵素を高生産する。具体的には、本発明の方法における本発明の酵素の生産性は、１Ｌの培養液あたり５０Ｕ／Ｌ以上、１，０００Ｕ／Ｌ以上、１０，０００Ｕ／Ｌ以上である。
（１）β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現する微生物を培養することによる当該酵素の製造方法
本発明の一態様において、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素はフォトバクテリウム属に属する微生物由来であり、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産させ、これを採取することによって得られる。
本発明の一態様において、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素はフォトバクテリウム属に属する微生物由来であり、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産させ、これを採取することによって得られる。
ここで用いる微生物としては、フォトバクテリウム属に属し、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物であれば、いずれの菌株でも用いることができる。フォトバクテリウム属に属するものが好ましい。本発明の方法において用いる微生物の例としては、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８７）が挙げられる。
上記微生物の培養に用いる培地としては、それらの微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機物等を含むものを用いる。炭素源としては、ペプトン、トリプトン、カゼイン分解物、肉エキス、ブドウ糖等が挙げられ、好ましくはペプトンを用いる。窒素源としては、酵母エキスを用いるのが好ましい。塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ほう酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を適宜組み合わせて用いるのが好ましい。
また、上記成分を含んだマリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）を用いてもよい。さらには、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプトン、酵母エキス等を添加した培地を用いてもよい。培養条件は培地の組成や菌株によって多少異なるが、例えば、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株を培養する場合、培養温度は２０〜３０℃、好ましくは２５〜３０℃程度、培養時間は６〜４８時間、好ましくは１５〜２４時間程度である。
目的とする酵素は菌体内に存在するため、公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などのいずれかの方法を行えばよく、その菌体破砕物から目的とする酵素を分離精製する。本発明の方法における好ましい菌体破砕法は超音波破砕法である。例えば、菌体破砕物から遠心分離により固形物を除去した後に、得られた菌体破砕液上清を市販の陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ−ＰＡＧＥ等を適宜組み合わせて精製することができる。
なお、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は完全に精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は精製品であってもよく、または部分精製品であってもよい。
（２）組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も提供する。
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も提供する。
本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子等から誘導された適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに、転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。
本発明のベクターに挿入されるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸配列は、上述した本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸の塩基配列である。この配列は、リーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。リーダー配列を含む場合、配列番号１のヌクレオチド１−４２に相当するリーダー配列であってもよく、また他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよい。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分泌させるように発現システムを設計することも可能である。
また、本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質は、当該酵素をコードする核酸に続いて、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧTMタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをコードする核酸を連結した核酸をベクターに挿入することにより、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製および検出を容易にすることができる。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えα２，６−シアル酸転移酵素タンパク質から切り離すこともできる。
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１または２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような市販のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易である。適切なプロモーターならびにβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸のＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, スウェーデン、ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotech.、米国、ウイスコンシン州、マディソン）などが含まれる。
原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター（Changら、Nature 275:615, 1978;およびGoeddelら、Nature 281:544, 1979、引用によりその全体を本明細書に援用する。）などが含まれる。
また、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を酵母宿主内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、S. cerevisiae ）を用いるが、ピキア属（Pichia）またはクルイベロミセス属（Kluyveromyces）のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。酵母を形質転換する方法は、例えば、Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス２などから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol., 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する。）の方法で構築することができる。
本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を産生する１つの方法は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じてβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を培養培地または細胞抽出液から回収する。
組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作は、用いた宿主の型および本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかといった要因に従って適宜選択される。例えば、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ−ＰＡＧＥ等、またはそれらの組み合わせが含まれる。また、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素に精製を容易にするタグなどを融合させて発現させた場合には、アフィニティークロマトグラフィーによる精製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧTMタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを融合させた場合には、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）カラム、抗ＦＬＡＧ抗体を連結したカラム、またはグルタチオンを連結したカラム、などを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は電気泳動的に単一バンドになるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシド−２，６−シアル酸転移酵素は精製品であってもよく、または部分精製品であってもよい。
抗体
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のフラグメントは、当該酵素のアミノ酸配列中、少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のフラグメントは、当該酵素のアミノ酸配列中、少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。
抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素またはそのフラグメントを、当該技術分野において抗体作製のために用いられる動物、例えば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギなどに免疫して作製してもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作製することができる。
本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質をアフィニティー精製により回収するのに用いることができる。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を、ウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどのアッセイにおいて検出するのに用いることもできる。
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされてきている糖鎖の合成・生産手段を提供するという観点において貢献する。特に、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、既存のものと比較しても、生産効率が高く、比活性が高く、さらに受容体基質特異性が広範囲である。シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１： β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産する微生物のスクリーニングと菌株の同定
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を粗酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株を得た。なお、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はカマスの内臓から得られた。
実施例１： β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産する微生物のスクリーニングと菌株の同定
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を粗酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株を得た。なお、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はカマスの内臓から得られた。
