JPH10234373A - β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、β−ガラクシド−α２,６−シア
ル酸トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドする新規遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明の遺伝子は、配列番号１のアミノ
酸配列または配列番号１のアミノ酸配列に１若しくは複
数のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ
配列を有し、かつβ−ガラクシド−α２,６−シアル酸
トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るものである。本発明はさらに、該遺伝子を用いた、β
−ガラクシド−α２,６−シアル酸トランスフェラーゼ
タンパク質の発現ベクター、宿主細胞および組換えタン
パク質も提供する。本発明の遺伝子によってコードされ
る酵素のアミノ酸配列は、従来知られているシアル酸転
移酵素のものと相同性は無く、また、膜結合領域も従来
知られている酵素とは異なりＣ末端に存在している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、β−ガラクトシド
−α２,６−シアル酸転移酵素をコードする新規遺伝子
に関する。

【０００２】本発明はさらに、新規シグナルペプチドを
コードする遺伝子に関する。

【０００３】

【従来技術】近年、動物細胞における糖タンパク質、糖
脂質などの複合糖質が有する生物活性が次々と明らかに
され、複合糖質における糖鎖の重要性が認識されつつあ
る。複合糖質の糖鎖の非還元末端に存在することの多い
糖としてシアル酸が挙げられるが、糖鎖の持つ生理機
能、生物学的意識が重要視される中でこのシアル酸はと
りわけ多くの機能を有していると考えられる。しかしな
がら、その化学合成、特にシアル酸をオリゴ糖、複合糖
質糖鎖などの糖鎖に付加する反応は困難であるため、方
法が非常に簡便で、かつ副反応を生じることなく高収率
で合成を可能にする酵素法が注目されている。

【０００４】現在市販されているシアル酸転移酵素は、
ラット、ブタ、ヒト等の動物の顎下腺、肝臓などの臓器
から取得された酵素である（Poulson et al. J.Biol.Ch
em.2 52, 2356-2362 (1977), Weinstein et al. J.Biol.
Chem. 257, 13835-13844(1982), Miyagi et al. Eur.J.
Biochem.126 253-261 (1982)）。これらの動物由来の酵
素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であ
り、さらには酵素としての安定性が悪いという問題を有
している。

【０００５】そこで、本発明者らは大量供給可能なシア
ル酸転移酵素の開発を目的として、まずシアル酸転移酵
素活性を有する細菌の探索を行った結果、目的の活性を
有する海洋性細菌フォトバクテリウム ダムセーラ（Ph
otobacterium damsela）ＪＴ０１６０（以下、本明細書
中「ＪＴ０１６０」と言う）を見いだした。またＪＴ０
１６０の生産するシアル酸転移酵素０１６０（以下、
「ＳＴ０１６０」と言う）を電気泳動的に単一にまで精
製した。さらに、本酵素の結合様式を解析し、ＳＴ０１
６０が糖鎖中の非還元末端に存在するガラクトースの６
位にα２−６結合でシアル酸を転移するβ−ガラクトシ
ド−α２,６−シアル酸転移酵素であることを明らかに
した（特開平８−１５４６７３号公報）。これにより、
ＳＴ０１６０の生産菌であるＪＴ０１６０を培養するこ
とにより、シアル酸転移酵素を大量に生産することが可
能となった。しかしながら、この方法の場合、本酵素が
膜結合型酵素であるために精製の際に界面活性剤を添加
する必要があり、精製酵素溶液に界面活性剤が入ってし
まう等の問題がある。

【０００６】一方、遺伝子工学技術の発展により、所定
のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターで形質転換した組換え大腸菌を用いて、当該タンパ
ク質を大量に発現させることが可能となっている。この
方法をβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素
に応用した場合、上述したような問題を伴わないばかり
でなく、膜結合に関与する配列を欠失した可溶性の酵
素、あるいは、基質特異性を改変した酵素等の天然に存
在しない改変体を産生することも可能となる。さらに、
例えば、Ｔ７プロモーター等の高効率のプロモーターを
用いれば、菌体の可溶性タンパク質の５０％以上が所望
のタンパク質となるような非常に生産性の高い生産系の
構築も可能であると期待される。しかしながら、生育培
地であるマリンブロスで増殖したＪＴ０１６０からは遺
伝子ＤＮＡを抽出することができないという問題があっ
たため、β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵
素をコードする遺伝子は得られていなかった。よって本
発明前は、その必要性が高かったにもかかわらず、β−
ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素を遺伝子工
学的に利用することはできなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、β−ガラク
トシド−α２,６−シアル酸転移酵素をコードする新規
遺伝子を提供することを目的とする。

【０００８】本発明は、また、前記遺伝子を含む、β−
ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質
の発現ベクターを提供すること目的とする。

【０００９】本発明は、さらに、前記発現ベクターを用
いた組換えβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移
酵素タンパク質の製造方法を提供することを目的とす
る。

【００１０】本発明はさらにまた、前記方法を用いて製
造された組換えβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸
転移酵素タンパク質を提供することを目的とする。

【００１１】本発明はまた、新規シグナルペプチドをコ
ードする遺伝子を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
に勤めた結果、ＪＴ０１６０の生育培地として、典型的
に使用されていたマリンブロス２２１６（デフィコ社
製）ではなくニュートリエンスブロス（オキソイド社
製）を用いることにより、ＪＴ０１６０から遺伝子ＤＮ
Ａを抽出することに初めて成功した。さらにこうして抽
出したＤＮＡからＳＴ０１６０タンパク質をコードする
遺伝子（以下、「ｂｓｔ遺伝子」と言う）を単離する試
みも行った。ＳＴ０１６０タンパク質は、一般の宿主細
胞にとって毒性があると思われること等の種々の困難が
あったが、ついにその単離に成功した。当該遺伝子の塩
基配列を決定して、そのアミノ酸配列を推定した結果、
ＳＴ０１６０タンパク質は、後述の配列表において配列
番号１で表されるアミノ酸配列を有することが判明し
た。

【００１３】本発明者は、さらに、得られた遺伝子を含
む発現ベクターを作成し、組み換えＳＴ０１６０タンパ
ク質を発現させることを可能にした。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転
移酵素 本明細書において、“β−ガラクトシド−α２,６−シ
アル酸転移酵素”とは、シチジン１リン酸−シアル酸か
らシアル酸を、複合糖質糖鎖若しくは遊離の糖鎖中のガ
ラクトース残基の６位、又は複合糖質を構成しうる単糖
で６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位に転移させる
活性を有するタンパク質を意味する。限定するわけでは
ないが、本酵素の至適ｐＨは５−６の範囲にあり、至適
温度は３０℃で、分子量はゲル濾過法によると６４,０
００±５,０００である。ここで、複合糖質を構成しう
る単糖で６位の炭素に水酸基を有する単糖とは、例えば
ガラクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサ
ミンマンノース等を意味する。

【００１６】本発明の遺伝子によってコードされるβ−
ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素は、フォト
バクテリウム ダムセーラＪＴ０１６０中に発見され
た。しかしながら、同種の酵素が、フォトバクテリウム
ダムセーラＡＴＣＣ３３５３９およびフォトバクテリ
ウム ダムセーラＡＴＣＣ３５０８３中にも存在するこ
とが判明しており、さらに、同種の酵素を生産する他の
微生物や生物が存在することが予想される。

【００１７】β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転
移酵素遺伝子 本発明により決定されたｂｓｔ遺伝子の塩基配列は、配
列番号２並びに図７および図８にそれがコードする推定
アミノ酸配列とともに示されている。この配列から明ら
かなように、この遺伝子ＤＮＡは塩基番号１から２０２
８の合計２０２８塩基対からなる。塩基番号１から３は
翻訳開始遺伝暗号に相当し、塩基番号２０２６から２０
２８までは翻訳停止遺伝暗号に相当する。この塩基番号
２０２６から２０２８の配列（＊）はＴＡＡであるが、
ＴＧＡまたはＴＡＧでもよい。さらに、図７および８に
記載された構造遺伝子の５'側上流領域には大腸菌のプ
ロモーター領域（−１０領域と−３５領域）とリボソー
ム結合領域（ＳＤ配列）と相同性の高い配列が、また、
本構造遺伝子の３'側下流にはステムアンドループ構造
という典型的なターミネーター領域が各々確認され、こ
れらの領域がｂｓｔ遺伝子の発現制御に関わる領域であ
ると推定される。

【００１８】配列番号１はＳＴ０１６０タンパク質のア
ミノ酸を示したものである。ＳＴ０１６０タンパク質
は、１５個のアミノ酸残基（配列番号１の１−１５）か
らなるシグナル配列、細胞外領域（配列番号１の１６−
４９８）を含む、全長６７５個のアミノ酸残基で構成さ
れる。ｂｓｔ遺伝子から推定されるアミノ酸配列を有す
るタンパク質の分子量は７６.５ｋＤａであり、シグナ
ル配列を除いた分子量でも７４.８ｋＤａである。完全
に精製したＳＴ０１６０タンパク質のＳＤＳ電気泳動上
での分子量は約６１ｋＤａであることから（特開平８−
１５４６７３号公報）、ＳＴ０１６０タンパク質はプロ
セッシングを受けて活性体となるか、または、精製中に
菌体内のプロテアーゼの作用を受けているものと考えら
れる。

【００１９】さらに、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末
端領域（配列番号１の４９７−６７５）は、大腸菌のリ
ン酸輸送システム制御蛋白質と６０％以上という非常に
高い相同性を有する。この領域のうち５３９残基−５９
４残基の部位に、途中で短いターン構造を持つ長い２つ
のαヘリックス構造が存在すると推定される。通常αヘ
リックスは18個のアミノ酸残基で１単位を構成するが、
ＳＴ０１６０タンパク質の場合、その内の一つの面を構
成する４個のアミノ酸残基がすべて疎水性の高いアミノ
酸で構成されるαヘリックスが２単位続いており、さら
にそのＣ末端側にも疎水性の高いアミノ酸残基が片寄っ
た領域が存在している。この領域とＮ末端に存在するシ
グナル配列領域以外には膜と結合する可能性のある領域
は検出されず、したがつて、この部分がＳＴ０１６０の
膜結合領域であると推定される。現在、クローニングさ
れている動物由来のシアル酸転移酵素の膜結合領域はＮ
末端側に存在する膜貫通領域であると考えられているこ
とから、ＳＴ０１６０タンパク質の膜結合様式は動物由
来のシアル酸転移酵素のものとはまったく異なるもので
あると考えられる。

【００２０】このような考察から、本発明はＳＴ０１６
０の膜結合領域および／またはシグナル配列領域の少な
くとも一部を削除したタンパク質も酵素活性を有するこ
とは明らかであり、そのようなタンパク質はそれをコー
ドする遺伝子も含めて本発明の範囲内である。特に、Ｓ
Ｔ０１６０タンパク質の膜結合領域を削除して可溶性に
したβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素
は、本発明の好ましい態様であり、後に詳述する。

【００２１】本発明の遺伝子は下記実施例に記載されて
いるように、例えば、ニュートリエントブロス（オキソ
イド社製）で培養したＪＴ０１６０のゲノムＤＮＡを用
いて作成した遺伝子ライブラリーから、例えばプラーク
ハイブリダイゼーション法を利用して得ることもでき
る。あるいは、本発明により決定されたＤＮＡの塩基配
列に基づいて、微生物等由来の遺伝子ライブラリーを鋳
型とするＰＣＲ法により容易に調製することもできる。
このように調製したβ−ガラクトシド−α２,６−シア
ル酸転移酵素遺伝子は、次に述べる方法により変異体に
調製することもできる。

【００２２】１つのアミノ酸をコードするコドンは複数
存在する。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列
またはその酵素活性部分をコードするいずれのＤＮＡも
本発明の範囲に含まれる。

