JP4812625B2 - 糖転移酵素の酵素活性を向上させる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、糖転移酵素の活性を向上させる方法に関する。
糖転移酵素は、生体内において糖タンパク質、糖脂質等の糖鎖の生合成に関与する酵素である。その反応生成物である糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖（以下、複合糖質糖鎖）は、分化や発生における細胞間および細胞-細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることなどが明らかにされている。
糖鎖を応用して産業化されている例として、エリスロポエチンの糖鎖付加が挙げられる。エリスロポエチンは本来糖鎖が付加されているが、その糖鎖の数を増加させることにより、生体におけるエリスロポエチンの寿命を伸ばした製品が開発され、市販されている。今後、このような糖鎖を付加した製品の上市が増加することが想定される。そのため、糖転移酵素の生産も重要となる。また、複合糖質糖鎖の機能解明を行う上で様々な糖鎖の合成が必要とされ、大量生産が必須となる。
一般に、複合糖質糖鎖の合成方法は、大きく2種類に分けられる。一つは、化学合成法であり、他方は糖転移酵素を用いる酵素法である。なお、化学合成法と酵素法を使用する化学／酵素的合成法という中間的な合成方法も存在する。
化学合成法と酵素法を比較した場合、どちらも長所、短所を有する。
化学合成法の長所として、糖鎖合成に関する数多くの知見があり、様々な糖鎖の合成に柔軟に対応できる可能性があることが挙げられる。しかしながら、化学合成法では一般に保護・脱保護という工程を経なければならず、必然的に合成経路が長く操作自体も煩雑であるので、高い収率で目的物を得られない短所がある。さらに、前述のように、今後タンパク質や脂質等の糖鎖修飾が重要になると考えられているが、化学合成法では、その合成条件から、タンパク質や脂質等の機能を損なうことなく糖を付加することは極めて難しい。
一方、酵素法には化学合成法と比較した場合、以下の長所がある。酵素法では、反応工程が極めて簡便であり、高い反応収率で目的物を得ることが可能である。さらに、温和な条件で反応できるため、タンパク質や脂質を変性させることがなく、それらの糖鎖修飾に応用可能である。
これまでに、約１５０種類以上の糖転移酵素遺伝子がヒト、マウス、ラット及び酵母等の真核生物から単離されており、さらにCHO細胞や大腸菌等を宿主細胞とする生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現されている。しかし、これらを宿主として生産された酵素が示す比活性は、本来の組織や細胞内での糖転移酵素の比活性と比較すると、一般に非常に低い値を示す。これは、大腸菌などを宿主として生産した糖転移酵素は、動物細胞内で生産されている本来の糖転移酵素とタンパク質の一次構造は同じであっても、タンパク質部分に付加される構造等が異なり、その結果、本来の酵素と比較して組換え体酵素の比活性が低下すると考えられるからである。
一方、原核生物である細菌からもいくつかの糖転移酵素遺伝子が単離されており、さらに大腸菌を用いる生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現され、それらの基質特性や酵素化学的な諸性質が明らかにされている。そのような微生物に由来し、大量に生産可能な安定な糖転移酵素の例として、Photobacterium damselae JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素が報告されている（特許第3062409号、特開平10-234364）。同酵素の生産性は培養液１Lあたり550Uであり、同酵素は大量に生産できる例として挙げることができる。しかし、より効率的な糖鎖合成を可能にするため、酵素活性を増加させる新規な酵素反応方法の開発が望まれていた。
また、哺乳類から得られたシアル酸転移酵素について、酵素活性を測定する際には、多くの場合その反応系にMgCl2、CaCl2などの２価イオンを添加することが示されている（グライコバイオロジー実験プロトコール、細胞工学別冊、1996年7月 page 104〜107、秀潤社）。また、特殊な好熱性細菌から抽出されたプロテアーゼの中には、1-5Mという極めて高いＮａＣｌの濃度で、活性が促進されることは知られていた( Inouye et al. J. Biochem 1997; 122, 358-364)。
しかし、糖転移酵素の活性に及ぼすＮａＣｌの効果については、その由来に関わらず、何も明らかにされてはいなかった。
特開平10-234364
細胞工学別冊、1996年7月 page 104〜107
.J. Biochem 1997; 122, 358-364
本発明が解決しようとする課題は、糖転移酵素について、従来の酵素反応系と比較して効率的に糖転移反応を行うことができる安価で簡便な方法を開発することにある。
本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、ビブリオ科に属する微生物由来の糖転移酵素について、その酵素反応系に適量のNaClを添加することにより、その酵素活性が増加することを見いだした。
本発明の効果は、Ｎａイオンに特有であり、Ｋ等の他の１価イオン、Ｍｇ2+等の２価イオンでは得ることができない。また、本発明のＮａイオンによる活性増加は、ビブリオ科に属する微生物由来の糖転移酵素に特有の効果であり、本発明の時点では、他の生物例えば哺乳類由来の糖転移酵素では認められていない。
従って、本発明は、ビブリオ科に属する微生物由来の糖転移酵素について、その酵素反応系に適量のNaClを添加することにより、酵素活性を増加させる方法に関する。
ビブリオ科に属する微生物由来の糖転移酵素は、本発明の方法でＮａＣｌを添加することにより、その酵素活性が増加すると期待でき、あるいは、ＮａＣｌを反応系に追加することによりその酵素活性の増加を確認することは、本明細書の開示を見た当業者にとって容易である。
本発明の方法において、ビブリオ科（Vibrionaceae）に属する微生物の例としては、ビブリオ属（Vibrio）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、アロモナス属（Allomonas）、カテノッコッカス属（Catenococcus）、エンテロビブリオ属（Enterovibrio）、あるいはサリニビブリオ属（Salinivibrio）などが含まれるが、これらに限定されない。ビブリオ科に属する微生物の中で好ましいものはフォトバクテリウム属に属する微生物、あるいはビブリオ属に属する微生物である。フォトバクテリウム属に属する微生物の例としては、フォトバクテリウム・ダムセーラ（Photobacterium damselae）、あるいはフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）、あるいはフォトバクテリウム・アンガスタム（Photobacterium angustum）、あるいはフォトバクテリウム・インディカム（Photobacterium indicum）、あるいはフォトバクテリウム・イリオピスカリウム（Photobacterium iliopiscarium）、あるいはフォトバクテリウム・プロファンダム（Photobacterium profundum）、あるいはフォトバクテリウム・レイオグナシィ（Photobacterium leiognathi）、あるいはフォトバクテリウム属菌（Photobacterium sp.）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ビブリオ属に属する微生物としては、ビブリオ・フィシリー（Vibrio fisheri）、あるいはビブリオ・アエロゲネス（Vibrio aerogenes）、あるいはビブリオ・カルビエンシス（Vibrio calviensis）、あるいはビブリオ・ルモイエンシス（Vibrio rumoiensis）、あるいはビブリオ・サルモニシーダ（Vibrio salmonicida）、あるいはビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、あるいはビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）、あるいはビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、あるいはビブリオ属菌（Vibrio sp.）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明におけるビブリオ科微生物は、限定されるものではないが、海洋性微生物であることが好ましい。海洋性微生物とは、例えば、海水、海砂、海産魚介類等から得られる微生物である。
ビブリオ科微生物由来の糖転移酵素の好ましいものは、シアル酸転移酵素である。その一例は、特開平10-234364に開示されているβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素である。また、ビブリオ科に属する微生物由来のβ-ガラクトシド-α2,3-シアル酸転移酵素であっても構わない。
ビブリオ科に属する微生物由来のβ-ガラクトシド-α2,3-シアル酸転移酵素は、本発明者らによって同定された。これら酵素については、PCT/JP2005/007340（2005年4月15日出願）およびPCT/JP2005/010814（2005年6月13日出願）にて国際特許出願されており、これら出願は本明細書に引用により援用される。また、これら酵素の同定と調製についての具体的な方法および結果は、後に示す参考例にも記載した。
本明細書において、糖転移酵素とは、天然材料としてビブリオ科に属する微生物中もしくはその培養培地から抽出した酵素、および遺伝子工学により当該酵素が由来するビブリオ科に属する微生物以外の宿主細胞で製造された酵素のいずれも含むものであり、また酵素の精製程度は、ゲル電気泳動による分析で単一バンドを示す程度まで十分に精製したもの、および粗精製品で活性を有する酵素の両方を含むものとする。さらに、糖転移酵素は天然の酵素と同じポリペプチドからなっていてもよく、あるいは天然酵素の活性部位を含むよう加工されたポリペプチドからなるものでもよい。
本発明の方法において、酵素反応を行う条件は、該糖転移酵素が反応する条件であれば、特に制限はない。酵素反応溶液には、限定するわけではないが、酢酸緩衝液、カコジレート緩衝液、リン酸緩衝液、ビストリス緩衝液、などの緩衝液を用いてもよい。反応溶液のｐＨおよび／または反応温度は、それぞれの糖転移酵素が反応する条件であればいずれでもよく、好ましくはそれぞれの糖転移酵素の至適ｐＨおよび／または至適温度である。糖供与体および糖受容体濃度の条件は、糖転移酵素が反応する条件であれば特に制限はなく、当業者であれば、これらの濃度を適宜設定することができる。
本発明の方法において、糖転移酵素の反応系にＮａＣｌを添加する時期に特に制限はないが、例えば、酵素反応前に、酵素反応用緩衝液に、酵素溶液に、糖受容体基質溶液に、または糖供与体溶液に溶解させておいてもよく、あるいはこれらと独立に適当濃度のＮａＣｌ溶液を調整し、これを反応系に添加してもよい。ＮａＣｌ溶液を酵素反応成分と独立に調整する態様では、反応の直前または反応の途中でＮａＣｌを反応系に添加することも可能である。
いずれにせよ、本発明の方法において、添加するＮａＣｌの量は、反応系の全量を基準として、0.1M〜2.0M、好ましくは0.1M〜1.5M、更に好ましくは0.2M〜1.0Mである。
本発明の方法において、使用できる糖受容体の例として、単糖類、二糖類、多糖類、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法において、使用できる糖供与体の例としては、糖ヌクレオチド、例えばCMP-NeuAc、CMP-KDN、CMP-NeuGc等のCMP-シアル酸、UDP-ガラクトース、GDP-フコース、GDP-マンノース、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン、UDP-グルコース等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、糖転移酵素とはグリコシル基を含む糖供与体から糖受容体にグリコシル基を転移する反応を触媒する酵素である。糖転移酵素の例には、シアル酸の転移反応を触媒するシアル酸転移酵素、グルコースの転移反応を触媒するグルコース転移酵素、ガラクトースの転移反応を触媒するガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミンの転移反応を触媒するアセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミンの転移反応を触媒するアセチルグルコサミン転移酵素、マンノースの転移反応を触媒するマンノース転移酵素、フコースの転移反応を触媒するフコース転移酵素、が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書においてシアル酸転移酵素とは、シアル酸を含む糖供与体から糖受容体にシアル酸を転移する反応を触媒する酵素である。本発明の方法におけるシアル酸転移酵素の例としては、ガラクトシド-α2,3-シアル酸転移酵素、ガラクトシド-α2,4-シアル酸転移酵素、ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素、シアル酸-α2,8-シアル酸転移酵素、およびシアル酸-α2,9-シアル酸転移酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、本発明の方法におけるシアル酸転移酵素は、ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素、および／または、ガラクトシド-α2,3-シアル酸転移酵素である。
本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖を構成しているガラクトース残基等の６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖を構成しているガラクトース残基等の６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、またはガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどの複合糖質を構成しうる単糖であって６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。なお、いずれの単糖も、α配位であっても、β配位であっても構わない。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。
本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖を構成しているガラクトース残基等の３位の炭素に水酸基を有する単糖の３位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖を構成しているラクトース残基等の３位の炭素に水酸基を有する単糖の３位、またはガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどの複合糖質を構成しうる単糖であって３位の炭素に水酸基を有する単糖の３位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。なお、いずれの単糖も、α配位であっても、β配位であっても構わない。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。
また、ここでいう「シアル酸」とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、N−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸などを示すが、これらに限定されない。
本発明の方法は、ビブリオ科に属する微生物に由来する糖転移酵素について、その酵素反応系にＮａＣｌを添加することにより、酵素活性を増加させる方法である。ここで、酵素活性が増加するとは、当該反応をＮａＣｌの存在下で行うことにより、ＮａＣｌの非存在下に比べて当該反応の効率が高まることをいう。好ましい態様において、酵素活性が増加するとは、当該反応をＮａＣｌの存在下で行うことにより、ＮａＣｌの非存在下に比べて、酵素の相対活性が１倍より大きい、より好ましくは１．１倍より大きい、さらに好ましくは１．２倍より大きいことをいう。増加した酵素活性の上限は特に定めなくてもよく、好ましくは１０倍以下、５倍以下、３倍以下、２倍以下であってもよい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ ビブリオ科微生物由来のα２，３−シアル酸転移酵素の同定とクローニング
材料および方法
参考例１−１： α２，３−シアル酸転移酵素を発現する微生物のスクリーニングと菌株の同定
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、さらに、ピリジルアミノ化糖鎖を用いて、シアル酸結合様式の決定を行った。その結果、α2,3-シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株を得た。なお、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株は、スルメイカの表皮から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はカマスの内臓から、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株はアジの内臓から、それぞれ得られた。
参考例１ ビブリオ科微生物由来のα２，３−シアル酸転移酵素の同定とクローニング
材料および方法
参考例１−１： α２，３−シアル酸転移酵素を発現する微生物のスクリーニングと菌株の同定
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、さらに、ピリジルアミノ化糖鎖を用いて、シアル酸結合様式の決定を行った。その結果、α2,3-シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株を得た。なお、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株は、スルメイカの表皮から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はカマスの内臓から、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株はアジの内臓から、それぞれ得られた。