シアル酸転移活性は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、14ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ 約２０，０００ｃｐｍを含む。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体基質としてラクト−ス（１．２５μｍｏｌ）、ＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように添加し、および上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液（３０μｌ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応は２５℃で１０分間から１８０分間程度行った。反応終了後、反応溶液に１．９７ｍｌの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ4 3‐ フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクト−スに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。
次に、シアル酸の結合様式を明らかにするために、ＰＡ−ラクトースを基質とする反応を行った。得られた粗酵素液を用い、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を用い分析した。５μｌの粗酵素液に１．５μｌの５ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃおよび１．５μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌ糖受容体基質を加え、２５℃下で１８時間反応させた。反応終了後、１００℃で２分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。ＨＰＬＣシステムとしてＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ１０Ａ（島津製作所製）を用い、分析カラムにはＴａｋａｒａ ＰＡＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｒ（タカラバイオ製）を用いた。０．１５％ Ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．０）で平衡化したカラムに７２μｌの溶出液Ａ（１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を加えた反応液を注入した。ピリジルアミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）および溶出液Ｂ（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を用い、３０〜５０％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜２０分）および１００％溶出液Ｂ（２１〜３５分）により、順次ピリジルアミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件で行った（流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：蛍光（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４００ｎｍ））。その結果、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性およびβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなった（図１−１〜６）。
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の細菌学的同定
得られたＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．０〜１．５μｍ。
得られたＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．０〜１．５μｍ。
（２）運動性 ＋
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では−、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では−
（２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／−
（４）カタラーゼテスト ＋
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 ＋
（７）グルコースからのガス産生 ＋
（８）発光性 −
（９）硝酸塩還元 ＋
（１０）インドール産生 ＋
（１１）ブドウ糖酸性化 −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ ＋
（１３）ウレアーゼ −
（１４）エスクリン加水分解 −
（１５）ゼラチン加水分解性 −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１７）ブドウ糖資化性 −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンノース資化性 −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２２）マルトース資化性 −
（２３）グルコン酸カリウム資化性 −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２５）アジピン酸資化性 −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２８）酢酸フェニル資化性 −
（２９）チトクロームオキシダーゼ ＋
（３０）Ｏ／１２９感受性、１０μｇ −、１５μｇ ＋
（３１）菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（モル％）３９．４％
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号５に示した。
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では−、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では−
（２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／−
（４）カタラーゼテスト ＋
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 ＋
（７）グルコースからのガス産生 ＋
（８）発光性 −
（９）硝酸塩還元 ＋
（１０）インドール産生 ＋
（１１）ブドウ糖酸性化 −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ ＋
（１３）ウレアーゼ −
（１４）エスクリン加水分解 −
（１５）ゼラチン加水分解性 −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１７）ブドウ糖資化性 −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンノース資化性 −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２２）マルトース資化性 −
（２３）グルコン酸カリウム資化性 −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２５）アジピン酸資化性 −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２８）酢酸フェニル資化性 −
（２９）チトクロームオキシダーゼ ＋
（３０）Ｏ／１２９感受性、１０μｇ −、１５μｇ ＋
（３１）菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（モル％）３９．４％
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号５に示した。
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はマリンアガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、Ｏ／１２９感受性などの形態観察および生理・生化学的性状試験の結果からビブリオ科に属することが示された。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）基準株ＡＴＣＣ１１０４０の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．２％であること、次にフォトバクテリウム・イリオピスカリウム（Photobacterium iliopiscarium）基準株ＡＴＣＣ５１７６０の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に相同性が高く、その相同率は９９．１％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はビブリオ科フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.）に属する微生物であることが明らかとなった。
実施例２：ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列決定、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株におけるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモローグの存在の確認
実施例１でβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったＪＴ−ＩＳＨ−２２４株において、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するかどうかを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。ＪＴ−ＩＳＨ−２２４の菌体ペレット約０．５ｇから、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ １００／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。次に、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡ数μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（GeneBankアクセッション番号：E17028）の部分断片（ATGからHindIIIまでの約１．２ｋｂEcoRI−HindIII断片）をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験はECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブをラベリングした。ハイブリダイゼーションは、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃（通常４２℃）で４時間行った。洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５０ ℃（通常５５℃）で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。その結果、ＥｃｏＲＩ消化で、約１２．５ｋｂのバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で、約９ｋｂのバンドが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株には、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
（ｉ）ゲノムライブラリー構築
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡ１−２μｇにつき、０．１〜０．２ユニットの四塩基認識の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを反応させ、部分分解を行った。ゲノムＤＮＡは総量８０μｇ処理した。反応バッファーは酵素に添付のものを用い、反応条件は３７℃、３０分とした。反応終了後、反応液に最終濃度２５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加え、フェノール・クロロホルム処理を行った。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、ＴＥ ４００μｌに溶解した。遠心チューブ（日立製作所製４０ＰＡ）に、グラジエント作製装置を用いて、４０％シュークロースバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１Ｍ ＮａＣｌ）と１０％シュークロースバッファーから、４０−１０％のグラジエントを作製し、そこへ上記の部分分解ＤＮＡ溶液を重層した。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ７０Ｈ、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて、２６，０００ｒｐｍ、２０℃、１５時間遠心した。遠心後チューブの底部に２５Ｇの針で穴を空け、底部の液から１ｍｌずつ回収した。回収したゲノムＤＮＡを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳動糟を用い、０．５−０．６％アガロースゲル／ＴＡＥバッファー中で、２６Ｖ、２０時間電気泳動を行い、９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡを含む画分を把握した。マーカーとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を含む画分にＴＥを２．５ｍｌ加えシュークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量のＴＥに溶解した。