【００２３】さらに、一般に生理活性を有するペプチド
のアミノ酸配列が多少変更された場合、即ち、該アミノ
酸配列の中の１又は複数のアミノ酸が置換され若しくは
欠失し、または１又は複数のアミノ酸が付加された場合
でも該ペプチドの生理活性が維持される場合があること
は周知の事実である。例えば、変異体は保存的に置換さ
れた配列を含んでいてもよく、これは、特定のアミノ酸
残基が類似の物理化学的特徴を有する残基によって置き
換えられていてもよいことを意味している。保存的置換
の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌ
ａ相互の置換の如き脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置
換、又はＬｙｓとＡｒｇ間の如き極性基含有アミノ酸残
基の間の置換が含まれる。したがって、配列番号１で示
されるアミノ酸配列またはその酵素活性部分において、
このような修飾が加えられ、かつβ−ガラクトシド−α
２,６−シアル酸転移酵素の生物活性を有するβ−ガラ
クトシド−α２,６−シアル酸転移酵素の変異体も本発
明の範囲内である。さらに、当該変異体タンパク質をコ
ードするＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。

【００２４】アミノ酸の付加、欠失または置換による変
異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知
技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid
Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）
を施すことにより作成できる。本明細書において「１又
は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により
付加、欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味
する。

【００２５】部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の
変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本
鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮ
Ａで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培
養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞
からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には
５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファー
ジを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所
望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイ
ブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダ
イズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ
処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせ
る。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾
い、培養しＤＮＡを回収する。

【００２６】尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ
酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ
酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の
部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理す
る方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌ
クレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する
方法もある。

【００２７】さらに、本発明の範囲内に入る塩基配列に
は、温和な又は苛酷なストリンジェンシーの条件下で本
明細書に開示したβ−ガラクトシド−α２,６−シアル
酸転移酵素塩基配列にハイブリダイズし、かつ生物学的
に活性なβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵
素をコードする単離されたＤＮＡ及びＲＮＡも含まれ
る。温和なストリンジェンシーによるハイブリダイゼー
ションの条件は、例えば、Sambrookら, Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, pp. 1. 101-
104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)に
記載された条件を意味する。Sambrookらにより定義され
ているように、温和なストリンジェンシーの条件には、
５×ＳＳＣ，0.５％ＳＤＳ，1.０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ
８.０）の前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩
のハイブリダイゼーション条件の使用が含まれる。苛酷
なストリンジェンシーの条件には、より高温のハイブリ
ダイゼーションと洗浄が含まれる。その際、プローブの
長さ等の各種要因に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度は
適宜調節される。好ましくは、５×ＳＳＣ以下で２０℃
以上の範囲の条件が好ましい。

【００２８】組換えβ−ガラクトシド−α２,６−シア
ル酸転移酵素の製造 本発明はβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵
素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、並びにこれ
ら発現ベクターを含有する宿主細胞を前記遺伝子の発現
に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク
質を回収することにより組換えβ−ガラクトシド−α
２,６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も
提供する。

【００２９】本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２,
６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造するためには、
使用する宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、哺
乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子等から誘導
された、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に連
結したβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素
遺伝子配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロ
モーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡ
リボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結
を制御する適切な配列が挙げられる。

【００３０】β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転
移酵素タンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細
胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵
母、及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング
及び発現ベクターは、例えば、Pouwels ら, Cloning Ve
ctors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York,(19
85)に記載されている。

【００３１】原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性
菌、例えば、大腸菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のよ
うな原核細胞を宿主として使用する場合、β−ガラクト
シド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質は、原核
細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするため
にＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。この
Ｎ末端Ｍｅｔは、発現後に組換えβ−ガラクトシド−α
２,６−シアル酸転移酵素タンパク質から切り離すこと
ができる。

【００３２】原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、
一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を
含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生
物質耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺
伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例に
は、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販の
プラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれ
る。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を
同定するのが簡単である。適切なプロモーター並びにβ
−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素遺伝子の
ＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入され
る。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−
３（スェーデン、ウプサラの Pharmacia Fine Chemical
s）及びｐＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、マジソ
ンの Promega Biotec）が含まれる。

【００３３】原核宿主細胞用の発現ベクターに普通に用
いられるプロモーター配列には、ｔａｃプロモーター、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロ
モーター（Chang ら,Nature 275:615, 1978；及び Goed
delら, Nature 281:544, 1979）等が含まれる。特に有
用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰ_Lプロモータ
ー及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用い
る。λＰ_Lプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手で
きるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２
（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存す
る）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＰ１（ＡＴＣＣ５３０
８２）内に存する）が含まれる。

【００３４】ｂｓｔ遺伝子の場合は、後述するように、
本遺伝子全体を含む約２.８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断
片が挿入されたプラスミドを有する大腸菌を得ることが
できず、約１.６ｋｂと約１.２ｋｂの２つのＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片としてクローニングされたことから、本遺伝子
から生産するタンパク質が大腸菌にとって致死的である
可能性がある。よって、本遺伝子を発現させる場合、制
御可能なプロモーターを使用し、宿主が十分に増殖して
からｂｓｔ遺伝子の発現が生じさせることが好ましい。
制御可能なプロモーターの典型的な例はｔａｃプロモー
ターであるが、これに限定されるものではない。さら
に、本発明者はｔａｃプロモーターをｂｓｔ遺伝子の翻
訳開始コドンに対して、少し離れた位置に存在させるこ
とにより（例えば数塩基分）、発現の制御が弱くなるこ
とも見いだしている。プロモーターと翻訳開始コドンの
間の距離を適宜変化させることは慣用手段により行うこ
とができる。

【００３５】また、組換えβ−ガラクトシド−α２,６
−シアル酸転移酵素タンパク質を酵母宿主細胞内で発現
させてもよい。好ましくはサッカロミセス属（例えば、
Ｓ．セレビシエ）を用いるが、ピキア (Pichia) 又はク
ルイベロミセス (Kluyveromyces)の如き他の酵母の属を
用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドか
らの複製起点の配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモ
ーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結の
ための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有する
ことが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、組換え
β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパ
ク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主からの組
換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリー
ダー配列も知られている。酵母を形質転換する方法は、
例えば Hinnenら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75:192
9, 1978に記載されている。

【００３６】哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用い
て、組換えβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移
酵素タンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源
の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞
発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィル
スゲノムから得ることができる。普通に用いられるプロ
モーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィ
ルス、アデノウィルス２等から誘導される。ＳＶ４０ウ
ィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プ
ロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリ
アデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺
乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他
の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用
いるための発現ベクターは、例えば Okayama及び Berg
（Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983）の方法で構築するこ
とができる。

【００３７】本発明のβ−ガラクトシド−α２,６−シ
アル酸転移酵素タンパク質を産生する１つの方法は、β
−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転
換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で
培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じてβ
−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク
質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。組換えβ−
ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質
を精製する操作は、用いた宿主細胞の型及び本発明のタ
ンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかといった要
因に従って適宜選択されるであろう。

【００３８】可溶性のβ−ガラクトシド−α２,６−シ
アル酸転移酵素 さらに、本発明は一つの態様において、可溶性β−ガラ
クトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質、お
よび当該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。可
溶性β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タ
ンパク質は、天然のβ−ガラクトシド−α２,６−シア
ル酸転移酵素タンパク質の細胞外ドメインの全部又は一
部を含むが、そのポリペプチドを細胞膜上に停留させる
膜結合領域を欠くものである。例えば、前述したＳＴ０
１６０タンパク質の場合、アミノ酸残基４９９−６７５
の一部または全部を削除して可溶性にすることができ
る。また、可溶性β−ガラクトシド−α２,６−シアル
酸転移酵素タンパク質は、合成された当初は分泌を促進
するために天然のまたは異種起源のシグナルペプチドを
含んでもよいが、このシグナルペプチドは細胞からβ−
ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質
が分泌されるとすぐに切り離される。膜結合領域および
／またはシグナルペプチド領域の全部または一部のいず
れが削除された可溶性タンパク質であっても、β−ガラ
クトシド−α２,６−シアル酸転移酵素活性を保持する
限り、本発明に含まれる。すなわち、可溶性β−ガラク
トシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質は、当
該タンパク質が分泌されることを条件として、膜結合領
域の一部又は細胞質領域の一部または他の配列を含んで
もよい。可溶性組換えタンパク質を宿主細胞で発現させ
る場合、可溶性タンパク質は細胞膜に結合しないので、
精製が容易となる。また、当該タンパク質を分泌させる
シグナルペプチドは、宿主由来あるいは、異種起源のも
のでもよい。配列番号１の１−１５のアミノ酸配列は、
より好ましいシグナルペプチドの１つである。

【００３９】可溶性タンパク質を含む、短縮形のβ−ガ
ラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素タンパク質
は、所望の慣用的技術を用いて調製することができる。
例えば、配列番号２の完全長クローン化ＤＮＡ断片を制
限エンドヌクレアーゼによって消化して短縮形のＤＮＡ
断片を作成し、アガロースゲルでの電気泳動によって単
離することができる。このとき、制限エンドヌクレアー
ゼによる消化は、天然に存在する開裂部位において行っ
てもよく、予め所定の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
を有するリンカーをつないだ配列番号２のＤＮＡ断片に
対して行ってもよい。こうして単離された、所定の短縮
型タンパク質断片をコードするＤＮＡ配列は、周知のポ
リメラーゼ連鎖反応を用いて増幅することができる。別
の方法として、既知の突然変異誘発法を用いて所定の位
置に、例えば細胞外領域の最後のアミノ酸のコドンのす
ぐ下流に、停止コドンを挿入してもよい。

【００４０】さらに別の方法では、酵素処理（例えば、
Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼ）を用いてＤＮＡ断片か
ら末端ヌクレオチドを削除して所望の特定の末端を有す
る断片に置き換えることもできる。その場合使用するリ
ンカーとしては、市販品として、Ｂａｌ３１消化により
生成する平滑末端に連結することができ、かつ、制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位を含有するものがある。

【００４１】あるいは、組換えタンパク質の所定の点に
Ｎ末端又はＣ末端を再構築するようなオリゴヌクレオチ
ドを合成して、ＤＮＡ断片に結合させることもできる。
このオリゴヌクレオチドは、遺伝子操作の便宜のためコ
ード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有
してもよく、また、特定の宿主での発現のためＮ末端に
開始コドン（ＡＴＧ）が存在してもよい。

【００４２】可溶性タンパク質は、得られた遺伝子によ
り形質転換した宿主細胞を培養してその上澄液精製して
得ることができるが、収率を高めるためには、菌体を破
壊することが望ましい。

【００４３】以下の実施例は、本発明の特定の態様を説
明するために示したものであって、本発明の技術的範囲
を限定するものではない。

【００４４】

【実施例】以下の実施例の各工程では以下のような方法
を採用した。

【００４５】ペプチドのアミノ酸配列の解析 プロテインシーケンサー：Model 476A（パーキンエルマ
ー社製）を用いて、得られたペプチドのアミノ酸配列を
解析した。

【００４６】プローブの合成 プローブは、所定のアミノ酸配列の内、対応するコドン
の少ないアミノ酸を多く含む領域を選定し、そのアミノ
酸配列から推定される塩基配列を基に作製した。なお、
合成は日本バイオサービスに依頼した。

【００４７】ＪＴ０１６０の遺伝子ライブラリーの作製 ＪＴ０１６０をニュートリエントブロス（オキソイド社
製）で３０℃、１６時間培養した。培養液を遠心分離
（４℃・１０分間・８,０００ｒｐｍ）し、得られた３ｇ
の菌体から Saito-Miura法（Preparetion of transform
ing deoxyribonucleic acid by Phenol treatment. Bi
ochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963)）に従いゲ
ノムＤＮＡを精製した。精製したゲノムＤＮＡ５０μｇ
をＳａｕ３ＡＩで部分消化し、得られた遺伝子断片をλ
DASH II/BamHI Vetor Kit（ストラタジーン社製）に連
結した。これを、GigapakII Packging Extracts（スト
ラタジーン社製）を用いてパッケージングして遺伝子ラ
イブラリーを調製した。