シアル酸転移活性は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法に準じ測定した。具体的には、糖供与体基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、14ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ ２５０００ｃｐｍを含む、３５６ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）、糖受容体基質としてラクト−ス（１．２５μｍｏｌ）、および上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液（３０μｌ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応は２５℃で１０分間から３０分間行った。反応終了後、反応溶液に１．９７ｍｌの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ4 3‐ フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクト−スに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。
また、シアル酸結合様式の決定はピリジルアミノ化糖鎖を用いて行った。得られた酵素を用い、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０２６）を用い分析した。なお、標品として、ピリジルアミノ化α２，３シアリルラクトース（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０２９）を用いた。糖受容体基質が２．０μＭ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが５．７μＭおよび酵素が２０ｍＵ／ｍｌ程度となるように、それぞれを２０ｍＭ カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）あるいはビストリス緩衝液（ｐＨ６．０）２５μｌ中に溶解し、２５℃下で３時間から１８時間反応させた。反応終了後、１００℃で２分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。
ＨＰＬＣシステムとしてＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ１０Ａ（島津製作所製）を用い、分析カラムにはＴａｋａｒａ ＰＡＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｒ（タカラバイオ製）を用いた。０．１５％ Ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．０）で平衡化したカラムに溶出液Ａ（１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）で希釈した反応液を注入した。ピリジルアミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）および溶出液Ｂ（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を用い、３０〜１００％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜３５分）および１００％溶出液Ｂ（３５〜５０分）により、順次ピリジルアミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件で行った（流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：蛍光（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４００ｎｍ））。
（ｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株
得られたＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ。
（ｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株
得られたＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ。
（２）運動性 −
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では＋、２５℃では＋、３０℃では−
（２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／−
（４）カタラーゼテスト −
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 −
（７）グルコースからのガス産生 −
（８）発光性 ＋
（９）硝酸塩還元 ＋
（１０）インドール産生 ＋
（１１）ブドウ糖酸性化 −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ ＋
（１３）ウレアーゼ −
（１４）エスクリン加水分解 −
（１５）ゼラチン加水分解性 −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１７）ブドウ糖資化性 −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンノース資化性 −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２２）マルトース資化性 −
（２３）グルコン酸カリウム資化性 −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２５）アジピン酸資化性 −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２８）酢酸フェニル資化性 −
（２９）チトクロームオキシダーゼ ＋
（３０）菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（モル％）３９．７％
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによる種の同定）
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３に示した。この塩基配列はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）基準株であるＡＴＣＣ１１０４０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、相同率１００％の高い相同性を示した。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株はフォトバクテリウム属に属することが明らかとなった。しかしながら、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は細菌の全ゲノムの一部でしかないので、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列による同定解析は種レベルの極めて近縁な生物間の距離に対しては誤差が非常に大きいとされている。そこで、属内における菌株の類縁関係の定量的な評価に一般的に用いられているＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験法を用い、種の決定を行った。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株およびフォトバクテリウム・フォスフォレウム基準株であるＮＣＩＭＢ１２８２株（ＡＴＣＣ１１０４０株と同一株）の全ＤＮＡを抽出し、供試した。その結果、８４．７％の高い相同値（DNA-DNA relatedness）が得られた。一般に、同一種間のＤＮＡ−ＤＮＡ相同値は６０％以上を示すことから、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）と同定された。なお、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験は「微生物の分類・同定実験法」（鈴木健一郎・平石 明・横田 明 編、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、２００１年９月、参照によりその全体を本明細書に援用する）に従い、マイクロプレートを用いたフォトビオチン標識法によって行った。
（ｉｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株
得られたＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．０〜１．５μｍ。
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では＋、２５℃では＋、３０℃では−
（２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／−
（４）カタラーゼテスト −
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 −
（７）グルコースからのガス産生 −
（８）発光性 ＋
（９）硝酸塩還元 ＋
（１０）インドール産生 ＋
（１１）ブドウ糖酸性化 −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ ＋
（１３）ウレアーゼ −
（１４）エスクリン加水分解 −
（１５）ゼラチン加水分解性 −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１７）ブドウ糖資化性 −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンノース資化性 −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２２）マルトース資化性 −
（２３）グルコン酸カリウム資化性 −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２５）アジピン酸資化性 −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２８）酢酸フェニル資化性 −
（２９）チトクロームオキシダーゼ ＋
（３０）菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（モル％）３９．７％
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによる種の同定）
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３に示した。この塩基配列はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）基準株であるＡＴＣＣ１１０４０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、相同率１００％の高い相同性を示した。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株はフォトバクテリウム属に属することが明らかとなった。しかしながら、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は細菌の全ゲノムの一部でしかないので、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列による同定解析は種レベルの極めて近縁な生物間の距離に対しては誤差が非常に大きいとされている。そこで、属内における菌株の類縁関係の定量的な評価に一般的に用いられているＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験法を用い、種の決定を行った。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株およびフォトバクテリウム・フォスフォレウム基準株であるＮＣＩＭＢ１２８２株（ＡＴＣＣ１１０４０株と同一株）の全ＤＮＡを抽出し、供試した。その結果、８４．７％の高い相同値（DNA-DNA relatedness）が得られた。一般に、同一種間のＤＮＡ−ＤＮＡ相同値は６０％以上を示すことから、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）と同定された。なお、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験は「微生物の分類・同定実験法」（鈴木健一郎・平石 明・横田 明 編、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、２００１年９月、参照によりその全体を本明細書に援用する）に従い、マイクロプレートを用いたフォトビオチン標識法によって行った。
（ｉｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株
得られたＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．０〜１．５μｍ。
（２）運動性 ＋
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では−、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では−
（２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／−
（４）カタラーゼテスト ＋
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 ＋
（７）グルコースからのガス産生 ＋
（８）発光性 −
（９）硝酸塩還元 ＋
（１０）インドール産生 ＋
（１１）ブドウ糖酸性化 −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ ＋
（１３）ウレアーゼ −
（１４）エスクリン加水分解 −
（１５）ゼラチン加水分解性 −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１７）ブドウ糖資化性 −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンノース資化性 −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２２）マルトース資化性 −
（２３）グルコン酸カリウム資化性 −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２５）アジピン酸資化性 −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２８）酢酸フェニル資化性 −
（２９）チトクロームオキシダーゼ ＋
（３０）Ｏ／１２９感受性、１０μｇ −、１５μｇ ＋
（３１）菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（モル％）３９．４％
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析）
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３２に示した。
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では−、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では−
（２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／−
（４）カタラーゼテスト ＋
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 ＋
（７）グルコースからのガス産生 ＋
（８）発光性 −
（９）硝酸塩還元 ＋
（１０）インドール産生 ＋
（１１）ブドウ糖酸性化 −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ ＋
（１３）ウレアーゼ −
（１４）エスクリン加水分解 −
（１５）ゼラチン加水分解性 −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１７）ブドウ糖資化性 −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンノース資化性 −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２２）マルトース資化性 −
（２３）グルコン酸カリウム資化性 −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２５）アジピン酸資化性 −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２８）酢酸フェニル資化性 −
（２９）チトクロームオキシダーゼ ＋
（３０）Ｏ／１２９感受性、１０μｇ −、１５μｇ ＋
（３１）菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（モル％）３９．４％
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析）
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３２に示した。
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はマリンアガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、Ｏ／１２９感受性などの形態観察および生理・生化学的性状試験の結果からビブリオ科に属することが示された。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）基準株ＡＴＣＣ１１０４０の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．２％であること、次にフォトバクテリウム・イリオピスカリウム（Photobacterium iliopiscarium）基準株ＡＴＣＣ５１７６０の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に相同性が高く、その相同率は９９．１％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はフォトバクテリウム属（Photobacterium sp.）に属する微生物であることが明らかとなった。
（ｉｉｉ）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株
得られたＪＴ−ＦＡＪ−１６株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．２〜１．５μｍ。
（ｉｉｉ）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株
得られたＪＴ−ＦＡＪ−１６株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．２〜１．５μｍ。
（２）運動性 −
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では＋w、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では＋