実施例２：ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列決定、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株におけるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモローグの存在の確認
実施例１でβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったＪＴ−ＩＳＨ−２２４株において、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するかどうかを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。ＪＴ−ＩＳＨ−２２４の菌体ペレット約０．５ｇから、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ １００／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。次に、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡ数μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（GeneBankアクセッション番号：E17028）の部分断片（ATGからHindIIIまでの約１．２ｋｂEcoRI−HindIII断片）をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験はECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブをラベリングした。ハイブリダイゼーションは、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃（通常４２℃）で４時間行った。洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５０ ℃（通常５５℃）で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。その結果、ＥｃｏＲＩ消化で、約１２．５ｋｂのバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で、約９ｋｂのバンドが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株には、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
（ｉ）ゲノムライブラリー構築
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡ１−２μｇにつき、０．１〜０．２ユニットの四塩基認識の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを反応させ、部分分解を行った。ゲノムＤＮＡは総量８０μｇ処理した。反応バッファーは酵素に添付のものを用い、反応条件は３７℃、３０分とした。反応終了後、反応液に最終濃度２５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加え、フェノール・クロロホルム処理を行った。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、ＴＥ ４００μｌに溶解した。遠心チューブ（日立製作所製４０ＰＡ）に、グラジエント作製装置を用いて、４０％シュークロースバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１Ｍ ＮａＣｌ）と１０％シュークロースバッファーから、４０−１０％のグラジエントを作製し、そこへ上記の部分分解ＤＮＡ溶液を重層した。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ７０Ｈ、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて、２６，０００ｒｐｍ、２０℃、１５時間遠心した。遠心後チューブの底部に２５Ｇの針で穴を空け、底部の液から１ｍｌずつ回収した。回収したゲノムＤＮＡを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳動糟を用い、０．５−０．６％アガロースゲル／ＴＡＥバッファー中で、２６Ｖ、２０時間電気泳動を行い、９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡを含む画分を把握した。マーカーとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を含む画分にＴＥを２．５ｍｌ加えシュークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量のＴＥに溶解した。
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムライブラリー作成のためのベクターとして、λＤＡＳＨ ＩＩ（Stratagene製）を用いた。λＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩベクターとゲノムＤＮＡ断片のライゲーション反応はStratagene製のライゲーションキットを用いて、１２℃で一晩行った。反応後、反応液をGigaPack III Gold Packaging extractと反応させ、ゲノムＤＮＡが組み込まれたλベクターをファージ粒子に取り込ませた。ファージ液は５００μｌのＳＭバッファーと２０μｌのクロロホルム中で４℃保管した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）（Stratagene製）をＬＢＭＭ（ＬＢ＋０．２％マルトース＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ4）中でＡ600＝０．５になるまで培養し、この培養液２００μｌに、適量のファージ溶液を加え、３７℃で１５分間培養した。ここへ４８℃で保温したＮＺＹトップアガロースを４ｍｌ加え、混合し、ＮＺＹアガープレート（直径９ｃｍのプラスチックシャーレ）にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩培養し、プラーク数を数え、ｔｉｔｅｒを計算したところ、ライブラリーサイズは約３０万ｐｆｕ（plaque forming unit）と算出された。
（ｉｉ）プラークハイブリダイゼーションとＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子を含むゲノム断片のサブクローニング
次に、先述のフォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片をプローブに用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。直径９ｃｍの丸形シャーレにλＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ ベクターキット（Stratagene社製）の説明書きに従って、数百ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Amersham社製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブのラベリング、ハイブリダイゼーション条件は、上記（１）に記載の方法で行った。その結果、プラーク精製を兼ねた二次選抜までに、８クローンを得、うち４つのプラークを回収し、それぞれ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともに、一枚数万ｐｆｕとなるようにＮＺＹプレートにプレーティングし、一晩３７℃で保温した。プラークが一面に出ている６枚のプレートにＳＭバッファーを４ｍｌづつ注ぎ、４℃で一晩静置した。パスツールピペットで、ファージプレートライセートを回収し、ＱＩＡＧＥＮ Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）で、λＤＮＡを抽出、精製した。これらの４種のλＤＮＡサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ、またはＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の（１）と同様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、再度フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片をプローブに用い、サザン分析を行った。その結果、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化の場合、１０ｋｂのバンドが検出された。１０ｋｂの長さのゲノムは常法で高コピープラスミドベクターにサブクローン化するのは困難であると考えられたので、さらに各種の制限酵素を用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。用いた酵素はＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩである。その結果、ＥｃｏＲＶで６．６ｋｂ、ＫｐｎＩで７ｋｂ、ＮｈｅＩで３．５ｋｂのバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＮｈｅＩで消化し、ＴＡＥ緩衝液中で低融点アガロース（SeaPlaqueGTG）をもちいたアガロースゲル電気泳動を行った。３．５ｋｂのＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、ゲルと等量の２００ｍＭ ＮａＣｌを加え、６５℃で１０分処理し、ゲルを融解した。このサンプルをフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各一回行い、エタノール沈殿によって３．５ｋｂDNA断片を回収した。この断片をLigation kit（タカラバイオ製）を用いて、プラスミドベクターpBluescript SK(-)のＸｂａＩ部位（脱リン酸処理したもの）にライゲーションした。ライゲーション反応後、ＤＮＡをエレクトロポレーションによって大腸菌ＴＢ１に形質転換し、アンピシリン（１００(ｇ／ｍＬ）を含むＬＡ寒天培地にプレーティングした。３７℃一晩培養し得られたコロニーを複数、ＬＢ培地（アンピシリン入り）に接種し、３７℃で一晩振とう培養し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition（引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミドを抽出した。
（ｉｉｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列の決定
次に、上記でインサートＤＮＡが確認されたプラスミドに関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、３．５ｋｂ ＮｈｅＩ断片の両端の塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ配列を、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、アミノ酸配列に翻訳し、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに対して、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索を行った。その結果、片方のＤＮＡ配列から翻訳されたアミノ酸配列が、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列と有意な同一性を示した。同一性を示した領域の方向性から、３．５ｋｂ ＮｈｅＩ断片の中には完全なＪＴ−ＩＳＨ−２２４株β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子が含まれることが示唆された。
（ｉｉ）プラークハイブリダイゼーションとＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子を含むゲノム断片のサブクローニング