【００４８】遺伝子ライブラリーの増幅 調製した遺伝子ライブラリーを増幅するために宿主とし
てEschrchia coli XL-1 Blue MRA（P2）を用い、ＬＢ培
地で３７℃、１５０ｒｐｍで一晩培養した。培養終了
後、培養液を１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液でＯ.Ｄ.₆₆₀
が０.５となるように希釈した。この希釈液６００μｌ
に上記の通り調製した遺伝子ライブラリーを１０μｌ加
え、３７℃で１５分間振とうした。これに予め４８℃に
保温したLB-トップアガロース１０mlを加えて撹拌した
後に、予め３７℃に保温したＬＢ−プレートに重層し
た。これを室温で固めた後に、３７℃で８時間培養し
た。重層したLB-トップアガロース上の宿主が完全に溶
菌した後に、５ｍｌのＳＭ緩衝液を加え15分間放置した
後に、トップアガロースをＳＭ緩衝液と共にスパーテル
で回収した。得られたトップアガロースを遠心分離（４
℃・１０分間・８,０００ｒｐｍ）し、その遠心上清を
増幅遺伝子ライブラリーとした。

【００４９】プローブの蛍光標識 合成したプローブを、３'-オリゴラベリングキット（ア
マシャム社製）を用いて蛍光標識した。

【００５０】ハイブリダイゼーション サザンハイブリダイゼーション用のアガロースゲルのレ
プリカは以下の方法で調製した。

【００５１】制限酵素で消化したＤＮＡをＴＡＥ緩衝液
を用いた０.８％アガロースゲルで電気泳動した。泳動
後、アガロースゲルを変性溶液（０.５ＭＮａＯＨ、 １.
５ＭＮａＣｌ）中に１５分間浸し、ゲル中のＤＮＡをア
ルカリ変性させた。次に、このゲルを中和溶液（０.５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１.５ＭＮａＣｌ）に
５分間浸し、アルカリを中和した。このゲルをゲルと同
じ大きさに切ったＨｙｂｏｎｄＮ⁺ではさみ、さらにキ
ムタオルではさんで室温で放置してＨｙｂｏｎｄＮ⁺に
ＤＮＡを転写し、ゲルのレプリカを調製した。得られた
レプリカを２×ＳＳＣ緩衝液で洗浄し、濾紙上、室温で
乾燥するまで放置した。乾燥終了後、レプリカを８０℃
で２時間ベーキングした。

【００５２】コロニーハイブリダイゼーション、および
プラークハイブリダイゼーション用のコロニー、および
プラークのレプリカは以下の方法で調製した。

【００５３】適度な頻度でコロニーまたはプラークを形
成させたプレート上に、プレートと同じ大きさに切った
ＨｙｂｏｎｄＮ⁺を乗せて、コロニーまたはプラークを
写し取り、レプリカを作製した。なお、レプリカ後のマ
スタープレートは４℃で保存した。作製したレプリカを
変性溶液（０.５ＭＮａＯＨ、１.５ＭＮａＣｌ）に浸し
た濾紙上に５分間放置して、コロニー、もしくはファー
ジをアルカリ変性させた。このレプリカを中和溶液
（０.５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、 １.５ＭＮａ
Ｃｌ）に浸した濾紙上に３分間放置して中和し、さらに
２×ＳＳＣ緩衝液で洗浄した。処理したレプリカを濾紙
上、室温で乾燥するまで放置した。乾燥終了後、レプリ
カを８０℃で２時間ベーキングした。

【００５４】ハイブリダイゼーションは、３’オリゴラ
ベリングキット（アムシャム社製）のマニュアルに従
い、以下の方法で行なった。

【００５５】レプリカをハイブリバッグに入れ、このバ
ッグに３０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を入れて
恒温水槽中で４３℃、１時間振とうし、平衡化した。次
に、この溶液に蛍光ラベルしたプローブを１０ｎｇ／ｍ
ｌとなるように加え、さらに恒温水槽中で４３℃、３時
間振とうし、アニーリングした。以下の操作はバット内
で行なった。アニーリング終了後、レプリカを０.１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５×ＳＳＣで５分間、室
温で洗浄した。この操作は２回繰り返した。引続き０.
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１×ＳＳＣで１５分
間、４３℃で洗浄した。この操作も２回繰り返した。洗
浄操作終了後、レプリカを緩衝液１（０.１ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、 １.５ＭＮａＣｌ）で１分間、さ
らに洗浄した。次に、ブロッキング溶液にレプリカを浸
し、室温で３０分間振とうし、ブロッキングした。ブロ
ッキング終了後、緩衝液１で１分間洗浄した。洗浄後、
抗体溶液に浸し、室温で30分間振とうし、抗体を結合さ
せた。次に、これを緩衝液２（０.１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ(ｐＨ７.５)、 ０.４ＭＮａＣｌ）で５分間洗浄した。
この操作は４回繰り返した。洗浄終了後、ディテクショ
ン溶液を加えて１分間振とうし、蛍光を発色させた。こ
のレプリカをキムタオルにはさみ、かるく水分を除き、
フィルムカセットに置いた。その上にサランラップを置
いてさらにその上にＸ線フィルムをのせて１５分間放置
して感光した。Ｘ線フィルムは富士メディカルフィルム
プロセサー（富士フィルム社製）で現像した。

【００５６】ｂｓｔ遺伝子断片を含むファージの単離 目的とするプラークをプレートから単離してＳＭ緩衝液
（５０μｌ）に懸濁し、４℃で保存した。ＳＭ緩衝液で
抽出したファージは、前述した遺伝子ライブラリーの増
幅方法に従って増幅した。

【００５７】ファージＤＮＡの精製 増幅したファージ溶液から、ファージＤＮＡをλ−プレ
ップＤＮＡ精製キット（プロメガ社製）を用いて、以下
の方法で精製した。

【００５８】増幅したファージ溶液１０ｍｌに、ヌクレ
アーゼミックス４０μｌを加えて撹拌した後に、３７℃
で１５分間放置し、溶液中の核酸を分解した。これにフ
ァージ沈澱剤4mlを加えて氷中に３０分間放置し、ファ
ージ粒子を沈殿させた。生成した沈殿を遠心分離（１
０,０００ｒｐｍ・１０分間・４℃）で回収し、５００μ
ｌのファージ緩衝液を加えて懸濁した。さらに、これを
遠心分離（１５,０００ｒｐｍ・５分間・４℃）して不
溶解物を除去した。得られた遠心上清に１ｍｌのＤＮＡ
精製溶液を加え、ファージ粒子を構成する蛋白質を変性
させてファージＤＮＡを抽出すると同時にＤＮＡ精製溶
液中に抽出されたＤＮＡをレジンに吸着させた。この溶
液をシリンジでＤＮＡ精製用カラムに添加し、レジンの
みをカラムにつめた。このカラムを２ｍｌの８０％イソ
プロピルアルコールで洗浄した後に遠心（１２,０００
ｒｐｍ・２０秒間・４℃）してカラム中のレジンを乾燥
した。このカラムに、８０℃に保温したTE緩衝液を１０
０μｌ加えて遠心（１２,０００ｒｐｍ・２０秒間・４
℃）し、レジンからファージＤＮＡを溶出した。

【００５９】遺伝子断片のベクターへの挿入 ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１時間切断し
た。次に、これを６５℃、１時間、バクテリアルアルカ
リフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理し、これをエタノー
ル沈澱した。得られた沈澱を７０％エタノールで洗浄
し、スピードバックで乾燥してエタノールを除き、滅菌
水に溶解した。

【００６０】ファージＤＮＡ（５μｇ）をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動を行なった。電気
泳動後、サザンハイブリダイゼーションでプローブとハ
イブリダイズする目的の遺伝子断片を含むゲル断片を切
り出した。切り出したゲル断片からジーン−クリーン
（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、エタノール
沈澱した。得られた沈澱を７０％エタノールで洗浄し、
スピードバックで乾燥してエタノールを除き、１０μlの
滅菌水に溶解した。

【００６１】切り出したＤＮＡ（９μｌ）と、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化後ＢＡＰ処理したｐＵＣ１９（１μｌ）を
混合し、タカラライゲーションキット溶液Ｉ（１０μ
ｌ）を加え撹拌後、１６℃で一晩反応した。

【００６２】形質転換 E. coli MV1184の形質転換は以下の方法で行なった。

【００６３】−８０℃で保存したE.coli MV1184コンピ
テント細胞（１００μｌ）を氷中で溶かし、これにプラ
スミドＤＮＡ（１０μｌ）を添加し、30分間氷中で放置
した。これを42℃で１分間処理し、その後３分間氷中に
放置した。これに、３７℃に保温したＬＢ培地を９００
μｌ添加し、１時間、３７℃で振とうした。振とう終了後、
本溶液を、ＬＢ−アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌ
寒天培地に塗布し、３７℃、１６時間培養した。

【００６４】プラスミドＤＮＡの調製 目的とするコロニーを寒天培地から釣菌し、ＬＢ−アン
ピシリン液体培地に植菌して3７℃、１6時間振とう培養
した。培養終了後、培養液を遠心分離（１５,０００ｒ
ｐｍ・１０分間・４℃）し、菌体を回収した。得られた
菌体からQIAGENミニプレパレーションキットを用いてプ
ラスミドＤＮＡを精製した。

【００６５】ＤＮＡ塩基配列の解析 ＡＬＦredＤＮＡシークエンサーを用いて、プラスミ
ド、およびファージに挿入された遺伝子断片の塩基配列
を解析した。プラスミドの場合、塩基配列解析用サンプ
ルは、ｃｙ５オートリードシークエンシングキット（フ
ァルマシア社製）に添付されているプロトコールに従っ
て調製した。また、その塩基配列の解析は、オートリー
ドシークエンシングキットを用いて行なった。ファージ
の場合、塩基配列解析用サンプルは、オートサイクルシ
ークエンシングキット（ファルマシア社製）に添付され
ているプロトコールに従って調製した。また、その塩基
配列はオートサイクルシークエンシングキットを用いて
行なった。

【００６６】塩基配列解析のための電気泳動用ゲルに
は、０.５mmロングレンジャーゲルを用いた。電気泳動
は、シークエンサーに添付されてきた０.５mmロングレ
ンジャーゲル用の電気泳動条件で行なった。

【００６７】寄託 フォトバクテリウムダムセーラＪＴ０１６０は、平成６
年１１月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭＢＰ−４９００として寄託されている。

【００６８】実施例１ ｂｓｔ遺伝子の単離 ＳＴ０１６０タンパク質のアミノ酸配列を解析し、これ
に基に作製したプローブを用いてＪＴ０１６０遺伝子ラ
イブラリーを探査し、ｂｓｔ遺伝子をクローニングし
た。

【００６９】Ｉ．ｂｓｔ遺伝子の５'末端側断片の単離 ａ．ＳＴ０１６０タンパク質のトリプシン消化 完全精製したＳＴ０１６０:５μｇ（１ｍｌ）をシリコ
ン処理した１.５ｍｌ容チューブに分取し、１００％Ｔ
ＣＡ溶液１５０μｌを加えた。これを、２０分間氷上で
放置して酵素を沈殿した後に、遠心分離（４℃・１５分
間・１５,０００ｒｐｍ）して沈殿を回収した。得られ
た沈殿を冷アセトンで２回洗浄し、これをスピードバッ
クで乾燥した。これに８Ｍ尿素＋０.４Ｍ重炭酸アンモ
ニウム溶液２５μｌを加え、さらに４５ｍＭジチオスレ
イトール溶液２.５μｌを加えて５０℃で１５分間保温
して蛋白質中のジスルフィド結合を切断した。次に、溶
液を室温に戻し、１００ｍＭヨードアセトアミド溶液２.
５μｌを加え、室温で１５分間放置して切断したＳＨ基
を修飾した。これに超純水７０μｌと塩化カルシウムが
最終濃度５ｍＭとなる様に加え、５Ｕのトリプシンを含
むトリプシン溶液１０μｌを加えて３７℃、２４時間放
置し、トリプシン消化反応を行なった。

【００７０】ｂ．ペプチドの分離 ＳＴ０１６０をトリプシンで消化して得られたペプチド
を以下の方法で分取した。

【００７１】ペプチド分離システムとして、Ｓｍａｒｔ
Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア製）を用いた。ペプチド分
離用カラムはμＲＰＣＣ₂／Ｃ₁₈ＳＣ２.１／１０（ファ
ルマシア製）を用いた。カラムにＳＴ０１６０トリプシ
ン消化溶液を添加後、溶液１（０.０６％ＴＦＡ、２％
アセトニトリル）と溶液２（０.０５２％ＴＦＡ、１０
０％アセトニトリル）を用いて、溶液１：１００％から
開始し、１８０分で最終的に溶液２が５０％となる様な
濃度勾配でペプチドを溶出し、分取した。