（２）集落の色調 淡黄色〜クリーム色
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／＋
（４）カタラーゼテスト ＋
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 ＋
（７）グルコースからのガス産生 −
（８）硝酸塩還元 ＋
（９）インドール産生 −
（１０）ブドウ糖酸性化 ＋
（１１）アルギニンジヒドロラーゼ −
（１２）ウレアーゼ −
（１３）エスクリン加水分解 ＋
（１４）ゼラチン加水分解性 −
（１５）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１６）ブドウ糖資化性 −
（１７）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１８）Ｄ−マンノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２０）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２１）マルトース資化性 −
（２２）グルコン酸カリウム資化性 −
（２３）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２４）アジピン酸資化性 −
（２５）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２６）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２７）酢酸フェニル資化性 −
（２８）チトクロームオキシダーゼ ＋
（２９）Ｏ／１２９感受性、 −
（３０）マンイトール発酵性、 ＋
（３１）イノシトール発酵性、 ＋
（３２）アラビノース発酵性、 ＋
（３３）ラムノース発酵性、 −
（３４）サッカロース発酵性、 −
（３５）生育性（ＮａＣｌ）、３％ＮａＣｌ＋、４％ＮａＣｌ＋、６％ＮａＣｌ＋、
（３６）デンプン加水分解、 −
（３７）Ｔｗｅｅｎ８０分解、 −
（３８）Ｈ2Ｓ産生、 −
（３９）アセトイン産生（ＶＰテスト）、 −
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析）
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３３に示した。
（３）グラム染色性 −
（４）胞子の有無 −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度 ４℃では＋w、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では＋
（２）集落の色調 淡黄色〜クリーム色
（３）Ｏ／Ｆテスト ＋／＋
（４）カタラーゼテスト ＋
（５）オキシダーゼテスト ＋
（６）グルコースからの酸産生 ＋
（７）グルコースからのガス産生 −
（８）硝酸塩還元 ＋
（９）インドール産生 −
（１０）ブドウ糖酸性化 ＋
（１１）アルギニンジヒドロラーゼ −
（１２）ウレアーゼ −
（１３）エスクリン加水分解 ＋
（１４）ゼラチン加水分解性 −
（１５）β‐ガラクトシダーゼ ＋
（１６）ブドウ糖資化性 −
（１７）Ｌ−アラビノース資化性 −
（１８）Ｄ−マンノース資化性 −
（１９）Ｄ−マンニトール資化性 −
（２０）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性 −
（２１）マルトース資化性 −
（２２）グルコン酸カリウム資化性 −
（２３）ｎ−カプリン酸資化性 −
（２４）アジピン酸資化性 −
（２５）ｄｌ−リンゴ酸資化性 −
（２６）クエン酸ナトリウム資化性 −
（２７）酢酸フェニル資化性 −
（２８）チトクロームオキシダーゼ ＋
（２９）Ｏ／１２９感受性、 −
（３０）マンイトール発酵性、 ＋
（３１）イノシトール発酵性、 ＋
（３２）アラビノース発酵性、 ＋
（３３）ラムノース発酵性、 −
（３４）サッカロース発酵性、 −
（３５）生育性（ＮａＣｌ）、３％ＮａＣｌ＋、４％ＮａＣｌ＋、６％ＮａＣｌ＋、
（３６）デンプン加水分解、 −
（３７）Ｔｗｅｅｎ８０分解、 −
（３８）Ｈ2Ｓ産生、 −
（３９）アセトイン産生（ＶＰテスト）、 −
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析）
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３３に示した。
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株はマリンアガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、Ｏ／１２９感受性などの形態観察および生理・生化学的性状試験の結果からビブリオ科に属することが示された。さらに、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はビブリオ・ルモイエンシス（Vibrio rumoiensis）基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．５％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株はビブリオ属（Vibrio sp.）に属する微生物であることが明らかとなった。
参考例１−２： フォトバクテリウム フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７からのα２，３−シアル酸転移酵素の抽出および精製
マリンアガー２２１６平板培地上で継代培養したフォトバクテリウム フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のコロニーから菌体をループで採取し、マリンブロス２２１６液体培地１０ｍｌに接種し、２５℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
参考例１−２： フォトバクテリウム フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７からのα２，３−シアル酸転移酵素の抽出および精製
マリンアガー２２１６平板培地上で継代培養したフォトバクテリウム フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のコロニーから菌体をループで採取し、マリンブロス２２１６液体培地１０ｍｌに接種し、２５℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
本培養は、以下の手順で実施した。２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅおよび４ ｇ／ＬのＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを加えたマリンブロス２２１６培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で滅菌した。これを３６本（合計１０．８Ｌ）用意した。各々のフラスコに前述の培養液１０ｍｌを接種し、２５℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。湿重量で約６０ｇを得た。
この菌体を、９９０ｍｌの０．２％トリトンＸ−１００および３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を、透析膜チューブに入れ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）中で４℃、塩化ナトリウムが２０ｍＭ程度になるまで透析した。透析後、溶液中に沈澱が生じたため、４℃で、１００，０００×ｇで１時間遠心分離を行い、沈殿を取り除いた。
この粗酵素液を、０．２％トリトンＸ−１００なる界面活性剤を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ １６／１０ ＤＥＡＥ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス製）という陰イオン交換カラムに吸着させ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、予め０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）から０．２％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、リン酸緩衝液濃度が１２５ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
この画分をＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ（アマシャムバイオサイエンス製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。
この画分を、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ カコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈し、ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ（ファルマシア製）陰イオン交換カラムに吸着させた。０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）から１Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ、直線濃度勾配法で溶出させた。塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。
この画分を０．２％トリトンＸ−１００および０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス製）ゲルろ過カラムで分画した。０．２％トリトンＸ−１００および０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ カコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させた。
活性のあった画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約３９，０００の分子量を示した（本明細書において467 nativeと表記する）。この画分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて約３５０倍に上昇した（表３）。
粗酵素液からのＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表１に示す。酵素活性は、実施例７−１に記載したのと同様にJ. Biochem. 120, 104-110(1996)に記載されている方法で測定した。また、タンパク質の定量はCoomassie Protein Assay Reagent（PIERCE製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。
参考例１−３： ピリジルアミノ化糖鎖を用いたシアル酸結合様式の決定
参考性１−２で得られた酵素を用い、参考例１−１のように、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。その結果、本酵素を用いることにより、ピリジルアミノ化ラクトースからピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースが合成されることが明らかとなった。
参考例１−４： フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するα２，３−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列解析および当該遺伝子の形質転換
（１）ゲノムＤＮＡの精製とゲノムライブラリーの作成
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の菌体ペレット約０．５ｇから、Qiagen Genomic-tip 100/G（Qiagen社製）を用いて、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。１−２μｇのＤＮＡに対して、０．１〜０．２ユニットの四塩基認識の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを反応させ、部分分解を行った。反応バッファーは酵素に添付のものを用い、反応条件は３７℃、３０分とした。反応終了後、反応液に最終濃度２５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加え、フェノール・クロロホルム処理を行った。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、ＴＥ ４００μｌに溶解した。遠心チューブ（日立製作所製４０ＰＡ）に、グラジエント作製装置を用いて、４０％シュークロースバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１Ｍ ＮａＣｌ）と１０％シュークロースバッファーから、４０−１０％のグラジエントを作製し、そこへ上記の部分分解ＤＮＡ溶液を重層した。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ７０Ｈ、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて、２６，０００ｒｐｍ、２０℃、１５時間遠心した。遠心後チューブの底部に２５Ｇの針で穴を空け、底部の液から１ｍｌずつ回収した。回収したゲノムＤＮＡを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳動糟を用い、０．５−０．６％アガロースゲル／ＴＡＥバッファー中で、２６Ｖ、２０時間電気泳動を行い、９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡを含む画分を把握した。マーカーとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を含む画分にＴＥを２．５ｍｌ加えシュークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量のＴＥに溶解した。
参考性１−２で得られた酵素を用い、参考例１−１のように、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。その結果、本酵素を用いることにより、ピリジルアミノ化ラクトースからピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースが合成されることが明らかとなった。
参考例１−４： フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するα２，３−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列解析および当該遺伝子の形質転換
（１）ゲノムＤＮＡの精製とゲノムライブラリーの作成
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の菌体ペレット約０．５ｇから、Qiagen Genomic-tip 100/G（Qiagen社製）を用いて、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。１−２μｇのＤＮＡに対して、０．１〜０．２ユニットの四塩基認識の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを反応させ、部分分解を行った。反応バッファーは酵素に添付のものを用い、反応条件は３７℃、３０分とした。反応終了後、反応液に最終濃度２５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加え、フェノール・クロロホルム処理を行った。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、ＴＥ ４００μｌに溶解した。遠心チューブ（日立製作所製４０ＰＡ）に、グラジエント作製装置を用いて、４０％シュークロースバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１Ｍ ＮａＣｌ）と１０％シュークロースバッファーから、４０−１０％のグラジエントを作製し、そこへ上記の部分分解ＤＮＡ溶液を重層した。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ７０Ｈ、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて、２６，０００ｒｐｍ、２０℃、１５時間遠心した。遠心後チューブの底部に２５Ｇの針で穴を空け、底部の液から１ｍｌずつ回収した。回収したゲノムＤＮＡを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳動糟を用い、０．５−０．６％アガロースゲル／ＴＡＥバッファー中で、２６Ｖ、２０時間電気泳動を行い、９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡを含む画分を把握した。マーカーとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を含む画分にＴＥを２．５ｍｌ加えシュークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量のＴＥに溶解した。
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のゲノムライブラリー作成のためのベクターとして、λＤＡＳＨ ＩＩ（Stratagene製）を用いた。λＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩベクターとゲノムＤＮＡ断片のライゲーション反応はStratagene製のライゲーションキットを用いて、１２℃で一晩行った。反応後、反応液をGigaPack III Gold Packaging extractと反応させ、ゲノムＤＮＡが組み込まれたλベクターをファージ粒子に取り込ませた。ファージ液は５００μｌのＳＭバッファーと２０μｌのクロロホルム中で４℃保管した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）（Stratagene製）をＬＢＭＭ（ＬＢ＋０．２％マルトース＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ4）中でＡ600＝０．５になるまで培養し、この培養液２００μｌに、適量のファージ溶液を加え、３７℃で１５分間培養した。ここへ４８℃で保温したＮＺＹトップアガロースを４ｍｌ加え、混合し、ＮＺＹアガープレート（直径９ｃｍのプラスチックシャーレ）にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩培養し、プラーク数を数え、ｔｉｔｅｒを計算したところ、ライブラリーサイズは約３０万ｐｆｕ（plaque forming unit）と算出された。