次に、先述のフォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片をプローブに用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。直径９ｃｍの丸形シャーレにλＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ ベクターキット（Stratagene社製）の説明書きに従って、数百ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Amersham社製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブのラベリング、ハイブリダイゼーション条件は、上記（１）に記載の方法で行った。その結果、プラーク精製を兼ねた二次選抜までに、８クローンを得、うち４つのプラークを回収し、それぞれ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともに、一枚数万ｐｆｕとなるようにＮＺＹプレートにプレーティングし、一晩３７℃で保温した。プラークが一面に出ている６枚のプレートにＳＭバッファーを４ｍｌづつ注ぎ、４℃で一晩静置した。パスツールピペットで、ファージプレートライセートを回収し、ＱＩＡＧＥＮ Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）で、λＤＮＡを抽出、精製した。これらの４種のλＤＮＡサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ、またはＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の（１）と同様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、再度フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片をプローブに用い、サザン分析を行った。その結果、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化の場合、１０ｋｂのバンドが検出された。１０ｋｂの長さのゲノムは常法で高コピープラスミドベクターにサブクローン化するのは困難であると考えられたので、さらに各種の制限酵素を用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。用いた酵素はＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩである。その結果、ＥｃｏＲＶで６．６ｋｂ、ＫｐｎＩで７ｋｂ、ＮｈｅＩで３．５ｋｂのバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＮｈｅＩで消化し、ＴＡＥ緩衝液中で低融点アガロース（SeaPlaqueGTG）をもちいたアガロースゲル電気泳動を行った。３．５ｋｂのＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、ゲルと等量の２００ｍＭ ＮａＣｌを加え、６５℃で１０分処理し、ゲルを融解した。このサンプルをフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各一回行い、エタノール沈殿によって３．５ｋｂDNA断片を回収した。この断片をLigation kit（タカラバイオ製）を用いて、プラスミドベクターpBluescript SK(-)のＸｂａＩ部位（脱リン酸処理したもの）にライゲーションした。ライゲーション反応後、ＤＮＡをエレクトロポレーションによって大腸菌ＴＢ１に形質転換し、アンピシリン（１００(ｇ／ｍＬ）を含むＬＡ寒天培地にプレーティングした。３７℃一晩培養し得られたコロニーを複数、ＬＢ培地（アンピシリン入り）に接種し、３７℃で一晩振とう培養し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition（引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミドを抽出した。
（ｉｉｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列の決定
次に、上記でインサートＤＮＡが確認されたプラスミドに関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、３．５ｋｂ ＮｈｅＩ断片の両端の塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ配列を、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、アミノ酸配列に翻訳し、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに対して、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索を行った。その結果、片方のＤＮＡ配列から翻訳されたアミノ酸配列が、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列と有意な同一性を示した。同一性を示した領域の方向性から、３．５ｋｂ ＮｈｅＩ断片の中には完全なＪＴ−ＩＳＨ−２２４株β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子が含まれることが示唆された。
次に、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の同酵素の遺伝子のＤＮＡ配列を完全に決定するため、３．５ｋｂ ＮｈｅＩ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、２種のプライマー：
ISH224-26ST-C3-R（5'-TTCATCGTCATCTAATCGTGGC-3' (22 mer)：配列番号６）；
ISH224-26ST-C4-R（5'-AGTTGTTGCGTACCACAAGT-3' (20 mer)：配列番号７）；
を合成し、塩基配列決定に用いた。
ISH224-26ST-C3-R（5'-TTCATCGTCATCTAATCGTGGC-3' (22 mer)：配列番号６）；
ISH224-26ST-C4-R（5'-AGTTGTTGCGTACCACAAGT-3' (20 mer)：配列番号７）；
を合成し、塩基配列決定に用いた。
これらのプライマーを用いて、上述の様に塩基配列を決定した結果、配列表の配列番号１の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、１５４５塩基対からなり、５１４個のアミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７を用いてＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のＤＮＡ配列は、フォトバクテリウム・ダムセラJT0160株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子と６３％の同一性を有していた。またアミノ酸配列でも、フォトバクテリウム・ダムセラJT0160株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と５４．５％の同一性を示した。
（３）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するかどうかを調べるため、またＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を大量に得るため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
（３）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するかどうかを調べるため、またＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を大量に得るため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の１７アミノ酸がシグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例においてＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマーISH224-26ST-N0BspHI（5'- AGAATATCATGAAAAACTTTTTATTATTAAC-3' (31 mer)：配列番号８）、ISH224-26ST-C0BamHI（5'-TTTTTTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACC-3' (33 mer)：配列番号１０）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例においてＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマーISH224-26ST-N1PciI（5'-CTTGTAACATGTCAGAAGAAAATACACAATC-3' (31 mer)：配列番号９）、ISH224-26ST-C0BamHI（5'-TTTTTTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACC-3' (33 mer)：配列番号１０）を設計、合成した。
３．５ｋｂ ＮｈｅＩ断片を含むプラスミドを鋳型に、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ ５００ｎｇ、１０× Ｅｘ ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ ４μｌ、プライマー ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ ｔａｑ（タカラバイオ製）０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００(ASTEK製)を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ２分を５回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．５５ｋｂ、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０でおよそ１．５ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition）に従いプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Takara社製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。その結果、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０においては、配列表の配列番号１の第７１８番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に塩基置換されていた。この変異によって、コドンがＴＴＡからＣＴＡに変化するが、これらのコドンはともにロイシン（Ｌｅｕ）をコードするため、アミノ酸変異は生じない。一方、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０には塩基配列の変化はなかった。ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０の塩基配列は配列番号３に示す。
塩基配列が確認されたＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０の代表クローンそれぞれ一つについて、制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩ（ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０の場合）、または制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩ（ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０の場合）で二重消化した後、上述（２）の（ｉｉ）と同様にゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia LKB製）を用いた。このベクターを制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行ったＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０のＰＣＲ産物とTakara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に形質転換した。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析して、インサートの組み込みを確認し、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃを完成した。
さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の各種短縮型たんぱく質を作成するため、以下のプライマーを設計した。
プライマー名、配列（配列番号）、長さ
224-26-N2Bsp AAACTTTCATGACGCAACAACTATTAACAGAA（配列番号１５）、32mer
224-26-N3Bsp AAGTAATCATGAACGTAGTGGCTCCATCTTTA（配列番号１６）、32mer
224-26-N3.1Bsp CACGTGTCATGACTCTTCAGCAGCTAATGGAT（配列番号１７）、32mer