【００７２】ｃ．ＳＴ０１６０タンパク質のアミノ酸配
列の分析 ＳＴ０１６０のＮ末端アミノ酸配列と、本酵素をトリプ
シン分解して得られたペプチドのアミノ酸配列、すなわ
ち本酵素の内部のアミノ酸配列と推定される９個の配
列、計１０個のＳＴ０１６０の部分アミノ酸配列を明ら
かにした。得られたアミノ酸配列を、以下の表１に示
す。

【００７３】

【表１】 (a) ＸＮＳＤＮＴＳＬＫＥＴＶＳＳＸＸＡＸＶ （Ｎ末端配列） (b) ＤＹＬＧＳＳＡＫＫ （内部配列） (c) ＦＶＳＷＫＩＶＮ （内部配列） (d) ＡＮＹＬＡＧＴＳＰＤＡＰＫ （内部配列） (e) ＥＴＶＸＸＮＳＡＶＶＶＥＴＥＴＹ （内部配列） (f) ＹＮＷＨＫ （内部配列） (g) ＱＡＩＳＦＤＦＶＡＰＥＬＫ （内部配列） (h) ＱＬＩＨＩＩＱＡＫ （内部配列）

【００７４】なお、Ｎ末端アミノ酸配列の解析結果によ
ると、Ｎ末端のアミノ酸残基は解析不能であり、この残
基が修飾を受けている、もしくはＣｙｓ残基である可能
性が考えられた。

【００７５】ｄ．プローブの合成 得られたアミノ酸配列の内、配列(d) （配列番号１のア
ミノ酸残基２５８−２７０に相当）に対応するように、
以下の配列：

【化１】 ５'−GCIAAITAIITIGCIGGIACIIIICCIGAIGCICCIAA−３' （配列番号３） を有するプローブＡを作製した。なお、Ｉはイノシンで
あり、アデニン、ウラシルおよびシトシンを認識して対
合を形成することが可能である。

【００７６】ｅ．ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼ
ーション Ｐ. ｄａｍｓｅｌａ ＪＴ０１６０のゲノムＤＮＡをＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化したものを対象として、ｄで作製し
たプローブＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを
行なった。その結果、約２.８ｋｂｐのＤＮＡ断片が強
くハイブリダイズした。そこで、ゲノムＤＮＡをＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行ない、
２.８ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むゲル断片を切り出し、
この断片からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡとＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化後ＢＡＰ処理したｐＵＣ１９とを結合
した。得られたプラスミドでＥ.ｃｏｌｉＭＶ１１８４
を形質転換した。生じたコロニーのコロニーハイブリダ
イゼーションを行なったが、意外なことにプローブＡと
ハイブリダイズするコロニーは得られなかった。

【００７７】ｆ．ｂｓｔ遺伝子断片を含むと考えられる
ファージの単離 上記ｄのコロニーハイブリダイゼーションでは目的とす
るコロニーが得られなかったため、次に、Ｐ. ｄａｍｓ
ｅｌａ ＪＴ０１６０のゲノムＤＮＡの遺伝子ライブラ
リーを対象としてプローブを用いてプラークハイブリダ
イゼーションを行なった。その結果、ｂｓｔ遺伝子断片
を含むと考えられるファージが７株得られた。これらの
ファージをそれぞれ増幅してファージＤＮＡを調製し、
得られたファージＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化したも
のを対象として、プローブＡを用いてサザンハイブリダ
イゼーションを行なった結果、すべてのファージで約
１.６ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が非常に強くハイブ
リダイズした。

【００７８】ｇ．サブクローニング ７株のファージから１株を選定し、そのファージＤＮＡ
５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、アガロースゲル電
気泳動を行なった。電気泳動後、アガロースゲル中の約
１.６ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むゲル断片を切り出し、
このゲル断片からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ
と、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後ＢＡＰ処理したｐＵＣ１９
とを結合した。得られたプラスミドでＥ.ｃｏｌｉＭＶ
１１８４を形質転換した。生じたコロニーのコロニーハ
イブリダイゼーションをプローブＡを用いて行なった結
果、強くハイブリダイズする３コロニーを得た。この３
株をそれぞれ寒天培地から釣菌し、ＬＢ−アンピシリン
液体培地に植菌して３７℃で１６時間振とう培養した。
得られた培養液から菌体を遠心分離によって回収し、そ
の菌体からプラスミドＤＮＡの調製を行なった。得られ
たプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロ
ースゲル電気泳動を行なった。その結果、いずれの株か
ら精製したプラスミドにも約１.６ｋｂｐのＤＮＡ断片
が挿入されていることが確認できた。また、この電気泳
動したゲルのサザンハイブリダイゼーションをプローブ
Ａを用いて行なった結果、この約１.６ｋｂｐのＤＮＡ
断片は強くハイブリダイズした。以上の結果から、これ
らのプラスミドに挿入された約１.６ｋｂｐのＤＮＡ断
片にｂｓｔ遺伝子断片が含まれると考えられた。

【００７９】ｈ．ｂｓｔ遺伝子の５'末端側断片の塩基
配列の解析 上記ｇで得られたプラスミドに挿入されている約１.６
ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、ＡＬＦｒｅｄＤＮＡ
シークエンサーを用いて解析した（図７および８の塩基
配列マイナス３６１から１２４４）。得られた塩基配列
をアミノ酸配列に翻訳したところ、片方のＨｉｎｄＩＩ
Ｉから数えて３９６番目以降のＡＴＧ（Ｍｅｔ残基）か
ら始まり、もう片方のＨｉｎｄＩＩＩ以降まで続く、４
１４個のアミノ酸残基からなる長いオープン・リーディ
ング・フレーム（ＯＲＦ）が存在していた。このＯＲＦ
のアミノ酸配列と、ｃで得られたＳＴ０１６０のアミノ
酸配列と比較したところ、Ｎ末端アミノ酸配列を含む８
個のアミノ酸配列が確認できた。

【００８０】以上の結果から、得られたＯＲＦがｂｓｔ
遺伝子の５'末端側であると考えられ、このプラスミド
をｐＢＳＴＮと命名した。

【００８１】なお、ＳＴ０１６０の分子量が６０ｋＤａ
であることから、ＳＴ０１６０タンパク質のＣ末端側の
少なくとも２００アミノ酸残基をコードする、ｂｓｔ遺
伝子３’末端側断片をさらにクローニングする必要が有
ると考えられた。

【００８２】なお、ＳＴ０１６０のＮ末端アミノ酸配列
の２番目のＡｓｎ残基から始まる配列は得られたＯＲＦ
の１７番目からの配列と一致しており、ｃで推定した様
にＳＴ０１６０のＮ末端アミノ酸配列はＣｙｓ残基から
始まることが明らかとなった。また、得られたＯＲＦの
疎水性・親水性を解析したところ、本ＯＲＦのＮ末端側
には疎水性の非常に高い領域が存在していた。さらに、
このＯＲＦの始めのＭｅｔ残基の直後には正電荷を持つ
Ｌｙｓ残基が２残基存在していた。これは典型的なシグ
ナル配列の構造であったことから、このＭｅｔ残基から
１６番目のＣｙｓ残基の前までの１５個のアミノ酸残基
からなる配列がＳＴ０１６０のシグナル配列であると推
定された。

【００８３】ＩＩ．ｂｓｔ遺伝子の３'末端側断片の単
離 ａ．ｂｓｔ遺伝子の３’側下流の塩基配列の決定 ｐＢＳＴＮに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を基に、
以下の塩基配列：

【化２】 ５'−GGGGGGGAAACGAAAGAGTATTATG−３' （配列番号４） （配列番号２の塩基配列１０８７−１１１１） ５'−ATTTTTCAAGGGGCATCCTGCTGG−３' （配列番号５） （配列番号２の塩基配列１１８８−１２１１） を有する２種類のシークエンス用プライマーを作製し
た。これらのプライマーを用い、Ｉ．ｆで得られたｂｓ
ｔ遺伝子断片を含むと考えられたファージＤＮＡのシー
クエンシングを行った。その結果、ｐＢＳＴＮのＨｉｎ
ｄＩＩＩの３'側下流の約１５０ｂｐまでの塩基配列を
決定することができた。

【００８４】ｂ．ｂｓｔ遺伝子の３'末端側断片のクロ
ーニング 得られた塩基配列を基にさらに、以下の塩基配列：

【化３】 ５'−AAGATTTCATTTGAGGT−３’ （配列番号６） （配列番号２の塩基配列１２７０−１２８６） を有するプローブＢ作製した。ファージＤＮＡをＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、蛍
光標識したプローブＢを用いてサザンハイブリダイゼー
ションを行なった。その結果、約１.２ｋｂｐの遺伝子
断片がプローブＢと非常に強くハイブリダイズした。

【００８５】そこで、ファージＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行ない、泳
動後、アガロースゲル中の１.２ｋｂｐのＤＮＡ断片を
含む部分を切り出し、ゲルからＤＮＡを抽出した。抽出
したＤＮＡと、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後ＢＡＰ処理した
ｐＵＣ１９を結合し、得られたＤＮＡでＥ.ｃｏｌｉＭ
Ｖ１１８４を形質転換した。生じたコロニーのコロニー
ハイブリダイゼーションをプローブＢを用いて行なった
ところ、強くハイブリダイズした５コロニーを得た。

【００８６】得られたコロニーをそれぞれ寒天培地から
釣菌し、ＬＢ−アンピシリン液体培地に植菌して３７℃
で１６時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を
それぞれ遠心分離（４℃・１５,０００ｒｐｍ・３０秒
間）により回収し、菌体からプラスミドＤＮＡを精製し
た。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動を行なったところ、いずれ
のコロニーから精製したプラスミドＤＮＡにも約１.２
ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることが確認でき
た。また、このアガロースゲルのサザンハイブリダイゼ
ーションをプローブＢを用いて行なった結果、この約
１.２ｋｂｐのＤＮＡ断片全てがプローブＢと強くハイ
ブリダイズした。

【００８７】ｂ．ｂｓｔ遺伝子断片のＣ末端部分のＤＮ
Ａ塩基配列の解析 上記ａで得られた約１.２ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配
列を、ＡＬＦｒｅｄＤＮＡシークエンサーを用いて解析
した。得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したとこ
ろ、片方のＨｉｎｄＩＩＩから２６２個のアミノ酸残基
からなる長いＯＲＦが存在していた。なお、本ＯＲＦの
３'側下流には１０ｂｐからなるステムと７ｂｐからな
るループで構成されるステムアンドループ構造が存在し
ていた。

【００８８】以上の結果から、本遺伝子断片のＯＲＦが
ｂｓｔ遺伝子の構造遺伝子のＣ末端側（図７および８の
塩基配列１２３９−２３４８）であると考えられ、この
プラスミドをｐＢＳＴＣと命名した。

【００８９】ＩＩＩ．ＪＴ０１６０の持つＤＮＡメチル
化酵素 上記Ｉｂで示したとおり、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＪ
Ｔ０１６０のゲノムＤＮＡを対象としてサザンハイブリ
ダイゼーションを行なった結果、約２.８ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片がプローブＡと強くハイブリダイズした。この大
きさは、ｐＢＳＴＮとｐＢＳＴＣに挿入された遺伝子断
片を合わせたもの、すなわちｂｓｔ遺伝子の全塩基配列
の大きさに等しい。これは、ｂｓｔ遺伝子内にＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）が存在するにも関わらず、
ゲノムＤＮＡではＨｉｎｄＩＩＩが切断されなかったこ
とを意味する。その理由として、ＪＴ０１６０の菌体内
でゲノムＤＮＡがメチル化等の修飾を受けたためにＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断できなかったと考えられた。ｂｓｔ遺
伝子全長の塩基配列を解明した結果、このｂｓｔ遺伝子
の内部に存在するＨｉｎｄＩＩＩの配列は外側の塩基も
含めてＧＡＡＧＣＴＴＣであり、パリンドローム構造を
持っていた。制限酵素部位やメチル化酵素部位の配列
は、そのほとんどがパリンドロームであり、このＧＡＡ
ＧＣＴＴＣという８ｂｐの配列は、ＪＴ０１６０の持つ
ＤＮＡメチル化酵素の認識配列であると推測された。な
お、ｂｓｔ遺伝子の両端に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部分
の配列はＡＡＧＣＴＴＡとＡＡＡＧＣＴＴであり、パリ
ンドローム配列ではないためにこれらの部位はメチル化
されず、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたと考えられる。