（２）プライマー設計とプローブ作成
Procise 494 cLC Protein Sequencing System（Applied Biosystems製）を用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸配列、および内部アミノ酸配列を決定した。
（２）プライマー設計とプローブ作成
Procise 494 cLC Protein Sequencing System（Applied Biosystems製）を用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸配列、および内部アミノ酸配列を決定した。
Ｎ末端アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を５／２０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ製）にてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、当該酵素をＰＶＤＦ膜に吸着させ、アミノ酸配列分析装置により、アミノ末端側１０個のアミノ酸の配列を決定した。その結果、当該酵素のＮ末端アミノ酸配列はＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）であった。
また、内部アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を５／２０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ製）にてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルを染色した後、目的のバンドを切り出し、リジルエンドペプチダーゼを含むトリスバッファー（ｐＨ８．５）を加え、３５℃、２０時間の処理を行った。その後、溶液の全量を逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ３．５μｍ）に供して、断片ペプチドを分離した。アミノ酸配列分析装置により、当該酵素の内部アミノ酸配列は、ＳＬＤＳＭＩＬＴＮＥＩＫ（配列番号５）、ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）およびＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）を有することが明らかとなった。
上記のように決定されたフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７由来α２，３−シアル酸転移酵素の部分アミノ酸配列、即ちＮ末アミノ酸配列：ＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）と、三箇所の内部アミノ酸配列のうち、二箇所の内部アミノ酸配列：ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）およびＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）を基に以下のｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを設計、合成した。即ち、Ｎ末端のアミノ酸配列：ＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）から、下記の表２に示す３本のプライマーを合成した。
また、内部アミノ酸配列：ＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）から下記の表３に示す４本のプライマーを合成した。
さらに、内部アミノ酸配列：ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）から下記の表４に示す２本のプライマーを合成した。
これらのプライマーを用いて、上記（１）で抽出・精製したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなるＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分長ＤＮＡを増幅した。プライマー組み合わせは、Ｎ末端配列由来の３本のプライマーのそれぞれと、４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）、４６７ｉｎ１ＦＷ２（配列番号１４）もしくは４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）の９つの組み合わせ、４６７ｉｎ１ＲＶ（配列番号１１）もしくは４６７ｉｎ１ＲＶ２（配列番号１３）と４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）の２つの組み合わせ、さらに４６７ｉｎ２ＲＶ（配列番号１５）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）もしくは４６７ｉｎ１ＦＷ２（配列番号１４）の２つの組み合わせの、総計１３組み合わせである。ＰＣＲ反応は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、ゲノムＤＮＡ ２５０ｎｇ、１０( Ｅｘ ｔａｑバッファー ５μｌ、２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ ４μｌ，プライマーをそれぞれの配列について５ｐｍｏｌｅ，Ｅｘ ｔａｑ（タカラバイオ製）０．５μｌ、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社）を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５０℃ １分、７２℃ ２分を４０回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、９つのプライマー組み合わせ（４６７Ｎ−ＲＶ（配列番号８）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）、４６７Ｎ−ＲＶ（配列番号８）と４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）、４６７ｉｎ１ＲＶ（配列番号１１）と４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）、４６７ｉｎ２ＲＶ（配列番号１５）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）の組み合わせ以外の９つ）において、ＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物のうち、特異的かつ高い増幅効率の得られた組み合わせ（４６７Ｎ−ＲＶ３（配列番号１０）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２））由来のＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Invitrogen製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition（引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミドＤＮＡを抽出した。このクローンに関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer製）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。
決定されたＤＮＡ塩基配列（９２９ｂｐ：配列番号１７）に関して、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに対して、ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索を行った。その結果、有意な相同性を示すＤＮＡ配列は検出されなかった。これは本発明によって明らかにされた、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＤＮＡ塩基配列が新規な配列であることを意味する。次に、この塩基配列をアミノ酸に翻訳して、再度ＢＬＡＳＴサーチをかけたところ、フォトバクテリウム・ダムセーラ（Photobacterium damselae）のα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３０％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株（Pasteurella multocida subsp. multocida）Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質 ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２６％の相同性、へモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）３５０００ＨＰ株の仮定上のタンパク質 ＨＤ００５３（ＡＡＰ９５０６８）と２１％の相同性が検出された。さらに、翻訳されたアミノ酸配列は、上記の精製酵素から直接決定された内部アミノ酸配列：ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）とＳＬＤＳＭＩＬＴＮＡＩＫ（配列番号５）の全体を含み、Ｎ末アミノ酸配列：ＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）と、内部アミノ酸配列：ＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）の一部を含んでいた。以上の結果から、クローニングされたＤＮＡは、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の一部であり、かつ本発明のフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、既報配列と３０％程度しか相同性を示さない新規なアミノ酸配列であることが明らかとなった。
（３）スクリーニングと遺伝子クローニング
上記（２）でクローン化されたフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクターから制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、これをプローブとして、上記（１）作製したフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。直径９ｃｍの丸形シャーレにλＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ ベクターキット（Stratagene製）の説明書きに従って、約３００−５００ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブはrediprime IITM DNA labelling system（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて32Ｐラベルした。ハイブリダイゼーションは０．５Ｍ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．２、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５(Ｃで一晩、洗浄の条件は４０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ中で６５℃、１５分を２回、４０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５(Ｃ、１５分を２回行った。１次スクリーニングで約５，０００ｐｆｕのファージから２４個のポジティブクローンが得られた。うち１８個のクローンに関して、プラークの精製を兼ねた２次スクリーニングを行った。その結果、６種類の選抜・精製プラークを得ることが出来た。
（３）スクリーニングと遺伝子クローニング
上記（２）でクローン化されたフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクターから制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、これをプローブとして、上記（１）作製したフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。直径９ｃｍの丸形シャーレにλＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ ベクターキット（Stratagene製）の説明書きに従って、約３００−５００ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブはrediprime IITM DNA labelling system（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて32Ｐラベルした。ハイブリダイゼーションは０．５Ｍ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．２、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５(Ｃで一晩、洗浄の条件は４０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ中で６５℃、１５分を２回、４０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．２、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５(Ｃ、１５分を２回行った。１次スクリーニングで約５，０００ｐｆｕのファージから２４個のポジティブクローンが得られた。うち１８個のクローンに関して、プラークの精製を兼ねた２次スクリーニングを行った。その結果、６種類の選抜・精製プラークを得ることが出来た。
これらのプラークを回収し、それぞれ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）とともに、一枚数万ｐｆｕとなるようにＮＺＹプレートにプレーティングし、一晩３７℃で保温した。プラークが一面に出ている６枚のプレートにＳＭバッファーを４ｍｌづつ注ぎ、４℃で一晩静置した。パスツールピペットで、ファージプレートライセートを回収し、QIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）で、λＤＮＡを抽出、精製した。これら６種類のλＤＮＡ、および（１）で精製したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の全ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の９２９ｂｐのプローブ（配列番号１７）を用いて、上述のようにサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＥｃｏＲＩ消化では、９ｋｂまたはそれ以上のバンドが検出された。一方、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合、全てのλＤＮＡ、ゲノムＤＮＡともに４．６ｋｂのバンドが検出された。そこで、λＤＮＡを再度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、４．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、常法に従いクローニングした。
次に、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を決定するため、同遺伝子の部分ＤＮＡ配列（上述、９２９ｂｐ：配列番号１７）を基に以下の表５に示すプライマーを合成した。
これらのプライマーを用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer製）で、４．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片の内部塩基配列を解析し、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の内部、およびその近傍の塩基配列を解析した。その結果、配列表の配列番号１の配列を得た。この配列は、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。最初のＡＴＧの上流には同じ読み枠で、翻訳終止コドンが現れるのでこれが、本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。
フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、１２３０塩基からなり、４０９個アミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。このアミノ酸配列は、精製酵素から決定された４箇所のアミノ酸配列全てを完全に含む。Ｎ末のアミノ酸配列の一文字目が解読されていなかったが、遺伝子から演繹されるこの部分のアミノ酸はＣｙｓ（システイン）であった。また成熟タンパクのＮ末端は、配列表の配列番号２の配列のうちの第２２番目のＣｙｓであることから、初めの２１アミノ酸からなる配列は、フォトバクテリウム・フォスフォレウムにおいてはプロセッシングを受け、除去されると考えられた。遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）を用いて、本発明のフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質全長、およびその遺伝子全長と、それらのホモローグの全長同士の相同性を解析したところ、アミノ酸配列では、フォトバクテリウム・ダムセーラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３２％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２８％の相同性を有し、そして、遺伝子ＤＮＡ配列ではそれぞれと、５３％、５１％の相同性を有していた。
（４）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