２２４−２６−Ｎ２Ｂｓｐでは、Ｎ末端側６２アミノ酸が欠失し、かつＮ末端にメチオニンが導入される。２２４−２６−Ｎ３Ｂｓｐでは、Ｎ末端側１１０アミノ酸が欠失し、かつＮ末端にメチオニンが導入される。２２４−２６−Ｎ３．１Ｂｓｐでは、Ｎ末端側１２７アミノ酸が欠失し、かつＮ末端にメチオニンが導入される。これらのプライマーと、上述のプライマーＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩとの組み合わせで、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０を鋳型に用い、上記と同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、塩基配列を確認したところ、すべての組み合わせのクローンに関して、それらの塩基配列は、鋳型としたＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０の塩基配列と１００％の相同性を示した。２２４−２６−Ｎ２ＢｓｐとＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩ の組み合わせから得られるクローンをＮ２Ｃ０、２２４−２６−Ｎ３ＢｓｐとＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩ の組み合わせから得られるクローンをＮ３Ｃ０、２２４−２６−Ｎ３．１ＢｓｐとＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩ の組み合わせから得られるクローンをＮ３．１Ｃ０と命名した。これらのクローンについて、制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで二重消化した後、上述のように、大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａにクローニングし、ＩＳＨ２２４−Ｎ２Ｃ０／ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０／ｐＴｒｃ、ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ３．１Ｃ０／ｐＴｒｃを完成した。
（４）発現誘導と活性測定
上記（３）で得られた５種類のクローン（ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ２Ｃ０／ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０／ｐＴｒｃ、及びＩＳＨ２２４−Ｎ３．１Ｃ０／ｐＴｒｃ）に関して、タンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（６ｍｌ）に接種し、Ａ600＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間程度振とう培養した。培養液４ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、これを０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ カコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００倍希釈し、活性測定に供試した。反応は２反復で行った。反応条件は表１−１および表１−２の脚注に示す通りである。その結果、下記の表１−１および表１−２に示すように、ＩＳＨ２２４−Ｎ３．１Ｃ０／ｐＴｒｃ以外のクローンの粗酵素液中には糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の14ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクト−スに転移する因子、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。以上の結果から、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ２Ｃ０/ｐＴｒｃ、及びＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０/ｐＴｒｃを導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されていることが明らかとなった。
224-26-N2Bsp AAACTTTCATGACGCAACAACTATTAACAGAA（配列番号１５）、32mer
224-26-N3Bsp AAGTAATCATGAACGTAGTGGCTCCATCTTTA（配列番号１６）、32mer
224-26-N3.1Bsp CACGTGTCATGACTCTTCAGCAGCTAATGGAT（配列番号１７）、32mer
２２４−２６−Ｎ２Ｂｓｐでは、Ｎ末端側６２アミノ酸が欠失し、かつＮ末端にメチオニンが導入される。２２４−２６−Ｎ３Ｂｓｐでは、Ｎ末端側１１０アミノ酸が欠失し、かつＮ末端にメチオニンが導入される。２２４−２６−Ｎ３．１Ｂｓｐでは、Ｎ末端側１２７アミノ酸が欠失し、かつＮ末端にメチオニンが導入される。これらのプライマーと、上述のプライマーＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩとの組み合わせで、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０を鋳型に用い、上記と同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、塩基配列を確認したところ、すべての組み合わせのクローンに関して、それらの塩基配列は、鋳型としたＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０の塩基配列と１００％の相同性を示した。２２４−２６−Ｎ２ＢｓｐとＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩ の組み合わせから得られるクローンをＮ２Ｃ０、２２４−２６−Ｎ３ＢｓｐとＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩ の組み合わせから得られるクローンをＮ３Ｃ０、２２４−２６−Ｎ３．１ＢｓｐとＩＳＨ２２４−２６ＳＴ−Ｃ０ＢａｍＨＩ の組み合わせから得られるクローンをＮ３．１Ｃ０と命名した。これらのクローンについて、制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで二重消化した後、上述のように、大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａにクローニングし、ＩＳＨ２２４−Ｎ２Ｃ０／ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０／ｐＴｒｃ、ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ３．１Ｃ０／ｐＴｒｃを完成した。
（４）発現誘導と活性測定
上記（３）で得られた５種類のクローン（ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ２Ｃ０／ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０／ｐＴｒｃ、及びＩＳＨ２２４−Ｎ３．１Ｃ０／ｐＴｒｃ）に関して、タンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（６ｍｌ）に接種し、Ａ600＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間程度振とう培養した。培養液４ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、これを０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ カコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００倍希釈し、活性測定に供試した。反応は２反復で行った。反応条件は表１−１および表１−２の脚注に示す通りである。その結果、下記の表１−１および表１−２に示すように、ＩＳＨ２２４−Ｎ３．１Ｃ０／ｐＴｒｃ以外のクローンの粗酵素液中には糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の14ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクト−スに転移する因子、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。以上の結果から、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ、ＩＳＨ２２４−Ｎ２Ｃ０/ｐＴｒｃ、及びＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０/ｐＴｒｃを導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されていることが明らかとなった。
以上、ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０が、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の活性を保持する最小のクローンであった。よって、配列番号２のうち少なくともアミノ酸１１１−５１４が存在すればβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の活性を保持しうることが判明した。
（５）β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性の確認
上記（４）のＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンおよびＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンから調製した粗酵素液を用いて、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。実施例１と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０２６）を用い、酵素反応を行った。その結果、実施例１と同様に、ＰＡ−６’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ）が検出された。すなわち、両クローン株由来のシアル酸転移酵素はいずれもβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。これらの結果から、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子がクローニングされ、かつ、大腸菌内で発現されたことが証明された。
上記（４）のＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンおよびＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンから調製した粗酵素液を用いて、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ、ならびにＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。実施例１と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０２６）を用い、酵素反応を行った。その結果、実施例１と同様に、ＰＡ−６’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ）が検出された。すなわち、両クローン株由来のシアル酸転移酵素はいずれもβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。これらの結果から、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子がクローニングされ、かつ、大腸菌内で発現されたことが証明された。
実施例３：ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の生産性
ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンとＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンの比較