【００９０】現在、６ｂｐの塩基配列を認識する制限酵
素の存在が数多く知られており、遺伝子工学的研究を行
なう際に頻繁に使用されている。しかしながら、特に最
近は、より長いヒトの遺伝子を扱うことが多くなったた
め、８ｂｐの配列を認識する制限酵素が要望されてい
る。ところが、現在市販されている８ｂｐの配列を認識
する制限酵素はＮｏｔＩのみである。一方、多くの細菌
が、生体防御の機構として同じ配列を認識するＤＮＡメ
チル化酵素と制限酵素を合わせ持つことが知られてい
る。ＪＴ０１６０が８ｂｐの配列を認識するＤＮＡメチ
ル化酵素を持つと考えられ、したがって本菌がこの配列
を切断する制限酵素も合わせ持つ可能性が有ると推定さ
れた。この８ｂｐの配列を認識する新規制限酵素の開発
は非常に有益であると期待される。

【００９１】ＩＶ．シアリルモチーフ 現在までに、主として動物由来のシアル酸転移酵素がい
くつか精製され、クローニングされている。動物由来の
シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中には、その起源、種
類を問わず、相同性の高い領域が２ケ所存在し、シアリ
ルモチーフと呼ばれている。その一方は、すべてのシア
ル酸転移酵素の糖受容体であるＣＭＰ−シアル酸の結合
部位であることが明らかにされている。今回得られたＳ
Ｔ０１６の推定アミノ酸配列と、ラット由来のβ−ガラ
クトシドα−２，３シアル酸転移酵素のアミノ酸配列に
は相同性の高い領域は見られなかった。また、前記シア
リルモチーフの配列と相同性の高い領域も見い出せなか
った。このことは、ＳＴ０１６０の起源と、現在までに
主に動物から得られているシアル酸転移酵素と起源が異
なることを示すものと考えられる。本酵素の基質結合部
位、特にＣＭＰ−シアル酸の結合部位については非常に
興味深く、その解析は有益であると期待される。

【００９２】実施例２ 組換えＳＴ０１６０タンパク質
の発現 本実施例では、ｐＢＳＴＮとｐＢＳＴＣに分けてクロー
ニングされた遺伝子断片に含まれる長いオープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）が、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａ ＪＴ０１６０由来のシアル酸
転移酵素０１６０（ＳＴ０１６０）をコードすると遺伝
子、すなわちｂｓｔ遺伝子であることを証明する。その
ために、本遺伝子を発現ベクターに挿入し、大腸菌にお
いて発現し、その遺伝子産物を解析する。また、構築し
たＳＴ０１６０生産系を用いて、本構造遺伝子のＣ末端
に存在する膜結合に関与すると推定される領域の機能を
解析する。

【００９３】Ｉ．発現プラスミドの作製 ｂｓｔ遺伝子のクローニングの際に、サザンハイブリダ
イゼーションで本遺伝子を含むと推定された２.８ｋｂ
ｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片がｐＵＣ１８に挿入できず、
１.６ｋｂｐと１.２ｋｂｐの２つＨｉｎｄＩＩＩ断片と
してクローニングできたことから、本遺伝子が大腸菌に
とって致死遺伝子であると推定された。そこで、２つに
分けてクローニングされているｂｓｔ遺伝子の連結を、
制御可能なｔａｃプロモーターの制御下で行うこととし
た。

【００９４】発現ベクター作製の基となるベクターとし
てｐＡＱＩを改変したｐＡＱＮを使用した。ｐＡＱＩの
構造を図１に示し、ｐＡＱＮの構造を図２に示す。本プ
ラスミドはｔａｃプロモーターの直後のＥｃｏＲＩとｒ
ｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの直前のＨｉｎｄＩＩＩ
間にアクアライシンＩをコードする遺伝子（ａｑｕＩ遺
伝子）を有する。ａｑｕＩ遺伝子中には本プラスミド中
でユニークな制限酵素部位が、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩを含めて１０個存在しており、遺伝子操作を行う際
に有利である。また、本プラスミドはｔａｃプロモータ
ーを制御するｌａｃＩ^qをプラスミド中に持ち、通常の
系よりもｔａｃプロモーターをより強力に押さえるた
め、本実施例の目的に適していると考えた。

【００９５】ｐＡＱＩは、特開平２−９２２８８号にそ
の構築方法が記載されており、また、生命工学技術研究
所にＦＥＲＭ ＢＰ２３０５として寄託されている。

【００９６】ｐＡＱＩのｐＡＱＮへの改変はMutan-K
（宝酒造社製）を用い、次の手順により行った。 1. ３７℃で１夜培養したBP2305をQIAprep Spin Plasm
id Kit（QIAGEN社）を用い、pAQIを抽出した。 2. pAQIをXhoIとHindIIIで切断し、ライゲーションし
た。（pAQIΔXH） 3. pAQIΔHのアクアライシン遺伝子のEcoRI-XbaI部位
切り出し、M13mp18のEcoRI-XbaIサイトへ挿入した。（p
MBAL1） 4. pMBAL1を以下のプライマーにより、ポイントミュー
テション し、アクアライシン遺伝子のEcoRI-XbaI部位
にAccIII, BamHI,BglIIを挿入し、さらにXmaIII, KpnI
を消去した。（pMBAL1ΔXH） AccIII挿入用（塩基番号１４１） 5' -CCTGGATGATCCGGAAGCTATCC- 3' (23 mer) BamHI挿入用（塩基番号５０３） 5'- TGACACCGGGATCCGCACGA- 3' (20 mer) BglII挿入用（塩基番号９６６） 5' -TAGTTGCGTAGATCTCTTCGCC- 3' (22 mer) XmaIII消去用（塩基番号５３１） 5' -AGTTCGGCGGACGGGCCCG- 3' (19 mer) KpnI消去用（塩基番号５９２号） 5' -ACGGCCACGGGACCCATGTGG- 3' (21 mer) アニーリング温度は、６５度１５分、３７度１５分で行
った。 5. pMBAL1ΔXHのEcoRI-XbaI部位を切り出し、pAQIΔH
のアクアライシン遺伝子のEcoRI-XbaI部位切り出したプ
ラスミドのEcoRI-XbaIサイトへ挿入した。（pAQN）

【００９７】ｂｓｔ遺伝子発現プラスミドｐＥＢＳＴの
構築は、ｐＢＳＴＮとｐＢＳＴＣに含まれる遺伝子断片
がいずれもＨｉｎｄＩＩＩ断片であることから、次に述
べるとおり、方向性を持たせてこれらの断片をｐＡＱＮ
のｔａｃプロモーターの下流に挿入した。なお、この際
にｂｓｔ遺伝子の持つ本来のプロモーターは完全に切除
した。

【００９８】簡単に述べると、まず、ｐＡＱＮの制限酵
素部位はｔａｃプロモーター直後から順番にＥｃｏＲ
Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩと並んでい
るのをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩの順に改
変した。次に、ｐＢＳＴＣに含まれるＯＲＦの下流に存
在するＨｐａＩ部位（図７および８の塩基配列２２０１
−２２０６）をＸｂａＩに改変し、このＣ末端部分を含
むＯＲＦを、改変ｐＡＱＮにＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
で挿入した。次に、ｐＢＳＴＮに含まれるＯＲＦのＮ末
端に存在するＭｅｔの上流にＥｃｏＲＩ部位を挿入し、
このＮ末端部分を含むＯＲＦをＣ末端部分を含むＯＲＦ
を挿入したｐＡＱＮにＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで挿
入し、発現プラスミドｐＥＢＳＴを完成した。

【００９９】なお、Ｃ末端領域を欠失した変異体も同様
にして作製した。以下、より詳細に説明する。

【０１００】ａ．材料 発現ベクター作製のための材料は以下のものを使用し
た。 宿主：Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４， プラスミド：Ｍ１３ｍｐ１８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），Ｍ１
３ｍｐ１９（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） ｐＵＣ１８（宝酒造），ｐＵＣ１９（宝酒造） ｐＢＳＴＮ，ｐＢＳＴＣ 発現ベクター：ｐＡＱＮ 試薬：和光純薬 遺伝子工学用試薬およびＫｉｔ：宝酒造 但し、部位特異的異変ＫｉｔはＢｉｏ−Ｒａｄのものを
使用した リンカー：

【化４】 ＨｉｎｄＩＩＩリンカー ５'−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ−３'（配列番号７）（宝酒造:４７６０Ａ） ＸｂａＩリンカー ５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧ−３' （配列番号８）（宝酒造:４６９３Ａ） 合成オリゴヌクレオチド：

【化５】 プライマーＢＳＴ０１ ５'-TTATGTGAATTCGCTTAATATG-３’ （配列番号９） プライマーＢＳＴ０２ ５'-TTTTTATGTGAATGTGGAATTCATGAAGAAAATACTGA-３’ （配列番号１０） プライマーＢＳＴ０３ ５'-CAAAACAATTACTGATTAATAGTGAATTGGCGATGTGGCAG-３'（配列番号１１） プライマーＢＳＴ０４ ５'-TGTTCTGTTCTGGGCTTAGTGATAAGATCTCTCGATGGAAGTTGCC-３’ （配列番号１２）

【０１０１】ｂ．手順 ｐＡＱＮの改良 （図３） まず、ｐＡＱＮをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断し、
クレノー断片処理により平滑化し、そのままＬｉｇａｔ
ｉｏｎした。この処理により、ＨｉｎｄＩＩＩが消失し
ＸｂａＩのみ復活した（図３のｐＡＱＮΔＸＨ）。この
改良工程における塩基配列の変化の様子を下に示す。

【化６】

【０１０２】次に、ｐＡＱＮΔＸＨをＢｇｌＩＩで切断
し、クレノー断片処理により平滑化した。続いてＨｉｎ
ｄＩＩＩリンカーを加えてライゲーションした。この処
理によりＢｇｌＩＩ部位がＨｉｎｄＩＩＩ部位に置き換
わった（図３のｐＡＱＮ−ＥＨＸ）。

【０１０３】ｐＢＳＴＣの改変とｐＡＱＮ−ＥＨＸへの
挿入（図４） ｐＢＳＴＣに挿入されているＳＴ０１６０のＣ末端側を
含むと考えられている１.２ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断
片をＭ１３ｍｐ１８のクローニング部位のＨｉｎｄＩＩ
Ｉに挿入した。この際、３'末端がクローニング部位の
ＥｃｏＲＩ側（即ち、ＸｂａＩ側）の向きに挿入されて
いるものを選択した（図４のｐＭＢＳＴＣ）。

【０１０４】次にｐＭＢＳＴＣをＨｐａＩで切断し、ク
レノー断片処理により平滑化し、ＸｂａＩリンカーを加
えてライゲーションした。この処理によりＨｐａＩがＸ
ｂａＩに置き換わった（図４のｐＭＢＳＴＣ−ＨＸ）。

【０１０５】ｐＭＢＳＴＣ−ＨＸをＸｂａＩで切断し、
そのままライゲーションした。この処理により余分なＸ
ｂａＩ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む）が切除された
（図４のｐＭＢＳＴＣΔＸ）。

【０１０６】ｐＭＢＳＴＣΔＸのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂ
ａＩ断片をｐＡＱＮ−ＥＨＸのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａ
Ｉ部位に挿入し、ｐＥＢＳＴＣを作製した。

【０１０７】ＳＴ０１６０の膜結合領域を削除した改変
体の作製：なお、ＳＴ０１６０の膜結合領域と推定され
ている領域（以下、「Ｍ」と言う）、およびｐｈｏＵと
相同性の高い領域（以下、「Ｐ」と言う）の機能および
発現に及ぼす影響を解析することを目的として、これら
の領域を欠失した改変体も併せて作製した。