（４）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の２４アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本明細書において４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子と表記する）をクローン化するためのプライマー ４６７−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ（配列番号２７）および４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂｍ（配列番号２６）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本明細書において４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子と表記する）をクローン化するためのプライマー ４６７−２３ＳＴ−Ｎ２−Ｎｃｏ（配列番号２５）および４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂｍ（配列番号２６）を設計、合成した（表６）。
クローニング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素ＰｃｉＩ（４６７−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ）、ＮｃｏＩ（４６７−２３ＳＴ−Ｎ２−Ｎｃｏ）、ＢａｍＨＩ（４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂｍ）部位を下線で示した。翻訳開始コドンＡＴＧ、翻訳終止コドンに対応する相補配列ＴＡＡを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、制限酵素部位より３’側で、鋳型ＤＮＡとアニーリングする部分の配列を太字で示した。ＰＣＲ時の鋳型ＤＮＡは、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子全長を含む上記ＨｉｎｄＩＩＩ ４．６ｋｂ断片が組み込まれたプラスミドを用いた。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、１０× Ｅｘ ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ ４μｌ、プライマー ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ ｔａｑ（タカラバイオ製） ０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ製）を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５０℃ １分、７２℃ ２分を１５回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子でおよそ１．２ｋｂ、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子でおよそ１．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物のうち、４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子を制限酵素ＰｃｉＩ（New England Biolab製）とＢａｍＨＩ（タカラバイオ製）で二重消化し、そして、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）とＢａｍＨＩで二重消化した後、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia LKB製）を用いた。このベクターを同じ制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩ、または制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物とTakara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に形質転換した。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析し、インサートの組み込みを確認した。さらに、クローンした４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子およびクローンした４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子の全塩基配列を決定し、ＰＣＲ反応による塩基配列の変異がないことを確認した。即ち、クローンした４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子は配列番号１に示す塩基配列を含み、そしてクローンした４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子は配列番号１の第７３番目の塩基から第１２３０番目の塩基までの配列を含んでいた。
（５）発現誘導と活性測定
上記（４）で得られた４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子に関して、タンパク質発現誘導実験を行った。４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子および４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子がそれぞれ組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００(ｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、Ａ600＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。反応は２反復で行い、反応組成は実施例１と同様に行った。但し、反応時間は１５時間とした。その結果、下記の表７に示すように、４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子形質転換体の粗酵素液中および４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子形質転換体の粗酵素液中には、糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の14ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクトースに転移する因子、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。この結果から、４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子、または４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子を導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されていることが明らかとなった。
（５）発現誘導と活性測定
上記（４）で得られた４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子に関して、タンパク質発現誘導実験を行った。４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子および４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子がそれぞれ組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００(ｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、Ａ600＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。反応は２反復で行い、反応組成は実施例１と同様に行った。但し、反応時間は１５時間とした。その結果、下記の表７に示すように、４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子形質転換体の粗酵素液中および４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子形質転換体の粗酵素液中には、糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の14ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクトースに転移する因子、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。この結果から、４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子、または４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子を導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されていることが明らかとなった。
（６）α２，３−シアル酸転移活性の確認
上記（５）の粗酵素液を用いて、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子を導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。参考例１−１と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトースを用い、酵素反応を行った。反応終了後、９５℃で５分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、ＨＰＬＣで分析した。なお、酵素反応は、ピリジルアミノ化ラクトースが２．０μＭ、ＣＭＰ−シアル酸が５．７μＭとなるように、それぞれを２０ｍＭ カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）２５μｌ中に溶解し、２５℃下で６時間行った（反応１）。一方、ＣＭＰ−シアル酸を含まない反応液を供試した対照実験（反応２）を行った。また、標品の保持時間を明らかにするため、熱処理（９５℃、５分間）によって失活させた粗酵素液を加え、ピリジルアミノ化ラクトースおよびピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースを添加した試験を行った。
上記（５）の粗酵素液を用いて、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子を導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。参考例１−１と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトースを用い、酵素反応を行った。反応終了後、９５℃で５分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、ＨＰＬＣで分析した。なお、酵素反応は、ピリジルアミノ化ラクトースが２．０μＭ、ＣＭＰ−シアル酸が５．７μＭとなるように、それぞれを２０ｍＭ カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）２５μｌ中に溶解し、２５℃下で６時間行った（反応１）。一方、ＣＭＰ−シアル酸を含まない反応液を供試した対照実験（反応２）を行った。また、標品の保持時間を明らかにするため、熱処理（９５℃、５分間）によって失活させた粗酵素液を加え、ピリジルアミノ化ラクトースおよびピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースを添加した試験を行った。
標品の分析結果から、ピリジルアミノ化ラクトースの保持時間は４．１分、ピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースの保持時間は５．４分であることが示された。これにより反応１では検出されるが、反応２では検出されない保持時間５．３分のピークが、ピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースであることが明らかとなった。すなわち、４６７−Ｎ２Ｃ０遺伝子を導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有することが証明された。
また、同様に４６７−Ｎ０Ｃ０遺伝子を導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。その結果、大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応において、反応生成物としてピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースのピークが検出された。よって、この酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
参考例１−５： フォトバクテリウム属細菌ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと、塩基配列解析および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認
参考例１−１でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったフォトバクテリウム属ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株において、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。参考例１−４に記載した方法で、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の菌体ペレットからゲノムＤＮＡを調製した後、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記のＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブとして用いて、参考例１−４に記載した方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。ただしハイブリダイゼーション温度、および洗浄処理の温度は、５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化では、１６ｋｂのバンドが検出された。一方、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合、５ｋｂと２．７ｋｂのバンドが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株にはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
次に、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行った。参考例１−４に記載した方法により、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡから、λＤＡＳＨ ＩＩ（Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、参考例１−４と同様にハイブリダイゼーション、および洗浄の温度は５５℃とした。その結果、プラーク精製を兼ねた二次選抜までに、１２クローンを得、うち６つのλＤＮＡを、参考例１−４のようにQIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）を用いて精製した。さらにこのうち３クローンのλＤＮＡサンプル、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の全ゲノムＤＮＡについて、制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、サザン分析を行った。ハイブリダイゼーション、洗浄の温度は５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化の場合、１２ｋｂまたはそれ以上のバンドが検出されたのに対し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合は、３つ全てのλＤＮＡサンプルとＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の全ゲノムＤＮＡに関して、５ｋｂと２．７ｋｂの二本のバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これら５ｋｂと２．７ｋｂの二本のＤＮＡ断片をゲル精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に常法に従いクローニングした。
参考例１−５： フォトバクテリウム属細菌ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと、塩基配列解析および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認
参考例１−１でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったフォトバクテリウム属ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株において、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。参考例１−４に記載した方法で、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の菌体ペレットからゲノムＤＮＡを調製した後、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記のＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブとして用いて、参考例１−４に記載した方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。ただしハイブリダイゼーション温度、および洗浄処理の温度は、５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化では、１６ｋｂのバンドが検出された。一方、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合、５ｋｂと２．７ｋｂのバンドが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株にはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