実施例２で得られたＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンとＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンに関して、経時的なタンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（６ｍｌ）に接種し、３０℃で約８時間培養した。この前培養液を抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（３００ｍｌ）に接種し、３０℃で振とう培養した。ＯＤ６００＝０．５程度になった時、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに振とう培養した。培養４、６、２２，および２８時間後、培養液中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、０．３３６％トリトンＸ−１００含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、これを０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ カコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００倍希釈し、活性測定に供試した。反応は２反復で行った。反応条件は表２の脚注に示す通りである。その結果、下記の表２に示すように、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンでは、ＩＰＴＧ添加４時間後に、β−ガラクトシド−α２，６シアル酸転移活性が最大となり、その生産量は５，５０１Ｕ／Ｌ・培地であった。一方、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンではＩＰＴＧ添加２２時間後に、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性が最大となり、その生産量は１０，７７６Ｕ／Ｌ・培地であった。
ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンとＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンの比較
実施例２で得られたＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンとＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンに関して、経時的なタンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（６ｍｌ）に接種し、３０℃で約８時間培養した。この前培養液を抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（３００ｍｌ）に接種し、３０℃で振とう培養した。ＯＤ６００＝０．５程度になった時、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに振とう培養した。培養４、６、２２，および２８時間後、培養液中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、０．３３６％トリトンＸ−１００含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、これを０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ カコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００倍希釈し、活性測定に供試した。反応は２反復で行った。反応条件は表２の脚注に示す通りである。その結果、下記の表２に示すように、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンでは、ＩＰＴＧ添加４時間後に、β−ガラクトシド−α２，６シアル酸転移活性が最大となり、その生産量は５，５０１Ｕ／Ｌ・培地であった。一方、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンではＩＰＴＧ添加２２時間後に、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性が最大となり、その生産量は１０，７７６Ｕ／Ｌ・培地であった。
以上より、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０クローンよりＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンの方が、β−ガラクトシド−α２，６シアル酸転移酵素の生産性が高いことが明らかとなった。
本出願前に明らかにしたフォトバクテリウム・ダムセラ由来の組換え型のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の生産性、すなわち、プラスミドｐＥＢＳＴΔ１７８を形質転換した大腸菌によるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の生産性は２２４．５Ｕ／Ｌ（Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)）である。この酵素と比較し、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えα２，６−シアル酸転移酵素の生産性は約４８倍高いことが明らかとなった。また、酵素の種類が異なるが、微生物由来のシアル酸転移酵素としては生産性の高いパステレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のα２，３−シアル酸転移酵素の生産性は６，０００Ｕ／Ｌ（Yu, H. et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619, 2005）である。この酵素と比較しても、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の生産性は、約１．８倍程度高い。
実施例４−１：ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０からのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の抽出、精製および精製タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の決定
（１）抽出及び精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養したＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
（１）抽出及び精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養したＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
本培養は、以下の手順で実施した。１．５ｍｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）＋３００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧ（１．１９２ｇ／５ｍｌ）を添加した３００ｍｌ−ＬＢ培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、これを９本（合計２．７Ｌ）用意した。各々のフラスコに前培養液１２ｍｌを接種し、３０℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。湿重量で約１５ｇを得た。
この菌体を、９９０ｍｌの０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、１．６ｇ／２６ｍｌとし、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。
この粗酵素液を、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したHiLoad 26/10 Q Sepharose HP（Amersham社製）という陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、予め０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）から０．３３６％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が１２５ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
この画分をＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ（Amersham社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。
活性のあった画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約５６，０００の分子量を示した。精製された画分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて９．４倍に上昇した（表３−１）。以上より、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の比活性は１１３Ｕ／ｍｇであり、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の比活性５．５Ｕ／ｍｇ（J. Biochem., 120, 104-110, 1996, T.Yamamoto et al.）と比較し、約２１倍であった。また、酵素の種類が異なるが、パステレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の比活性は６０Ｕ／ｍｇ（Yu, H. et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619, 2005.）である。この酵素と比較しても、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の比活性は、約１．９倍高い。
粗酵素液からのＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表３−１に示す。酵素活性は、実施例１に記載したのと同様にJ. Biochem. 120, 104-110(1996)に記載されている方法に準じて、表３−１脚注に示した反応条件で測定した。また、タンパク質の定量はCoomassie Protein Assay Reagent（PIERCE製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。
（２）アミノ末端アミノ酸配列の決定
上記（１）で単一バンドまで精製した酵素溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した。泳動後にタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＣＢＢにて染色した後、目的のバンド部分を切り出し、Procise 494 HT Protein Sequencing System（Applied Biosystems）でアミノ酸配列を分析した。その結果、アミノ末端がセリンで始まる配列の１５残基目（Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys）まで確定することができた。この結果から、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンの形質転換大腸菌が生産したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質において、アミノ末端のメチオニンは大腸菌体内でプロセスされたと考えられる。
上記（１）で単一バンドまで精製した酵素溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した。泳動後にタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＣＢＢにて染色した後、目的のバンド部分を切り出し、Procise 494 HT Protein Sequencing System（Applied Biosystems）でアミノ酸配列を分析した。その結果、アミノ末端がセリンで始まる配列の１５残基目（Ser Glu Glu Asn Thr Gln Ser Ile Ile Lys Asn Asp Ile Asn Lys）まで確定することができた。この結果から、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０クローンの形質転換大腸菌が生産したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質において、アミノ末端のメチオニンは大腸菌体内でプロセスされたと考えられる。
実施例４−２：ＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０からのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の抽出及び精製
（１）抽出及び精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養したＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
（１）抽出及び精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養したＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
本培養は、以下の手順で実施した。１．５ｍｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）＋３００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧ（１．１９２ｇ／５ｍｌ）を添加した３００ｍｌ−ＬＢ培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、これを１８本（合計５．４Ｌ）用意した。各々のフラスコに前培養液１２ｍｌを接種し、３０℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。湿重量で約３３．１ｇを得た。