【０１０８】具体的には、図４中のｐＭＢＳＴＣΔＸに
対して部位特異的変異法を用い、ＯＲＦのアミノ酸残基
５３９位のロイシン（プライマーＢＳＴ０３を使用）、
および４９８位のアスパラギン酸（プライマーＢＮＳＴ
０４を使用）をコードする塩基配列部分を各々終止コド
ンに改変した。得られたプラスミドは各々ｐＭＢＳＴＣ
ΔＣ１３７およびｐＭＢＳＴＣΔＣ１７８である。この
際、完全に翻訳を終止するために、３種類の終止コドン
を挿入し、さらに改変の簡易確認のために制限酵素部位
を併せて挿入した（ｐＭＢＳＴＣΔＣ１３７にはＰｓｈ
ＢＩ、ｐＭＢＳＴＣΔＣ１７８にはＢｇｌＩＩ）。

【０１０９】以下、ｐＭＢＳＴＣΔＣ１３７およびｐＭ
ＢＳＴＣΔＣ１７８は、上記ｐＭＢＳＴＣ△Ｘの場合と
同様にして、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片をｐＡＱＮ
−ＥＨＸのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に挿入し、ｐ
ＥＢＳＴを作製した（それぞれｐＥＢＳＴＣΔＣ１３７
およびｐＥＢＳＴＣΔＣ１７８）。

【０１１０】ｐＢＳＴＮの改変とｐＥＢＳＴＣへの挿入
による発現ベクターの構築（図５） 実施例１のＩｈで作製されたｐＢＳＴＮに挿入されてい
るＳＴ０１６０のＮ末端側を含むと考えられている１.
６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｍ１３ｍｐ１９のク
ローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩに挿入した。この際、
Ｎ末端がクローニング部位のＥｃｏＲＩ側の向きに挿入
されたものを選択した（図５のｐＭＢＳＴＮ）。

【０１１１】次に、部位特異的変異法を用いてｐＢＳＴ
ＮのＯＲＦ開始部位の上流にＥｃｏＲＩ部位を挿入し
た。この際、ＥｃｏＲＩ部位とメチオニンをコードする
コドンＡＴＣとの間を０塩基としたもの（プライマーＢ
ＳＴ０２を使用：ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ０）と７塩基とした
もの（プライマーＢＳＴ０１を使用：ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ
７）の２種類を作製した。ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ０をｐＡＱ
Ｎに挿入した場合、ＳＤ配列からＡＴＧまでの距離は９
塩基となり、ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ７の場合には１６塩基と
なる。ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ０で、ＳＤ配列からＡＴＧまで
の距離を９塩基としたのは、その場合に発現効率が最も
良くなると考えられているためである。また、ｐＭＢＳ
ＴＮ−Ｅ７で、前述したようにｂｓｔ遺伝子が大腸菌に
とって致死遺伝子である可能性が考えられたため、発現
の程度を少し弱めたものを得るためにＳＤ配列からＡＴ
Ｇまでの距離を若干大きくした。

【０１１２】ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ０とｐＭＢＳＴＮ−Ｅ７
を各々ＥｃｏＲＩで切断し、そのままライゲーションし
た。この処理により余分なＥｃｏＲＩ断片（ＨｉｎｄＩ
ＩＩを含む）が切断された（図５のｐＭＢＳＴＮ−Ｅ０
ΔＥとｐＭＢＳＴＮ−Ｅ７ΔＥ）。

【０１１３】ｐＭＢＳＴＮ−Ｅ０ΔＥ、およびｐＢＳＴ
Ｎ−Ｅ７ΔＥのＥｃｏＲＩ断片をｐＥＢＳＴＣのＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、発現ベクターｐＥ
ＢＳＴを構築した（図６） ｐＥＢＳＴＣΔＣ１３７およびｐＥＢＳＴＣΔＣ１７８
についても同様に挿入を行い、以下の表２に示す６種類
のＳＴ０１６０発現ベクターを構築した。

【０１１４】

【表２】ｐＥＢＳＴ−Ｅ０＝ｐＢＳＴＮ−Ｅ０ΔＥ＋ｐ
ＥＢＳＴＣ＝Ａ２シリーズ ｐＥＢＳＴ−Ｅ７＝ｐＢＳＴＮ−Ｅ７ΔＥ＋ｐＥＢＳＴ
Ｃ＝Ａ１シリーズ ｐＥＢＳＴ−Ｅ０ΔＭ＝ｐＢＳＴＮ−Ｅ０ΔＥ＋ｐＢＳ
ＴＮＣΔＣ１３７＝Ｂ２シリーズ ｐＥＢＳＴ−Ｅ７ΔＭ＝ｐＢＳＴＮ−Ｅ７ΔＥ＋ｐＢＳ
ＴＮＣΔＣ１３７＝Ｂ１シリーズ ｐＥＢＳＴ−Ｅ０ΔＰ＝ｐＢＳＴＮ−Ｅ０ΔＥ＋ｐＢＳ
ＴＮＣΔＣ１７８＝Ｃ２シリーズ ｐＥＢＳＴ−Ｅ７ΔＰ＝ｐＢＳＴＮ−Ｅ７ΔＥ＋ｐＢＳ
ＴＮＣΔＣ１７８＝１２シリーズ

【０１１５】ＩＩ．発現の実施例 (1) 形質転換、および菌株の保存 −８０℃で保存したE.coli MV1184コンピテント細胞
（１００μｌ）を氷中で溶かし、これに表ー２に示した
６種類の発現ベクター（１０μｌ）を添加し、30分間氷
中で放置した。これを42℃で１分間処理し、その後３分
間氷中に放置した。これに、３７℃に保温したＬＢ培地
を９００μｌ添加し、１時間、３７℃で振とうした。振と
う終了後、本溶液を、ＬＢ−アンピシリン、ＩＰＴＧ、
Ｘ−Ｇａｌ寒天培地に塗布し、３７℃、１６時間培養し
た。

【０１１６】(2) 培養 得られた形質転換体（６種類）を、それぞれLBーアンピ
シリンーIPTG液体培地で、３０℃、１５０rpmで振とう
培養し、菌体の増殖とシアル酸転移活性を測定した。な
お、菌体の接種は、培地0.5%量の(1)の方法で調製した
グリセロールストックを培地に添加することにより行っ
た。また、培養液中のアンピシリン濃度は１００mg/l、
IPTG濃度は０．０２mM とした。菌体の増殖は培養開始
後、培養液を経時的にサンプリングして６６０nmの吸光
度を測定することによりモニターした。

【０１１７】その結果、A,B,Cシリーズいずれの発現ベ
クターを含むE.coli MV1184形質転換株いずれも、長い
ラグタイムの後に菌体の増殖が認められた。それぞれの
菌体（A2,B2,C2)の増殖を図９に示す。図９に示したよ
うに、Cシリーズ>Bシリーズ>Aシリーズの順番で増殖は
速かった。

【０１１８】菌体からの粗酵素の調整は、培養液から遠
心分離で菌体を集めて、0.2% Triton X-100を含む20mM
カコジレート緩衝液（pH 5.0)に菌体を懸濁し、これを
超音波処理して菌体を破砕して粗酵素とした。表３に示
すように酵素生産量もC>B>Aの順であった。

【０１１９】シアリルトランスフェラーゼ活性は、供給
基質であるＣＭＰ−〔４，５，６，７，８，９−¹⁴Ｃ〕
−ＮｅｕＡｃから受容基質であるラクトースに転移し
た、〔４，５，６，７，８，９−¹⁴Ｃ〕−ＮｅｕＡｃを
測ることにより測定した。標準反応混合物は、７０nmol
のＣＭＰ−〔４，５，６，７，８，９−¹⁴Ｃ〕−Ｎｅｕ
Ａｃ（６４２cmp/nmol）、１．２５μmol のラクトー
ス、並びに０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む
２０mMカコジレートナトリウム緩衝液（pH５．０）２５
μl 中の酵素溶液からなる。酵素反応は、３０℃で３分
間行った。全ての測定は、二重に行った。反応後、反応
混合物を５mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH６．８）で２
mlに希釈し、Ｄｏｗｅｘ１×８（リン酸型）のカラム
（０．５×２cm）に充填した。抽出物（２ml）をシンチ
レーションバイアルに直接集め、計測を行った。抽出物
中の、受容基質に転移した〔４，５，６，７，８，９−
¹⁴Ｃ〕−ＮｅｕＡｃの放射活性を液体シンチレーション
カウンターで測定し、転移した〔４，５，６，７，８，
９−¹⁴Ｃ〕−ＮｅｕＡｃの量を測定した。１単位（Ｕ）
は、上述した条件下で１μmol のシアル酸を１分間にラ
クトースに転移する酵素の量と定義した。

【０１２０】

【表３】 A1シリーズ 43 units/L A2シリーズ 66 units/L B1シリーズ 74 units/L B2シリーズ 112 units/L C1シリーズ 91 units/L C2シリーズ 240 units/L

【０１２１】(3) 酵素反応生成物の同定 上記(2) に記載した方法で調製した粗酵素を、イオン交
換カラム（Ｑ−セファロース，ファルマシア）、ハイド
ロキシアパタイト（高研製）で部分精製した酵素を用い
て、糖受容体基質としてピリジルアミノ化ラクトース、
糖供与体基質としてCMP-NeuAcを用いて酵素反応を行い
（30℃、6時間）、反応生成物を反応終了後、１００℃
で２分間処理することにより酵素を失活させた。その
後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。

【０１２２】ＨＰＬＣシステムとしてはShimazu LC-10
（島津製）、カラムとしてはTakaraPALPAK Type R（宝
酒造製）を用い、酵素を失活させた反応液１０μlを、
０．１５％ ｎ−ブタノールを含む１００mM酢酸−トリ
エチルアミン（pH５．０）で平衡化したカラムに注入し
た。ピリジルアミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（１００
mM酢酸−トリエチルアミン、pH５．０）及び溶出液Ｂ
（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００mM酢酸−トリ
エチルアミン、pH５．０）を用い、３０〜１００％溶出
液Ｂの直線濃度勾配法（０〜３５分）及び１００％溶出
液Ｂ（３５〜５０分）により、順次ピリジルアミノ化糖
鎖の溶出を行い、１ml/minの流速、４０℃のカラム温度
の条件下、蛍光（Ｅｘ：３２０nm、Ｅｍ：４００nm）を
検出することによりピリジルアミノ化糖鎖を検出した。

【０１２３】その結果（図１０）、いずれの粗酵素を用
いて酵素反応を行った場合にも、ST0160を酵素として反
応を行った場合と同じリテンションタイムをもつ反応生
成物のピークが検出されたことから、6種類の粗酵素は
いずれもシアル酸をガラクトースの６位にa２、６で転
移していると判断した。

【０１２４】(4) 可溶化体酵素 一般に、100,000 xg,１hrで遠心分離を行い、その遠心
上清に存在するタンパク質は可溶化されていると定義さ
れる。そこで、C2シリーズの菌株をLBーアンピシリンー
IPTG液体培地で、３０℃、１５０rpmで振とう培養し、
培養終了後、遠心分離を行い、菌体を集め、20mMカコジ
レート緩衝液（pH 5.0)に菌体を懸濁し、これを超音波
処理して菌体を破砕して粗酵素とした。この菌体破砕液
を４℃、100,000 xg,１hrで遠心分離を行い上清を集
め、この遠心上清のシアル酸転移活性を測定した。その
結果、この遠心上清には、(2) で示した酵素生産量の約
５０％（１２０unis/L)の酵素が存在した。一方、A1,A2
シリーズの菌株を用いて同様の検討を行ったところ、界
面活性剤が抽出緩衝液に含まれていない場合には、100,
000 xg,１hrで遠心分離を行って得られた遠心上清には
ほとんど酵素は存在しなかった。つまり、本酵素をコー
ドする遺伝子のC末端側が膜結合に関与しているものと
考えられ、この部分を欠損させたタンパク質を生産する
ことで、可溶化体のシアル酸転移酵素を生産することが
可能となった。