次に、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行った。参考例１−４に記載した方法により、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡから、λＤＡＳＨ ＩＩ（Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、参考例１−４と同様にハイブリダイゼーション、および洗浄の温度は５５℃とした。その結果、プラーク精製を兼ねた二次選抜までに、１２クローンを得、うち６つのλＤＮＡを、参考例１−４のようにQIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）を用いて精製した。さらにこのうち３クローンのλＤＮＡサンプル、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の全ゲノムＤＮＡについて、制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、サザン分析を行った。ハイブリダイゼーション、洗浄の温度は５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化の場合、１２ｋｂまたはそれ以上のバンドが検出されたのに対し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合は、３つ全てのλＤＮＡサンプルとＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の全ゲノムＤＮＡに関して、５ｋｂと２．７ｋｂの二本のバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これら５ｋｂと２．７ｋｂの二本のＤＮＡ断片をゲル精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に常法に従いクローニングした。
次に、これらのクローンに関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片と２．７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片の両端の塩基配列を決定した。その結果、５ｋｂ断片の片側のＤＮＡ配列、および２．７ｋｂの片側のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列が、データベース検索の結果ともに、シアル酸転移酵素と相同性を示した。ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の同酵素の遺伝子のＤＮＡを完全に決定するため、ＨｉｎｄＩＩＩ ２．７ｋｂ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、下記の表８のプライマーを合成し、塩基配列決定に用いた。
その結果、配列表の配列番号２８の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。最初のＡＴＧの上流には同じ読み枠で翻訳終止コドンが現れるので、これが本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のそれと同様に、１２３０塩基からなり、４０９個のアミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２９に示す。遺伝子内部にはＨｉｎｄＩＩＩ部位を有していた。ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７を用いて核酸、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子と９２％の相同性を有していた。またアミノ酸配列でも、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素と９２％の相同性を示した。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、フォトバクテリウム・ダムセーラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３３％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２９％の相同性を示し、遺伝子ＤＮＡ配列ではそれぞれと、５４％、５０％という相同性であった。
（３）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の２４アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本明細書において２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子と表記する）をクローン化するためのプライマー２２４−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ（配列番号３５）、２２４−２３ＳＴ−Ｃ０ｎｅｗ−Ｂｍ（配列番号３７）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本明細書において２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子と表記する）をクローン化するためのプライマー２２４−２３ＳＴ−Ｎ１−Ｎｃｏ（配列番号３６）、２２４−２３ＳＴ−Ｃ０ｎｅｗ−Ｂｍ（配列番号３７）を設計、合成した（表９）。
クローニング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素ＰｃｉＩ（２２４−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ）、ＮｃｏＩ（２２４−２３ＳＴ−Ｎ１−Ｎｃｏ）、ＢａｍＨＩ（２２４−２３ＳＴ−Ｃ０ｎｅｗ−Ｂｍ）部位を下線で示した。翻訳開始コドンＡＴＧ、および翻訳終止コドンに対応する相補配列ＴＡＡを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、鋳型ＤＮＡとアニーリングする部分の配列を太字で示した。プライマー２２４−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉの場合、後のクローニング用にＰｃｉＩ部位を導入したことで、翻訳開始コドンＡＴＧ直後のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換される。このため、翻訳開始メチオニンの直後のアミノ酸配列がロイシン（Ｌｅｕ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換される。ＬｅｕとＰｈｅは同じ疎水性のアミノ酸であること、この部分はシグナルペプチド領域であることから、この変異によって酵素活性に大きな変化をもたらす可能性は低いと判断した。
続いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。鋳型ＤＮＡは、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を含む上記λＤＮＡを用いた。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、１０× Ｅｘ ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ ４μｌ、プライマー ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ ｔａｑ（タカラバイオ製）０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ASTEK製）を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５０℃ １分、７２℃ ２分を１５回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子でおよそ１．２ｋｂ、そして２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子でおよそ１．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、制限酵素ＰｃｉＩ（New England Biolab社製）とＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子の場合）、または制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の場合）で二重消化した後、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａを用いた。このベクターを同じ制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子を導入する場合）、または制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子を導入する場合）で二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物とTakara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に形質転換した。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析して、インサートの組み込みを確認し、そしてクローンした２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子、ならびにクローンした２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の全塩基配列を確認した。その結果、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子においては、上述のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換が確認されたが、それ以外は塩基配列の変異はなかった。同様に２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の場合は、塩基配列の変異はなく、所望の塩基配列、即ち配列表の配列番号２８のうち、第７３番目の塩基から第１２３０番目の塩基までを含んでいた。
（４）発現誘導と活性測定
参考例１−４と同様に、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子および２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の２クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表１０に示すように、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子および２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の形質転換体の粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。
（４）発現誘導と活性測定
参考例１−４と同様に、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子および２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の２クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表１０に示すように、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子および２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子の形質転換体の粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。
（５）α２，３−シアル酸転移酵素活性の確認
参考例１−４と同様に、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子および２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子をそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルアミノ化ラクトースを糖受容体として用いる反応により、α２，３−シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物をＨＰＬＣにより評価した結果、いずれのクローンを用いた反応についてもピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースのピークが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来のシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
参考例１−６： ビブリオ属細菌ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列解析、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認
参考例１−１でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったビブリオ属 ＪＴ−ＦＡＪ−１６株において、フォトバクテリウム・フォスフォレウム ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。参考例１−４に記載した方法で、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株の菌体ペレットからゲノムＤＮＡを調製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の９２９ｂｐのプローブ（配列番号１７）を用いて、参考例１−４に記載した方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。ただしハイブリダイゼーション温度、および洗浄処理の温度は、５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化で、３．６ｋｂのバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で、７ｋｂのバンドが検出された。即ちＪＴ−ＦＡＪ−１６株にはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
参考例１−４と同様に、２２４−Ｎ０Ｃ０遺伝子および２２４−Ｎ１Ｃ０遺伝子をそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルアミノ化ラクトースを糖受容体として用いる反応により、α２，３−シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物をＨＰＬＣにより評価した結果、いずれのクローンを用いた反応についてもピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースのピークが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来のシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
参考例１−６： ビブリオ属細菌ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列解析、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認
参考例１−１でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったビブリオ属 ＪＴ−ＦＡＪ−１６株において、フォトバクテリウム・フォスフォレウム ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。参考例１−４に記載した方法で、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株の菌体ペレットからゲノムＤＮＡを調製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の９２９ｂｐのプローブ（配列番号１７）を用いて、参考例１−４に記載した方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。ただしハイブリダイゼーション温度、および洗浄処理の温度は、５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化で、３．６ｋｂのバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で、７ｋｂのバンドが検出された。即ちＪＴ−ＦＡＪ−１６株にはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
次に、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行った。参考例１−４に記載した方法で、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のゲノムＤＮＡから、λＤＡＳＨ ＩＩ（Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、ハイブリダイゼーション実験はECL direct labelling & detection system（アマシャムバイオサイエンス製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブを作成した。ハイブリダイゼーションは、キット中のハイブリダイゼーションバッファーにブロッキング試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃で４時間行った。洗浄は、０．４％ＳＤＳ、０．５Ｘ ＳＳＣ中で、５０℃で２０分を２回、２Ｘ ＳＳＣ中で室温、５分を１回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。
次に、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行った。参考例１−４に記載した方法で、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のゲノムＤＮＡから、λＤＡＳＨ ＩＩ（Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、ハイブリダイゼーション実験はECL direct labelling & detection system（アマシャムバイオサイエンス製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブを作成した。ハイブリダイゼーションは、キット中のハイブリダイゼーションバッファーにブロッキング試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃で４時間行った。洗浄は、０．４％ＳＤＳ、０．５Ｘ ＳＳＣ中で、５０℃で２０分を２回、２Ｘ ＳＳＣ中で室温、５分を１回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。