この菌体を、５３８．５ｍｌの０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、１．６ｇ／２６ｍｌとし、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。
この粗酵素液を、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したHiLoad 26/10 Q Sepharose HP（Amersham社製）という陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、予め０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）から０．３３６％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が１２５ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。 この画分をＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。
活性のあった画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約４０，０００の分子量を示した。精製された画分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて１３１．５倍に上昇した（表３−２）。以上より、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素N3C0の比活性は２６４Ｕ／ｍｇであり、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の比活性５．５Ｕ／ｍｇ（J. Biochem., 120, 104-110, 1996, T.Yamamoto et al.）と比較し、約４８倍であった。また、酵素の種類が異なるが、パステレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の比活性は６０Ｕ／ｍｇ（Yu, H. et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 17618-17619, 2005.）である。この酵素と比較しても、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ３Ｃ０の比活性は、約４．４倍高い。
粗酵素液からのＩＳＨ２２４−Ｎ３Ｃ０クローンのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素N3C0の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表３−２に示す。酵素活性は、実施例１に記載したのと同様にJ. Biochem. 120, １０４−１１０（１９９６）に記載されている方法に準じて、表３−２脚注に示した反応条件で測定した。また、タンパク質の定量はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。
実施例５：ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適ｐＨ、至適温度および至適塩濃度
実施例４−１で調製した精製酵素を用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の至適ｐＨ、至適温度、至適塩濃度を調べた。
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適ｐＨ
酢酸バッファー（ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、およびｐＨ５．０）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、およびｐＨ７．０）、リン酸バッファー（ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、およびｐＨ９．０）を調製し、これを用いて、２５℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。
その結果、図２−１に示すように、ｐＨ５．０において、酵素活性が最大であった。なお、各ｐＨにおける酵素活性はｐＨ５．０における酵素活性を１００とする相対活性で示した。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適温度
カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いて、１０℃から５０℃までの５℃毎の反応温度において、酵素活性を測定した。
実施例４−１で調製した精製酵素を用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の至適ｐＨ、至適温度、至適塩濃度を調べた。
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適ｐＨ
酢酸バッファー（ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、およびｐＨ５．０）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、およびｐＨ７．０）、リン酸バッファー（ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、およびｐＨ９．０）を調製し、これを用いて、２５℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。
その結果、図２−１に示すように、ｐＨ５．０において、酵素活性が最大であった。なお、各ｐＨにおける酵素活性はｐＨ５．０における酵素活性を１００とする相対活性で示した。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適温度
カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いて、１０℃から５０℃までの５℃毎の反応温度において、酵素活性を測定した。
その結果、図２−２に示すように、３０℃において、酵素活性が最大であった。なお、各温度における酵素活性は３０℃における酵素活性を１００とする相対活性で示した
（３）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適塩濃度
カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いて、３０℃で、反応液中のＮａＣｌ濃度をそれぞれ０Ｍ、０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍに調整し、酵素活性を測定した。
（３）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適塩濃度
カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いて、３０℃で、反応液中のＮａＣｌ濃度をそれぞれ０Ｍ、０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍに調整し、酵素活性を測定した。
その結果、図２−３に示すように、０．５Ｍから０．７５Ｍにおいて酵素活性は最大となった。また、０Ｍから１．０Ｍまではほぼ同程度の酵素活性の高さを維持した。なお、各ＮａＣｌ濃度における酵素活性はＮａＣｌ濃度０Ｍにおける酵素活性を１００とする相対活性で示した。
実施例６：ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびＪＴ０１６０菌株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素（公知酵素）の受容体基質特異性（単糖・二糖類・三糖類）の比較
（材料および方法）
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来Ｎ１Ｃ０組換え大腸菌およびフォトバクテリウム・ダムセラ ＪＴ０１６０菌株から調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖、二糖類および三糖類へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。
（材料および方法）
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来Ｎ１Ｃ０組換え大腸菌およびフォトバクテリウム・ダムセラ ＪＴ０１６０菌株から調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖、二糖類および三糖類へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。
各種の糖受容体基質を用いたシアル酸転移反応
反応溶液２４μｌ中に、糖供与体基質ＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃを含むＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（１０．９ｎｍｏｌ（８４８５ｃｐｍ）、反応溶液中での最終濃度：０．４５５ｍＭ）、２０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した各種糖受容体基質（１μｍｏｌ、反応溶液中での最終濃度：４２ｍＭ）、シアル酸転移酵素（ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来Ｎ１Ｃ０では３．０ｍＵ、ＪＴ０１６０由来では４．３ｍＵ）、ＮａＣｌ（反応溶液中での最終濃度：５００ｍＭ）からなる反応溶液を調製して、３０℃で２分間、あるいは６０分間、酵素反応を行った。なお、糖受容体基質として用いた単糖は、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Man−β−OMe）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GalNAc）の８種類を用いた。二糖類として、ラクト−ス（Gal−β1,4−Glc）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Gal−β1,4−GlcNAc）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニド（Gal−β1,3−GlcNAc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α１，３−ガラクトピラノシド（Gal−α1,3−Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトピラノシド（Gal−β1,3−Gal−β−OMe）の５種類を用いた。三糖類として、２'−フコシルラクト−ス（Fuc-α1,2-Galβ1,4-Glc ）の１種類を用いた。但し、表４−２に示す糖鎖、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α１，３−ガラクトサミニド（Gal−α1,3−Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトサミニド（Gal−β1,3−Gal−β−OMe）および２'−フコシルラクト−ス（Fuc-α1,2-Galβ1,4-Glc）については最終濃度８．４ｍＭで反応させた。
反応溶液２４μｌ中に、糖供与体基質ＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃを含むＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（１０．９ｎｍｏｌ（８４８５ｃｐｍ）、反応溶液中での最終濃度：０．４５５ｍＭ）、２０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した各種糖受容体基質（１μｍｏｌ、反応溶液中での最終濃度：４２ｍＭ）、シアル酸転移酵素（ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来Ｎ１Ｃ０では３．０ｍＵ、ＪＴ０１６０由来では４．３ｍＵ）、ＮａＣｌ（反応溶液中での最終濃度：５００ｍＭ）からなる反応溶液を調製して、３０℃で２分間、あるいは６０分間、酵素反応を行った。なお、糖受容体基質として用いた単糖は、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Man−β−OMe）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GalNAc）の８種類を用いた。二糖類として、ラクト−ス（Gal−β1,4−Glc）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Gal−β1,4−GlcNAc）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニド（Gal−β1,3−GlcNAc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α１，３−ガラクトピラノシド（Gal−α1,3−Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトピラノシド（Gal−β1,3−Gal−β−OMe）の５種類を用いた。三糖類として、２'−フコシルラクト−ス（Fuc-α1,2-Galβ1,4-Glc ）の１種類を用いた。但し、表４−２に示す糖鎖、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α１，３−ガラクトサミニド（Gal−α1,3−Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトサミニド（Gal−β1,3−Gal−β−OMe）および２'−フコシルラクト−ス（Fuc-α1,2-Galβ1,4-Glc）については最終濃度８．４ｍＭで反応させた。