【０１２５】(5) Ｃ２シリーズ形質転換体培養上清液の
シアリルトランスフェラーゼ活性前記Ｃ２シリーズの菌
株をＬＢ−アンピシリン−ＩＰＴＧ液体培地で３０℃１
５０rpm で振とう培養し、ＯＤ₆₀₀が２．８となったと
き９７０ml分取し、シアリルトランスフェラーゼ活性を
測定した。

【０１２６】シアリルトランスフェラーゼ活性は、供給
基質であるＣＭＰ−〔４，５，６，７，８，９−¹⁴Ｃ〕
−ＮｅｕＡｃから受容基質であるラクトースに転移し
た、〔４，５，６，７，８，９−¹⁴Ｃ〕−ＮｅｕＡｃを
測ることにより測定した。標準反応混合物は、７０nmol
のＣＭＰ−〔４，５，６，７，８，９−¹⁴Ｃ〕−Ｎｅｕ
Ａｃ（６４２cmp/nmol）、１．２５μmol のラクトー
ス、並びに０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む
２０mMカコジレートナトリウム緩衝液（pH５．０）２５
μl 中の酵素溶液からなる。酵素反応は、３０℃で３分
間行った。全ての測定は、二重に行った。反応後、反応
混合物を５mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH６．８）で２
mlに希釈し、Ｄｏｗｅｘ１×８（リン酸型）のカラム
（０．５×２cm）に充填した。抽出物（２ml）をシンチ
レーションバイアルに直接集め、計測を行った。抽出物
中の、受容基質に転移した〔４，５，６，７，８，９−
¹⁴Ｃ〕−ＮｅｕＡｃの放射活性を液体シンチレーション
カウンターで測定し、転移した〔４，５，６，７，８，
９−¹⁴Ｃ〕−ＮｅｕＡｃの量を測定した。１単位（Ｕ）
は、上述した条件下で１μmol のシアル酸を１分間にラ
クトースに転移する酵素の量と定義した。

【０１２７】その結果、シアル酸トランスフェラーゼ活
性は、１２．９８Ｕ／ｌであった。

【０１２８】

【配列表】

【０１２９】配列番号:1 配列の長さ: 675アミノ酸残基 配列の型: アミノ酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: タンパク質 起源 生物名: ファトバクテリウムダムセーラ（Photobacte
rium damsela） 株名: ＪＴ０１６０ 配列の特徴: 特徴を表す記号: シグナルペプチド 存在位置: 1..15 配列の特徴: 特徴を表す記号: 成熟タンパク質 存在位置: 16..675 配列: 配列番号:1 Met Lys Lys Ile Leu Thr Val Leu Ser Ile Phe Ile Leu Ser Ala Cys 1 5 10 15 Asn Ser Asp Asn Thr Ser Leu Lys Glu Thr Val Ser Ser Asn Ser Ala 20 25 30 Asp Val Val Glu Thr Glu Thr Tyr Gln Leu Thr Pro Ile Asp Ala Pro 35 40 45 Ser Ser Phe Leu Ser His Ser Trp Glu Gln Thr Cys Gly Thr Pro Ile 50 55 60 Leu Asn Glu Ser Asp Lys Gln Ala Ile Ser Phe Asp Phe Val Ala Pro 65 70 75 80 Glu Leu Lys Gln Asp Glu Lys Tyr Cys Phe Thr Phe Lys Gly Ile Thr 85 90 95 Gly Asp His Arg Tyr Ile Thr Asn Thr Thr Leu Thr Val Val Ala Pro 100 105 110 Thr Leu Glu Val Tyr Ile Asp His Ala Ser Leu Pro Ser Leu Gln Gln 115 120 125 Leu Ile His Ile Ile Gln Ala Lys Asp Glu Tyr Pro Ser Asn Gln Arg 130 135 140 Phe Val Ser Trp Lys Arg Val Thr Val Asp Ala Asp Asn Ala Asn Lys 145 150 155 160 Leu Asn Ile His Thr Tyr Pro Leu Lys Gly Asn Asn Thr Ser Pro Glu 165 170 175 Met Val Ala Ala Ile Asp Glu Tyr Ala Gln Ser Lys Asn Arg Leu Asn 180 185 190 Ile Glu Phe Tyr Thr Asn Thr Ala His Val Phe Asn Asn Leu Pro Pro 195 200 205 Ile Ile Gln Pro Leu Tyr Asn Asn Glu Lys Val Lys Ile Ser His Ile 210 215 220 Ser Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ser Glu Tyr Val Ser Leu Tyr Gln Trp 225 230 235 240 Lys Asp Thr Pro Asn Lys Ile Glu Thr Leu Glu Gly Glu Val Ser Leu 245 250 255 Leu Ala Asn Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Pro Asp Ala Pro Lys Gly Met 260 265 270 Gly Asn Arg Tyr Asn Trp His Lys Leu Tyr Asp Thr Asp Tyr Tyr Phe 275 280 285 Leu Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Val Glu Ala Asn Leu His Asp Leu Arg 290 295 300 Asp Tyr Leu Gly Ser Ser Ala Lys Gln Met Pro Trp Asp Glu Phe Ala 305 310 315 320 Lys Leu Ser Asp Ser Gln Gln Thr Leu Phe Leu Asp Ile Val Gly Phe 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Ser Gln Ser Pro Leu Pro Asn 340 345 350 Phe Ile Phe Thr Gly Thr Thr Thr Trp Ala Gly Gly Glu Thr Lys Glu 355 360 365 Tyr Tyr Ala Gln Gln Gln Val Asn Val Ile Asn Asn Ala Ile Asn Glu 370 375 380 Thr Ser Pro Tyr Tyr Leu Gly Lys Asp Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly 385 390 395 400 His Pro Ala Gly Gly Val Ile Asn Asp Ile Ile Leu Gly Ser Phe Pro 405 410 415 Asp Met Ile Asn Ile Pro Ala Lys Ile Ser Phe Glu Val Leu Met Met 420 425 430 Thr Asp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Gly Ile Ala Ser Ser Leu Tyr 435 440 445 Phe Thr Ile Pro Ala Asp Lys Val Asn Phe Ile Val Phe Thr Ser Ser 450 455 460 Asp Thr Ile Thr Asp Arg Glu Glu Ala Leu Lys Ser Pro Leu Val Gln 465 470 475 480 Val Met Leu Thr Leu Gly Ile Val Lys Glu Lys Asp Val Leu Phe Trp 485 490 495 Ala Asp His Lys Val Asn Ser Met Glu Val Ala Ile Asp Glu Ala Cys 500 505 510 Thr Arg Ile Ile Ala Lys Arg Gln Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu 515 520 525 Val Ile Ala Ile Ile Lys Thr Ile Thr Asp Leu Glu Arg Ile Gly Asp 530 535 540 Val Ala Glu Ser Ile Ala Lys Val Ala Leu Glu Ser Phe Ser Asn Lys 545 550 555 560 Gln Tyr Asn Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gln His Thr Val 565 570 575 Arg Met Leu His Glu Val Leu Asp Ala Phe Ala Arg Met Asp Val Lys 580 585 590 Ala Ala Ile Glu Val Tyr Gln Glu Asp Asp Arg Ile Asp Gln Glu Tyr 595 600 605 Glu Ser Ile Val Arg Gln Leu Met Ala His Met Met Glu Asp Pro Ser 610 615 620 Ser Ile Pro Asn Val Met Lys Val Met Trp Ala Ala Arg Ser Ile Glu 625 630 635 640 Arg Val Gly Asp Arg Cys Gln Asn Ile Cys Glu Tyr Ile Ile Tyr Phe 645 650 655 Val Lys Gly Lys Asp Val Arg His Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gly Thr 660 665 670 Met Leu Asp 675