その結果、プラーク精製を兼ねた一次選抜で、１２クローンを得、うち６つのλＤＮＡを、参考例１−４のようにQIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）を用いて精製した。さらにこれらのλＤＮＡサンプル、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株の全ゲノムＤＮＡに関して、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＥＣＬシステムを用いて、上述と同じ条件でサザン分析を行った。その結果、６つ全てのλＤＮＡサンプルとＪＴ−ＦＡＪ−１６株の全ゲノムＤＮＡについて、３．６ｋｂのバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＥｃｏＲＩで消化し、この３．６ｋｂのＤＮＡ断片をゲル精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ部位に常法に従いクローニングした。
次に、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を含むと考えられたＥｃｏＲＩ ３．６ｋｂ断片に関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer製）で、両端の塩基配列を決定した。その結果、片側の端のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列が、データベース検索でフォトバクテリウム・ダムセーラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と２７％の相同性を示した。ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を完全に決定するため、ＥｃｏＲＩ ３．６ｋｂ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、下記の表１１に記載のプライマーを合成し、塩基配列決定に用いた。
得られた塩基配列データからさらに以下の表１２に記載のプライマーを設計、合成し、全塩基配列の決定を行った。
その結果、配列表の配列番号３０の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。最初のＡＴＧの上流には同じ読み枠で翻訳終止コドンが現れるので、これが本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、１２０９塩基からなり、４０２個アミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号３１に示す。ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７を用いて核酸、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子と、それぞれ６９．７％および６８％の相同性を有していた。またアミノ酸配列でも、それぞれ、６４．７％および６４．８％の相同性を示した。さらに、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、フォトバクテリウム・ダムセーラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３０．５％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質 ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２７．３％の相同性を示し、遺伝子ＤＮＡ配列ではそれぞれと、５１．２％、４８．３％という相同性であった。
（３）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の２２アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例においてＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子と表記する）をクローン化するためのプライマーＦＡＪ２３ＳＴＮ０−ＢｓｐＨＩ（配列番号４３）、ＦＡＪ２３ＳＴＣ０−ＢａｍＨＩ（配列番号４５）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例においてＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子と表記する）をクローン化するためのプライマーＦＡＪ２３ＳＴＮ１−ＢｓｐＨＩ（配列番号４４）、ＦＡＪ２３ＳＴＣ０−ＢａｍＨＩ（配列番号４５）を設計、合成した（表１３）。
クローニング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素ＢｓｐＨＩ（ＦＡＪ２３ＳＴＮ０−ＢｓｐＨＩ、ＦＡＪ２３ＳＴＮ１−ＢｓｐＨＩ）、ＢａｍＨＩ（ＦＡＪ２３ＳＴＣ０−ＢａｍＨＩ）部位を下線で示した。翻訳開始コドンＡＴＧ、翻訳終止コドンに対応する相補配列ＴＡＡを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、鋳型ＤＮＡとアニーリングする部分の配列を太字で示した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。鋳型ＤＮＡは、同遺伝子を含む上記３．６ｋｂのＤＮＡ断片を用いた。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ ３００ｎｇ、１０× Ｅｘ ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ ４μｌ、プライマー ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ ｔａｑ（タカラバイオ製） ０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ製）を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５０℃ １分、７２℃ ２分を１０回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．２ｋｂ、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０でおよそ１．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、ＴＡクローニング用ベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Invitrogen製）に、ＴＡクローニングキット（Invitrogen製）に添付された説明書に従って、クローニングした。大腸菌はＴＢ１を使用した。得られたコロニーから常法でプラスミドを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩでＰＣＲ産物のベクターへの導入を確認した。導入の確認されたプラスミドサンプルを、制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで二重消化した後、１．２ｋｂ（ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子）または１．１ｋｂ（ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子）断片をゲル精製した。これらのＤＮＡサンプルを、予め制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで二重消化した大腸菌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａに、Takara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に組み込んだ。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析を行いインサートの組み込みを確認し、クローンされたＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子およびクローンされたＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子の全塩基配列を確認した。ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子については、塩基配列の変異はなく、所望の塩基配列、即ち、配列表の配列番号３０のうち、第１番目の塩基から第１２０９番目の塩基までを含んでいた。また、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子については、塩基配列の変異はなく、所望の塩基配列、即ち、配列表の配列番号３０うち、第６７番目の塩基から第１２０９番目の塩基までを含んでいた。
（４）発現誘導と活性測定
参考例１−４と同様に、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子の２クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表１４に示すように、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子の形質転換体の粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。
参考例１−４と同様に、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子の２クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表１４に示すように、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子の形質転換体の粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。
（５）α２，３−シアル酸転移活性の確認
参考例１−４と同様に、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子をそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルアミノ化ラクトースを糖受容体として用いる反応により、α２，３−シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物をＨＰＬＣにより分析した結果、いずれのクローンを用いた反応においてもピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースのピークが検出された。この結果から、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
実施例1 P. damselae JT0160株由来の糖転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
海洋性微生物であるP. damselae JT0160株から、既に報告されている方法（特許第3062409号）に従ってβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を精製した。酵素の精製純度はSDS-PAGEで確認し、最終精製酵素は電気泳動的に単一のタンパク質であることを確認した。この完全精製した酵素を用いて以下の実験を行った。
参考例１−４と同様に、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０遺伝子、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０遺伝子をそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルアミノ化ラクトースを糖受容体として用いる反応により、α２，３−シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物をＨＰＬＣにより分析した結果、いずれのクローンを用いた反応においてもピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトースのピークが検出された。この結果から、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のシアル酸転移酵素がα２，３−シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
実施例1 P. damselae JT0160株由来の糖転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
海洋性微生物であるP. damselae JT0160株から、既に報告されている方法（特許第3062409号）に従ってβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を精製した。酵素の精製純度はSDS-PAGEで確認し、最終精製酵素は電気泳動的に単一のタンパク質であることを確認した。この完全精製した酵素を用いて以下の実験を行った。
反応溶液20μl中に、糖供与体基質CMP-14C-NeuAc（50.066 nmol、25000cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（1 mmol）、シアル酸転移酵素（0.5mU〜1.5mU）、NaClをそれぞれ0〜2.5M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（30℃、1分）。酵素反応終了後、それぞれの条件においてラクト−スに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出し、各試験区における酵素活性に対するNaClの影響を検討した。
なお具体的には、反応終了後、反応溶液に1.98mlの5mMリン酸緩衝液（pH6.8）を加え、この溶液をAG1-×2Resin（PO4 3‐form、0.2×2cm）カラムに供した。このカラムは、AG1-×2Resin (OH- form)(BIO-RAD社製)を1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（0〜2ml）の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた14C-NeuAc（N-アセチルノイラミン酸）が結合したシアリルラクト−ス及び未反応のラクト−スが含まれるが、未反応のCMP-14C-NeuAcはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じたシアリルラクト−ス由来の14Cの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性から酵素活性を算出することができる。
結果
P. damselae JT0160株由来のシアル酸転移酵素は、酵素反応系中のNaClの存在により、その酵素活性が増加することが認められた。NaClが酵素反応系に0.2Mから１M濃度で存在した場合、NaCl無添加の場合と比較して、その酵素活性はいずれも約1.2倍から1.4倍に向上した（図１）。
実施例2 P. damselae JT0160株由来の糖転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすKClの影響
材料および方法
実施例1と同様にして、P. damselae JT0160株からβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を完全精製し、以下の実験を行った。
結果
P. damselae JT0160株由来のシアル酸転移酵素は、酵素反応系中のNaClの存在により、その酵素活性が増加することが認められた。NaClが酵素反応系に0.2Mから１M濃度で存在した場合、NaCl無添加の場合と比較して、その酵素活性はいずれも約1.2倍から1.4倍に向上した（図１）。
実施例2 P. damselae JT0160株由来の糖転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすKClの影響
材料および方法
実施例1と同様にして、P. damselae JT0160株からβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を完全精製し、以下の実験を行った。
反応溶液に20μl中に、糖供与体基質CMP-14C -NeuAc（50.066 nmol,25000cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（1 mmol）、シアル酸転移酵素（0.5mU〜1.5mU）、KClをそれぞれ0〜１M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（30℃、1分）。酵素反応終了後、それぞれの条件においてラクト−スに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出し、各試験区における酵素活性に対するKClの影響を検討した。なお具体的には、反応終了後、反応溶液に1.98mlの5mMリン酸緩衝液（pH6.8）を加え、この溶液をAG1-×2Resin（PO4 3‐form、0.2×2cm）カラムに供した。このカラムは、AG1-×2Resin (OH- form)(BIO-RAD社製)を1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（0〜2ml）の放射活性を測定した。
結果
酵素反応系中に添加した様々な濃度のKClが、P. damselae JT0160株由来のシアル酸転移酵素活性を向上させることは認められなかった（図２）。
実施例3 P. damselae JT0160株由来の糖転移酵素の酵素活性に及ぼす２価イオンを含む塩類の影響
材料および方法
実施例1と同様にして、P. damselae JT0160株からβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を完全精製し、以下の実験を行った。
結果
酵素反応系中に添加した様々な濃度のKClが、P. damselae JT0160株由来のシアル酸転移酵素活性を向上させることは認められなかった（図２）。
実施例3 P. damselae JT0160株由来の糖転移酵素の酵素活性に及ぼす２価イオンを含む塩類の影響
材料および方法
実施例1と同様にして、P. damselae JT0160株からβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素を完全精製し、以下の実験を行った。