酵素反応終了後、反応溶液に１．９８ｍｌの５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を添加して酵素反応を停止した。その後、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）で希釈した酵素反応溶液（２ｍｌ）を、ＡＧ１−×２Ｒｅｓｉｎ（ＰＯ4 3‐ フォーム、０．２×２ｃｍ）カラムに供した。このカラムは、ＡＧ１−×２Ｒｅｓｉｎ（ＯＨ‐ｆｏｒｍ、BIO-RAD社製）を１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた14Ｃ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）が結合した反応生成物および未反応の糖受容体基質が含まれるが、未反応のＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じた各種シアル酸含有糖鎖由来の14Ｃの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性から酵素活性を算出することができる。
上記の方法を用いて、それぞれの糖受容体基質に転移されたＮｅｕＡｃの放射活性を測定して転移されたシアル酸を算出した。
（結果）
今回糖受容体基質として用いた１４種類の単糖、二糖、三糖のいずれにもシアル酸が転移していることが明らかとなった（表４−１および表４−２）。ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、公知のＪＴ０１６０菌株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素と比較して、広範囲な受容体基質について高い糖転移活性を示した。より具体的には、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニド、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトピラノシド、２'−フコシルラクト−スの６種類の糖受容体において、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０は、公知のＪＴ０１６０菌株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素よりも高い活性を示し、広い受容体基質特異性を有することが明らかとなった。なお、各受容体基質に対する相対活性は、ラクトースに対するシアル酸転移活性を１００とした場合を示す。
（結果）
今回糖受容体基質として用いた１４種類の単糖、二糖、三糖のいずれにもシアル酸が転移していることが明らかとなった（表４−１および表４−２）。ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、公知のＪＴ０１６０菌株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素と比較して、広範囲な受容体基質について高い糖転移活性を示した。より具体的には、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニド、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトピラノシド、２'−フコシルラクト−スの６種類の糖受容体において、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０は、公知のＪＴ０１６０菌株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素よりも高い活性を示し、広い受容体基質特異性を有することが明らかとなった。なお、各受容体基質に対する相対活性は、ラクトースに対するシアル酸転移活性を１００とした場合を示す。
実施例７：ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびＪＴ０１６０菌株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素（公知酵素）の糖タンパク質に対する受容体基質特異性の比較
糖受容体基質として、アシアロフェツインを用いた。２ｍｇのアシアロフェツインを１ｍｌの２０ｍＭ Bis-tris緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて、糖受容体基質溶液とした。糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを用いた。糖受容体基質溶液４０μｌ、糖供与体基質５μｌ、酵素溶液５μｌ（いずれも１０ｍＵ）を混合して、２５℃、２時間インキュベートしてシアル酸転移反応を行った。反応終了後、反応溶液を０．１ Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−５０スーパーファイン（０．８ｘ１８．０ｃｍ）に供して、ゲルろ過を行った。糖タンパク質が含まれるゲルろ過の溶出液画分（２〜４ｍｌの画分）を集め、この画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定することで、糖受容体基質に転移したシアル酸の定量を行った。
糖受容体基質として、アシアロフェツインを用いた。２ｍｇのアシアロフェツインを１ｍｌの２０ｍＭ Bis-tris緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて、糖受容体基質溶液とした。糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを用いた。糖受容体基質溶液４０μｌ、糖供与体基質５μｌ、酵素溶液５μｌ（いずれも１０ｍＵ）を混合して、２５℃、２時間インキュベートしてシアル酸転移反応を行った。反応終了後、反応溶液を０．１ Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−５０スーパーファイン（０．８ｘ１８．０ｃｍ）に供して、ゲルろ過を行った。糖タンパク質が含まれるゲルろ過の溶出液画分（２〜４ｍｌの画分）を集め、この画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定することで、糖受容体基質に転移したシアル酸の定量を行った。
その結果、いずれの酵素もアシアロフェツインにシアル酸を転移することが明らかとなった。また、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来のβ−ガラクトシド−α２，６シアル酸転移酵素（Ｎ１Ｃ０）は、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０菌株由来のβ−ガラクトシド−α２，６シアル酸転移酵素と比較して、シアル酸の転移効率が高いことが明らかとなった。
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされてきている糖鎖の合成・生産手段を提供する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つである。本発明の新規なシアル酸転移酵素は、糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発に利用することが可能である。
Claims (14)
- 配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基１５−５１４、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
- β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
（ａ）配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基１５−５１４、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸の保存的置換を含み、それにより当該アミノ酸配列と８５％以上のアミノ酸同一性を有する、アミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基１５−５１４、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
を含んでなる、前記タンパク質。 - 配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。
- β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
（ａ）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列；または、
（ｂ）配列番号１、配列番号１の塩基４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列の相補鎖に、６５℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、および６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を含んでなる核酸によってコードされる、前記タンパク質。 - フォトバクテリウム属に属する微生物由来である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
- 配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基１５−５１４、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする、単離された核酸。
- β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
（ａ）配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基１５−５１４、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸の保存的置換を含み、それにより当該アミノ酸配列と８５％以上のアミノ酸同一性を有する、アミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基１５−５１４、配列番号４および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
を含んでなるタンパク質をコードする、前記核酸。 - 配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含んでなる単離された核酸。
- β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
（ａ）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列；または
（ｂ）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４３−１５４５、配列番号３および配列番号１１からなる群より選択される塩基配列の相補鎖に、６５℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、および６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を含んでなる、前記核酸。 - 請求項６ないし９のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
- 請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
- β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
１）フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８７）を培養し；
２）培養した微生物または培養上清から、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。 - β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
１）請求項６ないし９のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
２）得られた形質転換細胞を培養し；そして、
３）培養した形質転換細胞またはその培養上清から、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。 - 請求項１ないし５のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質に対する抗体。
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