【０１３０】配列番号:2 配列の長さ: 2709塩基対 配列の型: 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: Genomic DNA 起源 生物名: ファトバクテリウムダムセーラ（Photobacte
rium damsela） 株名: ＪＴ０１６０ 配列: 配列番号2 AAGCTTATCT TGAAATGAAT GATAAGGAAG GGGCGATTGA ATTACTTGAA GAGGTAACGG -336 CAAAAGCGGA TGGGGCTGTA AAAGCGGAAG CTGAGGAAGT TATTGAATAA CTAATTTTTC -276 AAATGTTCTG TTTTAAGGCG TAAACGATTG AGTCTCTTAA AGCGTACTAT GTCATCATAA -216 GGCTGGTGTG GCATAGTACG CACTTTTAAT GATCTTCATT ATTTATTACT TATTGGTATG -156 ACAGTTTGTA AATAATAATT TTTCAATTGA TATTTTTATG CTGGTATTGA ACCTGAAATC -96 AAATGAGATA TATCTCACAA AAAGCAAATG TAAACATCAT CTTAAATAGA TGAGGCAATA -36 TACTACTAAG AATTTTTTAT GTGAATGTGC TTAAT ATG AAG AAA ATA CTG ACA 18 Met Lys Lys Ile Leu Thr 1 5 GTT CTA TCT ATT TTT ATT CTT TCA GCG TGT AAT AGT GAC AAT ACC AGC 66 Val Leu Ser Ile Phe Ile Leu Ser Ala Cys Asn Ser Asp Asn Thr Ser 10 15 20 TTG AAA GAA ACG GTA AGC TCT AAT TCT GCA GAT GTA GTA GAA ACA GAA 114 Leu Lys Glu Thr Val Ser Ser Asn Ser Ala Asp Val Val Glu Thr Glu 25 30 35 ACT TAC CAA CTG ACA CCG ATT GAT GCT CCT AGC TCT TTT TTA TCT CAT 162 Thr Tyr Gln Leu Thr Pro Ile Asp Ala Pro Ser Ser Phe Leu Ser His 40 45 50 TCT TGG GAG CAA ACA TGT GGC ACA CCT ATC TTG AAT GAA AGT GAC AAG 210 Ser Trp Glu Gln Thr Cys Gly Thr Pro Ile Leu Asn Glu Ser Asp Lys 55 60 65 70 CAA GCG ATA TCT TTT GAT TTT GTT GCT CCA GAG TTA AAG CAA GAT GAA 258 Gln Ala Ile Ser Phe Asp Phe Val Ala Pro Glu Leu Lys Gln Asp Glu 75 80 85 AAG TAT TGT TTT ACT TTT AAA GGT ATT ACA GGC GAT CAT AGG TAT ATC 306 Lys Tyr Cys Phe Thr Phe Lys Gly Ile Thr Gly Asp His Arg Tyr Ile 90 95 100 ACA AAT ACA ACA TTA ACT GTT GTT GCA CCT ACG CTA GAA GTT TAC ATC 354 Thr Asn Thr Thr Leu Thr Val Val Ala Pro Thr Leu Glu Val Tyr Ile 105 110 115 GAT CAT GCA TCC TTA CCA TCG CTA CAG CAG CTT ATC CAC ATT ATT CAA 402 Asp His Ala Ser Leu Pro Ser Leu Gln Gln Leu Ile His Ile Ile Gln 120 125 130 GCA AAA GAT GAA TAC CCA AGT AAT CAA CGT TTT GTC TCT TGG AAG CGT 450 Ala Lys Asp Glu Tyr Pro Ser Asn Gln Arg Phe Val Ser Trp Lys Arg 135 140 145 150 GTA ACT GTT GAT GCT GAT AAT GCC AAT AAG TTA AAC ATT CAT ACT TAT 498 Val Thr Val Asp Ala Asp Asn Ala Asn Lys Leu Asn Ile His Thr Tyr 155 160 165 CCA TTA AAA GGC AAT AAT ACC TCA CCA GAA ATG GTG GCA GCG ATT GAT 546 Pro Leu Lys Gly Asn Asn Thr Ser Pro Glu Met Val Ala Ala Ile Asp 170 175 180 GAG TAT GCT CAG AGC AAA AAT CGA TTG AAT ATA GAG TTC TAT ACA AAT 594 Glu Tyr Ala Gln Ser Lys Asn Arg Leu Asn Ile Glu Phe Tyr Thr Asn 185 190 195 ACA GCT CAT GTT TTT AAT AAT TTA CCA CCT ATT ATT CAA CCT TTA TAT 642 Thr Ala His Val Phe Asn Asn Leu Pro Pro Ile Ile Gln Pro Leu Tyr 200 205 210 AAT AAC GAG AAG GTG AAA ATT TCT CAT ATT AGT TTG TAT GAT GAT GGT 690 Asn Asn Glu Lys Val Lys Ile Ser His Ile Ser Leu Tyr Asp Asp Gly 215 220 225 230 TCT TCT GAA TAT GTA AGT TTA TAT CAA TGG AAA GAT ACA CCA AAT AAG 738 Ser Ser Glu Tyr Val Ser Leu Tyr Gln Trp Lys Asp Thr Pro Asn Lys 235 240 245 ATA GAA ACA TTA GAA GGT GAA GTA TCG CTT CTT GCT AAT TAT TTA GCA 786 Ile Glu Thr Leu Glu Gly Glu Val Ser Leu Leu Ala Asn Tyr Leu Ala 250 255 260 GGA ACA TCT CCG GAT GCA CCA AAA GGA ATG GGA AAT CGT TAT AAC TGG 834 Gly Thr Ser Pro Asp Ala Pro Lys Gly Met Gly Asn Arg Tyr Asn Trp 265 270 275 CAT AAA TTA TAT GAC ACT GAT TAT TAC TTT TTG CGC GAA GAT TAC CTT 882 His Lys Leu Tyr Asp Thr Asp Tyr Tyr Phe Leu Arg Glu Asp Tyr Leu 280 285 290 GAC GTT GAA GCA AAC CTA CAT GAT TTA CGT GAT TAT TTA GGC TCT TCC 930 Asp Val Glu Ala Asn Leu His Asp Leu Arg Asp Tyr Leu Gly Ser Ser 295 300 305 310 GCA AAG CAA ATG CCA TGG GAT GAA TTT GCT AAA TTA TCT GAT TCT CAG 978 Ala Lys Gln Met Pro Trp Asp Glu Phe Ala Lys Leu Ser Asp Ser Gln 315 320 325 CAA ACA CTA TTT TTA GAT ATT GTG GGT TTT GAT AAA GAG CAA TTG CAA 1026 Gln Thr Leu Phe Leu Asp Ile Val Gly Phe Asp Lys Glu Gln Leu Gln 330 335 340 CAA CAA TAT TCA CAA TCC CCA CTA CCA AAC TTT ATT TTT ACC GGC ACA 1074 Gln Gln Tyr Ser Gln Ser Pro Leu Pro Asn Phe Ile Phe Thr Gly Thr 345 350 355 ACA ACT TGG GCT GGG GGG GAA ACG AAA GAG TAT TAT GCT CAG CAA CAA 1122 Thr Thr Trp Ala Gly Gly Glu Thr Lys Glu Tyr Tyr Ala Gln Gln Gln 360 365 370 GTA AAT GTG ATT AAT AAT GCG ATC AAT GAA ACT AGC CCT TAT TAT TTA 1170 Val Asn Val Ile Asn Asn Ala Ile Asn Glu Thr Ser Pro Tyr Tyr Leu 375 380 385 390 GGT AAA GAC TAC GAT CTA TTT TTC AAG GGG CAT CCT GCT GGT GGC GTT 1218 Gly Lys Asp Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ala Gly Gly Val 395 400 405 ATT AAC GAC ATC ATT CTT GGA AGC TTC CCT GAT ATG ATC AAT ATT CCA 1266 Ile Asn Asp Ile Ile Leu Gly Ser Phe Pro Asp Met Ile Asn Ile Pro 410 415 420 GCC AAG ATT TCA TTT GAG GTC TTG ATG ATG ACG GAT ATG TTG CCT GAT 1314 Ala Lys Ile Ser Phe Glu Val Leu Met Met Thr Asp Met Leu Pro Asp 425 430 435 ACA GTA GCT GGT ATT GCG AGC TCT CTG TAC TTC ACA ATT CCT GCC GAT 1362 Thr Val Ala Gly Ile Ala Ser Ser Leu Tyr Phe Thr Ile Pro Ala Asp 440 445 450 AAA GTT AAT TTT ATT GTA TTT ACT TCA TCT GAC ACT ATT ACT GAT CGT 1410 Lys Val Asn Phe Ile Val Phe Thr Ser Ser Asp Thr Ile Thr Asp Arg 455 460 465 470 GAA GAG GCT CTT AAA TCA CCA TTA GTA CAA GTG ATG CTA ACG TTG GGT 1458 Glu Glu Ala Leu Lys Ser Pro Leu Val Gln Val Met Leu Thr Leu Gly 475 480 485 ATT GTT AAA GAA AAA GAT GTT CTG TTC TGG GCT GAT CAT AAA GTA AAC 1506 Ile Val Lys Glu Lys Asp Val Leu Phe Trp Ala Asp His Lys Val Asn 490 495 500 TCG ATG GAA GTT GCC ATT GAT GAA GCC TGT ACT CGG ATC ATT GCA AAG 1554 Ser Met Glu Val Ala Ile Asp Glu Ala Cys Thr Arg Ile Ile Ala Lys 505 510 515 CGA CAA CCA ACC GCG AGT GAT TTA CGC TTG GTT ATT GCT ATT ATC AAA 1602 Arg Gln Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu Val Ile Ala Ile Ile Lys 520 525 530 ACA ATT ACT GAT CTT GAG CGT ATT GGC GAT GTG GCA GAA AGT ATT GCT 1650 Thr Ile Thr Asp Leu Glu Arg Ile Gly Asp Val Ala Glu Ser Ile Ala 535 540 545 550 AAA GTC GCA TTA GAG AGC TTT AGT AAT AAG CAA TAT AAC CTA TTG GTT 1698 Lys Val Ala Leu Glu Ser Phe Ser Asn Lys Gln Tyr Asn Leu Leu Val 555 560 565 TCT TTA GAA TCT CTT GGC CAG CAT ACG GTT CGA ATG CTG CAT GAG GTG 1746 Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gln His Thr Val Arg Met Leu His Glu Val 570 575 580 TTA GAT GCG TTT GCT CGT ATG GAT GTT AAA GCC GCA ATA GAA GTG TAC 1794 Leu Asp Ala Phe Ala Arg Met Asp Val Lys Ala Ala Ile Glu Val Tyr 585 590 595 CAA GAA GAT GAT CGA ATT GAT CAA GAG TAT GAG TCG ATA GTC AGA CAG 1842 Gln Glu Asp Asp Arg Ile Asp Gln Glu Tyr Glu Ser Ile Val Arg Gln 600 605 610 CTA ATG GCC CAT ATG ATG GAA GAT CCA AGC TCA ATT CCT AAT GTA ATG 1890 Leu Met Ala His Met Met Glu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asn Val Met 615 620 625 630 AAA GTG ATG TGG GCG GCA CGT TCT ATT GAG CGA GTG GGT GAT CGC TGT 1938 Lys Val Met Trp Ala Ala Arg Ser Ile Glu Arg Val Gly Asp Arg Cys 635 640 645 CAA AAC ATT TGT GAG TAC ATT ATC TAC TTT GTG AAG GGT AAA GAC GTT 1986 Gln Asn Ile Cys Glu Tyr Ile Ile Tyr Phe Val Lys Gly Lys Asp Val 650 655 660 CGC CAT ACC AAA CCA GAT GAT TTT GGT ACT ATG CTC GAT TAA 2028 Arg His Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gly Thr Met Leu Asp STP 665 670 675 TCTATACAAG AAACAAGAAA CAAGAAGGTC GCCAGCATCG TAAATGTGGC GACCTTTTTT 2088 AATGCAAAAA AGCCCTTCTA AAGGTAAACG AAGGGCGAGA GTAACCAAAT GGTCAAAATT 2148 GAGTGGATAT AACATTCATG CTGATTTTGT TATTGTTGCT ATATTTCAAT TAGTTAACTG 2208 CGTTTCAGTT AAAGCTGTAT TGTAAACCGA CACCGCCTGC GACTTCTGAT GACGAGTATT 2268 TACCGCTCGT TTCGTAATGG AAAGTTCCTG ATACACTTAA GTTTTCGTTG ATTCCATAAG 2328 CACCACCAAG GCTAAAGCTT 2348

【０１３１】配列番号:3 配列の長さ:38 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:3 GCIAAITAII TIGCIGGIAC IIIICCIGAI GCICCIAA 38

【０１３２】配列番号:4 配列の長さ: 25 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:4 GGGGGGGAAA CGAAAGAGTA TTATG 25

【０１３３】配列番号:5 配列の長さ: 24 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:5 ATTTTTCAAG GGGCATCCTG CTGG 24

【０１３４】配列番号:6 配列の長さ: 17 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:6 AAGATTTCAT TTGAGGT 17

【０１３５】配列番号:7 配列の長さ: 10 配列の型: 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:7 CCAAGCTTGG 10

【０１３６】配列番号:8 配列の長さ: 8 配列の型: 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:8 CTCTAGAG 8

【０１３７】配列番号:9 配列の長さ: 22 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:9 TTATGTGAAT TCGCTTAATA TG 22

【０１３８】配列番号:10 配列の長さ: 38 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:10 TTTTTATGTG AATGTGGAAT TCATGAAGAA AATACTGA 38

【０１３９】配列番号:11 配列の長さ: 41 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:11 CAAAACAATT ACTGATTAAT AGTGAATTGG CGATGTGGCA G 41

【０１４０】配列番号:12 配列の長さ: 46 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列: 配列番号:12 TGTTCTGTTC TGGGCTTAGT GATAAGATCT CTCGATGGAA GTTGCC 46

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｐＡＱＩの構造を示す。

【図２】図２は、ｐＡＱＮの構造を示す。

【図３】図３は、ｐＡＱＮからｐＡＱＮ−ＥＨＸまでの
構築工程を示す。

【図４】図４は、ｐＢＳＴＣからｐＥＢＳＴＣまでの構
築工程を示す。

【図５】図５は、ｐＢＳＴＮからｐＥＢＳＴまでの構築
工程を示す。

【図６】図６は、発現ベクターｐＥＢＳＴの構造を示
す。

【図７】図７は、ｂｓｔ遺伝子の塩基配列の前半を推定
アミノ酸配列と共に示す。

【図８】図８は、ｂｓｔ遺伝子の塩基配列の後半を推定
アミノ酸配列と共に示す。

【図９】図９は、本発明の発現ベクターを含むE.coli M
V1184形質転換株（A2,B2,C2)の増殖を示す。

【図１０】図１０は、実施例２II(2) で６種類の形質転
換体から得た粗酵素が、ST0160と同じ活性をもつことを
確認するため、糖供与体基質としてCMP-NeuAcを用いて
酵素反応を行った際の、反応生成物のリテンションタイ
ムを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコ
   ードする遺伝子： （Ａ）配列番号１の１６−４９８のアミノ酸配列を含む
   タンパク質 （Ｂ）配列番号１の１６−４９８において、１若しくは
   複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつβ−ガラクトシド−α２,６−シ
   アル酸転移酵素活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
   る、請求項１に記載の遺伝子： （ａ）配列番号２の４６−１４９４の塩基配列を含むＤ
   ＮＡ （ｂ）配列番号２の４６−１４９４を含むＤＮＡと温和
   なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ
   β−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移酵素活性を
   有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】さらに、配列番号１の４９９−Ｘ（Ｘは、
   ５００−６７５の整数である）のアミノ酸配列をコード
   する遺伝子も含む、請求項１または２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   ＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
5. 【請求項５】発現ベクターのシグナル配列が宿主由来の
   ＤＮＡである、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 【請求項６】発現ベクターのシグナル配列が： （Ａ）配列番号１の１−１５のアミノ酸配列を含むペプ
   チドをコードするＤＮＡ配列、または（Ｂ）配列番号１
   の１−１５において、１若しくは複数のアミノ酸が欠
   失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且
   つシグナル活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配
   列である、請求項４に記載の発現ベクター。
7. 【請求項７】組換えβ−ガラクトシド−α２,６−シア
   ル酸転移酵素タンパク質を製造する方法であって、請求
   項４ないし６のいずれか１項に記載したベクターで形質
   転換された宿主細胞をβ−ガラクトシド−α２,６−シ
   アル酸転移酵素の発現を促進する条件下で培養し、その
   培養物からβ−ガラクトシド−α２,６−シアル酸転移
   酵素タンパク質を回収することを含む方法。