反応溶液20μl中に、糖供与体基質CMP-14C -NeuAc（50.066 nmol、25000cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（1 mmol）、シアル酸転移酵素（0.5mU〜1.5mU）、MgCl2・MgSO4・CoCl2・CaCl2・MnCl2・FeSO4をそれぞれ最終濃度0mM、10ｍM、20ｍMになるように添加し、酵素反応を行った（30℃、1分）。酵素反応終了後、それぞれの条件においてラクト−スに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出し、各試験区における酵素活性に対する各種塩類の影響を検討した。なお具体的には、反応終了後、反応溶液に1.98mlの5mMリン酸緩衝液（pH6.8）を加え、この溶液をAG1-×2Resin（PO4 3‐form、0.2×2cm）カラムに供した。このカラムは、AG1-×2Resin (OH- form)(BIO-RAD社製)を1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（0〜2ml）の放射活性を測定した。
結果
反応溶液中の各種2価イオンを含む塩類が、P. damselae JT0160株由来のα2,6-シアル酸転移酵素活性を向上させることは認められなかった（表１５）。
結果
反応溶液中の各種2価イオンを含む塩類が、P. damselae JT0160株由来のα2,6-シアル酸転移酵素活性を向上させることは認められなかった（表１５）。
実施例4 ラット肝臓由来のシアル酸転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
ラット肝臓由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素（和光純薬製）を使用し、酵素に添付されてきた酵素活性測定法に若干の変更を加えた以下の方法で実験を行った。
材料および方法
ラット肝臓由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素（和光純薬製）を使用し、酵素に添付されてきた酵素活性測定法に若干の変更を加えた以下の方法で実験を行った。
糖供与体基質CMP-14C -NeuAc（50.066 nmol、25000cpm）、糖受容体基質アシアロフェツイン（10mg）、シアル酸転移酵素（1ｍU〜5ｍU）、NaClをそれぞれ0〜1.4M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（37℃、1時間）。酵素反応終了後、反応溶液をSephadex G-50 super fine（アマシャム製）カラム（0.8×20cm）に供し、0.1M NaCl溶液を移動層に用いて、2〜4mlに溶出する反応生成物（アシアロフェツインに14CでラベルされたNeuAcが転移した酵素反応生成物）を含む高分子画分を集めた。なお、この画分には、未反応のCMP-14C -NeuAcは溶出されないことはコントロール実験で反応毎に確認を行った。その画分からアシアロフェツインに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出した。
結果
結果を図３に示す。なお、図３では反応溶液中にＮａＣｌを含まない場合を1とした相対活性で示した。ラット肝臓由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素では、NaClの添加による酵素活性の上昇は認められなかった。
実施例5 Photobacterium. damselaeに属する各種菌株から調製した糖転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素の粗酵素）の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
Photobacterium damselaeに属し、JT0160とは異なる菌株 ATCC33539T及びATCC35083を培養し、得られた菌体からP. damselae JT0160の粗酵素溶液調製方法（Purification and characterization of a Marine bacterial β-Galactoside α2,6-Sialyltransferase from Photobacterium damselae JT0160 J.Biochem. 120, 104-110. 1996）に従って粗酵素溶液を調整した。それらの粗酵素を用いて以下の実験を行った。
結果
結果を図３に示す。なお、図３では反応溶液中にＮａＣｌを含まない場合を1とした相対活性で示した。ラット肝臓由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素では、NaClの添加による酵素活性の上昇は認められなかった。
実施例5 Photobacterium. damselaeに属する各種菌株から調製した糖転移酵素（α2,6-シアル酸転移酵素の粗酵素）の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
Photobacterium damselaeに属し、JT0160とは異なる菌株 ATCC33539T及びATCC35083を培養し、得られた菌体からP. damselae JT0160の粗酵素溶液調製方法（Purification and characterization of a Marine bacterial β-Galactoside α2,6-Sialyltransferase from Photobacterium damselae JT0160 J.Biochem. 120, 104-110. 1996）に従って粗酵素溶液を調整した。それらの粗酵素を用いて以下の実験を行った。
反応溶液20μl中に、糖供与体基質CMP-14C-NeuAc（50.066 nmol、25000cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（1 mmol）、各種菌株由来の糖転移酵素（1mU以下）、NaClをそれぞれ0.5M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（30℃、1分）。酵素反応終了後、それぞれの条件においてラクト−スに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出し、各試験区における酵素活性に対するNaClの影響を検討した。なお具体的には、反応終了後、反応溶液に1.98mlの5mMリン酸緩衝液（pH6.8）を加え、この溶液をAG1-×2Resin（PO4 3‐form、0.2×2cm）カラムに供した。このカラムは、AG1-×2Resin (OH- form)(BIO-RAD社製)を1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（0〜2ml）の放射活性を測定した。
結果
いずれの菌株由来の糖転移酵素についても、0.5M NaClが反応系に存在した場合、酵素活性が向上していた。その程度は菌株によって異なるが、おおよそ1.2から1.3倍程度に酵素活性が上昇した（表１６）。
結果
いずれの菌株由来の糖転移酵素についても、0.5M NaClが反応系に存在した場合、酵素活性が向上していた。その程度は菌株によって異なるが、おおよそ1.2から1.3倍程度に酵素活性が上昇した（表１６）。
実施例６ P. damselae JT0160由来の糖転移酵素（組換えα2,6-シアル酸転移酵素のデリ−ション・ミュータント；Ｎ２Ｃ１）の酵素活性に及ぼすNaClの影響
材料および方法
P. damselae JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素遺伝子のデリーション・ミュータントN2C1を作製し、発現プラスミドに組換え、同発現プラスミドで大腸菌の形質転換を行った。形質転換された大腸菌をL Broth（アンピシリン：最終濃度0.2mg／ml、IPTG：最終濃度1mMを含む）で、30℃、180rpmで12時間培養した後に、遠心分離で菌体を集めた。集めた菌体を20mM Sodium cacodyrate buffer(pH5.0)に懸濁後、4℃で超音波処理を行うことで菌体を破砕して、N2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質を含む粗酵素液を調製した。N2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質は、P. damselae JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素をコードする遺伝子配列から想定されるアミノ酸配列と比較すると、そのアミノ酸配列のN末端側（Met）から107残基のアミノ酸及び、C末端側から176残基のアミノ酸が削除されているが、天然の酵素と実質的に同じ酵素活性を有する。このN2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質を用いて以下の実験を行った。
材料および方法
P. damselae JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素遺伝子のデリーション・ミュータントN2C1を作製し、発現プラスミドに組換え、同発現プラスミドで大腸菌の形質転換を行った。形質転換された大腸菌をL Broth（アンピシリン：最終濃度0.2mg／ml、IPTG：最終濃度1mMを含む）で、30℃、180rpmで12時間培養した後に、遠心分離で菌体を集めた。集めた菌体を20mM Sodium cacodyrate buffer(pH5.0)に懸濁後、4℃で超音波処理を行うことで菌体を破砕して、N2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質を含む粗酵素液を調製した。N2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質は、P. damselae JT0160株由来のβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素をコードする遺伝子配列から想定されるアミノ酸配列と比較すると、そのアミノ酸配列のN末端側（Met）から107残基のアミノ酸及び、C末端側から176残基のアミノ酸が削除されているが、天然の酵素と実質的に同じ酵素活性を有する。このN2C1遺伝子由来のシアル酸転移酵素タンパク質を用いて以下の実験を行った。
反応溶液20μl中に、糖供与体基質CMP-14C-NeuAc（50.066 nmol、25000cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（1 mmol）、N2C1（0.5mU〜1.5mU）、NaClをそれぞれ0〜2.5M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（30℃、1分）。酵素反応終了後、それぞれの条件においてラクト−スに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出し、各試験区における酵素活性に対するNaClの影響を検討した。
なお具体的には、反応終了後、反応溶液に1.98mlの5mMリン酸緩衝液（pH6.8）を加え、この溶液をAG1-×2Resin（PO4 3^form、0.2×2cm）カラムに供した。このカラムは、AG1-×2Resin (OH- form)(BIO-RAD社製)を1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（0〜2ml）の放射活性を測定した。
結果
その結果、反応溶液中に0.2〜１.5MまでのNaClが含まれている場合、NaCl無添加の場合と比較して、酵素活性の活性化が認められた（図4）。
実施例７ ビブリオ科微生物由来の糖転移酵素（組換えα２，３−シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすＮａＣｌの影響
材料および方法
フォトバクテリウム・フォスフォレウム ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株より抽出・精製したα２，３−シアル酸転移酵素（467 native）、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来の組換えα２，３−シアル酸転移酵素（467 N0C0または467 N2C0）、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来の組換えα２，３−シアル酸転移酵素（224 N1C0）、および、ビブリオ属 ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来の組換えα２，３−シアル酸転移酵素（FAJ N1C0）について、これらの酵素活性に及ぼすＮａＣｌの影響を調べた。組換え酵素はいずれも、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示す程度に完全に精製したものを用いた。
結果
その結果、反応溶液中に0.2〜１.5MまでのNaClが含まれている場合、NaCl無添加の場合と比較して、酵素活性の活性化が認められた（図4）。
実施例７ ビブリオ科微生物由来の糖転移酵素（組換えα２，３−シアル酸転移酵素）の酵素活性に及ぼすＮａＣｌの影響
材料および方法
フォトバクテリウム・フォスフォレウム ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株より抽出・精製したα２，３−シアル酸転移酵素（467 native）、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来の組換えα２，３−シアル酸転移酵素（467 N0C0または467 N2C0）、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来の組換えα２，３−シアル酸転移酵素（224 N1C0）、および、ビブリオ属 ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来の組換えα２，３−シアル酸転移酵素（FAJ N1C0）について、これらの酵素活性に及ぼすＮａＣｌの影響を調べた。組換え酵素はいずれも、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示す程度に完全に精製したものを用いた。
467 N2C0、224 N1C0およびFAJ N1C0について、反応溶液３０μl中に、１μｌの１Ｍ カコジレート緩衝液（pH 5.5），糖供与体基質CMP-14C-NeuAc（70.041 nmol、25400cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（2.88 μmol）、シアル酸転移酵素（約2mU）、NaClをそれぞれ0〜2.0M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（25℃、5分）。また、467 nativeおよび467 N0C0について、反応溶液３０μl中に、糖供与体基質CMP-14C-NeuAc（7.041 nmol、25400cpm）、糖受容体基質ラクト−ス（2.88 μmol）、シアル酸転移酵素（約250μU）、NaClをそれぞれ0〜2.0M濃度になるように添加し、酵素反応を行った（25℃、5分）。酵素反応終了後、それぞれの条件においてラクト−スに転移されたNeuAcの放射活性を測定して酵素活性を算出し、各試験区における酵素活性に対するNaClの影響を検討した。
なお具体的には、反応終了後、反応溶液に1.98mlの5mMリン酸緩衝液（pH6.8）を加え、この溶液をAG1-×2Resin（PO4 3‐form、0.2×2cm）カラムに供した。このカラムの溶出液（0〜2ml）の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた14C-NeuAc（N-アセチルノイラミン酸）が結合したシアリルラクト−ス及び未反応のラクト−スが含まれるが、未反応のCMP-14C-NeuAcはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じたシアリルラクト−ス由来の14Cの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性から酵素活性を算出することができる。
結果
467 native、467 N0C0、467 N2C0、224 N1C0、およびFAJ N1C0についての結果は、それぞれ、図５ないし図９に示す。フォトバクテリウム・フォスフォレウム ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、およびビブリオ属 ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のシアル酸転移酵素あるいは組換えシアル酸転移酵素はいずれも、酵素反応系中のNaClの存在により、その酵素活性が増加することが認められた。NaClが酵素反応系に0.2Mから1.5M濃度で存在した場合、NaCl無添加の場合と比較して、その酵素活性はいずれも約1.5倍から2.6倍に向上した。
結果
467 native、467 N0C0、467 N2C0、224 N1C0、およびFAJ N1C0についての結果は、それぞれ、図５ないし図９に示す。フォトバクテリウム・フォスフォレウム ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、およびビブリオ属 ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のシアル酸転移酵素あるいは組換えシアル酸転移酵素はいずれも、酵素反応系中のNaClの存在により、その酵素活性が増加することが認められた。NaClが酵素反応系に0.2Mから1.5M濃度で存在した場合、NaCl無添加の場合と比較して、その酵素活性はいずれも約1.5倍から2.6倍に向上した。
Claims (5)
- フォトバクテリウム（Photobacterium）属またはビブリオ（Vibrio）属に属する海洋性微生物に由来するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を用いて、糖転移反応を行うに際し、当該反応をＮａＣｌの存在下で行うことにより、ＮａＣｌの非存在下に比べて当該反応の効率を高める方法。
- ＮａＣｌを０．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度で存在させる請求項１に記載の方法。
- ＮａＣｌを０．２Ｍ〜１．０Ｍの濃度で存在させる請求項１に記載の方法。
- フォトバクテリウム（Photobacterium）属の海洋性微生物が、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）またはフォトバクテリウム属菌（Photobacterium sp.）であり、またはビブリオ（Vibrio）属の海洋性微生物が、ビブリオ属菌（Vibrio sp.）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素が、配列番号２、配列番号２のアミノ酸２５〜４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸２５〜４０９、配列番号３１、および配列番号３１のアミノ酸２３〜４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
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